Nghiên cứu chiết xuất và bào chế viên giảo cổ lam

ĐẶT VẤN ĐỂTheo xu hướng chung hiện nay, con người ngày càng ưa dùng sản phẩm đi từ thiên nhiên để chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ. Việt Nam chúng ta là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Bởi vậy vấn đề nghiên cứu cây cỏ làm thuốc luôn được nhiều nhà khoa học quan tâm.Trong Xã hội phát triển, nhu cầu của con người về thuốc không chỉ dừng lại ở hiệu lực và sự an toàn, mà còn đòi hỏi cả sự tiện lợi trong sử dụng và bảo quản. Vì vậy ngành Y tế đã có chủ trương hiện đại hoá Y học cổ truyền, trong đó có có một nội dung quan trọng là nghiên cứu chuyển các dạng thuốc sắc, hãm... cổ truyền thành các dạng thuốc hiện đại như viên nén, viên nang...Cây Giảo cổ lam được phát hiện ở Việt Nam và đã có một số công trình nghiên cứu của GS.TS. Phạm Thanh Kỳ về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học cũng như thử độc tính và một số tác dụng sinh học. Kết quả của các công trình này đã cho thấy Giảo cổ lam là một dược liệu có nhiều tác dụng điều trị bệnh như hạ Cholesterol, hạ Lipid máu, hạ đường huyết, chống huyết khối, chống viêm, tăng sức đề kháng... Hiện nay một số nước trên Thế giới đã có các chế phẩm Giảo cổ lam ở dạng chè, viên nang có nhiều tác dụng tốt. Trên thị trường Việt Nam cũng đã có chè Giảo cổ lam của công ty Tuệ Linh.Để góp phần hiện đại hóa dạng bào chế thuốc Giảo cổ lam. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và bào chế viên Giảo cổ lam” với 2mục tiêu:> Lựa chọn phương pháp chiết xuất và bào chế cao khô từ dược liệu Giảo cổ lam. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho cao khô Giảo cổ lam.> Nghiên cứu bào chế và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén Giảo cổ lam. Bước đầu theo dõi độ ổn định của thuốc.

B Ộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • D ư ợ c • HÀ NỘI •

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 2002 - 2007)

Người hướng dẫn: GS.TS Phạm Thanh Kỳ.

PGS.TS Phạm Ngọc Bùng

Nơi thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội.

Thời gian thực hiện: Từ 1/2007 đến 5/2007.

Lời cảm ơn

Trong suốt quá trình làm Khóa luận té t nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, gia đình và bạn bè Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

GS,TS, Phạm Thanh K ỳ

PGS,TS, Phạm Ngọc Bùng

Những người thầy đã tận tình hướng dãn, tạo điều kiện tốt nhất

và trực tiếp giúp đ ỡ tôi hoàn thành Khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban Trường Đại học Dược Hà Nội; cảm ơn tấ t cả các thầy cô, các Kỹ thuật viên của Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Vật lý - Hóa lý và Bộ môn Bào chê đã tạo điều kiện thuận ỉợi cho tôi trong thời gian qua.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân yêu nhất trong gia đình, cảm ơn bạn bè - những người ỉuôn sá t cánh bên tôi, động viên, giúp đ ỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm Khoá luận.

Hà Nội, ngày 20 thảng 5 năm 2006.

Sinh viên

L ê Thị Á n h

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VÂN Đ Ể 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 2

1.1 Cây giảo cổ lam 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân b ố 2

1.1.2 Thành phần hoá học 2

1.1.3 Tác dụng và công dụng 4

1.1.4 Độc tính 6

1.1.5 Tiêu chuẩn chất lượng 6

1.2 Các công trình nghiên cứu chế phẩm thuốc từ dược liệu Giảo cổ lam 7

1.2.1 Các tư liệu nghiẽn cứu về chiết xuất Saponin và Flavonoid từ dược liệu Giảo cổ lam 7

1.2.2 Các chế phẩm thuốc từ Giảo cổ lam 7

1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng Saponin và Flavonoid trong Giảo cổ lam 8

1.3 Kỹ thuật bào chê cao thuốc và thuốc viên chứa cao dược liệu 8

1.3.1 Kỹ thuật bào chế cao thuốc 8

1.3.2 Kỹ thuật bào chế viên nén và nang cứng có chứa cao dược liệu 9

PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 11

2.1 N gu yên - vật liệu và phương pháp nghiên c ứ u 11

2.1.1 Nguyên - Vật liệu 11

2.1.2 Phương pháp nghiên cứ u 12

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 19

2.2.1 Xác định độ lặp lại kết quả của phương pháp định lượng Saponin và Flavonoid 19

2.2.2 Nghiên cứu điều chế cao khô Giảo cổ lam 20

2.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô giảo cổ lam 28

2.2.4 Nghiên cứu bào chế viên nén từ cao khô Giảo cổ lam 29

2.2.5 Nghiên cứu bào chế viên nang cứng từ cao khô Giảo cổ lam 32

2.2.6 Bước đầu đánh giá độ ổn định của viên 34

2.2.7 Hoàn ửdện tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén Giảo cổ lam đã bào chế 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 36 TẦI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỂ

Theo xu hướng chung hiện nay, con người ngày càng ưa dùng sản phẩm

đi từ thiên nhiên để chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ Việt Nam chúng ta là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Bởi vậy vấn đề nghiên cứu cây cỏ làm thuốc luôn được nhiều nhà khoa học quan tâm

Trong Xã hội phát triển, nhu cầu của con người về thuốc không chỉ dừng lại ở hiệu lực và sự an toàn, mà còn đòi hỏi cả sự tiện lợi trong sử dụng và bảo quản Vì vậy ngành Y tế đã có chủ trương hiện đại hoá Y học cổ truyền, trong

đó có có một nội dung quan trọng là nghiên cứu chuyển các dạng thuốc sắc, hãm cổ truyền thành các dạng thuốc hiện đại như viên nén, viên nang

Cây Giảo cổ lam được phát hiện ở Việt Nam và đã có một số công trình nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học cũng như thử độc tính và một số tác dụng sinh học Kết quả của các công trình này đã cho thấy Giảo cổ lam là một dược liệu có nhiều tác dụng điều trị bệnh như hạ Cholesterol, hạ Lipid máu, hạ đường huyết, chống huyết khối, chống viêm, tăng sức đề kháng Hiện nay một số nước trên Thế giới đã có các chế phẩm Giảo cổ lam ở dạng chè, viên nang có nhiều tác dụng tốt Trên thị trường Việt Nam cũng đã có chè Giảo cổ lam của công ty Tuệ Linh

Để góp phần hiện đại hóa dạng bào chế thuốc Giảo cổ lam Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và bào chế viên Giảo cổ lam” với

2 mục tiêu:

> Lựa chọn phương pháp chiết xuất và bào chế cao khô từ dược liệu Giảo

cổ lam Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho cao khô Giảo cổ lam

> Nghiên cứu bào chế và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén Giảo cổ lam Bước đầu theo dõi độ ổn định của thuốc

1

-PHẦN I: TỔNG QUAN

-Tên khoa học: Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae.

- Tên gọi khác: cổ yếm, Thư tràng năm lá [12], Thất diệp đởm, Tiểu khổ dược (Nhật Bản), Cam ù*à man, Công la oa đổ, Biển địa sLnh căn, Giao dịch lam [15]

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

s Đặc điểm thực vật

Thân thảo mọc leo yếu, không lông, vòi đơn Lá kép có cuống chung dài 3

- 4 cm, phiến do 5 - 7 lá chét vói mép có răng dài 3 - 9 cm, rộng 1 ,5 -3 cm Cây khác gốc; Qiuỳ hoa thòng Hoa nhỏ, hình sao, ống bao hoa rất ngắn; Cánh hoa rời nhau cao 2,5 cm; Nhị 5, bao phấn đính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy Quả khô, tròn, đường kính 5 - 9 mm, màu đen; Hạt 2 - 3 , treo, to 4 mm Hoa tháng 7 - 8, quả tháng 9 - 10 [7], [12]

13 Phân bố

Cây mọc trên đất đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m ở nước ta, cây mọc từ Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Thừa Thiên - Huế, Kon Tum vào tới Đồng Nai [7], [8]

Phân bố ở Ân Độ, Xii Lanca, Mianma, Băngladet, Nepal, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Việt Nam và bán đảo Mã Lai [8], [54]

- Các tài liệu [21], [29], [33] cho thấy dịch chiết phần trên mặt đất của Giảo cổ lam có Rutin, Ombuin và 1 acid hữu cơ là acid Malonic; Saponin triterpen phần aglycol có khung Dammaran.

- Các tác giả đã phân lập và xác định được cấu trúc của một số chất:

+ Quercetin, Rutin, Rhamnazin, 1 Saponin có công thức C47H76O17 được

dự kiến cấu trúc thuộc nhóm Triterpenoid có khung Dammaran và 5,6-dimethoxy-7,3',4'-trihydroxyflavone [6], [10], [11], [13], [14].+ 1 chất 4a-methylsterol mới có cấu trúc 4a,14a-dimethyl-5a-esgosta- 7,9(1 l),24(28)trien-3p-ol [16]

+ 4 glycoside có khung Dammaran mới [33]:

20(S),3P,20,23Ịtrihydroxydammar-24-en-21 -oicacid-21,231acton Epimer ở C21: 20(R)

20(S)dammar-23-en-3B,20,25,26-tetraol

li, 20(S)dammar-25-en-3 p,20,21,2-tetraol

- Theo Cui J và cộng sự [21], phần aglycol có khung Dammaran của Gypenoside phân lập từ dịch chiết phần trên mặt đất của Giảo cổ lam có cấu trúc giống với cấu trúc của aglycol của Ginsenoside trong nhân sâm (Protopanaxadiol và Protopanaxatriol)

- Theo tài liệu [33] và [56], Giảo cổ lam có 82 Gypenosides, trong đó có

4 Gypenosides có cấu trúc và tác dụng giống vói các Gypenosides trong nhân sâm, 70 Gypenosides khác khi thủy phân cũng thu được các chất tương tự trong nhân sâm

- Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X, các tác giả đã xác định trong Giảo cổ lam có chứa các nguyên tố Al, Si, Mg, p, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu,

Cr, Pb, Ag Trong đó cao nhất là Si (10%) và thấp nhất là Ag (0,0001%) [6], [9], [10], [11], [14]

- Các tác giả cũng đã tiến hành định lượng 2 thành phần chính của

3

-Giảo cổ lam [6], [11], [13], [14] Kết quả thu được như ghi trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Kết quả định lượng trong thân và lá cây Giảo cổ lam ở Cao Bằng

* Hạ Cholesterol, hạ lipid máu: Có khả năng giảm LDL (Cholesterol

xấu), trong khi đó lại tăng lượng HDL (Cholesterol tốt), tăng cường chuyển hóa lipid và giảm lắng đọng mỡ trên thành mạch [37]; Đẩy mạnh quá trình chuyển đường và Carbohydrate đến các cơ thay vì chuyển hóa thành dạng triglycerid dự trữ [25]; ức chế sự tăng Cholesterol ở động vật thínghiệm [10], [11], [13], [14]

* Chống huyết khối: Kìm hãm sự tích tụ tiểu cầu và đẩy nhanh quá trình

tan cục máu đông [34]

* ức chế khối u: Có tác dụng tới acid nucleic, protein và tế bào của bệnh

nhân ung thư phổi [23]; Có khả năng ức chế sự phát triển khối u trên động vật thí nghiệm [13], [38], [39], [40]

* Chống viêm: Tác dụng chống viêm mạnh hơn Indomethacin

[26], [27], [28]

* Hạ đường huyết: Trên thực tế, GS.TS Phạm Thanh Kỳ và cộng sự

đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tác dụng hạ đường huyết đối với sản phẩm trà tan GX7 chứa 3 g Giảo cổ lam

*Tăng sức đề kháng: Tăng cường đáp ứng miễn dịch [10], [11], [13],

[14], [36]; Tăng cường sự chống đỡ đối với tình trạng suy yếu ở bệnh nhân ung thư [24]

* Chống bức xạ: Hồi phục sự suy giảm số lượng bạch cầu, GOT, GPT,

IgG trong huyết thanh chuột sau khi bị chiếu tia gamma (y) [20]; Kìm hãm sự cảm ứng tia ư v của thực khuẩn lambda trong tương tác với

E coli [41]

* Bảo vệ tế bào gan: Làm giảm rõ rệt chỉ số AST (Aspartate

aminotransferase) và ALT (Alanine aminotransferase) [26], [27], [28]; Chống xơ hóa tế bào gan, ức chế sự phát triển của dòng tế bào Huh-7, Hep3B và HA22T [17], [18], [19]

* Chống oxy hoá: Có khả năng thu dọn gốc tự do anion Superoxide 0 ’2 và Hydrogen peroxide 'OH [26], [29]

HI Công dụng

ở Trung Quốc, Giảo cổ lam được dùng làm thuốc tu bổ cường tráng [7]; Các chế phẩm dạng chè thuốc, thuốc sắc được dùng để chữa viêm, trị ho, dưỡng tâm an thần và làm thuốc bổ [15] ở Quảng Tây, dùng trị tiêu chảy

và dùng ngoài trị rắn cắn; ở Vân Nam, cây được sử dụng để chữa viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành tá tràng, phong thấp đau khớp, bệnh về tim [8]

Theo tài liệu [15], dược liệu dùng để trị bệnh tăng huyết áp, bệnh mỡ máu, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, tiểu đường, trị ung thư, viêm phế quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm bể thận, viêm loét dạ dày - ruột, trúng gió, sỏi mật; Tăng sức khoẻ, chống lão suy

s Liều dùng

- Liều dùng tính cho dược liệu: Liều 5 - 1 0 g/ngày [14].

- Liều dùng tính theo Gypenosides: được thể hiện trong bảng sau:

5

-Bảng 1.2: Liều sử dụng (tính theo Gypenosỉdes) của các chếphẩm Giảo cổ lam [551

ức chế sự phát triển của khối u: + Phòng

+ Điều trị

20 mg/lần X 2 lần/ngày

60 mg/lần X 3 lần/ngày

Tiểu đường, rối loạn chức năng gan, viêm

1.1.4 Độc tính

Theo các nghiên cứu thu được trong nước, có thể thấy Giảo cổ lam là một dược liệu lành tính, không biểu hiện độc tính trong điều kiện thí nghiệm

- Độc tính cấp: Thử trên chuột với liều 50 g/Kg (tưcmg đương với 1250

lần liều dùng cho người) không có biểu hiện ngộ độc cấp [6], [10], [14]

- Độc tính bán trường diễn: Thử trên thỏ với liều 3 g/Kg/ngày, dùng liên

tục trong một tháng không thấy biểu hiện ngộ độc [6], [10], [14]

l l s Tiêu chuẩn chất lượng

Theo GS.TS Phạm Thanh Kỳ, tiêu chuẩn của dược liệu Giảo cổ lam được trình bày như phụ lục 1

1.2 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN c ứ u CHÊ PHẨM THUỐC t ừ

DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM

1.2.1 Các tư liệu nghiên cứu về chiết xuất Saponin và Flavonoid

từ dược liệu Giảo cổ lam

Hiện chúng tôi chưa tìm thấy một công trình nào công bố về quy trình sản xuất 2 nhóm chất chính (Flavonoid và Saponin) trong Giảo cổ lam Hầu hết các tác giả trong quá trình nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng sinh học đều sử dụng dung môi chiết xuất là nước và Ethanol; Khi định lượng cần chiết kiệt thì các tác giả sử dụng Methanol Tuy nhiên chưa có sự đánh giá về hiệu quả chiết xuất của các dung môi này

1.2.2 Các chế phẩm thuốc từ Giảo cổ lam

Hiện nay đã có một số nước trên Thế giới sản xuất các chế phẩm của Giảo cổ lam như: Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan Các mặt hàng này tồn tại chủ yếu dưới dạng trà túi lọc, một số sản phẩm dạng viên nang, cao thuốc, có duy nhất 1 viên nén được sản xuất bởi nhà máy Guangxi Health Tonic and Pharmaceutical ở Trung Quốc [57] Các chế phẩm này thường được dùng để bồi bổ sức khỏe hoặc sử dụng hỗ trợ trong điều trị xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, ung thư và một số bệnh khác

Nhưng hiện tại ở Việt Nam chưa có mặt các sản phẩm này mà mới chỉ

có sản phẩm trà túi lọc do công ty Tuệ Linh sản xuất

Tìm kiếm trên các Website, chúng tôi thu được khá nhiều hình ảnh về các chế phẩm có chứa Giảo cổ lam, nhiều nhất là các chế phẩm ở dạng trà

và viên nang Các chế phẩm dạng viên thường được bào chế từ dịch chiết Gypenoside toàn phần của dược liệu này

7

-Hình 1.1: Một số hình ảnh chế phẩm Giảo cổ lam lổ3J, [49], [51], [54], [56].

1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng Saponin và

Flavonoid trong Giảo cổ lam

Để định tính Flavonoid, các tác giả đã sử dụng phương pháp định tính trong ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng [10], [13], [14]

Để định tính Saponin, các tác giả dựa trên tính chất tạo bọt, chỉ số phá huyết, các phản ứng màu và sắc ký lófp mỏng [10], [11]

Để định lượng 2 nhóm chất này, các tác giả sử dụng phương pháp cân [6], [11], [13]

1.3 KỸ THUẬT BÀO CHẾ CAO THUỐC VÀ THUỐC VIÊN CHỨA

CAO DƯỢC LIỆU

1.3.1 Kỹ thuật bào chế cao thuốc

ỈU Quá trình bào chế cao thuốc nói chung được phân thành 4 giai đoạn [2]:

* Chiết xuất dược liệu: Phân chia dược liệu và chiết xuất với dung môi thích

hợp bằng phương pháp ngâm lạnh, hầm, sắc, ngấm kiệt hoặc ngấm kiệt cải tiến để thu dịch chiết

* Loại tạp chất trong dịch chiết: Gồm các tạp tan trong nước (tinh bột, gôm,

chất nhầy ) và tạp tan trong EtOH (nhựa, chất béo ) được loại bằng các phương pháp thích hợp như dùng nhiệt, Ethanol cao độ, muối kim loại nặng, acid hữu cơ

* Cô đặc, sấy khô: Nhằm thu được cao có thể chất thích hợp.

- Cô đặc: Áp dụng để bào chế cao lỏng hoặc cao đặc Có thể cô ở áp suất thường (bình cách thủy) hoặc cô ở áp suất giảm (cất quay, thiết bị cô

áp suất giảm)

- Sấy khô: Nhằm thu được cao khô Có thể sấy dưới áp suất giảm (tủ sấy chân không); Sấy khô bằng trống quay; Sấy khô bằng sấy phun sương; Đông khô

* Hoàn chỉnh chế phẩm: Xác định và điều chỉnh hàm lượng hoạt chất nếu

có quy định

s Tuỳ theo từng loại dược liệu, nếu dược liệu đã được xác định rõ hoạt chất thì cần lựa chọn dung môi và phương pháp chiết phù hợp để thu được hàm lượng hoạt chất cao nhất

1.3.2 Kỹ thuật bào chế viên nén và nang cứng có chứa cao dược liệu

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở kinh doanh sản xuất các chế phẩm

đi từ dược liệu, tiêu biểu như Công ty cổ phần Dược phẩm Traphaco (gần 40 sản phẩm), Viện Dược liệu (hơn 30 sản phẩm), Domesco (khoảng 20 sản phẩm), Công ty dược liệu TW I (hơn 15 sản phẩm), các Xí nghiệp Dược phẩm Nam Hà, Hà Tây, Công ty cổ phần Dược phẩm OPC [42], [44], [46], [48], [50] Các sản phẩm này có thể được tạo ra bằng các cách khác nhau:

- Tạo chế phẩm từ bột dược liệu

-Tạo chế phẩm từ dịch chiết dược liệu

- Tạo chế phẩm từ hoạt chất tinh khiết được tách ra từ dược liệu

9

-Cách sản xuất chế phẩm từ dịch chiết dược liệu là phổ biến nhất ở nước

ta hiện nay Bằng cách này các công ty đã cho ra đời nhiều chế phẩm, ví

dụ như: Hoạt huyết dưỡng não, Ampelop, Boganic, Cebral, Dưỡng cốt hoàn, Hà thủ ô, Tradin extra, ích mẫu của Traphaco; Cantonin, Morantin, Geranin, Dentonin, Panacrin, Haina của Viện Dược liệu; Garlic, Dogarlic, Dogarlicin, Dogarlic-Trà xanh, Doragon, Dogarlic 300mg, Doladi, Hà Thủ ô, Domeric, ích mẫu, Morinda Citrifolia của Dome SCO; Kim tiền thảo OPC, linh chi OPC, Thuốc dưỡng não OPCan, Viên an thần Mimosa của Công ty cổ phần Dược phẩm OPC [42], [44], [46], [48], [50]

Trong kỹ thuật bào chế viên nén chứa cao dược liệu thường sử dụng tá dược độn Lactose hoặc Calci carbonat, tá dược rã Tinh bột hoặc tá dược đa năng độn, dính, rã như Avicel, tá dược trơn thường dùng là Talc và Magnesi stearat

Nang cứng chứa cao dược liệu chủ yếu sử dụng tá dược độn Lactose, tá dược rã Tinh bột, tá dược trơn Talc và Magnesi stearat

PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

^T h u ố c thử, dung môi, hoá chất

Các thuốc thử: HCl đậm đặc, Magnesi kim loại, FeCl3.5% (TT)

Dung môi, hoá chất: EtOH.90%, Chloroform, Methanol, cồn tuyệt đối, Aceton, Ethyl acetat, nước cất

- Máy nghiền thô, nghiền mịn (cỡ rây l,5mm) tại Bộ môn Công nghiệpDược, trường Đại học Dược Hà Nội (Việt Nam).

- Cân phân tích Mettler

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Máy dập viên ERWEKA

- Máy đóng nang thủ công (Ấn Độ)

- Máy đo độ cứng ERWEKA

- M áyđođộrãERW EKA

- Máy đo tỷ trọng ERWEKA SVM

- Máy đo độ trơn chảy ERWEKA GWF

- Cân xác định độ ẩm nhanh Sartorius MA 30

- Thiết bị bao màng mỏng truyền thống

- Các dụng cụ, thiết bị khác; dụng cụ thuỷ tinh, bếp điện, nồi đun, bình gạn, dao cầu, chày, cối, rây

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Phương pháp điều chế cao khô giảo cổ lam

Dựa theo kỹ thuật chung điều chế cao khô được ghi trong Dược điển Việt Nam [5], chúng tôi tiến hành điều chế cao khô Giảo cổ lam theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn điều chế cao khô Giảo cổ lam.

* Phương pháp chiết xuất:

- Phương pháp ngâm lạnh: Ngâm 2 lần, sử dụng dung môi Ethanol

2.1.2.2 Phương pháp định tính, định lượng Saponin và Flavonoid

\^Định tính Flavonoid và Saponin:

Chúng tôi tiến hành định tính Flavonoid và Saponin bằng phương pháp định tính trong ống nghiệm theo phương pháp ghi trong tài liệu [4]:

- Flavonoid (dùng phản ứng Cyanidin): Lấy mẫu thử (dược liệu, cao

khô, bột thuốc), thêm Ethanol.96% và đun sôi cách thủy khoảng 10 phút Lọc, lấy khoảng 2 ml dịch lọc cho vào một ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại và 3 - 4 giọt HCl đặc Sau vài phút màu của dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ

- Saponin (quan sát hiện tượng tạo bọt): Lấy mẫu thử cho vào một ống nghiệm

to, thêm nước, lắc mạnh trong 2 phút Để yên, cột bọt phải bền sau 15 phút

SĐ /n/ỉ lượng Flavonoid và Saponin:

Chúng tôi tiến hành định lượng Flavonoid và Saponin theo tài liệu [13] Quá trình định lượng được biểu diễn theo sơ đồ sau:

-

Ethyl acetat thu hồi

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ tóm tắt quy trình định lượng Saponin và Flavonoid

Mô tả quy trình:

Cân một lượng chính xác mẫu thử và cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet Chiết bằng Chloroform tới khi dịch chiết trong suốt, lấy túi bã dược liệu ra để bay hơi hết Chloroform Sau đó chiết bằng Methanol cho tới khi không còn Flavonoid (thử bằng phản ứng Cyanidin) và Saponin (quan sát hiện tượng tạo bọt) Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để lấy dịch đặc rồi cô tới cắn Hòa tan cắn trong một lượng tối thiểu Ethanol tuyệt đối, rót từ từ vào 50ml Aceton và khuấy nhẹ sẽ xuất hiện tủa

Lọc lấy tủa thu được Saponin toàn phần, sấy ở 70°c đến khối lượng không

đổi, cân khối lượng Saponin

Phần dịch lọc đem cô tới cắn, hòa tan vào khoảng 20ml nước nóng, lọc lấy dịch lọc cho vào bình gạn, chiết Flavonoid bằng Ethyl acetat nhiều lần cho đến khi kiệt Flavonoid (thử bằng phản ứng Cyanidin) Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy đến cắn Sấy cắn ở 70°c đến khối lượng không đổi Cân khối lượng Flavonoid

Tính ra hàm lượng Flavonoid và Saponin theo công thức:

Hàm lượng Flavonoid (Saponin) (%) = - -.100

Trong đó: a: Khối lượng cắn khô Flavonoid (Saponin) (g)

A: KJiối lượng mẫu thử đem định lượng (g)X; Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.1.23 Phương pháp bào chế viên nén và nang cứng từ cao Giảo cổ lam

s Phương pháp bào chế viên nén

Phương pháp dập thẳng Tiến hành theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế viên nén

theo phương pháp dập thẳng.

1 5

-IU Phương pháp đóng nang

Phương pháp đong thể tích Tiến hành theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế viên nang cứng.

13 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

* Thử độ rã của viên: Theo phương pháp của DĐVNIII, phụ lục 8.6

* Thử độ đồng đều khối lượng của viên: Theo phương pháp của DĐVN III,

phụ lục 8.3

* Thử độ cứng của viên nén: Xác định trên máy đo độ cứng ERWEKA.

IU Phương pháp khảo sát một số tính chất cơ lý của khối bột và của viên

Sau một khoảng thời gian T nhất định, cân khối lượng của khối bột (hoặc viên) và tính ra độ tăng khối lượng theo công thức:

Khả năng hút ẩm (sau thời gian T) (%) = xioo

Trong đó: nibđ là khối lượng của bột (hoặc viên) cân lúc đầu

là khối lượng của bột (hoặc viên) sau thời gian T

* Tỷ trọng biểu kiến

Được xác định trên máy đo tỷ trọng ERWEKA SVM

Công thức tính: dbk = mẠ^

Trong đó: dbị^: Tỷ trọng biểu kiến của khối bột (g/ml)

m: Khối lượng của khối bột (g)

V: Thể tích biểu kiến của khối bột (ml)

* Thành phần phân đoạn theo kích thước tiểu phân

Tiến hành rây khối bột qua các cỡ rây khác nhau và đánh giá

* Khả năng trơn chảy

Được đo trên máy đo độ trơn chảy ERWEKA GWF, đường kính lỗ phễu 1 Imm Công thức tính: V = tgọ

Trong đó: v: Tốc độ trofn chảy của khối bột (g/s)

(p: góc giữa đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng hạt chảy theo thời gian và trục hoành (trục thời gian)

* Độ chịu nén

Độ chịu nén của khối bột được xác định bằng cách: nén 0.3g bột trên thiết

bị nén thuỷ lực (có áp kế đo lực nén) với lực nén 600Kg/cm^, chày cối 9mm

Độ chịu nén được biểu thị bằng giá trị tuyệt đối của lực gây vỡ viên tạo thành sau khi nén

* Lực đẩy viên ra khỏi cối.

Được xác định đồng thời khi đo độ chịu nén Sau khi nén, bỏ c),

đẩy viên ra khỏi cối Lực đẩy viên ra khỏi cối được áp kế chỉ ra

1 7

-13 Phương pháp bao bảo vệ viên

- Thành phần công thức bao:

Tartrazin: 10% so với lượng HPMC

PEG 6000: 25% so với lượng HPMC

EtOH.50%, H2O

- Chuẩn bị tá dược bao:

+ HPMC được ngâm trương nở hoàn toàn trong nước; PEG 6000 được phối hợp vào trong cồn; Nghiền mịn Talc, TÌO2, Tartrazin trong cối Phối hợp dần các thành phần trên vào trong cối và tiếp tục nghiền trộn

+ Lượng EtOH.50% được sử dụng vừa đủ để tạo thành dung dịch có nồng độHPMClà5%

- Thiết bị bao và các thông số kỹ thuật: Viên được bao trong nồi bao truyền thống có tốc độ nồi quay 1 0 -1 5 vòng/phút; Đầu phun có kích thước lỗ phun là

1 mm; Tốc độ phun 1.5-2 ml/phút; Nhiệt độ gió vào 50 - 55°c

2.1.2.4 Phương pháp theo dối độ ổn định của thuốc

* Bảo quản mẫu: Mẫu thuốc được bảo quản trong 2 điều kiện:

- Điều kiện thực: + Nhiệt độ: 15 - 33°c

+ Độ ẩm: 65 - 85%

- Điều kiện lão hóa cấp tốc: + Nhiệt độ: 40 ± 2°c

+ Độ ẩm: 75 ± 5%

* Sau 45 ngày, tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu của viên theo phương pháp

đã được mô tả trong mục 2.1.2.4

2.1.2.5 Phương pháp xử lý kết quả thực nghiệm

Xử lý kết quả thực nghiệm bằng phưoỉng pháp thống kê, sử dụng Student test ở mức ý nghĩa a = 0,05

2 mẫu thử.

Mẫu thử 1; Dược liệu Giảo cổ lam

Mẫu thử 2: Cao khô Giảo cổ lam do Công ty cổ phần Dược và Vật tư Y tế Hải Dương sản xuất

Kết quả được ghi trong bảng 2.2 và 2.3

Bảng 2.2: Kết quả định lượng Flavonoid và Saponin trong dược liệu

Lần định lượng Lần

1

Lần2

Lần3

Lần4

Lần5

19-Bảng 2.3: Kết quả định lượng Flavonoid và Saponin trong cao khô

1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

- Hàm lượng Saponin trong cao khô do Công ty cổ phần Dược và Vật tư

Y tế Hải Dương sản xuất cao gấp 1.77 lần hàm lượng Saponin trong dược liệu, còn hàm lượng Flavonoid cao hơn 1.89 lần Điều này có thể là do sự sai khác về nguồn nguyên liệu dùng để chiết xuất

2.2.2 Nghiên cứu điều chế cao khô Giảo cổ lam

Trong quá trình điều chế cao khô Giảo cổ lam, các giai đoạn cô đặc và sấy khô được tiến hành theo phương pháp chung trong sơ đồ 2.1 Chúng tôi chỉ đi sâu vào nghiên cứu giai đoạn chiết xuất nhằm lựa chọn được phương pháp chiết xuất hiệu quả nhất cho 2 nhóm chất chính trong cây là Flavonoid

và Saponin

2.2.2.1 Lựa chọn phương pháp và dung môi chiết xuất

13 Sử dụng phương pháp ngâm lạnh và phương pháp ngấm kiệt với các dung môi EtOH.70%, EtOH.60%, và EtOH.50% Vì;

- Phương pháp ngâm lạnh và ngấm kiệt:

+ Có thể chiết được khá nhiều hoạt chất trong dược liệu

+ Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

- Các dung môi EtOH.70%, EtOH.60%, và EtOH.50%:

+ Có thể hòa tan các nhóm chất cần chiết trong Giảo cổ lam (Flavonoid, Saponin) và có khả năng hòa tan chọn lọc

+ Nhiệt độ sôi thấp nên có thể cô đặc nhanh ở nhiệt độ thấp, bảo vệ dược chất

+ Thích hợp với phương pháp ngâm lạnh, ngấm kiệt

+ Phổ biến, rẻ tiền, ít độc hại

s Sử dụng phương pháp sắc với dung môi H2O Vì:

+ Phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

+ Dung môi sẵn có, không độc hại

2.22.2, Chọn độ mịn của bột dược liệu và dung môi phù hợp nhất

E Sử dụng phương pháp ngấm kiệt:

Chúng tôi tiến hành chiết xuất theo phương pháp đã nêu trong mục2.1.2.1 với thời gian ngâm 36 giờ, sau đó định lượng Saponin và Flavonoid trong cao khô thu được theo phương pháp ghi trong mục 2.1.2.2

Làm với 3 dung môi:

- EtOH.70%

- EtOH.60%

- EtOH.50%

Và 3 mức độ mịn khác nhau của bột dược liệu:

- Độ mịn 1: Xay dược liệu qua máy xay (cỡ rây 1,5 mm)

- Độ mịn 2: Xay dược liệu qua máy xay và rây qua rây 1,0 mm

- Độ mịn 2; Xay dược liệu qua máy xay và rây qua rây 0,5 mm

Đánh giá hiệu quả chiết xuất của các dung môi đối với mỗi độ mịn củabột dược liệu Kết quả được trình bày ở các bảng 2,4, 2.5, 2.6 và các

21