Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào bacillus subtilis natto được cố định trong gel alginate

ĐẶT VẤN ĐỀ Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù ra đời chưa lâu nhưng nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội so với nhiều phương pháp sử dụng tế bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzyme – cơ sở của phương pháp bất động tế bào. Sản xuất các chế phẩm sinh học bằng phương pháp bất động tế bào cho năng suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn và đặc biệt có thể sản xuất liên tục trong một quá trình tự động hóa. Bất động tế bào đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở quy mô công nghiệp. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose… trong đó protease là enzyme được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Cố định tế bào B. subtilis natto có thể phát huy được các ưu điểm của phương pháp bất động tế bào hướng tới mục tiêu sản xuất enzyme protease. Vì vậy, khóa luận “Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được cố định trong gel alginate” được thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate. 2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NHUNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH

PROTEASE CỦA TẾ BÀO

Bacillus subtilis natto ĐƯỢC CỐ ĐỊNH

TRONG GEL ALGINATE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NHUNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH

PROTEASE CỦA TẾ BÀO

Bacillus subtilis natto ĐƯỢC CỐ ĐỊNH

TRONG GEL ALGINATE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

cô giáo ThS Kiều Thị Hồng và TS Đàm Thanh Xuân, giảng viên Bộ môn Công

nghiệp Dược, những người thầy đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới DS Lê Ngọc Khánh, ThS

Nguyễn Khắc Tiệp đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu và giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Nguyễn Thị Nhung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto: 2

1.1.1 Phân loại khoa học: 2

1.1.2 Nguồn gốc: 2

1.1.3 Đặc điểm hình thái: 2

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng: 3

1.1.5 Đặc điểm sinh lý: 3

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto: 4

1.2 Alginate: 4

1.2.1 Cấu trúc của alginate: 4

1.2.2 Tính chất của alginate: 5

1.2.3 Ứng dụng của alginate: 7

1.3 Phương pháp cố định (bất động) tế bào: 7

1.3.1 Lịch sử phát triển: 7

1.3.2 Các phương pháp bất động tế bào: 9

1.3.3 Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào: 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị: 14

2.1.1 Chủng vi sinh vật sử dụng: 14

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng: 14

2.1.3 Môi trường sử dụng: 14

2.1.4 Máy móc và dụng cụ: 15

2.2 Nội dung nghiên cứu: 16

2.2.1 Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate: 16

2.2.2 Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt. 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 17

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy chủng Bacillus subtilis natto: 17

2.3.2 Phương pháp làm sữa đậu nành: 18

2.3.3 Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginate: 18

2.3.4 Phương pháp phá hạt: 18

2.3.5 Phương pháp thử hoạt tính enzyme protease: 18

2.3.6 Phương pháp xác định số lượng tế bào: 19

2.3.7 Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate: 22

3.2 Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 25

3.2.1 Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B subtilis natto: 25

3.2.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

Kết luận: 35 Kiến nghị: 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis natto Bacillus subtilis natto

thành)

(Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)

DANH MỤC CÁC BẢNG

4

3.2 Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy

hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang tại 3 thời

điểm 24h, 48h, 72h

26

5

3.3 Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy

hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang – sữa đậu

nành tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h

27

6

3.4 Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy

hạt calci alginate 3% trong môi trường sữa đậu nành tại 3

thời điểm 24h, 48h, 72h

28

7

3.5 So sánh đường kính vòng phân giải casein của enzyme

protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau

theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B subtilis natto

29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

7

3.1 Biến thiên đường kính vòng phân giải casein của enzyme

protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau

theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B subtilis natto

29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù ra đời chưa lâu nhưng

nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội so với nhiều phương pháp sử dụng tế bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzyme – cơ sở của phương pháp bất động

tế bào Sản xuất các chế phẩm sinh học bằng phương pháp bất động tế bào cho năng suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn và đặc biệt có thể sản xuất liên tục trong một quá trình tự động hóa Bất động tế bào đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở quy mô công nghiệp

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh

nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose… trong đó protease là enzyme được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con

người Cố định tế bào B subtilis natto có thể phát huy được các ưu điểm của

phương pháp bất động tế bào hướng tới mục tiêu sản xuất enzyme protease Vì vậy,

khóa luận “Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được

cố định trong gel alginate” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel

alginate

2 Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto:

Tên khác: Bacillus subtilis subsp natto; Bacillus var natto

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis

được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [29]

1.1.1 Phân loại khoa học:

B subtillis natto là một vi khuẩn nhân thật (EurobacterEur) thuộc: Giới:

Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [29] Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto

[29], [42]

Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi sinh vật mới Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B natto và B subtlilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [39], [41]; các khóa phân loại đã xếp B

subtilis natto là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác

là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [29], [35]

Trong dòng B subtilis natto còn có nhiều loại như B subtilis natto B – 12 [43]; B subtilis natto N – 77 [40];…

1.1.2 Nguồn gốc:

B subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập từ Natto – món ăn truyền

thống của người Nhật Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt [29], [35]

1.1.3 Đặc điểm hình thái:

B subtilis natto là trực khuẩn hình que, Gram (+) Nội bào tử hình que có

chuỗi (Hình 1.1)

Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định Bề mặt hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [29]

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn Bacillus subtilis natto [29]

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng:

B subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydrocarbon: đường đơn (glucose, fructose…); đường đôi (maltose, lactose, saccharose…); polysaccharid (tinh bột…) [29], [27]

Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là acid amin và protein VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan, phenylalanin VSV cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào dinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được [27]

1.1.5 Đặc điểm sinh lý:

B subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận

điện tử khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Vi khuẩn có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%

Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng Nhiệt độ thích hợp cho B

subtilis natto phát triển là 30 – 500C, nhiệt độ tối thích là 370C Ở 550C, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy

B subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu

cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6 Ở pH 4,5 thì sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế [29], [27]

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto:

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis natto có khả năng sinh

nhiều sản phẩm trao đổi chất: -PG A; levan (fructan); trong đó đặc biệt là nhóm các enzyme ngoại bào: nhóm enzyme -transpeptidase, phytase, amylase, cellulose

và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [24], [34]

1.2 Alginate:

Alginate là tên gọi chung của các muối của acid alginic Acid alginic có trong các loài tảo nâu, rong mơ (Sargassum), tồn tại chủ yếu ở dạng muối với các

1.2.1 Cấu trúc của alginate:

Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc

nhau bằng liên kết 1,4-glucosid Tuy nhiên, hai monomer này không liên kết một cách ngẫu nhiên mà tạo thành ba loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau GGGG, block homopolymemannuronic gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau MMMM, và block liên hợp MGMG

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của acid (M) và acid

(G)

Tùy theo nguồn gốc của alginate mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau Điều này làm cho tính chất của alginate biến đổi trong một dải rộng [13]

Hình 1.3 Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG [45]

1.2.2 Tính chất của alginate:

muối của các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước Còn

nước như alcol, ceton… và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [13]

- Độ nhớt: Natri alginate khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt

dao động trong khoảng từ 10-3.500 cps Độ nhớt này tăng tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử trung bình của alginate, với nồng độ alginate sử dụng và giảm đi khi tăng nhiệt độ Độ nhớt của dung dịch alginate còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion kim loại có trong dung dịch [13]

- Độ ổn định: Alginate khô giống như các polysaccharid tự nhiên khác, rất

không bền với oxy, nhiệt độ và ion kim loại Khi có mặt các tác nhân này alginate

sẽ bị rã ra Độ ổn định của các muối aginate xếp theo thứ tự: Natri alginate > Amoni alginate > Acid alginic, càng xếp cuối các muối càng kém ổn định Ngoài ra thêm

alginate [13]

- Sự gel hóa: Dung dịch Natri alginate có khả năng tạo gel khi phản ứng với

các ion kim loại hóa trị II, III Các gel này được hình thành ở các mức nhiệt độ nhỏ

dài sẽ cho gel bền hơn Module đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion liên kết ngang và

ái lực giữa các cation liên kết ngang Ngoài ra, độ bền gel còn phụ thuộc vào các yếu tố môi trường Về ảnh hưởng của cấu trúc phân tử tới độ bền gel: đoạn M-block thể hiện tính đàn hồi, còn đoạn G thể hiện mức độ cứng rắn của gel Các đặc tính này được quan tâm trong nhiều ứng dụng của alginate [13], [23]

Hình 1.4 Quá trình tạo gel của các phân tử calci alginate [45]

Hình 1.5 Liên kết của ion Ca 2+ với alginate

1.2.3 Ứng dụng của alginate:

Sản lượng alginate trên toàn thế giới khoảng 32000-39000 tấn/năm, những nước sản xuất alginate nhiều nhất là Scotlen, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha, Trung Quốc… Ở Việt Nam, chúng ta có nguồn rong mơ khá phong phú thích hợp cho việc sản xuất alginate thương phẩm đạt chất lượng và thực tế ở Nha Trang, Khánh Hòa

đã sản xuất được alginate thương phẩm đạt chất lượng [13]

Alginate được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: dệt, thực phẩm, dược phẩm – mỹ phẩm (vật liệu lấy khuôn răng, chế tạo chất cầm máu, thuốc thải xạ, thuốc trị bệnh đau dạ dày, làm tá dược dính…)… [12]

1.3 Phương pháp cố định (bất động) tế bào:

1.3.1 Lịch sử phát triển: [9]

Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy enzyme invertase của nấm men khi hấp phụ trên than hoạt vẫn giữ nguyên hoạt tính cho phản ứng thủy phân đường mía Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzyme Sau đó đã có rất nhiều nghiên cứu và báo cáo về bất động enzyme trên thế giới

Phương pháp cố định tế bào ngày nay bắt nguồn từ phương pháp cố định enzyme Nguyên lý của phương pháp cố định enzyme có thể được mô tả như sau: "Enzyme đã tinh chế ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói trong những polymer không hòa tan trong nước Các hạt chứa enzyme sẽ được nhồi vào các cột hình trụ

có kích thước thích hợp, cho dung dịch cơ chất chảy qua cột, enzyme sẽ thực hiện phản ứng phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng" [1]

Đặc điểm của enzyme cố định: Enzyme cố định có đặc điểm như sau: [44]

 Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do cùng loại

 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một số sai khác nhất định: xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang hoặc xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán

 Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do

 Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng enzyme tự do cùng loại

 Enzyme cố định có chất mang chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzyme tự do

 Enzyme cố định có thể tái sử dụng và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách

dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do

So với các enzyme ở dạng tự do, các enzyme được bất động có nhiều ưu điểm nổi bật hơn: [32], [19]

 Cho phép sử dụng enzyme nhiều lần, từ đó giá thành sản xuất một đơn vị sản phẩm rẻ đi nhiều lần

 Có thể tiến hành quá trình liên tục, đồng thời có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách enzyme ra khỏi cơ chất

 Enzyme không bị lẫn trong sản phẩm

Mặc dù có những ưu điểm như trên nhưng bất động enzyme cũng gặp nhiều khó khăn trong quá trình thực hiện: [32]

 Việc tách chiết, tinh chế enzyme ra khỏi tế bào gặp nhiều khó khăn, phức tạp

và tốn kém

 Các enzyme thường bị giảm hoạt tính do chịu ảnh hưởng của các phản ứng bất động enzyme lên cơ chất

 Các enzyme thiếu ổn định khi tách khỏi tế bào

Để khắc phục những nhược điểm trên, người ta tìm cách bất động toàn bộ tế bào thay cho bất động enzyme Khi đó, không cần phải tách chiết enzyme ra khỏi tế

bào nên tránh được việc làm giảm hoạt tính enzyme, cho phép sử dụng enzyme ở trạng thái ổn định hơn, không phải tốn chi phí cho việc tinh chế mà vẫn tận dụng được các ưu điểm của phương pháp bất động enzyme

Nguyên tắc của bất động tế bào là giữ hoặc cố định tế bào ở những vị trí xác định về mặt không gian mà không làm thay đổi hoạt tính của chúng Các tế bào này

 Phương pháp liên kết với chất mang:

Bản chất của phương pháp liên kết với chất mang là phương pháp liên kết giữa các chất xúc tác sinh học (tế bào, enzyme…) với chất mang không tan trong nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt Đặc tính của vật liệu làm chất mang là có độ cứng cơ học, ổn định về mặt sinh học và không gây độc với tế bào để có thể liên kết với các chất xúc tác sinh học

Các vật liệu thường sử dụng làm chất mang là: các polysaccharid không tan trong nước (celluluse, dextran, dẫn chất của agarose…), các protein (gelatin, albumin…), các polymer nhân tạo (dẫn xuất của polystyrene, polyurethane, nhựa trao đổi ion…) và các vật liệu vô cơ (cát, thủy tinh, ceramic…) [18],[10]

Phương pháp liên kết với chất mang thường ít được sử dụng cho bất động tế bào vì các chất mang thường là các chất độc với tế bào và việc tìm kiếm điều kiện

để bất động tế bào thường gặp khó khăn

 Phương pháp tạo liên kết ngang:

Phương pháp tạo liên kết ngang không sử dụng chất mang để cố định tế bào

mà các tế bào được liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet, tác nhân tạo thành liên kết ngang thường là glutaraldehyd, các diisocyanat… trong

đó glutaraldehyd là tác nhân phổ biến nhất Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo thành các liên kết ngang liên kết các tế bào Các tác nhân nhóm diisocyanat như: toluen diisocyanat, hexa methyl diisocyanat… lại tạo liên kết ngang bằng cách liên

kết nhóm urea với các nhóm amino Enzyme aspertase của E coli và Bacillus

coagulans cũng đã được bất động bằng phương pháp này với glutaraldehyd hoặc

toluen diisocyanat [18], [10], [28], [9]

 Phương pháp bẫy:

Dựa vào tính chất của vật liệu dùng để bẫy các tế bào vi khuẩn mà phương pháp bẫy được phân chia thành 4 dạng, đó là: dạng lưới, dạng nang nhỏ (microcapsule), dạng liposome và dạng màng

cơ học hoặc bị hòa tan dần khi có mặt các chất có khả năng tạo phức chelat với ion

hơn Ca-alginate vì ít bị tác động của các ion chelat và các tác nhân hóa học hơn

 Dạng nang nhỏ (microcapsule): Tế bào được gói trong các màng polymer thẩm thấu nhân tạo tạo thành các nang nhỏ

 Dạng lyposom: Các tế bào vi sinh vật được bẫy trong các màng chất lỏng tạo thành từ hợp chất amphiphtalic

 Dạng màng: Chất xúc tác sinh học được tách riêng khỏi môi trường bằng các màng siêu lọc, màng lọc hoặc bằng các sợi rỗng

Phương pháp bẫy được sử dụng phổ biến trong bất động tế bào Tế bào nấm men, vi khuẩn cũng như các tế bào động thực vật đều có thể được bất động bằng phương pháp này [18], [10], [21]

Hình 1.6 Các phương pháp bất động tế bào cơ bản [32]

1.3.3 Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào:

 Sản xuất kháng sinh:

Kháng sinh là nhóm thuốc rất cần thiết cho cuộc sống con người và hầu hết các kháng sinh thu được bằng con đường lên men vi sinh vật Theo các phương pháp truyền thống, các kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên men

mẻ trong các bình lên men Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh người ta đã tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục Điều này khó có thể thực hiện được với các tế bào tự do, khi đó bất động tế bào trở thành giải pháp hiệu quả nhất Nhiều kháng sinh đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp từ các nguyên liệu ban đầu được tạo ra từ phương pháp bất động tế bào như: oxytetracyclin, penicillin, bacitracin, neomycin, candicidin, cephalosporin… [18]

 Sản xuất các acid hữu cơ:

Bên cạnh phương pháp tổng hợp hóa học thì hiện nay một số acid hữu cơ cũng được sản xuất bằng bất động tế bào như: acid citric, acid lactic, acid acetic…

Ví dụ: Để sản xuất acid citric, hiện nay chủ yếu sử dụng các tế bào Yarrowia

lipolytica [38] hoặc Aspergillus niger cố định trên cơ chất khác nhau như alginate,

agarose, polyacrylamid hay cho hấp phụ lên cột bọt polyurethane hoặc bẫy vào các sợi rỗng với chất mang sử dụng là cellulose xốp… Tiến hành theo phương pháp lên men gián đoạn

Để sản xuất acid lactic, hiện nay các nhà khoa học hay sử dụng các chủng

Lactobacillus như: L helveticus [21], L casei [22], [26], L delbrueckii [25], [31],

L plantarum [33], L rhamnosus… hay chủng Lactococcus lactic [30], [37], được

cố định trên các chất mang khác nhau như: alginate, k-carrageenane… và tiến hành theo phương pháp lên men mẻ, lên men liên tục…

Lên men bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ khác như: acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic…

 Sản xuất enzyme:

Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzyme, đặc biệt phương pháp bất động tế bào là kỹ thuật thích hợp nhất để sản xuất các enzyme ngoại bào

glucoamylase được quan tâm nghiên cứu nhiều Chất mang hay sử dụng là polyacrylamid, alginate, agar và các polymer khác Ví dụ, để sản xuất -amylase sử

dụng tế bào B cereus được bất động vào chất mang alginate, sau đó các hạt nhồi

vào thiết bị phản ứng tầng sôi để sản xuất liên tục -amylase, với cách làm này hiệu suất phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do Ngoài ra, có thể

k-carragenenane có bổ sung thêm glycin Ngoài ra nhiều enzyme quan trọng khác cũng được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động như: invertase, lipase, protease, cellulose, -galactadase, xylanase, L – aminoacylase… [20]

 Tổng hợp các alcol:

VSV được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng phương pháp bất động tế

bào là nấm men S cerevisiae và Z mobilis Phương pháp sử dụng là phương pháp bẫy trong gel alginate, các tế bào S cerevisiae được giữ trong mạng lưới gel để

không bị khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào

này là: hiệu suất lên men đạt được cao hơn, tế bào ít bị ảnh hưởng có hại của môi trường và quá trình lên men diễn ra nhanh với dung dịch đường ở nồng độ cao [18]

Ở Việt Nam, kỹ thuật bất động đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Trong đó phương pháp bất động tế bào chứa enzyme bằng phương pháp gói trong khuôn gel (bẫy gel) calci alginate được sử dụng khá phổ biến để bất động tế bào nấm men ứng dụng lên men sản xuất alcol [16] Bộ môn Công nghiệp Dược cũng

đã có công trình nghiên cứu về bất động tế bào S cerevisiae trên calci alginate để

sản xuất ethanol và được ứng dụng làm bài thực tập cho sinh viên dược [2]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị:

2.1.1 Chủng vi sinh vật sử dụng:

Bacillus subtilis natto

Nguồn gốc: Nhật Bản

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

Cân kỹ thuật Đức (Satorius)

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, cốc có mỏ, ống đong, cốc có chân, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8cm), đĩa petri thủy tinh (đường kính 9cm), ống nghiệm, pipet bấm, đầu côn, ống li tâm, thước kẹp Palmer…

2.2 Nội dung nghiên cứu:

Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau:

2.2.1 Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate:

+ Xác định số lượng tế bào cố định được trong hạt gel trước và sau khi nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí sau 24h

+ Xác định số lượng tế bào có trong dịch nuôi cấy khi nuôi cấy hạt gel ở điều kiện hiếu khí sau 24h

2.2.2 Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt

+ Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy các hạt gel

alginate cố định B subtilis natto với môi trường canh thang và môi trường chứa sữa

đậu nành

+ Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt gel

alginate cố định B subtilis natto ở các thời điểm khác nhau

+ Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: Xác định số lượng tế bào vi khuẩn B

subtilis natto giữ lại được trong 1g hạt gel alginate 3% sau khi giữ trong môi trường

canh thang ở tủ lạnh sau thời gian 1 tháng