Nghiên cứu xây dựng công thức in situ gel diclonenac nhỏ mắt

1 ĐẶT VẤN ĐỀSinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt quy ước thường rất thấp (chỉ khoảng từ 13%), do cơ chế bảo vệ của hệ thống nước mắt và cấu tạo phức tạp của mắt, dẫn đếnhiệu quả điều trị không được như mong muốn. Nhiều hệ đưa thuốc đã được nghiêncứu để cải thiện vấn đề này như: thuốc mỡ, gel, hỗn dịch, màng nhãn khoa, hệnano…Trong đó có dạng “gel có thể nhỏ giọt”, gọi là “in situ gel”, với ưu điểm dễdàng nhỏ giọt khi sử dụng và chuyển thành gel nhớt trước giác mạc, tăng sinh khảdụng thông qua kéo dài thời gian lưu thuốc ở mắt. Đồng thời nó không gây khó chịucho người sử dụng như thuốc mỡ, màng nhãn khoa; có độ ổn định vật lý cao hơn vàđồng đều phân liều hơn hỗn dịch; phương pháp bào chế đơn giản hơn so với hệnano.Natri diclofenac thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau không steroid(NSAIDs), sử dụng cho mắt có tác dụng ngăn chặn co đồng tử xảy ra trong quátrình phẫu thuật lấy thủy tinh thể, giảm viêm và đau mắt trong tổn thương biểu môgiác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác. Hiện nay trên thị trường mới chỉ códạng dung dịch nhỏ mắt 0,1% (biệt dược Voltaren Ophtha), thuốc có thời gian tácdụng ngắn, người bệnh phải dùng ít nhất 45 lần một ngày.Xuất phát từ nhu cầu thực tế và góp phần khắc phục những hạn chế của cácdạng thuốc nhỏ mắt thông thường chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xâydựng công thức in situ gel diclofenac nhỏ mắt” với mục tiêu:1. Nghiên cứu, bào chế được dung dịch nhỏ mắt in situ gel chứa natri diclofenac.2. Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến các chỉ tiêuchất lượng của dung dịch in situ gel.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC IN SITU GEL DICLOFENAC NHỎ MẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC IN SITU GEL DICLOFENAC NHỎ MẮT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi tới:

DS Vũ Ngọc Mai

DS Đỗ Thị Kim Oanh

là những người đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Vũ Thị Thu Giang Các cô đã dành

nhiều thời gian và tâm huyết tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Bào chế, bộ môn Vật lý- Hóa lý đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thanh Hà

MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ………1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Thông tin về dược chất natri diclofenac 2

1.1.1 Công thức cấu tạo 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3 Thông tin về độ ổn định của natri diclofenac 3

1.1.4 Thông tin về tính thấm của natri diclofenac 3

1.1.5 Thuốc nhỏ mắt chứa natri diclofenac 4

1.2 Thuốc nhỏ mắt 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt 5

1.3 Dung dịch in situ gel 6

1.3.1 Khái niệm 6

1.3.2 Phân loại 6

1.3.3 Các hệ tạo gel in situ và một số nghiên cứu về dung dịch in situ gel dùng cho nhãn khoa 7

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Thiết bị 15

2.1.3 Động vật thí nghiệm 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt in situ gel 16

2.3.2 Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel 17

2.3.3 Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch nhỏ mắt in situ gel 17

2.3.4 Phương pháp thử kết dính sinh học 19

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro 21

2.3.6 Phương pháp định lượng 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

1.1 Xây dựng đường chuẩn 25

1.2 Xác định công thức bào chế cơ bản 26

1.2.1 Lựa chọn thành phần 26

1.2.2 Khảo sát tỉ lệ các thành phần 27

1.3 Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel 32

1.3.1 Hình thức 32

1.3.2 pH 32

1.4 Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch in situ gel 33

1.4.1 Nhiệt độ tạo gel 33

1.4.2 Khả năng tạo gel 33

1.4.3 Độ nhớt 35

1.4.4 Khả năng chảy lỏng 36

1.5 Đánh giá khả năng kết dính sinh học của dung dịch in situ gel 37

1.6 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

Phụ lục

Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PF127 Poloxamer P407

PF68 Poloxamer P188

NaDC Natri diclofenac

DIG Dung dịch in situ gel

Fa-x:y:z Công thức Fa với tỷ lệ PF127, PF68, Carbopol lần lượt là x,y,z% Fa-x:y Công thức Fa với tỷ lệ PF127, PF68 lần lượt là x,y%

Fa-z Công thức Fa với tỷ lệ Carbopol là z%

HPMC Hydroxypropylmethyl cellulose

HPC Hydroxypropyl cellulose

PVA Polyvinyl alcol

NaCMC Natri carboxymethyl cellulose

MC Methyl cellulose

STF Dung dịch nước mắt nhân tạo (Simulated Tear Fluid)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang

1.2 Phân loại các hệ tạo gel in situ 6

2.3 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 15 3.4 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ NaDC 25

3.5 Thành phần công thức lựa chọn tỷ lệ PF127: PF68 28

3.6 Nhiệt độ tạo gel, khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của

các công thức khảo sát tỷ lệ poloxamer 29 3.7 Thành phần công thức nghiên cứu 31 3.8 pH của các DIG khảo sát ở 25± 1oC 32

3.9 Kết quả đánh giá một số đặc tính tạo gel của DIG 34

3.12 Kết quả tỷ lệ dược chất giải phóng từ DIG trong 6 giờ 39

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang

1.2 Sơ đồ minh họa sự hình thành gel của PF127 khi tăng nhiệt

1.3 Cơ chế tạo gel của hệ nhạy cảm với pH 10

2.5 Mô hình thiết bị đo lực kết dính sinh học 19

2.6 Thiết bị thử kết dính sinh học tự chế tạo 20

3.7 Đồ thị biểu diễn dự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ

3.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của PF127 và PF68 tới nhiệt độ

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt quy ước thường rất thấp (chỉ khoảng từ 3%), do cơ chế bảo vệ của hệ thống nước mắt và cấu tạo phức tạp của mắt, dẫn đến hiệu quả điều trị không được như mong muốn Nhiều hệ đưa thuốc đã được nghiên cứu để cải thiện vấn đề này như: thuốc mỡ, gel, hỗn dịch, màng nhãn khoa, hệ

1-nano…Trong đó có dạng “gel có thể nhỏ giọt”, gọi là “in situ gel”, với ưu điểm dễ

dàng nhỏ giọt khi sử dụng và chuyển thành gel nhớt trước giác mạc, tăng sinh khả dụng thông qua kéo dài thời gian lưu thuốc ở mắt Đồng thời nó không gây khó chịu cho người sử dụng như thuốc mỡ, màng nhãn khoa; có độ ổn định vật lý cao hơn và đồng đều phân liều hơn hỗn dịch; phương pháp bào chế đơn giản hơn so với hệ nano

Natri diclofenac thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau không steroid (NSAIDs), sử dụng cho mắt có tác dụng ngăn chặn co đồng tử xảy ra trong quá trình phẫu thuật lấy thủy tinh thể, giảm viêm và đau mắt trong tổn thương biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác Hiện nay trên thị trường mới chỉ có dạng dung dịch nhỏ mắt 0,1% (biệt dược Voltaren Ophtha), thuốc có thời gian tác dụng ngắn, người bệnh phải dùng ít nhất 4-5 lần một ngày

Xuất phát từ nhu cầu thực tế và góp phần khắc phục những hạn chế của các

dạng thuốc nhỏ mắt thông thường chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây

dựng công thức in situ gel diclofenac nhỏ mắt” với mục tiêu:

1 Nghiên cứu, bào chế được dung dịch nhỏ mắt in situ gel chứa natri diclofenac

2 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến các chỉ tiêu

chất lượng của dung dịch in situ gel

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Thông tin về dược chất natri diclofenac

1.1.1 Công thức cấu tạo

Tên khoa học: Natri

2-[(2,6-diclorophenyl)amino]benzen acetat

Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2

Khối lượng phân tử: 318,14 [4]

1.1.2 Đặc tính lý hóa

Tính chất vật lý

- Cảm quan: tinh thể hay bột kết tinh trắng hay hơi vàng, dễ hút ẩm [4]

- Độ tan: dễ tan trong methanol, tan trong ethanol 96o, hơi tan trong nước và trong acid acetic băng, khó tan trong aceton, thực tế không tan trong ete [4] Độ tan của NaDC trong nước thay đổi theo nhiệt độ, dung môi và pH môi trường hòa tan [5], [19] Độ tan trong nước của NaDC thay đổi theo pH môi trường, được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Độ tan của NaDC trong nước

- Hệ số phân bố n-octanol/đệm phosphat pH 7,2: 13,4 [3]

- Dung dịch NaDC trong methanol và dung dịch đệm phosphat pH 7,2 có hấp

phụ tử ngoại cực đại ở bước sóng lần lượt là 283 nm và 276 nm [24]

3

Tính chất hóa học:

NaDC là dẫn chất của anilin, chứa nhóm amin bậc 2 nên dễ bị oxy hóa [3]

1.1.3 Thông tin về độ ổn định của natri diclofenac

Natri diclofenac có nhóm chức amin dễ bị oxy hoá, có nhóm phenyl acetat dễ

bị thuỷ phân đặc biệt dưới tác động của lực cơ học, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng Tuy nhiên nếu tồn tại ở dạng rắn thì tương đối ổn định Nóng chảy ở 280ºC, kèm theo sự phân huỷ [3]

Ahuja và các cộng sự đã đánh giá độ ổn định của các dung dịch nhỏ mắt trong nước của NaDC Các công thức bào chế được bảo quản ở trong lọ thủy tinh màu và khô, tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 15 ppm trong 20 phút Kết quả cho thấy, sau bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 12 tháng hoặc lão hóa cấp tốc trong 6 tháng, dung dịch NaDC 0,1% trong nước ở pH 7,4 hàm lượng NaDC còn lại đạt trên 90%; dung dịch NaDC trong nước ở pH thấp có vẩn đục [9]

Sankar và cộng sự đã nghiên cứu độ ổn định của NaDC trong gel nhỏ mắt chứa NaDC, HPMC, NaCMC và MC, propylen glycol, benzalkonium clorid và đệm phosphat pH 7,2 Gel được khử trùng bằng nồi hấp ở 15 ppm, 121oC trong 20 phút; bảo quản ở điều kiện nhiệt độ khác nhau 25 -28oC Kết quả cho thấy sau 6 tuần hàm lượng NaDC còn lại đạt 95% [38]

1.1.4 Thông tin về tính thấm của natri diclofenac

Ahuja và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức đến tính thấm của dung dịch nhỏ mắt NaDC trên giác mạc Kết quả cho thấy: khi tăng pH từ 6,0 đến 8,0 khả năng thấm của NaDC giảm, khi nồng độ dược chất giảm

từ 0,10 xuống 0,05% ảnh hưởng đến tính thấm không rõ ràng, khi nồng độ dược chất tăng từ 0,10 đến 0,15% tốc độ thấm giảm Các chất bảo quản cũng ảnh hưởng đến mức độ thấm của NaDC: natri metabisulfit, dinatri edetat, methyl và propyl paraben có tác dụng làm tăng đáng kể tính thấm của NaDC, acid sorbic làm giảm trong khi benzalkonium clorid không ảnh hưởng đến tính thấm của NaDC Các chất làm tăng độ nhớt cũng ảnh hưởng đến khả năng thấm của NaDC theo thứ tự sau: HPMC > MC > PVA > HPC trọng lượng phân tử thấp [8]

4

1.1.5 Thuốc nhỏ mắt chứa natri diclofenac

Trên thị trường, thuốc nhỏ mắt chứa natri diclofenac mới chỉ có dạng dung dịch 0,1% Trong đó, biệt dược Voltaren Ophtha (Novartis – Thụy Sĩ) đã báo cáo về các đặc điểm dược lực học, dược động học và liều dùng như sau [6]:

1.1.5.1 Đặc điểm dược lực học

Diclofenac thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau không steroid (NSAIDs),

có tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin rõ rệt, tác dụng giảm đau chống viêm mạnh

Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh diclofenac có khả năng ngăn chặn co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy thủy tinh thể đục, có tác dụng làm giảm viêm và đau mắt trong tổn thương biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác

Và không thấy dấu hiệu cho thấy diclofenac có tác dụng phụ ngăn cản quá trình lành vết thương

1.1.5.2 Đặc điểm dược động học

Thử nghiệm trên thỏ (đánh dấu bằng 14C) cho thấy diclofenac đạt nồng độ tối

đa trong giác mạc và kết mạc vào thời điểm 30 phút sau khi nhỏ Thuốc được thải trừ nhanh và hoàn toàn ra khỏi cơ thể sau 6 giờ

Ở người, khả năng diclofenac ngấm vào tiền phòng đã được xác nhận và không phát hiện thấy diclofenac trong huyết tương

1.1.5.3 Liều dùng

 Người lớn và người già:

Phẫu thuật về mắt và biến chứng: trước phẫu thuật 3 giờ nhỏ 5 lần, 1 giọt/lần;

sau phẫu thuật: ngay sau phẫu thuật nhỏ 1 giọt, lặp lại 3 lần trong ngày phẫu thuật, các ngày sau nhỏ 3-5 lần cho đến khi đạt hiệu quả

Điều trị giảm đau và khó chịu; viêm sau chấn thương: cứ 4-6 giờ nhỏ 1

giọt/lần

Đau do phẫu thuật: 1-2 giọt/1 giờ trước phẫu thuật, 1-2 giọt/15 phút sau phẫu

thuật, trong 3 ngày sau: cứ 4-6 giờ nhỏ 1 giọt/lần cho tới khi đạt hiệu quả

 Trẻ em: chưa có nghiên cứu được công bố

1.2.2 Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt.

1.2.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt

Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thường rất thấp (chỉ từ 1-3%) Nguyên nhân

do bên cạnh các yếu tố thông thường ảnh hưởng đến sinh khả dụng như: đặc tính lý hóa của dược chất, pH của chế phẩm, mức độ đẳng trương với dịch nước mắt,…, thì cấu tạo sinh lý đặc biệt gồm các lớp thân dầu và thân nước đan xen và cơ chế bảo vệ của hệ thống nước mắt là yếu tố quan trọng làm giảm sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt [16], [35]

1.2.2.2 Các biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt

Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt quy ước [1], [2]:

- Kéo dài thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: thêm chất kết dính sinh học, chất làm tăng độ nhớt, bào chế thuốc dưới dạng hỗn dịch, dạng gel, thuốc mỡ,

- Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: chất diện hoạt (Tween 80, Cremophor), tạo ra các tiền thuốc, tạo phức chelat với ion calci (natri edetat)

- Hiện nay dạng dung dịch nhỏ mắt in situ gel với đặc điểm là tồn tại ở dạng

dung dịch ở điều kiện bảo quản và chuyển sang dạng gel trong điều kiện sinh lý ở mắt, đang được nghiên cứu nhiều với kỳ vọng tăng sinh khả dụng của dung dịch thuốc nhỏ mắt quy ước và khắc phục được một số nhược điểm của những dạng bào chế khác dành cho nhãn khoa [7], [12] :

DIG tạo gel nhớt trước giác mạc, hạn chế rửa trôi dược chất, kéo dài thời gian lưu thuốc ở mắt, tăng sinh khả dụng và hiệu lực điều trị, đồng thời giảm số lần

sử dụng cho người bệnh so với dung dịch nhỏ mắt quy ước

6

DIG là dung dịch dược chất, đảm bảo đồng đều phân liều hơn và hạn chế nhược điểm kém ổn định vật lý của hỗn dịch

DIG không làm mờ, giảm tầm nhìn và khó chịu như thuốc mỡ

DIG sử dụng nhỏ giọt như thuốc nhỏ mắt thông thường không gây khó khăn khi dùng như màng đặt nhãn khoa, khắc phục được nhược điểm giải phóng dược chất không hằng định của hệ màng đặt theo cơ chế mài mòn

DIG có phương pháp bào chế đơn giản, ổn định hơn các dạng bào chế mới như nhũ tương nano, hỗn dịch nano, liposom,…

1.3 Dung dịch in situ gel

1.3.1 Khái niệm

Dung dịch in situ gel là dung dịch cao phân tử của các polyme, có đặc tính

chuyển thể sol-gel một cách thuận nghịch [2] Sự tạo gel có thể được kích hoạt bởi các tác nhân như nhiệt độ, ion, pH, tác động của dung môi hay của tia UV [10], [11]

Dung dịch nhỏ mắt in situ gel có thể nhỏ giọt vào mắt như dung dịch và

chuyển sang dạng gel nhớt đàn hồi dưới tác động của các điều kiện sinh lý ở mắt như: thay đổi nhiệt độ, pH và thay đổi thành phần điện giải [10], [11], [12]

1.3.2 Phân loại

Cơ chế tạo gel của dung dịch in situ gel được quyết định bởi loại polyme được

sử dụng, mỗi loại polyme tạo gel dưới tác động của các yếu tố nhất định, được chia thành 3 nhóm như trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Phân loại các hệ tạo gel in situ [34]

STT Tác nhân kích thích Polyme tạo gel

1 Nhiệt độ Chitosan, Pluronics, tetronics, xyloglucans,

hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC)

2 pH

Chitosan, cellulose acetate phtalat (CAP), Carbopol, polymethacrilic acid (PMMA),

polyethylen glycol (PEG),

3 Tương tác ion Gelrite, gellan, acid hyaluronic, alginat

Hệ in situ gel nhạy cảm với nhiệt độ bị kích hoạt bởi sự thay đổi nhiệt độ môi

trường và là hệ được nghiên cứu nhiều nhất [36] Sự chuyển thể sol - gel xảy ra chủ yếu do khả năng hòa tan khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau của các polyme tạo gel Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bắt đầu xảy ra sự chuyển thể sol-gel (LCST), liên kết hydro giữa các nhóm ưu nước ở trên bề mặt polyme và phân tử nước làm tăng

sự hòa tan của các chuỗi polyme và hệ tồn tại ở dạng dung dịch Khi nhiệt độ cao hơn LCST, các liên kết hydro bị phá vỡ, tương tác polyme - polyme và nước - nước chiếm ưu thế hơn, do các đại phân tử hòa tan bị khử nước đột ngột và chuyển sang cấu trúc kỵ nước hơn, dung dịch chuyển thành dạng gel [20], [32]

* Một số polyme thường dùng

POLOXAMER

Poloxamer (tên thương mại: Pluronics) là những chất hoạt động bề mặt không ion hóa tan được trong nước có cấu trúc gồm một chuỗi poly (propylen oxide) kỵ nước ở giữa và bao quanh bởi hai chuỗi poly (ethylen oxide) ưa nước (PEO-PPO-PEO)

Hình 1.1: Cấu trúc của poloxamer [34]

Chúng có thể ở các dạng lỏng, nhão hay rắn tương ứng với khối lượng phân tử

và tỷ lệ EO:PO lần lượt từ 1100-1400 và từ 1:9-8:2 [34], [37] Trong đó, poloxamer P407 hay được sử dụng nhất trong công nghiệp bào chế Nó tạo được gel trong suốt

Hình 1.2 Sơ đồ minh họa sự hình thành gel của PF127 khi tăng nhiệt độ [18]

Nghiên cứu về DIG sử dụng poloxamer:

Rathapon Asasutjari và cộng sự đã nghiên cứu công thức dung dịch nhỏ mắt in

situ gel natri diclofenac sử dụng tá dược tạo gel là poloxamer P407, P188 và

Carbopol 940 làm tăng độ nhớt Nghiên cứu chỉ ra rằng công thức có nồng độ 3 polyme lần lượt là 20:11:0,1% có nhiệt đô tạo gel 32,6 ± 1,1oC và thử nghiệm in

vivo trên thỏ thu được kết quả: nồng độ NaDC tối đa trong thủy dịch (Cmax) khi nhỏ DIG cao hơn 2,2 lần khi nhỏ dung dịch nhỏ mắt Dung dịch nhỏ mắt sau 6 giờ

không xác định được nồng độ của NaDC trong thủy dịch, in situ gel duy trì nồng độ

NaDC trong thủy dịch ít nhất 12 giờ [10]

Yong qian và các cộng sự đã phát triển công thức dung dịch nhỏ mắt in situ

gel của methazolamid, sử dụng kết hợp 2 poloxamer PF127 và PF68 Chọn ra được công thức tối ưu chứa 21% PF127 và 10% PF68, tỷ lệ dược chất giải phóng sau 1

9

giờ là 44,90%, sau 6 giờ là 86,63% So sánh tác dụng làm giảm áp lực nội nhãn với AZOPT® (hỗn dịch nhỏ mắt brinzolamid 1%) cho thấy, trong 1,5 giờ đầu tiên, tác dụng của AZOPT® tốt hơn so với công thức nghiên cứu, sau đó, tác dụng của công thức nghiên cứu lại tốt hơn và kéo dài đến 12 giờ sau khi nhỏ thuốc, trong khi tác dụng của AZOPT® chỉ trong hơn 8 giờ [31]

Dẫn chất của cellulose: MC và HPMC

Cellulose là một polysaccarid không tan trong nước Một số dẫn chất như MC

và HPMC tạo ra bằng cách alkyl hóa cellulose có đặc tính tạo gel in situ ở nồng độ

thấp (1-10%) Dung dịch MC chuyển thành dạng gel đục trong khoảng từ 40-50oC, HPMC trong khoảng từ 75-90oC Nhiệt độ chuyển pha này có thể thấp hơn nhờ những thay đổi về vật lý hay hóa học Ví dụ, NaCl làm giảm nhiệt độ tạo gel của dung dịch MC xuống từ 32-34oC Tương tự, khi giảm số nhóm thế hydroxy propyl của HPMC, nhiệt độ tạo gel của nó giảm còn khoảng 40oC [26]

Nghiên cứu về DIG sử dụng MC:

Bhowmik M và các cộng sự đã nghiên cứu sự tạo gel và giải phóng thuốc in

vitro của DIG ketorolac tromethamin nhạy cảm nhiệt chứa MC Kết quả chỉ ra rằng

dung dịch in situ gel 1% MC và 5-7% NaCl có nhiệt độ tạo gel dưới 37oC và tỷ lệ giải phóng thuốc trên 5 giờ đạt 100% [11]

XYLOGLUCAN

Xyloglucan là một polyme tự nhiên có nguồn gốc từ hạt me Nó có cấu trúc gồm một chuỗi β-(1-4)-glucose với nhánh α -(1-6)-xylose được thay thế một phần bằng β -(1-2)-galactoxylose Xyloglucan ít khi thể hiện đặc tính chuyển pha Khi ít

nhất 35% galactose bị thủy phân bởi β-galactosidase thì đặc tính tạo gel in situ mới

xuất hiện Nhiệt độ chuyển thể sol-gel của xyloglucan giảm từ 40oC xuống 5oC tương ứng với tỷ lệ galactose bị thủy phân tăng từ 35-58% [7]

Nghiên cứu về DIG sử dụng xyloglucan:

Burgalassi S và các cộng sự đã đánh giá nồng độ timolol trong nước mắt, giác

mạc, cơ mống mi mắt, thủy dịch, huyết tương và tác dụng làm giảm áp lực nội nhãn của công thức chứa 2% xyloglucan So sánh dược động học với thuốc nhỏ mắt chứa

10

timolol Droptimol® và Timoptic® XE (DIG sử dụng gellan làm tác nhân tạo gel) Thấy rằng công thức sử dụng xyloglucan có kết quả tốt hơn so với Droptimol® (diện tích dưới đường cong AUC gấp 1,8 lần và nồng độ thuốc cao nhất trong thủy dịch

Cmax gấp 1,61 lần) và tương đương với Timoptic® XE [13]

Miyazaki và các cộng sự đã nghiên cứu công thức dung dịch nhỏ mắt in situ

gel của pilocarpin hydrochlorid sử dụng tá dược tạo gel xyloglucan Kết quả cho thấy công thức chứa 2% xyloglucan duy trì gel ở mắt trong hơn 6 giờ khi nhỏ vào mắt thỏ [25]

1.3.3.2 Hệ tạo gel do thay đổi pH

* Cơ chế

Các polyme nhạy cảm với pH chuyển từ dạng dung dịch sang dạng gel do pH làm thay đổi mức độ ion hóa và độ tan trong nước của chúng Tất cả các polyme nhạy cảm với pH đều có các nhóm ion (acid hay base) có thể cho hoặc nhận điện tử khi pH môi trường thay đổi Khi pH môi trường tăng, sự trương nở của các polyme tăng lên nếu trong phân tử polyme có các nhóm có tính acid yếu, và giảm đi khi có các nhóm có tính base yếu [33]

Hình 1.3: Cơ chế tạo gel của hệ nhạy cảm với pH [34]

* Một số polyme thường dùng

CHITOSAN

Chitosan là một polyme cation, có bản chất là polysaccarid, sản phẩm của phản ứng deacetyl hoá một phần chitin Chitosan có độc tính thấp, tương tác sinh học tốt và có khả năng phân hủy sinh học Chitosan ít tan trong nước, ethanol 95%

11

và dung môi hữu cơ khác, tan nhanh trong các dung dịch acid (acid acetic) Vì các nhóm amin của polyme bị proton hoá tạo dạng muối RNH3+ tan trong nước Độ tan của chitosan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hoá và chịu ảnh hưởng lớn của việc thêm các chất điện ly vào dung dịch Ở pH nhỏ hơn 6,2 chitosan tồn tại trong nước dưới dạng dung dịch Ở pH lớn hơn 6,2 xảy ra sự trung hòa làm chitosan chuyển thành dạng gel ngậm nước giống như tủa [28]

Nghiên cứu về DIG sử dụng chitosan:

Varshosaz và các cộng sự đã nghiên cứu DIG ciprofloxacin sử dụng các chitosan có phân tử lượng khác nhau kết hợp với poloxamer Nghiên cứu đã chỉ ra rằng với cùng nồng độ PF127 15%, khi tăng nồng độ chitosan từ 0,1-0,3% hoặc

khối lượng phân tử chitosan tăng từ thấp đến cao, tỷ lệ dược chất giải phóng in vitro

giảm DIG chứa 15% PF127 và 0,1% chitosan phân tử lượng thấp có đường kính

vùng ức chế Pseudomonas aueroginosa (48 mm) và Staphylococcus aureus (48

mm) lớn hơn so với dung dịch nhỏ mắt ciprofloxacin quy ước (32 và 31 mm) [40]

CARBOPOL

Carbopol là một poly(acid acrylic) phân tử lượng lớn được sử dụng rộng rãi trong nhãn khoa để tăng thời gian lưu của thuốc trước giác mạc Carbopol 934 là một polyme tổng hợp gồm 62% nhóm carboxyl, với khối lượng phân tử lớn được tạo bởi các đơn vị lặp lại acid acrylic liên kết với allyl sucrose hoặc allyl ether của pentaerythritol Carbopol là một polyme có độ nhớt phụ thuộc vào pH, nó ở dạng dung dịch trong môi trường acid nhưng tạo gel nhớt trong môi trường pH kiềm Carbopol tương đối bền, không bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi của nhiệt độ, chất oxy hoá, có thể kháng lại sự phát triển của vi khuẩn Ở nồng độ gel 0,5%, Carbopol 934P có độ nhớt 29400 cP – 39400 cP [28]

Nghiên cứu về DIG sử dụng Carbopol:

Wu C, Qi H, Chen W nghiên cứu bào chế DIG puerarin sử dụng polyme tạo gel là Carbopol 980 và HPMC với nồng độ 0,1 và 0,4%, tạo gel ở điều kiện sinh lý, làm tăng độ nhớt, giải phóng dược chất trong 8 giờ, thời gian thuốc đạt nồng độ tối

12

đa trong thủy dịch Tmax gấp 1,76 lần và diện tích dưới đường cong AUC0-8 giờ gấp 2,17 lần so với dạng dung dịch quy ước [41]

Malik và cộng sự đã nghiên cứu bào chế DIG gatifloxacin chứa Carbopol 940

và HPMC làm tác nhân tạo gel nhạy cảm pH DIG được tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở

121oC, 15psi trong 15 phút Kết quả thử độ vô khuẩn trong môi trường thioglycolat

và thạch casein đậu tương cho thấy sau 7 ngày DIG không bị nhiễm vi sinh vật Các

DIG có khả năng duy trì giải phóng dược chất in vitro, sau 8 giờ có trên 84%

gatifloxacin được giải phóng [23]

1.3.3.3 Hệ tạo gel do ion hóa

* Cơ chế

Hệ tạo gel do ion hóa bị kích hoạt bởi sự có mặt của các ion có trong dịch nước mắt như Na+, Ca2+, Mg2+ Các polyme được sử dụng là các polyme anion, như: natri alginat, Gelrite, tamarind, gellan Sự tạo gel xảy ra do tương tác ion giữa các ion của polyme và các ion hóa trị 2 của nước mắt Khi các polyme anion tiếp xúc với các cation, chúng chuyển sang dạng gel có độ nhớt cao

Hình 1.4: Cơ chế tạo gel do ion hóa [34]

* Một số polyme thường dùng

ALGINAT

Cấu tạo hóa học của alginat gồm 2 phần tử β-D-mannuronic (M) và α – L –guluronic acid (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1- 4 glucozid Do bị thủy phân

13

một phần bởi acid, alginat có cả 2 thành phần: acid mannuronic, acid guluronic Alginat với lượng acid guluronic cao sẽ cải thiện đặc tính tạo gel và giảm được lượng polyme sử dụng Tương tác giữa phần tử G và các ion Ca2+ làm cho alginat tạo gel có cấu trúc 3 chiều bền vững Các đặc tính của gel tạo thành như là độ bền

và độ xốp phụ thuộc vào tỷ lệ G:M, loại ion liên kết, nồng độ và độ nhớt của dung dịch alginat ban đầu [26]

Nghiên cứu về DIG sử dụng alginat:

Liu và các cộng sự đã nghiên cứu DIG gatifloxacin sử dụng alginat là polyme tạo gel Kết quả chỉ ra rằng công thức gatifloxacin chứa 1% alginat và 2% HPMC

E50Lv có khả năng kéo dài giải phóng dược chất: tỷ lệ dược chất giải phóng in vitro

sau 0,5 giờ là 17,2%; sau 6 giờ là 80,0% trong khi dung dịch nhỏ mắt gatifloxacin đối chiếu tỷ lệ dược chất giải phóng đạt hơn 90,0% chỉ sau chưa tới 0,5 giờ [22]

 Bên cạnh dành cho nhãn khoa thì các DIG còn được nghiên cứu cho đường uống, đường tiêm hay cho mũi, âm đạo và trực tràng:

- Yuan và các cộng sự đã phát triển công thức dung dịch in situ gel đặt trực

tràng của nimesulid, sử dụng poloxamer P407 Kết quả nghiên cứu dược động học trên trực tràng thỏ cho thấy, công thức nimesulid 2% chứa 18% PF127, 0,5% natri alginat và 1,2% PEG 4000 có thời gian thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương

Tmax=131,33 phút, nhanh hơn so với thuốc đạn thông thường (chứa 2% nimesulid và 98% glyceryl monostearat) (Tmax=274,18 phút) Và nồng độ thuốc cao nhất trong huyết tương cũng cao hơn (26,69 và 16,21 µg/ mL) [42]

- Chaudhary và Verma đã nghiên cứu công thức dung dịch in situ gel chứa

acyclovir để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn virus herpes đường miệng, sử dụng PF127 và Carbopol 934, HPMC làm tá dược tạo gel Kết quả nghiên cứu khả năng

thấm in vitro của dược chất cho thấy, tất cả các công thức khảo sát đều có % dược

chất giải phóng tại các thời điểm 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 phút lớn hơn so với dạng kem thương mại (công thức chứa 6g PF127 và 0,15g HPMC K100M trong khoảng 42g chế phẩm có khoảng 35, 67, 90, 98% dược chất giải phóng tại các thời

Mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về dung dịch in situ gel, nhưng

trong nước các nghiên cứu vẫn rất hạn chế Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng và đánh giá công thức DIG natri diclofenac, trong đó sử dụng poloxamer PF127 và PF68 là tác nhân tạo gel nhạy cảm nhiệt và Carbopol là polyme kết dính sinh học

15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.3: Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn chất lượng

1 Natri diclofenac Trung Quốc Nhà sản xuất

2 Poloxamer P407 BASF (Đức) Nhà sản xuất

3 Poloxamer P188 BASF (Đức) Nhà sản xuất

4 Carbopol 934 Trung Quốc Nhà sản xuất

5 Chitosan Trung Quốc Nhà sản xuất

6 Kali dihydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

7 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

8 Acid phosphoric Trung Quốc Tinh khiết phân tích

9 Natri phosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

10 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết phân tích

11 Natri clorid Trung Quốc Tinh khiết phân tích

12 Calci clorid Trung Quốc Tinh khiết phân tích

13 Natri hydrocarbonat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

14 Acid acetic Trung quốc Tinh khiết phân tích

15 Methanol Baker (Mỹ) Dùng cho HPLC

2.1.2 Thiết bị

+ Máy đo pH Eutech Instrument pH 510

+ Thiết bị lọc nén Sartorius SM 16249

+ Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,2 µm; 0,45 µm

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Aligent 1260 Infinite (Mỹ)

+ Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research (Mỹ) + Bể siêu âm Ultrasonic LC_60H

16

+ Cân phân tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh khác,…

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Thỏ trắng trưởng thành khỏe mạnh, có trọng lượng 2,0- 2,5 kg, được nuôi

dưỡng trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, có kiểm soát

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn và xác định tỉ lệ các thành phần để xây dựng công thức bào chế cơ bản của DIG

- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến các chỉ tiêu

chất lượng của dung dịch in situ gel: đặc tính vật lý, đặc tính tạo gel, khả năng kết dính sinh học và khả năng giải phóng dược chất in vitro

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt in situ gel

DIG được bào chế bằng phương pháp lạnh theo các bước sau (áp dụng cho 100g DIG):

 Đối với công thức sử dụng tá dược Carbopol

Bước 1: Pha 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 6,0, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm

Bước 2: Chuẩn bị dung dịch polyme

- Cho từ từ Carbopol 934 vào khoảng 60mL dung dịch đệm, để qua đêm cho trương nở hoàn toàn

- Cho tiếp từ từ PF127 và PF68 vào, khuấy từ liên tục trong 1 giờ, tốc độ khoảng 100 vòng/ phút Để ít nhất 24 giờ trong tủ lạnh (4oC) cho tan hoàn toàn

- Tiệt khuẩn dung dịch bằng nhiệt ẩm ở 121oC trong 20 phút, để nguội và làm lạnh đến 4oC

Bước 3: Chuẩn bị dung dịch dược chất

Hòa tan hoàn toàn dược chất vào khoảng 10mL dung dịch đệm, lọc tiệt khuẩn

bằng màng lọc cellulose acetat 0,2 µm

Bước 4: Phối hợp 2 dung dịch trên, bổ sung dung dịch đệm đã lọc tiệt khuẩn đủ khối lượng

17

Bước 5: Đóng gói, dán nhãn, hoàn chỉnh sản phẩm

 Đối với công thức sử dụng tá dược chitosan

Bước 1: Pha 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 7,4, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm

Bước 2: Chuẩn bị dung dịch polyme

- Hòa tan hoàn toàn chitosan vào 5 mL dung dịch acid acetic 2%

- Cho từ từ PF127 và PF68 vào khoảng 60mL dung dịch đệm, khuấy từ liên tục trong 1 giờ, tốc độ khoảng 100 vòng/ phút Để ít nhất 24 giờ trong tủ lạnh cho tan hoàn toàn

- Phối hợp từ từ 2 dung dịch trên, khuấy từ liên tục trong 1 giờ cho đồng nhất

- Tiệt khuẩn dung dịch bằng nhiệt ẩm ở 121oC trong 20 phút, để nguội và làm lạnh đến 4oC

Bước 3: Chuẩn bị dung dịch dược chất

Hòa tan hoàn toàn dược chất vào khoảng 5mL dung dịch đệm, lọc tiệt khuẩn bằng màng lọc cellulose acetat 0,2 µm

Bước 4: Phối hợp 2 dung dịch trên, bổ sung dung dịch đệm đã lọc tiệt khuẩn đủ khối lượng

Bước 5: Đóng gói, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm

2.3.2 Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel

Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

2.3.3 Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch nhỏ mắt in situ gel

2.3.3.1 Đánh giá khả năng chảy lỏng

18

Khả năng chảy lỏng của DIG được đánh giá bằng cách úp ngược ống nghiệm

có chiều cao 14 cm có chứa 2 mL mẫu và quan sát bằng mắt thường Tính thời gian

t từ khi bắt đầu úp ống nghiệm đến khi DIG trong ống chảy đến miệng ống Khả năng chảy lỏng được đánh giá theo 4 mức:

2.3.3.2 Đo nhiệt độ tạo gel

Cho 10mL DIG và một thanh khuấy từ vào cốc có mỏ trong suốt dung tích 100mL, đặt trong một cốc có mỏ dung tích 500mL chứa 100mL nước được làm nóng đến 50oC Nhúng một nhiệt kế vào trong DIG và khuấy từ với tốc độ khoảng

100 vòng/phút Nhiệt độ mà ở đó thanh khuấy từ dừng lại được xác định là nhiệt độ tạo gel của DIG

Mỗi mẫu làm 3 lần lấy kết quả trung bình Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

2.3.3.3 Đánh giá khả năng tạo gel

Nhỏ 0,1 mL DIG vào 2 mL nước mắt nhân tạo chứa trong một ống nghiệm được điều nhiệt 35± 1oC Theo dõi thời gian tạo gel và thời gian gel tan hết Dung dịch nước mắt nhân tạo (STF) được pha theo công thức: 0,67g NaCl, 0,2g NaHCO3, 0,008g CaCl2.2H2O và nước cất vừa đủ 1000mL

Khả năng tạo gel của DIG được đánh giá theo 4 mức:

− Không tạo gel

+ Tạo gel sau vài giây và tan sau vài phút

++ Tạo gel ngay lập tức và tan sau thời gian từ 10-20 phút

+++ Tạo gel ngay lập tức và duy trì được > 20 phút

2.3.3.4 Độ nhớt

19

Sử dụng nhớt kế Brookfield

Sử dụng đầu đo S2 với tốc độ quay 30 vòng/phút khi đo mẫu ở 4±1ºC, 25±1oC

và đầu đo S4 với tốc độ quay 20 vòng/ phút khi đo mẫu ở 35±1oC Đo 3 lần và lấy kết quả trung bình Chỉ kết quả đo với độ tin cậy ≥ 10% mới có giá trị

Độ nhớt ở 35± 1oC được đo sau khi pha loãng bởi STF với tỷ lệ DIG:STF bằng 40:7 (tt/tt) [10]

Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

2.3.4 Phương pháp thử kết dính sinh học

Nhìn chung các thiết bị đánh giá lực kết dính sinh học thường có cấu tạo giống như mô hình thể hiện ở hình 2.5 [18] Trong điều kiện chưa có thiết bị đánh giá nên chúng tôi đã tự chế thiết bị đánh giá khả năng kết dính sinh học dựa theo mô hình tham khảo từ cân Roberval có độ nhạy 0,01g Hình ảnh chụp thiết bị tự chế tạo được thể hiện trong hình 2.6

Hình 2.5 Mô hình thiết bị đo lực kết dính sinh học [18]

Cách xử lý giác mạc mắt thỏ: giác mạc mắt thỏ sau khi bóc tách được rửa sạch

và bảo quản bằng dung dịch nước mắt nhân tạo, sử dụng trong vòng 3 giờ sau khi bóc tách

Tiến hành đo lực kết dính sinh học được tiến hành như sau: lắp đặt các bộ phận như hình mô tả, chỉnh cho đĩa cân thăng bằng, cho một lượng DIG thử kết dính vào vị trí D (khoảng 0,1mL) Giác mạc gắn với khối trụ C nhanh chóng được tiếp xúc với DIG trước khi nó bị gel hóa Ngay lúc đó một quả cân khối lượng 5g được đặt lên đĩa cân bên trái Sau 2 phút, lấy quả cân ra, điều chỉnh nước từ buret chảy xuống đĩa cân B với tốc độ hằng định 1mL/phút cho đến khi 2 giác mạc tách