Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 160 13

ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế thế giới đang có những bước phát triển đáng kể, đi cùng với nó là sự tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật và trong đó phải kể đến sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng sinh. Nhiều chất kháng sinh được tạo thành bằng con đường tổng họp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm. Trong số các kháng sinh mà con người đã phát hiện và công bố thì có tới 60% là do xạ khuẩn sinh ra. Chi Streptomyceslà chi có số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng tạo ra những kháng sinh quan trọng có cấu trúc phức tạp và đa dạng về đặc điểm kháng khuẩn. Một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chống ung thư, điều trị HIVAIDS.... Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 160.13” với các mục tiêu sau: Bước đầu lựa chọn môi trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy, lên men. Nâng cao hiệu suất sinh tổng họrp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13 bằng đột biến cải tạo giống kết hợp với sàng lọc. Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 160.13theo khóa phân loại ISP.

BỘ Y T Ế

ĐINH THANH HUYÊN

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS Lê Thị Thu Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi Sinh - Sinh Học, bộ môn Công Nghiệp Dược, cùng các phòng ban đã nhiệt tinh giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong suốt thời gian qua

Do thời gian và khả năng bản thân có hạn, nên trong khoá luận này không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong được sự chỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn

Xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội ngày 17 tháng 5 năm 2010

Sinh Viên

Đinh Thanh Huyền

LỜI CẢM ƠN

CHÚ GIẢI CHỮ VIÉT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN Đ Ề 1 •

CHƯƠNG 1: TÔNG Q U A N 2

1.1: Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1; Lịch sử phát triển của kháng sinh 2

1.1.2: Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2

1.1.4: Sơ đồ tổng quát qui trình sản xuất kháng sinh 3

1.1.5: Phân loại kháng sin h 3

1.2; Đại cương về xạ khuẩn 4

1.2.1.Xạ khuẩn 4

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 4

1.3 Cải tạo giống vi sinh v ậ t 6

1.3.1 Mục đích 6

1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống v s v 6

1.4 Lên men sinh tổng họp kháng sinh 7

1.4.1 Lên men bề m ặt 7

1.4.2 Lên men chìm 8

1.5 Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9

1.5.1 Chiết xuất 9

1.5.2 Tinh chế sản phẩm 10

1.6 Phổ hồng ngoại (IR), Phổ tử ngoại (UV) 11

MỤC LỤC

1.7 Hạn chế trong sản xuất Doxorubicin từ Síreptomyces peucetius 11

1.8 Nhận dạng và xác định đặc tính của một Streptomyces sp được phân lập biểu hiện hoạt lực chống lại Staphylococcus aureus kháng methỉcillỉn 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOÍNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Chủng xạ khuẩn 13

2.1.2 Giống v s v kiểm định 13

2.1.3 Các môi trường sử dụng 13

2.1.4 Các vật liệu và thiết bị được sử dụng 16

2.2 Nội dung nghiên cứ u 17

2.3 Phương pháp nghiên cứ u 17

2.3.1 Phương pháp gây, giữ giống trong ống thạch nghiêng 17

2.3.2 Đánh giá hoạt tứủi kháng sinh bằng phưong pháp khuy ếch tá n 17

2.3.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợ p 18

2.3.4 PhưoTig pháp cải tạo và chọn giố n g 19

2.3.5 Phương pháp lên men gián đoạn 20

2.3.6 Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu c ơ 21

2.3.7 Phương pháp sắc kí lóp m ỏng 21

2.3.8 Phương pháp cất quay 22

2.3.9 Phưong pháp xác định ảnh hưỏng của pH đến độ bền vững của kháng sinh: 22

2.3.10 Phương pháp thử khả năng bền nhiệt của kháng sinh 22

2.3.11 Phưcmg pháp tách kháng sinh bằng cột trao đổi io n 22

2.3.12 Phương pháp sắc kí cột 23

2.3.13 Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP 24

CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy thích h ọ p 26

3.2 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 160.13 27

3.3 Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1 28

3.4 Kết quả đột biến lần 2 30

3.5 Kết quả chọn môi trưòng lên men tốt nhất 32

3.6 Kết quả lên men môi trường MT5dd với các biến chủng tốt nhất 32

3.7 Đánh giá ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh 33

3.8 Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt túứi kháng sinh 34

3.9 Kết quả chiết kháng sinh bàng các dung môi hữu cơ 34

3.10 Kết quả chiết kháng sinh bằng phương pháp cột trao đổi ion 35

3.11 Kết quả sắc ký lớp m ỏng 36

3.12 Kết quả chạy sắc ký c ộ t 37

3.13 Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces 160.13 38

3.14 Kết quả đo phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và nhiệt độ nóng chảy 39

KÉT LUẬN VÀ KIÉN NG H Ị 40

Kết lu ậ n 40

Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN PHỤ LỤC

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

D [mm] Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn.ISP International Streptomyces Project.

MTdd Môi trưòng dung dịch,

s Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh

Bảng 1 : Chủng vi sinh vật kiểm định

Bảng 2: Các môi trường kiểm định

Bảng 3: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/lOOml)

Bảng 4: Các dung môi sử dụng

Bảng 5; Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 160.13 trên các môi trường

Bảng 6: Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 7: Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1

Bảng 8: Kết quả đột biến lần 2

Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men tốt nhất

Bảng 10: Kết quả lên men chìm với các biến chủng tốt nhất

Bảng 11 ; Kết quả thử độ bền pH sau 24h

Bảng 12; Kết quả thử độ bền pH sau 5 ngày

Bảng 13: Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của kháng sinh

Bảng 14; Kết quả phản hấp phụ bằng H ci IN

Bảng 15: Kết quả phản hấp phụ bằng NaOH 0,75N

Bảng 16: Kết quả hoạt tính các phân đoạn sau khi chạy sắc ký cột

Bảng 17: Kết quả thử sắc ký lớp mỏng sau chạy sắc ký cột

Bảng 18; Các đặc điểm của Streptomyces 160.13 và Streptomyces avellaneus

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1; Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Hình 2: Đặc điểm phát triển của v s v trong môi trường lỏng

Hình p 1: Chuỗi bào tử

Hình P2: Bề mặt bào tử

Hình P3: Hoạt tính kháng sinh của các chủng đột biến lần 2

Hìrth P4; Hoạt tữứi kháng sinh cửa các phân đoạn 1, 5 sau khi chạy sắc ký cột

Hình P5; Ket quả phổ tử ngoại của kháng sinh do Streptomyces 160.13

sinh tổng họp

Hình P6; Kết quả phổ hồng ngoại của kháng sinh do Streptomyces 160.13

sinh tổng hợp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nền kinh tế thế giới đang có những bước phát triển đáng kể, đi cùng với nó là

sự tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật và trong đó phải kể đến sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng sinh Nhiều chất kháng sinh được tạo thành bằng con đường tổng họp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm

Trong số các kháng sinh mà con người đã phát hiện và công bố thì có tới 60%

là do xạ khuẩn sinh ra Chi Streptomyces là chi có số lượng lớn các xạ khuẩn có khả

năng tạo ra những kháng sinh quan trọng có cấu trúc phức tạp và đa dạng về đặc điểm kháng khuẩn Một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chống ung thư, điều trị HIV/AIDS

Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng

họp kháng sinh từ Streptomyces 160.13'” với các mục tiêu sau:

- Bước đầu lựa chọn môi trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy, lên men

- Nâng cao hiệu suất sinh tổng họrp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13

bằng đột biến cải tạo giống kết hợp với sàng lọc

- Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên

khoa học của chủng Streptomyces 160.13 theo khóa phân loại ISP.

CHƯ ƠNG 1 TỎNG QUAN

1.1: Đ ại cương về kháng sinh

1.1.1: Lịch sử phát triển của kháng sinh [10]

Năm 1928 nhà vi khuẩn học người Anh - Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện chủng nấm có khả năng tạo ra chất ức chế các vi khuẩn Flemming đã phân lập

chủng nấm này và đặt tên là Penicillum notatum.

Năm 1938, hai nhà khoa học Howara Walter Florey và Ernst Boris Chaen chiết

được hoạt chat diệt khuẩn từ môi trường nuôi cấy Penỉcillum notatum và hoạt chất

đó được đặt tên là Penicilin Đến năm 1941 Penicilin được lên men trên qui mô công nghiệp để phục vụ điều trị cho thương binh trong chiến tranh Năm 1944 thì Waksman phát hiện ra Streptomycin

Đến nay, hàng chục nghìn chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ có khoảng 150 loại là được sử dụng rộng rãi (do phần lớn: độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao, )

1.1.2: Định nghĩa kháng sinh [2]

Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng họp hoặc tổng hợp hóa học Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

1.1.3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh [4]

Mỗi kháng sinh đều có đích tác dụng nhất định trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm, tuy nhiên có thể khái quát thành 6 nhóm tác dụng đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm:

+ Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào: P-Lactam, Vancomycin,

+ Tác dụng lên màng tế bào chất: Amphotericin, Valinomycin,

+ Tác dụng vào ADN: Actinomycin, Rifamycin,

+ Tác dụng vào việc tổng hợp protein: Aminoglycosid, Macrolid,

+ Tác dụng vào quá trình trao đổi chất hô hấp: Antimycin,

+ Tác dụng vào quá trình trao đổi chất folat: Sulfamid,

1.1.4: Sơ đồ tổng quát qui trình sản xuất kháng sinh [1], [10]

Hình 1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 1.1.5: Phân loại kháng sinh [1], [2], [4], [7]

Có thể phân loại dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, theo nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay theo cấu trúc hoá học Trong đó, phân loại theo cấu trúc hóa học được xem là phân loại khoa học nhất, bao gồm các nhóm:

- Nhóm Beta lactam: Penicillin, Cephalosporin, Carbapenem, Monobactam

- Nhóm Aminoglycosid (Aminosid): Streptomycin, Gentamicin, Tobramycin

- Nhóm Macrolid: Rythromycin, Clarithromycin, Spiramycin

- Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin

- Nhóm Phenicol; Cloramphenicol, Thiamphenicol

- Nhóm Tetracyclin: Tetracyclin, Doxycyclin

- Nhóm Peptid: Vancomycin, Polymycin, Bacitracin

- Nhóm Quinolon: Acid nalidixic, Ciprofloxacin, Ofloxacin,

- Nhóm Co-trimoxazol: Co-trimoxazol

- Các kháng sinh khác: Rifamicin, kháng sinh chống nấm, chống ung thư

1.2: Đại cương về xạ khuẩn

1.1.1.Xạ khuẩn [4], [5], [6]

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+) hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi (khuẩn ty) phân nhánh, có tỷ lệ G + c trong ADN cao hoTi 55% Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 32%

xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Đến nay có khoảng hơn

15000 chất kháng sinh được phát hiện trong đó có tới 60% là do xạ khuẩn sinh ra

♦ Một số đặc điểm của xạ khuẩn:

- Đường kính khuẩn ty khoảng từ 0,3-l,0|im đến 2-3ụ.m.

- Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới dày từ 10-12nm Thành tế bào xạ

khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và vận chuyển chất qua màng tế bào

- Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn

- Màu sắc hết sức phong phú, có thể gặp các màu: da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng, xám

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces [6], [7], [11]

♦ Khuẩn ty cơ chất;

- Mọc sâu trong môi trường nuôi cấy

- Be mặt nhẵn hoặc sần sùi, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển

- Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trưòng một số loại sắc tố, có sắc tố hòa tan trong nước, có sắc tố hòa tan trong dung môi hữu cơ

- Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần

- Được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh, tạo thành chuỗi bào tử

- Trên mỗi nhánh có từ 10-100 bào tử Bào tử trần có thể có hình cầu, hình bầu dục, hình que, hình trụ Đường kính của bào tử thường tương ứng với đường kính của khuẩn ty

- Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì mụn cơm, có gai hoặc có tóc

♦ Streptomyces là v s v dị dưỡng, nguồn cacbon thường dùng là đường, tinh bột

và nhiều chất hữu cơ khác; nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men; nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amoni, Khả năng đồng hóa ở các loài khác nhau là khác nhau

♦ Streptomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu của chúng

thường là 25®C-30*^C, một số loài có thể mọc tốt hơn ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu thường từ 6,8-7,5

♦ Khả năng tạo sắc tố:

Sắc tố được tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan,

sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tổ của khuẩn ty cơ chất và sắc tố melanoid

♦ Phân loại Streptomyces:

v ề phân loại Streptomyces có nhiều phân loại khác nhau Trong hội nghị vi

sinh vật học lần thứ 10 (1970) đã thống nhất chọn khoá phân loại của E.B.Shirling

và D.Gottieb làm khoá phân loại chính để phân loại Streptomyces.

Khoá phân loại này dựa vào các đặc điểm sau để phân loại:

- Đặc điểm hình thái: màu sắc khuẩn ty cơ chất, màu khuẩn lạc; hình dạng chuỗi bào tử; đặc điểm bề mặt bào tử

- Đặc điểm sinh thái: khả năng tạo sắc tố melanoid, khả năng tiêu thụ các nguồn đường, sắc tố hoà tan trong môi trường

1.3 Cải tạo giống vi sinh vật [1], [4], [6], [8], [10]

1.3.1 Mục đích.

Vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính thấp Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các biện pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp với các phưong pháp: chọn lọc lai tạo, gây đột biến trong chất liệu di truyền của tế bào hoặc trong hệ thống điều hòa trao đổi chất Qua đó đạt được các mục đích: tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, cải tạo các đặctính lên men, sinh tổng hợp được các sản phẩm mới,

1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống v s v

1.3.2.1 Chọn lọc ngẫu nhiên

Quần thể v s v luôn xuất hiện các đột biến tự phát theo tần số khác nhau sẽ có những cá thể có hoạt tính kháng sinh cao hơn 10-20% so với các cá thể khác Nhiệm vụ của phưong pháp này là tuyển chọn các cá thể có hoạt tính kháng sinh cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

1.3.2.2 Đột biến nhân tạo

♦ Cho các chủng v s v chịu tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh như ánh sáng ư v , tia X hay các tác nhân hoá học như ethylenimin, nitrosoguanidin,

dimethylsulphat .với liều lượng và thời gian thích hợp, phần lớn các v s v sẽ chết, những cá thể sống sót sẽ xuất hiện các biến đổi (biến đổi ở NST hay thay đổi tính

trạng) dẫn tới làm giảm (mất) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu xuất sinh tổng họrp kháng sinh của v sv (đột biến dương tính).

♦ Ánh sáng ư v có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào v s v có kích thước nhỏ (0,3-3,0|am) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân Vì vậy được dùng phổ biến trong cải tạo giống

♦ Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến:

+ Liều lượng chiếu; được đặc trưng bởi 3 yếu tố; thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và cuối cùng đạt đến một giới hạn nhất định

+ Ánh sáng: sau khi chiếu ánh sáng ư v lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng thường thì xảy ra hiện tượng quang phục hoạt làm quá trình đột biến không có ý nghĩa.+ Ngoài ra các yếu tố nhiệt độ, pH, thành phần môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lý của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng ư v

♦ Hiệu quả đột biến: là tỷ số giữa số tế bào đột biến chia cho tổng số tế bào sống sót sau đột biến Người ta thường áp dụng đột biến gây chết từ 75-90%, tuy nhiên trong công nghiệp người ta có thể đột biến gây chết tới 99%

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [1], [5], [7], [9], [10]

Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện môi trường tối ưu để sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men Có hai kiểu lên men chính hay sử dụng là: lên men bề mặt và lên men chìm

1.4.1 Lên men bề mặt.

Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc môi trưòng bán rắn v s v hấp thụ các chất của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt của môi trường dinh dưỡng Do đó yêu cầu của môi trường lên men phải rộng và không quá sâu, đồng thời phải giữ độ ẩm môi trưòng khoảng 60% để tránh khô bề mặt môi trường

+ ư u điểm; đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp

+ Nhược điểm; hiệu suất thấp, tốn diện tích, khó cơ giới hóa và tự động hoá Phương pháp này chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm

Quá trình lên men có thể thay đổi điều kiện ban đầu của môi trường lên men Do

đó cần theo dõi và điều chỉnh các thông số; sự cấp khí, sự tạo bọt, điều chỉnh pH, nhiệt độ, nhiên liệu và chất tiền thể

* ư u điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ tự động hóa và cơ giới hóa trên quy mô lớn

* Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn

► Các kiểu lên men chìm

* Lên men gián đoạn:

Quá trình lên men gián đoạn được xem như là một hệ thống kín Trong suốt thời gian lên men không có tác động hay bổ sung chất dinh dưỡng vào môi trường lên men trừ việc cung cấp ôxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH

v s v trong bình lên men phát triển qua các giai đoạn: pha tiềm tàng, pha log, pha

Ennh 2: Đặc điểm phát triển của v s v trong môi trường lỏng.

1: pha tiềm tàng, 2: pha log, 3: pha cân bằng, 4;pha suy vong

x; sinh khối khô vsv, t: thời gian lên men

Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của v s v hoặc việc sinh tổng hợp chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.

♦ Lên men có bổ sung

Nồng độ ban đầu cao của một số chất (Glucose, các hợp chất nitơ ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Do đó để nâng cao hiệu suất lên men, khi bắt đầu lên men các thành phần đó được đưa vào với nồng độ thấp và được bổ sung vào

hệ thống trong quá trình lên men

♦ Lên men bán liên tục

Khi v s v phát triển trong bình đạt đến một nồng độ sinh khối cần thiết thì lấy bớt dịch lên men rồi bổ xung thêm lượng môi trường mới bằng chính thể tích dịch lên men đã lấy đi Việc rút bớt dịch lên men và bổ xung thêm môi trường dinh dưỡng mới không xảy ra liên tục mà chỉ định kì trong một thời điểm nhất định

♦ Lên men liên tục

v s v được nuôi trong một thiết bị đặc biệt sao cho khi v s v phát triển đến một giai đoạn nhất định, khi đó lấy đi liên tục một thể tích môi trường lên men cùng các

tế bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng đồng thời bổ xung thêm đúng một thể tích môi trường dinh dưỡng như thế vào bình nuôi cấy

1.5 Chiết tách và tinh chế [1], [3], [5], [7], [10]

Các kháng sinh thu được trong dịch lọc dịch lên men thường có nồng độ thấp, ngoài ra trong dịch lọc dịch lên men còn có nhiều sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất Vì vậy, cần phải có phương pháp chiết tách thích họp để có thể thu được sản phẩm tối đa Các phương pháp chiết tách sau hay được sử dụng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

lọc dịch lên men hay sinh khối để tách riêng chất kháng sinh (có thể là một chất hay một nhóm chất) Nếu chiết bằng dung môi hữu cơ, cần thỏa mãn các yêu cầu: dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy, có tính chọn lọc cao và dễ cất thu hồi

1.5.2 Tinh chế sản phẩm.

Là một nhóm các phưong pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến một hỗn họp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng chất

♦ Sắc kí: là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của mỗi hỗn hợp Sự tách sắc kí dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau

và không hoà lẫn vào nhau; một pha tĩnh một pha động Quá trình sắc ký thường qua 3 giai đoạn chính: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện các chất

Theo bản chất hiện tượng sắc kí có thể chia làm bốn loại: sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố, sắc kí trao đổi ion, sắc kí gel

+ Sắc kí trao đổi ion: dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit Nhựa

có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Quá trình trao đổi tuân theo định luật khối lượng

+ Sắc kí lóp mỏng: kết quả sắc kí lớp mỏng bước đầu cho ta biết mẫu thử có bao nhiêu thành phần đồng thời lựa chọn được hệ dung môi thích hợp để tách riêng các thành phần

Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích: Hệ số R f

Khoảng cách của chất phân tích di chuyển được

R f =

Khoảng cách của dung môi di chuyển được

R f phụ thuộc vào các yếu tố như cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm Vì vậy người ta sắc ký song song với một chất đã biết để đối chứng trên cùng một bản mỏng và tính Rf

1.6 Phổ hồng ngoại (IR), Phổ tử ngoại (UV) [3], [11]

► Phổ hồng ngoại

Định nghĩa: Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp phụ bức xạ

hồng ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng là phổ hấp phụ hồng ngoại, thường gọi đơn giản là phổ hồng ngoại của một chất

Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó bị hấp phụ năng lượng và thay đổi trạng thái hoạt động thì tạo nên một dải hấp phụ trên phổ IR Có mối liên quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp phụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp phụ để nhận biết một nhóm chức nào đó Nhiều nhóm chức có giải hấp phụ đặc trưng Đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR

► Phổ tử ngoại

Phương pháp hấp phụ tử ngoại, khả kiến dựa trên sự hấp phụ năng lượng các bức xạ ánh sáng vùng UV-VIS bởi các phân tử chất nghiên cứu làm thay đổi mức năng lượng điện tử (Eq-^ Ei, E2) Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp phụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân tử nào có điện tử dễ bị kích thích mới hấp phụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái bị kích thích

Đó là: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, s, o

1.7 Hạn chế trong sản xuất Doxorubicin i\s Streptom yces peucetius [12]

Doxorubicin (DXR) được sản xuất bởi Streptomyces peucetius ATCC 27952

biểu hiện khả năng ức chế các khối u, chống lại các dòng tế bào gây ung thư khác nhau Một thời gian dài trôi qua kể từ khi quá trình sinh tổng hợp DXR lần đầu tiên được tổng kết Dựa trên những nghiên cứu về sinh tổng họp và phân tích sản phẩm,

các nhân tố khác nhau tác động tới sự sản xuất kháng sinh từ chủng S.peucetius

ATCC 27952 đã được xem xét lại để có thể giải quyết những khúc mắc khó khăn trong sản xuất DXR Qua đó cung cấp những ý tưởng để tạo ra sự cải tiến về gen

cho những chủng công nghiệp của s peucetius.

Streptomyces lavendulae and Streptomyces gỉobosus Lai tạp DNA-DNA cho thấy

80% tương đồng với s globosus DSM41122 Kháng sinh được tinh chế một phần

từ bề mặt nổi của môi trường nuôi cấy nhờ sử dụng kết họp các kỹ thuật than hoạt tính, kết lắng, trao đổi ion Kháng sinh được tạo ra có khả năng hòa tan trong nước

và rất bền vững bởi nhiệt độ cao tại pH acid Đặc biệt kháng sinh tinh chế một phần

này biểu hiện hoạt tính hướng vào Staphylococcus aureus kháng methicillin được

cô lập trên lâm sàng

CHƯƠNG 2

Đ Ó I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP N G H IÊN c ứ u

2.1 N guyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Chủng xạ khuẩn:

Giống xạ khuẩn Streptomyces 160.13 do bộ môn Vi sinh- Sinh học trưòng

Đại Học Dược Hà Nội cung cấp

2.1.2 Giống v s v kiểm định:

Do bộ môn Vi sinh- Sinh học trường đại học dược Hà Nội cung cấp (bảng 1)

Bảng 1: Chủng vi sinh vật kiểm định

Staphylococcus aureus ATCC 1128 Escherichia coli ATCC 25922

Bacillus pumilus ATCC 10241 Proteus mirabilis B V 108

Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201 Bacillus cereus ATCC 9946 Salmonella typhi D T 220

Sarcỉna lutea ATCC 9341 Shigella flexneri D T 112

2.1.3 Các môi trường sử dụng:

a) Môi trường nuôi cấy v s v kiểm định có thành phần trình bày ở bảng 2

Bảng 2: Các môi trường kiểm định

^ ■ \ ^ à n h phần

MT

NaCl(%)

Cao thịt(%)

Pepton(%)

Thạch(%)

- Tiệt trùng bằng hơi nước ở 118®C/30 phút

b) Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 3

- Tiệt trùng môi trường bằng hơi nước ở 118-120®C/30 phút.

IS P l: Tripton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất vđ lOOOml; pH = 7,0-7,2.

ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,Og; glucose 4,0g; thạch 20,Og; nước cấtvđ lOOOml; pH = 7,3

ISP3: Yến mạch 20,Og; dung dịch muối vi lượng l,Oml; thạch 18,0g; nước cất vđ 1000ml;pH = 7,2

ISP4: Tinh bột 10,Og; K2HPO4 l,Og; MgS04.7H2Ơ l,Og; NaCl l,Og; (NH4)2S04 2,0g; CaCOs 2,0g; dung dịch muối vi lưọTig l,Oml; thạch 20,Og; nước cất vđ

ISP7; Glycerin 15,0g; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K2HPO4 0,5g;

MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 0,01g; dung dịch muối vi lượng l,Oml; thạch 20,Og; nước cất vđ lOOOml; pH = 7,2-7,4

ISP9: Các nguồn đường được tiệt trùng bằng phưomg pháp Tyndal (A)

Dung dịch Pridham và Gottlieb (Dung dịch B): CUSO4.5H2O 0,64g; FeS04.7H20

0,1 Ig; M11CI2.4H2O 0,79g; ZnSƠ4.7H20 0,15g; nước cất vđ lOOOml

ISP9; (NH4)2SƠ4 2,64g; KH2PO4 2,38g; K2HPO4.3H2O 5,65g; MgSƠ4.7H20 l,Og; dung dịch B l,00g; thạch 15,0g; nước cất vđ lOOOml; pH = 6,8-7,0

D*ISP9; ISP9 sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 60°c thì cho 1 trong các nguồnđường A vào từng môi trường ISP9 riêng rẽ sao cho nồng độ đưÒTig trong môitrường là 1%

2.1.4 Các vật liệu và thiết bị được sử dụng:

♦ Các dung môi sử dụng: được trình bày trong bảng 4

Bảng 4; Các dung môi sử dụng Dung môi Khôi lượng riêng Nhiệt độ sôi

- Cân kỹ thuật Precisa Bj 210C, Sartorius

- Tủ cấy Aura VF48, Bassaire

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030, ALP

- Máy cất quay Buchi WaterBath B480 (Bộ môn công nghiệp Dược- Trưòng ĐH Dược Hà Nội)

Đĩa Petri, Pipet các loại, ống đong, cốc có mỏ, ống nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu MT nuôi cấy và MT lên men tốt nhất cho chủng xạ khuẩn

Streptomyces 160.13

+ Nghiên cứu các phương pháp cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng

hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13

+ Nghiên cứu các phương pháp tách chiết, tinh chế kháng sinh

+ Tiến hành phân loại chủng xạ khuẩn Streptomyces 160.13 theo khóa phân loại

ISP

+ Sơ bộ xác định một số nhóm chức của kháng sinh tinh thu được qua phân tích phổ IR, ư v

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp gây, giữ giống trong ống thạch nghiêng

Chuẩn bị môi trưÒTig phân lập (MT2), tiệt trùng ở 120®C/30 phút rồi đặt thạch nghiêng Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử

Streptomyces 160.13 lên bề mặt thạch nghiêng Để ở 28*^c trong 6 ngày cho xạ

khuẩn phát triển, sau đó đem cất trong tủ lạnh (2-4‘^C) Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán

Nguyên tắc; Mau thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểmđịnh, kháng sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

Tiến hành:

♦ Chuẩn bị môi trưòng cấy v s v kiểm định, v s v kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (đối với vi khuẩn), môi trưòng Sabouraud lỏng (đối với nấm men) hoặc đưa vào dung dịch Tween 80 hay dung dịch xà phòng 0,1% (đối với nấm mốc) Nuôi cấy tạo hỗn dịch v s v kiểm định có nồng độ từ 10^-10* tế bào/ml bằng

cách ủ trong tủ ấm ở 37'^c trong 18-24h (đối với vi khuẩn), ở 30**c trong 24- 48h (đối với vi nấm) Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường (đối với vi khuẩn), vào môi trưòmg Sabouraud đặc (đối với vi nấm) ở 40-50®C sau khi đã hấp tiệt trùng

ở I20V /30 phút với tỷ lệ Vgiống /Vthạch thường = 5/200, lắc đều để v s v kiểm định phân tán đều vào môi trường, đổ vào hộp Petri với thể tích 20ml/hộp

♦ Đưa mẫu thử vào hộp Petri có chứa môi trưÒTig v s v kiểm định; Có 3 cách thử

- Phương pháp đặt khối thạch: Mau thử là các khối thạch (bề mặt (|)=6mm) chứa

v s v cần thử lên bề mặt môi trường v s v kiểm định

- Phương pháp đục giếng thạch; Đục các giếng trên môi trường v s v kiểm định ((j) =6mm), sau đó cho 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng thạch

- Phương pháp đặt khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc ((|) = 6mm) đã sấy khô được tẩm 3-5 lần dung dịch thử, sấy khô ở 45®c, sau đó đặt các khoanh giấy này lên

bề mặt môi trường v s v kiểm định

♦ Nuôi cấy: Các hộp Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°c trong 18-24h (đối với vi khuẩn) ở 30^c trong 24- 48h (đối với vi nấm)

♦ Đánh giá kết quả; Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) và được đánh giá theo công thức:

D = s= 1

-=1 -n \ n - \

D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (vô nấm).

D ,: Đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n : Số thí nhiệm làm song song

2.3.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

Nguyên tắc; Chủng xạ khuẩn Streptomyces 160.13 nuôi cấy trên môi trường

xác định trong thời gian và nhiệt độ thích hợp sau đó thử hoạt tính kháng sinh của

xạ khuẩn với chín loại v s v kiểm định và môi trường nào xạ khuẩn có hoạt tính cao nhất được chọn làm môi trường nuôi cấy xạ khuẩn cho những nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành:

♦ Cân pha bảy môi trường, hấp tiệt trùng các môi trường ở 120°C/30 phút Rồi đổ môi trường ra các đĩa Petri vô trùng (20ml/ đ ĩa )

♦ Cấy zigzac chủng Streptomyces 160.13 lên bề mặt các môi trưÒTig, ủ ở 28**c

trong 6 ngày Sau đó đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưong pháp đặt khối thạch và tiến hành đánh giá

2.3.4 Phương pháp cải tạo và chọn giống

a) PhưoTig pháp chọn lọc ngẫu nhiên:

♦ Cân pha môi trường đã chọn, tiệt trùng ở 120*^C/30 phút Đổ môi trường ra các đĩa Petri vô trùng (20ml/đĩa) và để nguội Pha hỗn dịch bào tử: lấy một vòng que

cấy bào tử Streptomyces 160.13 cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng

lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn họrp bào tử có nồng độ pha loãng 10'* (định ước) Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10'^ bằng nước cất vô trùng

♦ Cấy bào tử: Dùng Pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng từ đến 10'^, nhỏ lên bề mặt thạch của môi trường đã chọn trong đĩa Petri Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng, cho các đĩa vào ủ ấm 28*^c trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển

♦ Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ sau 6 ngày, cấy zigzac lên bề mặt môi trưÒTig đã chọn trong đĩa Petri Cho các đĩa vào ủ ấm 28®c trong 6 ngày, lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch Chọn 3-5 dạng chủng tốt nhất để nghiên cứu tiếp

b) Phương pháp đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng u v

♦ Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 160.13 cho

vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng, lắc cho phân tử tan đều, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10’^ (định ước) Dùng Pipet vô trùng hút Iml hỗn dịch này pha loãng đến nồng độ 10'^ làm mẫu chứng, 9ml độ pha loãng 10'^ còn lại cho vào đĩa Petri vô trùng mang đi đột biển