Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid và thời gian tạo hạt đến quá trình cổ định tế bào nấm men sacharomyces cerevissiae

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vài năm gần đây các dạng thuốc probiotics đang rất đƣợc quan tâm nghiên cứu và phát triển bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại cho sức khỏe của con ngƣời. Trong đó, Lactobacillus acidophilus là một trong những chủng vi sinh vật probiotics phổ biến nhất hiện nay bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại. L. acidophilus xuất hiện từ rất sớm trong những thực phẩm truyền thống nhƣ sữa tƣơi, sữa chua, cũng nhƣ các sản phẩm bổ sung dinh dƣỡng23. Ở nƣớc ta, việc phát triển các sản phẩm probiotics đang trong giai đoạn đầu. Dạng bào chế probiotics thông dụng hiện nay là bột và cốm. Việc đảm bảo độ sống sót của vi sinh vật và bảo vệ vi sinh vật khi sử dụng qua đƣờng uống là vấn đề lớn còn mắc phải, do khi sử dụng theo đƣờng uống thuốc phải chịu tác động của các yếu tố nhƣ: pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật…23 là các yếu tố làm suy giảm số lƣợng sống sót của vi sinh vật đi rất nhiều. Trên thế giới, các nƣớc đã và đang tập trung nghiên cứu phát triển nhiều loại chế phẩm probiotics dạng pellet, bởi dạng pellet có nhiều ƣu điểm lớn nhƣ: rút ngắn thời gian lƣu thuốc ở dạ dày, ít bị rã ở dạ dày; mặt khác do pellet hình cầu, bề mặt nhẵn thuận tiện cho quá trình bao màng nhằm mục đích bảo vệ vi sinh vật, bao tan trong ruột…2, 3. Từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng của tá dƣợc lên khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilustrong pellet probiotic” nhằm 3 mục tiêu sau: 1. Khảo sát một số thông số trong quá trình tạo pellet probiotics chứa Lactobacillus acidophilustừ nguyên liệu đông khô tự tạo. 2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics. 3. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose đến số lƣợng vi sinh vật trong pellet thu đƣợc.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CAO HÀ PHƯƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG

ĐỘ CALCI CLORID VÀ THỜI GIAN

TẠO HẠT LÊN QUÁ TRÌNH

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN

Saccharomyces cerevisiae

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CAO HÀ PHƯƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG

ĐỘ CALCI CLORID VÀ THỜI GIAN

TẠO HẠT LÊN QUÁ TRÌNH

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

tới cô giáo ThS Kiều Thị Hồng – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và cô giáo TS Đàm Thanh Xuân, thầy giáo DS Lê Ngọc

Khánh, những người thầy đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn, để tôi có thể hoàn thành đề tài này

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể thầy cô giáo trong trường đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong suốt những năm học tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Cao Hà Phương

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… …1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ……….….2

1.1 Phương pháp cố định (bất động) tế bào ……… 2

1.1.1 Phương pháp cố định tế bào ……….….2

1.1.1.1 Phân loại……….….2

1.1.1.2 Ưu nhược điểm ……… 3

1.1.1.3 Ứng dụng ……… 4

1.1.2 Alginat ……… 5

1.1.2.1 Nguồn gốc……… 6

1.1.2.2 Cấu tạo, tính chất……….…6

1.1.2.3 Ứng dụng……….…9

1.2 Nấm men Saccaromyces cerevisiae……… 10

1.2.1 Phân loại khoa học ……….10

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo ………11

1.2.3 Đặc điểm sinh lý ……….11

1.2.4 Ứng dụng ………13

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị ……… 15

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất ……….15

2.1.2 Vi sinh vật sử dụng ……….15

2.1.3 Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men ………15

2.1.4 Dụng cụ, thiết bị ……….16

2.2 Nội dung nghiên cứu ……… 17

2.2.1 Khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt….………… 17

2.2.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong hạt.……….17

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……….17

2.3.1 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng……….….…….17

2.3.2 Phương pháp cấy nhân giống từ môi trường thạch nghiêng…….…… 17

2.3.3 Phương pháp xác định sinh khối trong mẫu nuôi cấy ………….…… 18

2.3.4 Phương pháp đồng nhất alginat với sinh khối……….18

2.3.5 Phương pháp tạo hạt bất động tế bào……….… 18

2.3.6 Phương pháp nuôi cấy hiếu khí hạt chứa sinh khối……….19

2.3.7 Phương pháp phá hạt………19

2.3.8 Phương pháp đo các kích thước của hạt……….… 19

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ……….20

3.1 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt ……….…….…20

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid đến kích thước hạt…… 20

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm trong calci clorid lên sự

hình thành hạt………22

3.1.3 Khảo sát lượng sinh khối tối đa cố định được……… ….27

3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong hạt………30

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch

calci clorid lên khả năng giữ tế bào nấm men của hạt cố định trong

nuôi cấy hiếu khí……….… 30

3.2.2 Khảo sát mối liên quan giữa kích thước hạt và số lượng tế bào

cố định trong quá trình tạo hạt……… 33

3.2.3 Khảo sát mối liên quan giữa kích thước hạt và số lượng tế bào

cố định trong quá trình nuôi cấy hiếu khí……… 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……… 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 3.6 Lượng sinh khối trong mỗi bình nuôi cấy hiếu khí sau chứa các

hạt khác nhau về kích thước sau 24h

35

Bảng 3.7 Lượng sinh khối ban đầu dùng để trộn và lượng sinh khối sau

khi nuôi cấy hạt ở mỗi bình trong điều kiện hiếu khí

36

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.2 ion Ca2+ kết hợp với sợi alginat tạo thành mạng lưới 7 Hình 3.1 Hạt bị cắt sau các khoảng thời gian ngâm khác nhau (hạt to)

trong calci clorid 2%

23

Hình 3.2 Hình ảnh hạt được tạo thay đổi theo thời gian (hạt to) ngâm

trong calci clorid 2%

Đồ thị 3.1 Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt

cố định theo thời gian của loại hạt nhỡ

24

Đồ thị 3.2 Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt

cố định theo thời gian của loại hạt to

24

“Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCl 2 và thời gian tạo hạt lên quá

trình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae”

Với các mục tiêu:

1 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt

2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong hạt

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Phương pháp cố định (bất động) tế bào:

1.1.1 Phương pháp cố định tế bào:

Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy enzym invertase của nấm men khi hấp phụ trên than hoạt vẫn giữ nguyên hoạt tính cho phản ứng thủy phân đường mía Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzym, sau đó đã có rất nhiều nghiên cứu và báo cáo về bất động enzym trên thế giới

Phương pháp cố định tế bào ngày nay bắt nguồn từ phương pháp cố định enzym Nguyên lý của phương pháp cố định enzym có thể được mô tả như sau: Enzym ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói vào những polymer không hòa tan trong nước Các hạt enzym này được nhồi vào trong cột hình trụ có kích thước thích hợp, sau đó cho dung dịch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng phân cắt tạo các sản phẩm tương ứng

1.1.1.1 Phân loại:

Có thế chia phương pháp cố định tế bào ra làm 4 loại: liên kết với chất mang, liên kết ngang, bẫy và kết hợp các phương pháp trên

o Phương pháp liên kết với chất mang:

Bản chất của phương pháp này là liên kết của các chất xúc tác sinh học (tế bào, enzym…) với các chất mang không tan trong nước thông qua các liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt Đặc tính của vật liệu làm chất mang: độ cứng cơ học, vật lý, hóa học, độ ổn định sinh học và không độc Thường dùng các polysaccharide không tan trong nước (cellulose, dextran, dẫn xuất agarose…), các protein (gelatin, albumin…), các polymer nhân tạo (polystyrene, nhựa trao đổi ion, polyerethan…), các vật liệu vô cơ (thủy tinh, ceramic…) Phương pháp đồng hóa trị được sử dụng thường xuyên để bất động các enzym, nhưng ít dùng cho bất động tế bào vì tác nhân cần có sự hình thành liên kết đồng hóa trị thường là các chất độc với tế bào [15],[17],[24]

o Phương pháp tạo liên kết ngang:

Tác nhân tạo liên kết ngang như glutaraldehyd, các diisocyanat… trong đó glutaraldehyd là tác nhân phổ biến nhất Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo thành liên kết ngang với tế bào Các tác nhân nhóm diisocyanat (toluene diisocyanat…) tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea với các nhóm

amoni Enzym aspetase của E coli và Bacillus coagulans được bất động bằng

Nguồn nguyên liệu tự nhiên để bất động tế bào thường sử dụng là các polysaccharide như: alginat, k-carageenan, agar…, trong đó alginat được sử dụng phổ biến nhất [15],[30] Một số nghiên cứu gần đây về gel Calci-pectat cũng là một

sự lựa chọn mới cho bất động tế bào [30]

1.1.1.2 Ƣu nhƣợc điểm:

Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp bẫy với chất mang là alginat có những ưu nhược điểm như sau:

■ Ưu nhược điểm của phương pháp:

- Ưu điểm: Đảm bảo cho các quá trình sản xuất liên tục Có thể ngừng nhanh quá trình phản ứng bằng cách tách hệ chất mang chứa tế bào ra khỏi cơ chất Mật độ

tế bào trên mỗi đơn vị thể tích của hệ cao hơn nên có thể dùng các thiết bị phản ứng nhỏ hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn, sự hấp thu cơ chất tăng và cải thiện năng

suất Mật độ tế bào cao hơn còn giúp hạn chế sự sinh trưởng các vi sinh vật có hại nên giảm khả năng nhiễm Quá trình lọc, tách chiết, tinh chế sản phẩm dễ dàng hơn

do giảm lẫn vi sinh vật trong sản phẩm Đơn giản hóa công nghệ, giảm chi phí Chất mang bảo vệ vi sinh vật chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lai và tác nhân lý hóa như nhiệt độ, pH, dung môi, thậm chí là kim loại nặng

- Nhược điểm: Khi tế bào tăng quá nhiều sẽ làm giảm độ bền gel Tế bào trên

bề mặt tăng lên nhiều lần và dễ thoát khỏi mạng gel rồi phát triển trong môi trường như tế bào tự do

■ Ưu nhược điểm của tế bào cố định:

- Ưu điểm: Hoạt tính của chất xúc tác sinh học trong tế bào bất động được giữ

ổn định và kéo dài Khả năng chịu đựng nồng độ cơ chất cao, giảm sự ức chế từ sản phẩm cuối

- Nhược điểm: Có hiện tượng rò rỉ tế bào vào dịch sản phẩm ít nhiều ảnh hưởng đến quá trình tinh chế Chất xúc tác sinh học ngoài sự bao bọc bởi thành tế bào, màng sinh chất thì lại có thêm chất mang làm cản trở sự thẩm thấu cơ chất và sản phẩm giữa tế bào và môi trường Những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ rất khó tiếp xúc với tế bào nên hoạt lực có thể sẽ thấp hơn so với tế bào tự do Tế bào

cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng đảm bảo khả năng phát triển và hoạt động bình thường Khi đó, trong hệ thống sử dụng tế bào cố định

có thể xảy ra hiện tượng phân hủy sản phẩm để cung cấp đầy đủ năng lượng và chất dinh dưỡng đầy đủ cho tế bào, vì thế mà có thể hiệu suất sử dụng tế bào cố định lại thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do

1.1.1.3 Ứng dụng:

o Sản xuất kháng sinh:

Một số kháng sinh được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: oxytetracyclin, neomycin, cephalosporin… Ampicillin và amoxicillin là 2 kháng sinh được tổng hợp từ 6-APA 6-APA được sản xuất ở qui mô công nghiệp

bằng cách cho penicillin G chảy qua các tế bào E coli hoặc Bacillus megatherium

(có hoạt tính enzym penicillinase cao) bất động trên các chất mang khác nhau, hiệu suất đạt tối 99,5% [5],[30]

o Sản xuất các acid hữu cơ:

Một số acid hữu cơ được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào: acid

citric, acid lactic, acid acetic Trong sản xuất acid citric, tế bào Aspergillus niger

được bất động bằng gel alginat, agarose, polyacrylamide hoặc hấp phụ trên cột polyurethane Bất động tế bào làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất acid citric [7]

o Sản xuất enzym:

Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzym Trong các enzym thì enzym thủy phân tinh bột α-amylase và glucoamylase được nghiên cứu nhiều hơn cả Tế

bào Bacillus cereus được bất động bằng Calci alginat, nhồi vào thiết bị phản ứng

tầng sôi để sản xuất liên lục α-amylase chịu nhiệt cho tốc độ phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do Ngoài ra, ta có thể sản xuất α-amylase từ

các tế bào biến đổi của E.coli bất động trong -carrageenan có bổ sung thêm glycin Vài enzym quan trọng khác cũng được nghiên cứu bằng phương pháp bất động tế bào như: invertase, lipase, protease…[13],[30]

o Sản xuất ancol:

Các vi sinh vật phổ biến để sản xuất ancol bằng phương pháp bất động tế bào

là Saccaromyces cerevisiae và Zimomonas mobilis Nhiều chất được nghiên cứu,

phát triển, đưa vào ứng dụng rộng rãi như sorbitol, glycerol, propan – diol, 2,3 – butandiol, ethanol, mannitol, xylitol Trong đó sản xuất ethanol được nghiên cứu,

ứng dụng rộng rãi [8]

1.1.2 Alginat:

Hiện nay, trong các phương pháp cố định tế bào, phương pháp bẫy tế bào trong chất nền polymer được quan tâm nhất, đặc biệt là sử dụng gel alginat Hạt gel alginat có dạng hình cầu, trong mỗi hạt, gel alginat tạo thành một mạng lưới bao quanh tế bào, cố định các tế bào trong đó Gel alginat có nhiều ưu điểm: dễ chuẩn

bị, không độc với tế bào, độ bền cơ học khá tốt, độ xốp thuận lợi cho sự khuếch tán

cơ chất và sản phẩm Nhược điểm là có thể bị nứt vỡ dưới các tác động cơ học, hoặc

bị hòa tan dần khi có mặc các chất cạnh tranh với các ion Ca2+ [27]

1.1.2.1 Nguồn gốc:

Alginat có nhiều nhất trong tảo nâu, rong mơ, là muối của acid alginic với các ion kim loại chủ yếu là Ca2+, Mg2+, Na+, Ba2+ Acid alginic được Stanford phát hiện đầu tiên năm 1881 trong tảo nâu, là acid hữu cơ có trọng lượng phân tử 32.000- 200.000

1.1.2.2 Cấu tạo, tính chất:

o Cấu tạo:

Acid alginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng cấu tạo từ 2 gốc uronic là acid α-L-guluronic (G) và acid β-D-mannuronic (M) nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid Tuy nhiên, hai monomer này không liên kết một cách ngẫu nhiên mà tạo thành 3 loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau GGGG, block homopolymeemannuronic gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau MMMM, và block liên hợp MGMG Tùy theo nguồn gốc của alginat và độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau Điều này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một khoảng rộng [9]

Hình 1.1: Cấu trúc của natri alginat

Hình 1.2: ion Ca 2+

kết hợp với sợi alginat tạo thành mạng lưới [31]

o Tính chất:

 Độ hòa tan: các muối alginat kim loại hóa trị I (Na+

, K+…), muối amoni và các muối của các amin phân tử lượng thấp tan được trong nước Còn các muối alginat của các kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+) thì không tan được (trừ muối Mg+) Các muối alginat hòa tan trong các dung môi than nước như alcol, aceton… và dễ dàng hòa tan hơn khi đun nóng

Natri alginat là một vật liệu hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu được bảo quản trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp Dung dịch natri alginat ổn định nhất ở pH 4-10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại, hấp tiệt khuẩn có thể làm giảm

độ nhớt của dung dịch [20],[29] Natri alginat tan chậm trong nước tạo dung dịch keo nhớt; thực tế không tan trong ethanol (95%), ether, chloroform, và dung dịch ethanol nước có chưa hơn 30% ethanol; không tan trong các dung môi hữu cơ khác [16],[25]

 Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành các dung dịch có độ nhớt

dao động từ 10-3500 cps Độ nhớt này tỉ lệ thuận vối khối lượng phân tử trung bình của alginat, nồng độ alginat sử dụng và giảm đi khi tăng nhiệt độ Khi duy trì nhiệt

độ ở 50oC trong nhiều giờ thì alginat sẽ bị cắt mạch và giảm độ nhớt Nhưng khi hạ nhiệt độ đến đông đặc rồi làm rã bằng thì độ nhớt của dung dịch không thay đổi đáng kể Độ nhớt của dung dịch alginat còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion kim loại có trong dung dịch

 Độ ổn định: alginat khô giống như các polysaccharide tự nhiên khác, rất

không bền với oxy, nhiệt độ và ion kim loại Khi có mặt các tác nhân này alginat sẽ

bị rã ra Độ ổn định của các muối alginat xếp theo thứ tự: natri alginat > amoni alginat > acid alginic Alginat có độ nhớt cao nhanh bị rã hơn alginat có độ nhớt trung bình hoặc thấp Ở nhiệt độ thường bột natri alginat khô chỉ bảo quản được vài tháng nhưng nếu hạ nhiệt độ và bảo quản tối thì sẽ duy trì được lâu hơn Còn nếu đông sâu thì có thể bảo quản được vài năm mà không giảm đáng kể khối lượng phân tử Các dung dịch alginat ổn định ở pH 5,5-10 và chuyển thành dạng gel ở pH

< 5,5 Ngoài ra thêm một lượng nhất định ion Ca2+ cũng làm tăng độ ổn định của các dung dịch alginat

 Sự gel hóa: dung dịch alginat natri có khả năng tạo gel khi phản ứng cới các

ion kim loại hóa trị II, III Các gel này được hình thành ở mức nhiệt độ < 100oC, chúng cũng không tan chảy khi đun nóng Sự tạo gel này được giải thích bằng mô hình cấu trúc của alginat – mô hình vỉ trứng: đoạn mạch của polymannuronic (MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp Khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân

tử alginat sắp xếp lại song song với nhau, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạp thành không gian trống giống như chỗ đặt quả trứng Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này, liên kết với nhóm cacboxyl và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song, khi đó gel alginat được hình thành Khả năng tạo gel của các muối alginat cũng phụ thuộc vào kích thước của các ion kim loại Ion stronti có kích thước lớn hơn ion calci nên liên kết mạnh mẽ hơn và được ưu tiên giữ lại hơn nếu

có sự cạnh tranh giữa Ca và Sr Ái lực ion của các kim loại đối với alginat xếp theo thứ tự Pb > Cu > Cd > Ba > Sr > Ca > Co

Khi nghiên cứu gel Calci alginat người ta thấy modul đàn hồi phụ thuộc mạnh mẽ vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronat Alginat có block G nhiều và dài sẽ cho gel bền hơn Modul đàn hồi còn phụ thuộc vào loại liên kết ngang và ái lực giữa các cation liên kết ngang Ngoài ra, độ bền của gel còn phụ thuộc vào yếu tố môi trường Về ảnh hưởng cấu trúc phân tử tới độ bền gel: đoạn M-block thể hiện tính đàn hồi, còn đoạn G thể hiện mức độ cứng rắn của gel Các đặc tính này được quan tâm nhiều trong ứng dụng của alginat [9]

1.1.2.3 Ứng dụng:

Alginat được sản xuất nhiều nhất ở Scotland, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha, Trung Quốc… Ở Việt Nam, chúng ta có nguồn rong mơ khá phong phú thích hợp cho việc sản xuất alginat thương phẩm đạt chất lượng, thực tế đã sản xuất ở Nha Trang – Khánh Hòa [9] Alginat có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như dệt

thực phẩm, giấy và dược phẩm Natri alginat được sử dụng nhiều nhất và là thành phần phụ gia để tạo hình, ổn định, tăng độ dày, tạo hình dáng, hương vị,…

Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã,

tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng ở viên giải phóng kéo dài Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược độn trong dạng viên nang, tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ; chất ổn định thể chất trong nhũ tương, hỗn dịch Trong thời gian gần đây, natri alginat được sử dụng để bào chế dạng vi nang và siêu vi tiểu phân chứa dược chất, hay được sử dụng trong một số chế phẩm có tác dụng tại chỗ như thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi [25] Trong công nghệ vi sinh, alginat được sử dụng trong phương pháp bất động tế bào, hiện nay còn được nghiên cứu sử dụng để tăng khả năng sống của chúng trong những điều kiện bất lợi [19],[23],[24]

Trong ngành y tế, loại vải sợi được sản xuất từ natri và calci alginat được sử dụng để bằng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn Ngoài ra do tính trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong nước, natri alginat còn được sử dụng trong một số thuốc để ngăn cản trào ngược dạ dày – thực quản, giảm triệu chứng ợ hơi… [25]

1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae:

1.2.1 Phân loại khoa học:

Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn,

hiển vi Nấm men có thể thuộc về 2 lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn (Deuteromecetes hoặc Fungi imperfect) Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men thuộc chi saccharomyces, họ sacchromyce-taceae, bộ saccharomyces-tales, lớp nấm túi trần, ngành nấm, giới nấm S cerevisiae phân bố rộng rãi trong tự

nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, pH thấp như trong hoa quả, rau dưa

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo:

Tế bào nấm men có nhiều hình dạng: hình cầu, hình oval hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy, có thể kéo dài thành dạng sợi Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước tùy thuộc vào điều kiện môi trường xung quanh Để cho hình dạng không thay đổi thì cần nuôi cấy giống còn trẻ trong môi trường tiêu chuẩn Về kích thước, so với tế bào các vi sinh vật khác thì tế bào nấm men khá lớn khoảng 7×8-12µm Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật với cấu trúc tế bào có 3 phần chính: thành tế bào, tế bào chất và nhân Thành tế bào có cấu tạo bởi glucan và manan giúp chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh [5]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý:

Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật tự dưỡng, kỵ khí tùy tiện, rất dễ phát triển trong môi trường nuôi cấy nên không đòi hỏi những điều kiện khắt khe như nuôi cấy vi khuẩn Nguồn dinh dưỡng gồm có:

 Nguồn carbon: gồm các loại đường và dẫn chất, các rượu, acid hữu cơ, acid amin,… Tất cả các loại nấm men đều sử dụng glucose Saccharomyces không

sử dụng được pentose, các disaccharide (maltose và saccarose), cũng không sử dụng trực tiếp tinh bột, cellulose và hemicellulose [10]

 Nguồn nitơ: bao gồm nitơ vô cơ và hữu cơ Nguồn nitơ vô cơ thường là các

muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ Đó là amoni sulfat, phosphate hay muối acetat, lactat, malat và succinat Nấm men chỉ sử dụng được acid amin ở dạng tự nhiên (L- acid amin) Muốn tiêu hóa được các hợp chất (acid amin và amit) nấm men cần có các vitamin như biotin, acid pantoteic, pyridoxin, thiamin [8]

 Các nguyên tố vô cơ: Phospho, kali, magie, lưu huỳnh… Phospho đóng vai trò

rất quan trọng trong cấu tạo tế bào, xác định biến đổi hóa sinh, đặc biệt là trao đổi chất và vận chuyển năng lượng Lưu huỳnh là thành phần một số acid amin trong phân tử protein, là nhóm phụ (-SH) của một số enzym CoA nên nếu thiếu

sẽ không tổng hợp được protein Các ion Ca2+, K+, Mg2+ cũng rất cần trong nuôi cấy nấm men Thông thường K+ được bổ sung cùng các muối sulfat hoặc

phosphat, còn Mg2+ và Ca2+ thường đủ trong nước máy Các nguyên tố vi lượng Mn, Cu, Fe, Zn, Bo, Li,… chỉ cần một lượng rất nhỏ

 Các chất sinh trưởng bao gồm vitamin, bazơ purin và pyrimidin Trong công

nghiệp, nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám, dịch thủy phân đậu tương và đặc biệt là rỉ đường Nguồn cao ngô đáp ứng cả nhu cầu vitamin và acid amin [10]

 Hô hấp: Nấm men là cơ thể sống kị khí tùy tiện, chúng có 2 kiểu hô hấp là hiếu

khí và kỵ khí tùy thuộc vào điều kiện oxy cung cấp trong quá trình nuôi cấy Trong điều kiện hô hấp kỵ khí, nấm men tạo ra ít năng lượng hơn nhiều so với hiếu khí, vì vậy để đám bảo cung cấp năng lượng nấm men tiêu tốn nhiều cơ chất hơn Trong điều kiện hiếu khí nấm men tạo ra lượng sinh khối nhanh hơn, nhiều hơn ở điều kiện kỵ khí Trong khảo sát này sử dụng điều kiện hiếu khí để nuôi cấy nấm men vì cần sử dụng sinh khối ở lượng lớn

 Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp là 28-30oC nhưng nấm men có thể chịu được nhiệt

độ tới 40oC Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến cường độ lên men mà còn ảnh hưởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh và tích

tụ các sản phẩm phụ và thứ cấp Chọn nhiệt độ nuôi cấy là 30 oC để ít sinh các sản phẩm phụ có thể gây ảnh hưởng đến kết quả [10]

 pH: pH ban đầu thích hợp cho lên men là 5,5 và trong quá trình lên men thì

giảm xuống 4,4 – 4,5 rồi lại tăng lên do sự tạo thành CO2 và các acid hữu cơ [10]

Nấm men có 2 hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính

Sinh sản vô tính phổ biến nhất của Saccharomyces cerevisiae là hình thức nảy chồi,

trên tế bào mẹ nảy ra một chồi con, lớn lên rồi tách khỏi tế bào mẹ thành tế bào mới độc lập, nhưng đôi khi chồi con không tách ra mà vẫn gắn với tế bào mẹ vừa tiếp tục nảy chồi Còn sinh sản hữu tính là hình thức tiếp hợp, xảy ra khi 2 tế bào kết hợp với nhau tạo thành hợp tử, hợp tử phân chia thành các tế bào trong nang, nang chín phát tán các tế bào ra ngoài ; nếu 2 tế bào có hình dáng, kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì gọi là tiếp hợp đẳng giao, nếu 2 tế bào tiếp hợp có hình dáng,

kích thước khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao Khi gặp những điều kiện không

thuận lợi, S cerevisiae còn sinh sản bằng bào tử [4],[11]

1.2.4 Ứng dụng:

Nấm men và các sản phẩm của nó được sử sụng trong các ngành công

nghiệp, đặc biệt phổ biến trong công nghệ thực phẩm và y học S cerevisiae được

sử dụng phổ biến nhất vì nó có độ an toàn sinh học cao Tế bào S cerevisiae có hàm

lượng protein, vitamin cao, có giá trị dinh dưỡng đặc biệt nên thường được bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho động vật

A Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm, đồ uống:

Nấm men được sử dụng nhiều để sản xuất thực phẩm, đồ uống như: rượu, bia, nước giải khát, ethanol, bánh mì,… Sinh khối nấm men được sủ dụng phổ biến

ở nhiều nước châu Âu dưới dạng men ép dùng làm men bánh mỳ, bột nở trong sản xuất bánh Men ép còn được sử dùng để sản xuất cao nấm men, bột nấm men để pha môi trường cho các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm

S cerevisiae được dùng để sản xuất protein đơn bào với giá thành thấp làm

thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm thay thế các nguồn protein đắt tiền như: bột cá, bột đậu tương… để cung cấp thực phẩm dinh dưỡng cao cho con người một cách gián tiếp Sản xuất các acid amin, vitamin, protein, đặc biệt là nấm men sản xuất protein làm thực phẩm cho con người trong chiến tranh thế giới thứ 2 và nạn đói ở

các nước Ấn Độ, Angiery Bã rượu chứa S cerevisiae từ rất lâu đã được sử dụng

làm thức ăn trong chăn nuôi

B Trong ngành dược:

Sinh khối nấm men được sử dụng trong ngành dược để chế tạo ra dược phẩm quí giá nhằm điều trị một số bệnh như chế phẩm đông khô Bioflor, Ultra Levure để

điều trị một số bệnh như ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa ở trẻ em Nuôi cấy S cerevisiae

trong điều kiện đặc biệt có thể sản xuất các hợp chất có chứa Selen hữu cơ trong y học để chữa trị hàng loạt các bệnh kể cả ung thư [21] Sinh khối nấm men có hàm lượng cao vitamin nhóm B, β-caroten, acid ribonucleic, các aminosid như lysine,

cysteine… được dùng làm thuốc bổ [5] Nhờ những thành tựu trong di truyền, các nhà khoa học đã tạo ra những chủng nấm men siêu tổng hợp có thể sinh enzym ngoại bào vượt xa nhu cầu sử dùng trong trao đổi chất của chúng, lượng enzym thừa được thu nhận để làm thuốc như amylase, glucoamylase, lipase… dùng làm thuốc

hỗ trợ tiêu hóa

Trong công nghệ sinh học tế bào, S cerevisiae được sử dụng như một vector

để tách dòng nhận các gen chuyên biệt sản xuất như các chế phẩm sinh học có hoạt tính cao để điều trị các bệnh hiểm nghèo như: insulin, interferon, albumin huyết

tương người, cytocrom P450…[1] Công trình nghiên cứu phá vỡ tế bào S

cerevisiae để thu nhận enzym superoxide dismustase- một enzym oxy hóa khử có

tác dụng dọn các gốc tự do, chống stress và chống lão hóa đang được thực hiện Men bia dùng để trị tiêu chảy, mụn trứng cá kinh niên, giúp ăn ngon miệng và

là nguồn cung cấp vitamin B Men bia có tác dụng chống lại C dificile và E Coli

độc hại nơi ruột do làm giảm lưu lượng nước và chất điện giải nơi ruột kích ứng bởi

độc tố của E.Coli Men bia có thể giúp tăng hoạt tính của một số enzym trong ruột

như disaccharidase, saccharidase, maltase, lactase giúp điều trị chứng tiêu chảy Men bia có chứa nhiều chromium giúp tăng hoạt động của isulin, tốt cho bệnh nhân tiểu đường

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị:

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất:

Bảng 2.1: Nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất

Hóa chất Nguồn gốc Hóa chất Nguồn gốc

Glucose Việt Nam Natri alginat Ấn Độ

Cao nấm men Merk – Đức Natri citrat Trung Quốc

(NH4)2SO4 Trung Quốc CaCl2 Trung Quốc

KH2PO4 Trung Quốc NaCl Trung Quốc

MgSO4.7H2O Trung Quốc Thạch bột Việt Nam

2.1.2 Vi sinh vật sử dụng:

Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (giữ giống tại phòng Vi Sinh – Bộ môn

Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội)

2.1.3 Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men:

 Công thức môi trường lỏng:

- Pipet 5ml (đường kính đầu nhỏ giọt là 1,3mm)

- Kim tiêm với các đầu kim 16G và 26G (đầu kim vát)

- Thìa, vợt hạt…

ii Thiết bị:

 Nồi hấp tiệt khuẩn (ALP – Nhật)

 Tủ cấy vô trùng (UV Bioair – Italia)

 Tủ ấm (Memmert – Đức)

 Lò vi sóng (Daewoo – Hàn Quốc)

 Máy lắc (Bioshaker – Đức)

 Máy ly tâm (Rotofix – Đức)

 Cân kỹ thuật (Satorius – Đức)

 Máy khuấy từ (Wisd – Hàn Quốc)

 Máy đo đường kính vòng vô khuẩn (Haloes Caliper – Tây Ban Nha)

 Tủ lạnh (Toshiba – Nhật)

2.2 Nội dung nghiên cứu:

2.2.1 Khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt:

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid đến kích thước hạt

 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm trong calci clorid lên sự hình thành hạt

 Khảo sát lượng sinh khối tối đa cố định được bằng gel alginat

2.2.2 Khảo sát lượng một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong hạt

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng:

Cân, đong các thành phần môi trường thạch như ở mục 2.1.3, đun trong lò vi sóng cho thạch tan hết Chia vào mỗi ống nghiệm 10ml môi trường, nút kín và hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp Sau đó đặt nghiêng các ống nghiệm sao cho chiều cao trong môi trường đến khoảng 2/3 ống, để nguội cho thạch đông lại thu được ống môi trường thạch nghiêng Dùng que cấy vô khuẩn lấy một vòng vi sinh vật từ ống giống khác rồi lướt que cấy trên bề mặt thạch theo hình zizac của ống giống mới (thực hiện trong tủ cấy vô trùng) Đặt ống giống mới trong tủ ấm ở

30oC Sau 24h, các ống giống đạt yêu cầu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 – 5oC

2.3.2 Phương pháp cấy nhân giống từ môi trường thạch nghiêng:

Cân, đong các thành phần môi trường theo công thức môi trường lỏng ở mục 2.1.3 Chia vào mỗi bình nón 250ml lượng 150ml môi trường, đậy kín bằng nút bông (bông không thấm), hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 115oC/20 phút trong nồi hấp