Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của indirubin và dẫn chất

ĐẶT VẤN ĐỂ Khi xã hội ngày càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người càng trở nên phức tạp và nhu cầu chăm sóc sức khoẻ cũng ngày càng tăng lên. Nếu đơn thuần chỉ dựa vào những thuốc lâu đời có nguồn gốc từ dược liệu hay tổng họp vi sinh thì chưa đủ để đáp ứng được nhu cầu đó. Ngày nay, việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới và đưa vào sử dụng trên lâm sàng là thành tựu của nhiều ngành khoa học như bào chế, hoá dược, vi sinh, dược lâm sàng...trong đó tổng hợp hoá dược đóng vai trò rất quan trọng. Được hình thành và phát triển trên cơ sở kĩ thuật tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hoá dược đã trở thành một ngành khoa học chuyên biệt chuyên nghiên cứu tìm ra các loại thuốc mới phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh cho con người. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hoá dược đóng vai trò không thể thiếu trong cuộc sống và chiếm một số lượng rất lớn. Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể ứng dụng trong điều trị, các nhà tổng hợp hoá dược thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng họp hoặc bán tổng họp tạo ra nhiều thuốc mới. Một số công trình nghiên cứu cho thấy indirubin và các dẫn chất có tác dụng sinh học rất đáng quan tâm như; kháng các dòng tế bào gây bệnh ung thư ở người, kháng nấm, kháng khuẩn... V ớ i m o n g m u ố n l à m p h o n g p h ú t h ê m c á c n g h i ê n c ứ u v ề t á c d ụ n g s i n h h ọ c của các dẫn chất indirubin, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của indirubin và dẫn chất” với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp indirubin và một số dẫn chất với các nhóm thế khác nhau tại vị trí C5, C7 2. Thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất tổng hợp được.

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến: TS Nguyễn Hải Nam, DS Nghiêm Thị Minh, DS Trần Phương Thảo - Bộ môn Hoả Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thày đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, chỉ bảo cho tôi trong quà trình thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp.

Tôi xỉn chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thày, các cô, các em kỹ thuật viên Bộ môn Hoá Dược đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoả luận này.

Trong quá trình thực hiện khoá luận, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cán bộ Phòng Thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội; Phòng Sinh học - Viện Hoả học các hợp chất tự nhiên; Phòng Phân tích phổ - Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam .cùng toàn thể các thày cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện Tôi xin chân thành cảm ơn.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đĩnh và bạn bè - những người luôn sát cánh, động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập.

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2010

Sinh viên Phạm Thị Hoa

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐÈ 1

Chương 1, TỎNG QUAN 3

1.1 Tác dụng sinh học của indirubin và dẫn chất 3

1.2 Tổng họp indimbin và dẫn chất 5

1.2.1 Tổng hợp một số dẫn chất isatin 8

1.2.2 Tổng hợp một số dẫn chất indirubin 9

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 10 (NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 2.1 Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ 10

2.1.1 Nguyên vật liệu 10

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 10

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2 3 P h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u 1 1 2.3.1 Tổng họp hoá học và kiểm tra độ tinh khiết 11

2.3.2 Xác định cấu trúc 12

2.3.3 Thử tác dụng sinh học 12

Chương 3 THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 13 3.1.H oáhọ c 13

3.1.1 Tổng hợp hoá học 13

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 17

3.1.3 Xác định cấu trúc 19

3.2 Thử tác dụng sinh học 26

3.2.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 26

3.2.2 Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người 30

3.3 Bàn luận 33

3.3.1 Tổng họp hoá học và xác định cấu trúc 33

3.3.2 Tác dụng sinh học 35 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 1 Một số phương pháp tổng họp indirubin 7Bảng 2 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của indirubin và dẫn chất 17Bảng 3: Giá trị Rf với hệ dung môi khai triển n-hexan/aceton (2:1) và 18

t°nc của 6 chất I-VI

Bảng 5: số liệu phổ EI-MS của 6 chất tổng hợp được 22

Bảng 6: số liệu p h â n tích phổ *H-NMR 25

Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 29

Bảng 8 : Kết quả thử độc tính tế bào của các chất I, II, IV 32

DANH MỤC CÁC s ơ ĐÒ

Trang

Sơ đồ 1 : Tổng họp indirubin theo phương pháp Baeyer 5

Sơ đồ 2: Tổng hợp indirubin theo phương pháp Rusell và Kaupp 6

Sơ đồ 3; Tổng hợp dẫn chất 5-bromoisatin 8

Sơ đồ 4: Tổng họp một số dẫn chất khác của isatin 8

Sơ đồ 5: Tổng hợp một số dẫn chất của indirubin 9

Sơ đồ 6: Tổng họp các dẫn chất của i n d i r u b i n 13

Sơ đồ 6: Sơ đồ phân mảnh của chất II 23

^H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry(Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân)

Infrared spectrometry (Phổ hồng ngoại)Mass Spectrometry (Phổ khối lượng)Khối lượng phân tử

Tế bào ung thư vú đã di căn của ngườiDeoxypodophyllotoxin

(Chất chuẩn dương tính)Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

Vi sinh vật Sắc ký lóp mỏng

ĐẶT VẤN ĐỂ

Khi xã hội ngày càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người càng trở nên phức tạp và nhu cầu chăm sóc sức khoẻ cũng ngày càng tăng lên Nếu đơn thuần chỉ dựa vào những thuốc lâu đời có nguồn gốc từ dược liệu hay tổng họp vi sinh thì chưa đủ để đáp ứng được nhu cầu đó Ngày nay, việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới và đưa vào sử dụng trên lâm sàng là thành tựu của nhiều ngành khoa học như bào chế, hoá dược, vi sinh, dược lâm sàng trong đó tổng hợp hoá dược đóng vai trò rất quan trọng Được hình thành và phát triển trên cơ sở kĩ thuật tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hoá dược đã trở thành một ngành khoa học chuyên biệt chuyên nghiên cứu tìm ra các loại thuốc mới phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh cho con người Các thuốc

có nguồn gốc tổng hợp hoá dược đóng vai trò không thể thiếu trong cuộc sống

và chiếm một số lượng rất lớn

Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể ứng dụng trong điều trị, các nhà tổng hợp hoá dược thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng họp hoặc bán tổng họp tạo ra nhiều thuốc mới

Một số công trình nghiên cứu cho thấy indirubin và các dẫn chất có tác dụng sinh học rất đáng quan tâm như; kháng các dòng tế bào gây bệnh ung thư ở người, kháng nấm, kháng khuẩn

Với những mục tiêu trên, chúng tôi hy vọng khoá luận này sẽ góp phần vào việc nghiên cứu, tổng hợp các dẫn chất indirubin có hoạt tính sinh học có thể được ứng dụng trong lâm sàng.

Chương 1 TỎNG QUAN

1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA INDIRUBIN

Trong những năm gần đây, thế giới đang phải đối mặt với nhiều bệnh nan y do đó nhu cầu tìm ra các phương thuốc đặc trị càng trở nên bức thiết Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật đồng thời do yêu cầu thực tiễn, năm

1966, Viện huyết học thuộc Học viện khoa học y dược Trung Quốc nghiên cứu tác dụng chữa bệnh máu trắng của bài thuốc truyền thống Trung Quốc có tên Danggui Longhui Wan gồm 11 loài cây thuốc Nghiên cứu cho thấy, tác dụng chữa bệnh máu trắng được xác định là do sự có mặt của indirubin [8,13], Ngoài ra, indirubin cũng được biết đến trong việc điều trị các bệnh: Bệnh do virus, bệnh tiểu đường [8], các bệnh về thần kinh như Alzheimer's, parkinson Tuy nhiên indirubin rất ít tan trong nước, sinh khả dụng thấp vì vậy để tăng khả năng hấp thu, giảm tác dụng phụ và đặc biệt là tăng tác dụng sinh học, các nhà khoa học đã và đang tiếp tục nghiên cứu để tổng hợp ra các dẫn chất mới của indirubin (hình 1.1)

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của indirubin Tên khoa học: 2',3-Bis(2,3-dihydroindolyliden)-2,3'-dion

Sau đây chúng tôi xin trình bày một số tác dụng chính của indirubin Năm 1999, Hoessel và cộng sự phát hiện ra tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của indirubin, là do ức chế enzym CDK (cyclin- dependent kinase) [9,13] - enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình

phân chia của chu kỳ tế bào qua liên kết tạo phức với các cyclin [19] (Các cyclin là một họ các protein kiểm soát sự phát triển của tế bào trong chu kỳ tế bào) Ngoài ra các CDK còn điều khiển các quá trình sao mã.

Năm 1999, Leclerc và cộng sự khám phá ra tác dụng ức chế GSK-3 (glycogen synthase kinase 3) của dẫn xuất indirubin Đồng thời, khi nghiên cứu độc lập, Meijer và cộng sự cũng phát hiện hoạt tính này ở các dẫn xuất thế indirubin (GSK-3 là một loại protein kinase của serin/threonin phổ biến trong não, tham gia vào quá trình điều chỉnh lượng glycogen nhờ vai trò của insulin [5] và liên quan tới một số quá trình sinh học khác như quá trình phát triển của tế bào sống và của mô tế bào Các GSK giữ vai trò thiết yếu đối với enzym trong sự chuyển hoá glycogen và điều khiển nhiều hoạt động khác nhau của té bào

Năm 2001, Adachi và các cộng sự đã phát hiện ra hoạt tính AhR (aryl hydrocacbon receptor) ở indirubin AhR là một phối tử bHLB/PAS - tác nhân chứa nhân tố phiên mã, điều khiển các gen khác nhau [20] AhR có thể liên kết và hoạt hoá nhiều quá trình hoá học khác nhau AhR là đích để phát triển các phối tử trong hoá trị liệu và một vài dạng của tế bào ung thư như tế bào ung thư vú MCF-7

Năm 2005, Nam và các cộng sự phát hiện thấy các hoạt tính Src tyrosin kinase và Stat3 (signal transducer and activator of transctiption 3) [20] Protein Stat (signal transducer and activator of transctiption-tin hiệu chuyển đổi và hoạt hoá trong quá trình phiên mã) có vai trò quan trọng đối với sự phát triển của các tế bào khối u [20] Stat3-họp phần của họ stat, là nhân tố có vai trò quan trọng trong sự chuyển pha Gl-S của chu kỳ tế bào, thúc đẩy quá trình phân bào và phát triển của tế bào [21] Protein Stat3 có vai trò đặc biệt đối với sự phát sinh, phát triển bệnh ung thư, hoạt tính này sẽ trở thành một liệu pháp nhắm trúng đích khi điều trị bệnh ung thư Hiện nay, khoảng 30%

lượng thuốc trong công nghiệp dược phẩm nhằm tới đích là các protein kinase [4]

Năm 2006, theo Yoan Ferandin và các cộng sự, một số dẫn chất thế C-7 đặc biệt là các dẫn xuất thế halogen có hoạt tính ức chế enzym CDK và GSK-

3 cao hơn indirubin [12'

Năm 2006, MJ.Moon và cộng sự chứng minh một số dẫn chất thế C-5, C-7 của indirubin có độc tính đối với một số tế bào gây bệnh ung thư ở người như: ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư ruột thừa, ung thư máu, ung thư vú [19],

1.2 TỔNG HỢP INDIRUBIN VÀ DẪN CHẤT

Ngoài các phương pháp tách, phân lập trực tiếp từ các nguồn thực vật, indirubin có thể được tổng hợp toàn phần từ các dẫn xuất indoxyl và dẫn xuất isatin

Indimbin được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1881 bởi Baeyer từ

o H Isatin

Sơ đồ 1: Tổng hợp indirubin theo phương pháp Baeyer

Phương pháp tổng hợp indirubin đã được các nhà khoa học liên tục cải tiến để nâng cao hiệu suất

Năm 1910, Wahl và Bagard sử dụng 2-clo-3H-indol-3-on và oxidol trong dung môi pyridin Cũng bằng phương pháp này năm 1989, Katritzky và các cộng sự đã thay dung môi pyridin bằng toluen [14].

Đen năm 1913, chính Wahl và Bagard cải tiến phương pháp của mình bằng cách sử dụng 2-methoxy-3H-indol-3-on thay cho 2-clo-3H-indol-3-on với dung môi benzen, anhydrid acetic, H 2S O 4 [14]

Năm 1919, Vorländer và cộng sự đã thay indoxyl bằng indoxylacetat trong dung môi H2O2 30% Vào năm 1931, Spencer cải tiến phương pháp của Vorländer bằng cách thay H2O2 bằng FeCls [14]

Từ đó đến năm 1966, đã có rất nhiều cải tiến trong phương pháp tổng hợp indirubin Tuy nhiên phương pháp của Baeyer được Rusell và Kaupp cải tiến bằng cách thay indoxyl bằng indoxylacetat, thay dung môi C2H5OH bằng dung môi C H 3 O H [14] Phương pháp cải tiến này cho hiệu suất đối với các dẫn xuất thế của indirubin có thể đạt được từ 25-98% [12] Hiện nay phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi để tổng hợp indirubin và dẫn chất

C H ,O H

NazCOj

o

Sơ đồ 2: Tổng họp indirubin theo phương pháp Rusell và Kaupp

Isatin

2-clo-3H-indol-3-on

- Pyridin

- ToluenOxidol

- Wahl và Bagard, 1910

- Katrizky và các cộng sự, 1989

Benzen,PbOi

- Plieningr và Wild, 1966

- Bauer, 1967

2-ethoxyindol

Các phản ứng thế ái điện tử vào nhân benzen của isatin thường xảy ra ở

vị trí 5 hoặc 7, các phản ứng thường gặp như thế brom, nitro [6]

Tổng hợp dẫn chất 5-bromoisatin theo sơ đồ sau:

Ọ

Br9/H7 0,HC1

Sơ đồ 3: Tổng hợp dẫn chất 5-bromoisatin Các dẫn chất với các nhóm thể khác của isatin như: 5-cloro, 5-fluoro, 7- cloroi satin được tổng hợp từ các anilin tương ứng và cloralhydrat theo phương pháp Sandmeyer công bố năm 1919 [17]

1.2.2 Tổng hợp một số dẫn chất của indirubin

Phương pháp Rusell-Kaupp thường được áp dụng để điều chế các dẫn xuất thế trong vòng benzen Tuỳ thuộc vị trí các nhóm thế của dẫn xuất indoxylacetat và isatin có thể thu được các sản phẩm thế khác nhau nhưng chủ yếu được tạo ra ở các vị trí C-5, C-7 của indirubin, do ở các chất ban đầu có các vị trí C-5, C-7 dễ gắn các nhóm thế hơn do sự tập trung mật độ điện tích lớn tại đây

Chuwng 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯOÍNG PHÁP NGHIÊN

CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU)

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ

Các hoá chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại

dành cho tổng hợp tại bộ môn Hoá dược và được nhập từ công ty Merck hoặc

Sigma-Aldrich, được sử dụng trực tiếp không có tinh chế gì thêm Bao gồm:

b) Dung môi và các hóa chất khác:

phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), cột sắc ký

- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Nhiệt độ nóng chảy (t°„c) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-500 em'' tại phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của Viện hóa học Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-

500, dùng CDCI3 làm dung môi Độ chuyển dịch hóa học (ô) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN cứ u

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

- Sử dụng phương pháp Rusell-Kaupp để tổng hợp indirubin và 5 dẫnchất

Chương 3 THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ

VÀ BÀN LUẬN3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Sau khi tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp dẫn chất của indirubin dựa trên cơ sở phản ứng ngưng tụ giữa 3-indoxyl acetat với các dẫn chất isatin khác nhau Sơ đồ phản ứng chung tạo các chất từ I đến VI như sau:

Sơ đồ 6: Tổng họp các dẫn chất của indirubin.

- Tiến hành:

Hòa tan 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat txong lOml MeOH khan, thêm 0,44 Ig (3 mmol) isatin và 0,636g (6 mmol) Na2C0 s vào một bình cầu đáy tròn dung tích 50ml Khuấy hỗn họp trong vòng nửa giờ ở nhiệt độ phòng với điều kiện tránh ánh sáng

Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng SKLM với chất hấp phụ là silicagel, hệ dung môi khai triển là n-hexan/aceton (2:1), quan sát vết sản phẩm dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm

Sau khi phản ứng kết thúc, để lắng hỗn hợp trong 24h, lọc hút chân không bằng phễu lọc Buchner Rửa phần cắn thu được bằng MeOH (2 lần) và nước lạnh cho tới khi dịch lọc trung tính, thu được sản phẩm thô

Tinh chế lại sản phẩm bằng sắc ký cột với hệ dung môi khai triển n- hexan/aceton (2:1), cất quay thu hồi bớt dung môi, để kết tinh trong tủ lạnh, lọc, sấy ở 60°c, hút ẩm và làm khan bằng KOH thu được 0,7312g tủa

- Kết quả: sản phẩm indirubin là tinh thể hình kim, màu tím đậm.

MeOH

5-bromoisatin 3-indoxylacetat

Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất I, nhưng với các hóa chất

là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,678g (3 mmol) 5-bromoisatin thu

được 0,9519g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hĩnh ìdm, màu nâu tím

MS (70 eV, m/z): 342 (M^) ^HNMR (DMSO-dẻ): ỏ [ppm]: bảng 5 (trang 25).

3.1.1.3 Tổng hợp 5-cloroindirubin (III)

o +

OCOCH3

\ NasCOạMeOH

5-cloroisatin 3-inđoxylacetat 5-cloroindirubin

Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất /, nhưng với các hóa chất

là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,543g (3 mmol) 5-cloroisatin thu được

0,7994g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hình Um, màu nâu tím T^nc > 260°c Hiệu suất phản ứng: 90% IR (KBr, cm'^): bảng 4 (ừang 20); EI-MS (70

Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất I, nhưng với các hóa chất

là 0,525g (3 mmol) 3-inđoxyl acetat và 0,543g (3 mmol) 7-cloroisatin thu được

0,7906g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tỉnh thể hĩnh kim, màu nâu tím T^nc >

260°c Hiệu suất phản ứng: 89% IR (KBr, CỈIĨ^): bảng 4 (tong 20); EI-MS (70

eV, m/z): 296 (M^); ^HNMR (DMSO-dg): ỏ [ppm]: bảng 6(trang 25).

5-floroisatin 3-indoxylacetat

Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất 7, nhưng với các hóa chất

là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,495g (3 mmol) 5-fluoroisatin thu

được 0,7814g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hình kim, màu nâu tỉm

MS (70 eV, m/z): 280 (M^) ‘HNMR (DMSO-dỹ): ô [ppm]\ bảng 6 (trang 25).

Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất I, nhưng với các hóa chất

là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,53Ig (3 mmol) 5-methoxyisatin thu

được 0,7974g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hình kim, màu nâu đậm

MS (70 eV, mJz): 292 (M^); 'HNMR (DMSO-dö): ỏ [ppm]\ bảng 6 (trang 25).

Như vậy, trong thời gian cho phép chúng tôi đã tổng hợp được 6 chất Công thức cấu tạo (CTCT), hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của các chất tổng hợp được được tóm tắt trong bảng 2

Bảng 2 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của indirubin và dẫn chất

VI 5-OCH3 C17HUN2O3 292,08 Nâu đậm 91

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết các chất tổng họp được bằng SKLM

và đo nhiệt độ nóng chảy (t°nc) của các chất

- SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-

230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Dung môi hòa

tan: dimethylformamid Dung môi triển khai: 6 chất đều được khảo sát với 3

hệ dung môi triển khai: n-hexan:aceton (2:1); n-hexan:aceton (3:1) và DCMiMeOH (15:1) Kết quả thu được trên các sắc ký đồ đối với từng hệ dung môi khai triển đều thấy một vết rõ, gọn khi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại

- Đo nhiệt độ nóng chảy: 6 chất (I-VĨ) sau khi được tinh chế bằng sắc

ký cột và kết tinh đều có dạng tinh thể rắn được đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

Nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf của các chất với hệ dung môi triển khai

n-hexan/aceton (2:1) được tóm tắt trong bảng 3

Bảng 3: Giá trị Rf với hệ dung môi khai triển n-hexan/aceton (2:1) và t®nc

Nhận xét: Với hệ dung môi triển khai n-hexan:aceton (2:1), các chất đã

tổng hợp được đều cho một vết gọn rõ và có giá trị hệ số dịch chuyển Rf nằm

trong khoảng từ 0,45 đến 0,59 Nhiệt độ nóng chảy của các chất đều rõ ràng

và có khoảng dao động hẹp từ l-3°c Như vậy, có thể kết luận các chất mà

chúng tôi tổng hợp được là tinh khiết

3.1.3 Xác định cấu trúc

Để xác định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được, chúng tôi đã tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (’H-NMR) của 6 chất (I-VI)

3.1.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)

Tại phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội, các chất (I-VI) đã được ghi phổ hồng ngoại (IR) trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr ghi trong vùng 4000-500 em'* Các phổ đồ được trình bày ở phụ lục la-6a

Thông qua việc phân tích phổ đồ của các chất tổng hợp, chúng tôi nhận biết được các dải hấp thụ đặc trưng của dao động hóa trị (v), dao động biến dạng (ô) của các nhóm chức và các liên kết điển hình có trong cấu trúc phân

tử của tìrng chất Từ đó xác định được bộ khung của phân tử, nhóm chức, vị trí của nhóm thế trên nhân thơm, số liệu phân tích phổ hồng ngoại của 6 chất được trình bày trong bảng 4 (trang 20)

Nhận xét: Qua bảng 4 (trang 20) chúng tôi nhận thấy số liệu phân tích phổ IR hoàn toàn phù họp với các tài liệu tham khảo cũng như cấu trúc dự kiến của 6 chất I-VI:

- Các chất từ I-VI đều có dải hấp thụ phân tử nằm trong vùng 1669-

1660 cm ’ là vùng tương đối đặc trưng cho liên kết c = 0 có trong phân tử

- Cả 6 chất đều có dải hấp thụ trong vùng 1625-1523 em'* đặc trưng cho liên kết đôi -C=C- trong vòng thơm

- Ngoài ra, trên phổ hồng ngoại của các chất này còn xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức và các vị trí nhóm thế khác nhau ở gốc l//-indolyl như: nhóm chức ether (C-O-C), nhóm thế halogen (Br, Cl, F) ở các vị trí khác nhau

Như vậy, tất cả các đặc điểm trên cho thấy cấu trúc của các chất tổng hợp được là phù hợp với cấu trúc dự kiến Đặc trưng nhất là pic của liên kết -C=C- trong bộ khung của họp chất thơm, tiếp theo đó là các pic đặc trưng cho nhóm thế ở gốc l//-indolyl

3.I.3.2 Phổ khối lượng (MS)

Sáu chất đã được tổng hợp có cùng bộ khung phân tử, không có nhiều pic IR đặc trưng Vì vậy, để khẳng định cấu trúc của các chất chúng tôi đã tiến hành đo phổ khối lượng của cả 6 chất bằng phương pháp EI (Electron Impact)-MS Phương pháp này dùng chùm điện tử có năng lưọng trung bình (70 eV) bắn phá phân tử tạo ra cation gốc Cation gốc bị bắn phá tiếp tạo thành các mảnh cation, vì vậy trên phổ ngoài pic phân tử (m/z = M^') còn có mảnh vỡ có m/z khác nhau

Các phổ MS được trình bày ở phụ lục lb-6b và kết quả phân tích phổ được tóm tắt trong bảng 5 (trang 22)

VI R = 5-OCH3

(M = 292)

292 ([M"D, 277 ([C,6H.oN202-Q-]), 263 ([Ci6HioN202]+l), 249 ([C,2Hi2N20]+l), 234 ([Ci6H,2N2]+2), 221 ([Ci6H,5N]), 163 ([C9H7N02-]-2), 132 ([CgHsNOl+l), 77 ([CeHj-])

Nhận xét: Thông qua số liệu phổ EI-MS ở bảng 5 chúng tôi thấy rằng

cả 6 chất đều có pic phân tử có số khối đúng bằng số khối dự kiến Phân tích phổ đồ (từ phụ lục lb-6b) cho phép ta nhận biết các pic phân mảnh phù họp với sơ đồ phân mảnh của các chất Dưới đây là minh họa sơ đồ phân mảnh của 2 chất (II, VI) đại diện cho 6 chất

Sơ đồ 6: Sơ đồ phân mảnh của chất II

+

+

Sơ đồ 7: Sơ đồ phân mảnh của chất VI

3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^H-NMR

Để khẳng định chắc chắn cấu trúc của chất đã được tổng họp, chúng tôi tiến hành ghi phổ 'H-NMR của cả 3 chất đại diện tại phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dùng DMSO làm dung môi, lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) Kết quả phổ ’H-NMR được trình bày trong bảng 6 (trang 25) và phụ lục lc-3c-6c