Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của bacillus subtilis natto

ĐẶT VẤN ĐỀ Thời gian gần đây các chế phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc probiotics ngày càng gia tăng mạnh mẽ về số lượng. Tuy nhiên, các vi sinh vật probiotics này rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa. Do đó, trong quá trình bảo quản và sau khi vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn còn sống sót rất hạn chế 34. Để giải quyết vấn đề này, một trong những hướng nghiên cứu đáng chú ý gần đây là bổ sung thêm prebiotics nhằm làm tăng số lượng vi sinh vật trong chế phẩm cũng như tăng khả năng chống chịu của chúng trước các điều kiện bất lợi trong quá trình bảo quản, sử dụng. Sự kết hợp này tạo ra synbiotics. Có thể thấy các sản phẩm synbiotics ngày càng có mặt phổ biến trên thị trường với sự kết hợp rất đa dạng giữa các chủng probiotics và prebiotics như: Lactobacillus acidophilusinulin, Lactobacillus rhamnosusFOS, Bifidobacterium breveGOS, Bifidobacterium longumlactulose,… Tuy nhiên câu hỏi đặt ra là sản phẩm nào mới thực sự có tác dụng vượt trội bởi mỗi vi sinh vật sống trong probiotics chỉ phù hợp với một hoặc một số prebiotics và ngược lại. Xuất phát từ lý do này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của một số prebiotics lên quá trình nuôi cấy Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum” nhằm 2 mục tiêu:  Khảo sát ảnh hưởng của inulin lên khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.  Khảo sát ảnh hưởng của lactulose lên khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HỒNG LIÊN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HỒNG LIÊN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

cô giáo TS Đàm Thanh Xuân - Giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy

đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths Kiều Thị Hồng, Ths

Nguyễn Khắc Tiệp, DS Lê Ngọc Khánh đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Hồng Liên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2

1.3.6 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên liệu và thiết bị sử dụng 13

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương

tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein

tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 16

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym 17 2.3.5 Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 18

Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 19

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon chứa đậu tương tới khả

năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 19 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả

năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto 19

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Bacillus subtilis natto trong môi

trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu nành đến khả năng sinh

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tổng hợp chứa đậu tương và casein

đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto 27 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh enzym protease của

Bacillus subtilis natto 27 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp casein và bột đậu

nành lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis natto Bacillus subtilis natto

năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu

Information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)

hoạt hóa plasminogen ở mô)

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1

Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men các môi

trường canh thang bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch

chiết natto sau 24 giờ

20

3.2

Đường kính vòng phân giải casein (D̅casein) của dịch lên men khi

nuôi cấy B subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các

môi trường bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch chiết natto

24

3.3

Đường kính vòng phân giải casein (D̅casein) của dịch lên men khi

nuôi cấy B subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong các

môi trường canh thang có bổ sung casein

28

3.4

Đường kính vòng phân giải casein (D̅casein) của dịch lên men khi

nuôi cấy B subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong môi

trường canh thang có bổ sung casein 2% và bột đậu nành

31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

1.1 Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto 3

3.1

Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên

men các môi trường canh thang bổ sung sữa đậu nành, bột đậu

và dịch chiết natto sau 24 giờ

21

3.2

Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên

men sau các khoảng thời gian trong các môi trường bổ sung sữa

đậu nành, bột đậu và dịch chiết natto

25

3.3

Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên

men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường canh thang

bổ sung casein

28

3.4

Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên

men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường bổ sung

casein 2% và bột đậu nành

32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh liên quan đến tim mạch là nguyên nhân lớn nhất gây tử vong trên toàn thế giới Trong năm 2012, khoảng 17,5 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tỉ lệ người tử vong trên toàn cầu [47] Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 900.000 người mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch, trong đó khoảng 300.000 ca tử vong [26] Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo thống kê, mỗi năm có khoảng 17.500 nguời bị đột quỵ do tai biến mạch máu não, trong đó 9.000 người tử vong Việc ngăn ngừa sự hình thành huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điệu trị các bệnh này [16] Trước đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông như heparin

và coumarin Bước sang đầu thế kỷ 20, người ta đã phát hiện ra các enzym có khả năng tiêu fibrin, các enzym hiện nay đang được dùng như streptokinase, urokinase tuy nhiên các enzym này được dùng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác dụng phụ [45]

Nattokinase là một protease có khả năng tiêu fibrin mạnh, được phát hiện năm

1980 bởi giáo sư Hiroyuki Sumi có nguồn gốc từ Natto - một món ăn truyền thống từ

Nhật Bản được lên men bằng cách ủ đậu nành nấu chín với Bacillus subtilis natto

Đặc biệt, nattokinase còn dùng được đường uống để phòng bệnh huyết khối [24],

[43] Trong điều kiện lên men chìm, B subtilis natto còn có khả năng sinh nhiều

enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase,…Việc thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn Với khả năng phát triển tốt trên đậu tương đã nấu chín và nguồn đậu tương dễ kiếm trong nước,

việc lựa chọn môi trường lên men B subtilis natto chứa đậu tương có ý nghĩa trong

sản xuất protease quy mô công nghiệp Do đó khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của

môi trường lên men chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis

natto” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon chứa đậu tương tới khả

năng sinh protease của Bacillus subtilis natto

2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và

casein đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis subsp natto; Bacillus var natto) là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được giáo sư

Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [38]

1.1.1 Phân loại khoa học

B subtillis natto là một vi khuẩn nhân thật (Eurobacteria) thuộc: Giới:

Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi:

Bacillus; Loài: Bacillus subtilis Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto [19]

Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi sinh vật mới Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B natto và B subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [36], [39], các khóa phân loại đã xếp B subtilis natto

là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng

lên men tạo sản phẩm Natto [23]

Trong dòng B subtilis natto còn có nhiều loại như B subtilis natto B – 12 [41]; B subtilis natto N – 77 [36]; B subtilis natto B – OK2 [18]…

1.1.2 Nguồn gốc

B subtilis natto được giáo sư Sawamura phân lập từ Natto – món ăn truyền

thống của người Nhật Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt, tôm, cua,… [23], [37]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

B subtilis natto là trực khuẩn Gram (+), hình que Nội bào tử hình que có kích

thước dưới 1𝜇𝑚 Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau tạo thành chuỗi

Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định Bề mặt hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [37]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto [44]

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng

B subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydratcacbon: đường đơn như glucose, fructose,…; đường đôi như maltose, lactose, saccharose,…; polysaccharid như tinh bột, Nguồn nitơ cần tiết cho sự phát triển của

vi khuẩn là amino acid và protein VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin,… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan, phenylalanin VSV cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào dinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được [37]

1.1.5 Đặc điểm sinh lý

B subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ oxy

lớn hơn 3% Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 500C); pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6 Nhiệt độ tối ưu

là 370C, nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 400C, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 00C Sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế ở 550C và pH ≤ 4,5 [37]

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của Bacillus subtilis natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis natto có khả năng sinh

nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: nhóm enzym 𝛾-transpeptidase, phytase, amylase, cellulase và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease [20], [22]

Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B subtilis natto như sau :

 Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác subtilisin NAT hay

subtilisin BSP Kí hiệu: EC 3.4.21.62 Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử TLPT: 27.728Da [30], [32], [41] Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất

và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học

 Elastase: theo nghiên cứu của Sumi, elestase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7 [25]

Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 500C; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [33]

 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp [40]

 Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; trung tâm hoạt động là bộ ba xúc

tác: Asp33, His81, Ser259 [23]

1.2 Natto và Nattokinase

1.2.1 Natto

Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản đã có từ cách đây hơn 1000

năm, là những hạt đậu nành đã luộc chín và được lên men với vi khuẩn B subtilis

natto ở nhiệt độ khoảng 400C – 430C trong vòng 24 – 32 giờ thành những hạt màu nâu, độ nhớt cao và có mùi nồng Natto truyền thống được làm bằng cách ủ hạt đậu

đã luộc chín trong các bó rơm hoặc phủ rơm lên, do trong rơm rạ có B subtilis natto

Natto là một thức ăn, một sản phẩm lên men chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe, trong đó có nattokinase được cho là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các bệnh về

tim mạch [24], [30]

Hình 1.2 Sản phẩm natto [30]

vulgaris tạo chất nhớt đặc trưng và vị ngọt Năm 1913, ông công bố kết quả của mình

qua nhiều mẫu nghiên cứu và kết luận vi khuẩn chủ yếu có trong Natto là Bacillus

subtilis natto; đồng thời mô tả chi tiết đặc điểm vi khuẩn, enzym và nhu cầu dinh

dưỡng [38] Tại Hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/04 – 03/05/2006), giáo sư Masafumi Kitakaze khẳng định tác dụng làm giảm rõ rệt chứng

mỡ máu cao và kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ Natto [45]

1.2.2 Nattokinase

a) Nguồn gốc

Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất mạnh có nguồn gốc từ Natto – món ăn truyền thống của Nhật Bản [30]

Trong đó: 3 (Loại): Hydroxylase

4 (Nhóm): Protease

21 (Dưới nhóm): Protease serin

62 (Enzym): Subtilisin

Tên ADN: arpN, định danh phân loại: 86.029 [NCBI] [30]

b) Đặc điểm cấu tạo

Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid gồm 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử Nattokinase có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser – 221, imidazol của His – 64 và nhóm carboxyl của Asp – 32 [7]

Hình 1.3 Cấu trúc bậc 3 của nattokinase [30]

c) Tính chất

Nattokinase có điểm đẳng điện pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 –

10, nhiệt độ < 500C; bị bất hoạt khi pH < 5, nhiệt độ ≥ 700C và các ion Fe3+, Al3+; hoạt tính của enzym được tăng lên một phần khi có mặt HgCl2, H2O2 và bị ức chế hoàn toàn bởi phenylmethylsulphonyl fluorides (PMSF); trung tâm hoạt động là bộ

ba xúc tác: Ser, His và Asp Cơ chất đặc hiệu: Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – pNA [30], [40]

d) Cơ chế tiêu fibrin

Nattokinase tiêu fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác nhau

Hình 1.4 Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase [31]

- Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin

từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử thấp, hòa tan Như vậy, nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin

- Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa Pro - urokinase thành urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm tăng plasminogen nội sinh là enzym phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể

- Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trình tổng hợp

t -PA trong huyết tương Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin

Đặc biệt, nattokinase không ảnh hưởng tới sự hình thành fibrin từ fibrinogen,

do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể Vì vậy, nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông thông thường khác [31]

e) Công dụng

Đã có rất nhiều nghiên cứu về hiệu quả của nattokinase trong điều trị huyết khối, tim mạch như nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm 1995 [32], Haritha M năm 2011 [30] Năm 2008, Kim J đã chỉ ra nattokinase có vai trò trong việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [28] Enzym này cũng được dùng để giảm

đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mạn tính, viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt

cơ, vô sinh, ung thư và bệnh beriberi [46]

Ở nước ta cũng có một số nghiên cứu về tác dụng của nattokinase trên lâm sàng: nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Chí Tuệ năm 2008 ở bệnh viện Quân Y 103 đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Nattospes (Nattokinase) trên 73 bệnh nhân đột quỵ não, hầu hết bệnh nhân có hiệu quả về lâm sàng, có xu hướng giảm đông máu, không có trường hợp nào bị tai biến chảy máu [15]; nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Văn Thông (2008) tại Bệnh viện 108 cũng cho thấy Nattospes có hiệu quả tương đương Aspirin (thuốc đầu tay trong điều trị đột quỵ não) [13]; năm 2009, Nguyễn Bá Anh với nghiên cứu hỗ trợ điều trị phục hồi chức năng vận động của bệnh nhân nhồi máu não sau giai đoạn cấp ở Bệnh viện Bạch Mai cũng cho thấy trên lâm sàng và trong dự phòng tái phát Nattospes và Aspirin có tác dụng tương đương, enzym còn rất ít tác dụng phụ so với Aspirin khi dùng trong thời gian dài [1]

Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nang: Nattospes (300FU/g), S-Nattokinase (5.000FU/g), Nattokinase plus FUcoidan (2.000FU/g), Nattokinase plus (3.000FU/g), Japato (600FU/g), Nattovena (4.000FU/g)

1.2.3 Đậu nành

Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, đậu nành có nhiều

màu sắc khác nhau Trong đó đậu nành có màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng

và sử dụng nhiều [4]

 Hạt đậu nành

Hạt đậu nành có ba bộ phận: vỏ hạt, phôi và tử diệp Hàm lượng dinh dưỡng của đậu nành thay đổi phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt nhưng nhìn chung chứa từ 35 – 40% protein, 15 – 25% chất béo, 15 – 30% cacbonhydrat; các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzym, sáp, nhựa, cellulose và khoảng 5% tro [4]

Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một lượng rất lớn Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài hai thành phần

methionin và tryptophan ra còn có các acid amin khác, số lượng khá cao tương đương acid amin có trong thịt Trong protein đậu nành glubolin chiếm 85 – 95% Ngoài ra còn có một lượng nhỏ albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin

Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành Phần hydratcacbon có thể chia làm hai loại, loại tan trong nước và loại không tan trong nước, loại tan trong nước chỉ chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon

Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô hạt đậu nành Trong

đó đáng chú ý nhất là calci, phospho, mangan, kẽm và sắt [8]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học trong đậu nành [8]:

Thành phần Tỷ lệ Protein Dầu Tro Hydratcacbon

Hạt đậu nành nguyên 100 40,0 21,0 4,9 34,0

Tử diệp 90,3 43,0 23,0 5,0 29,0

Vỏ hạt 8,0 8,8 1,0 4,3 86,0

Phôi 2,4 41,1 11,0 4,4 43,0

 Công dụng của đậu nành:

Đậu nành chứa nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu, là nguồn cung cấp chất xơ, sắt và vitamin nhóm B Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals) khác trong đậu nành như protease inhibitors, phytates, phytosterol, lecithin, acid Omega-3,…có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến mạch máu não, ung thư vú, ung thư kết tràng…(theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần Lan)

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis natto

1.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt

độ thích hợp khác nhau Tuy nhiên đa số các vi sinh vật tổng hợp enzym không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp Khi

nhiệt độ quá cao thì vi sinh vật sẽ chết, enzym bị biến tính, màng tế bào bị tổn thương tới mức khó phục hồi Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị đông kết lại, enzym cũng ngừng hoạt động [10], [45]

1.3.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp enzym Do đó người ta điều chỉnh pH để thu được enzym với hiệu suất cao nhất Việc lựa chọn pH của môi trường thu enzym phụ thuộc vào chủng

vi sinh vật và loại enzym [6]

1.3.3 Độ thông khí

Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo giống vi sinh vật Ở vi khuẩn hiếu khí, tăng tốc độ thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, tăng khả năng tích lũy các sản phẩm trao đổi chất trong tế bào như các enzym, acid amin, kháng sinh Tuy nhiên, nếu độ thông khí quá mức thích hợp thì sự tích lũy của vi sinh vật sẽ giảm [6]

1.3.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym Nếu môi trường có những chất khó đồng hóa thì vi sinh vật sẽ tiết ra những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được Vì vậy, khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng tổng hợp enzym của vi sinh vật tăng lên nhiều lần so với bình thường Trong công nghiệp sản xuất enzym cần lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [10], [17]

1.3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzym tối đa Thời gian đó phụ thuộc chủ yếu vào chủng vi sinh vật Enzym vi sinh vật thường được sinh vào pha log (pha lũy thừa) Protease ngoại

bào của loài B subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn

vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử [10]

1.3.6 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng

sinh enzym protease của B subtilis natto

a) Nghiên cứu trên thế giới

Năm 2005, Junguo Liu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh

dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamate, casein, pepton đậu nành; khảo sát các nguồn hydratcacbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20g/l; tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO4.7H2O, KH2PO4.3H2O, cao nấm men và CaCl2 Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300U/ml với thành phần môi trường tối ưu (g/l): pepton đậu nành: 8,28, CaCl2: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [29]

Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng

hợp nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Các nhân tố được chọn để khảo sát:

glucose, pepton, MgSO4 và CaCl2 ở 5 mức độ Hoạt tính nattokinase đạt 3.194 U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [21] LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase

từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4

0,01%, CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành 3% [35]

b) Nghiên cứu trong nước

Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzym nattokinase 470FU/g

trên môi trường thạch đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên

khay từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện sinh học nhiêt

đới và phân lập từ thực phẩm natto [12]

Hin Vireak (2012) đã xác định được enzym do Bacillus subtilis natto sinh ra

là protease và amylase; enzym protease của vi khuẩn có khả năng tiêu fibrin; xác định môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho hoạt tính enzym tốt nhất là canh thang có bổ sung 0,05% casein; xác định thời gian thu enzym có hoạt tính tốt nhất là 28 giờ [17]

Nguyễn Ngọc Ánh (2013) đã phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ

sản phầm natto thương mại và đã xác định được vi khuẩn sinh ra 3 enzym ngoại bào

là protease, amylase, cellulase, trong đó protease có khả năng tiêu fibrin; đồng thời xác định được môi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease và sinh ít amylase, cellulase là môi trường canh thang bổ sung 2% maltose, 0,5% casein, 0,05% CaCl2 [2]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị sử dụng

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng

Bacillus subtilis natto – (chủng được phân lập từ chế phẩm natto Nhật Bản

trên thị trường được lưu giữ tại phòng Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội)

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng

Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng:

Tên Nguồn gốc Tên Nguồn gốc

Pepton Ấn Độ Dung dịch Xanh methylen Việt Nam

Tinh bột Việt Nam

 Cách pha chế một số dung dịch hóa chất (theo Dược điển Việt Nam

b) Công thức môi trường canh thang (MT2)

c) Công thức môi trường canh thang sữa đậu (MT3)

2.1.4 Máy móc và dụng cụ

Danh sách thiết bị sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thiết bị được sử dụng:

Tên Nguồn gốc (Hãng) Tên Nguồn gốc (Hãng)

Tủ cấy vô trùng Italia (UV Bioair) Máy lắc Đức (Bioshaker)

Tủ ấm, tủ sấy Đức (Memmert) Cân phân tích Đức (Satorius)

Nồi hấp tiệt

trùng Nhật (ALP) Cân kỹ thuật Đức (Satorius)

Lò vi sóng Hàn Quốc (Daewoo) Máy làm sữa

đậu Hà Lan (Philips)

Tủ lạnh Nhật (Toshiba) Máy li tâm Đức (Rotofix)

(Universal)

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau:

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương

tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto

- Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng

sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto

- Khảo sát thời gian thu enzym protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong các môi trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein

tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto

- Lựa chọn nồng độ casein thích hợp bổ sung vào môi trường canh thang, khảo sát thời gian cho hoạt độ protease cao nhất

- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp bột đậu và casein, khảo sát thời gian cho hoạt độ protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường bổ sung

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto

a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch thường (theo mục 2.1.3), đun cho đồng nhất Chia đều

môi trường vào trong các ống nghiệm (5-6ml/ống), nút kín Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội cho thạch đông lại Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới theo hình ziczac Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ở 370C/24 giờ Bảo quản các ống giống trong tủ lạnh 4-50C Việc cấy truyền được thực hiện 1-2 tháng/lần [11]

b) Phương pháp nhân giống trong bình nón

Pha 100ml môi trường canh thang (theo mục 2.1.3) cho vào bình nón 250ml,

nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống giống vào môi trường Nuôi trên máy lắc ở 370C/24 giờ, tốc độ lắc 110 vòng/phút [5], [11]

c) Phương pháp lên men

Pha 100ml môi trường nghiên cứu cho vào bình nón 250ml, nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400C, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường mới, với tỉ lệ cấy truyền là 10% Nuôi trên máy lắc ở 370C trong thời gian thích hợp, tốc độ lắc 110 vòng/phút [5], [11]

2.3.2 Phương pháp làm sữa đậu nành

Rửa sạch 80g đậu tương hạt Ngâm trong nước lạnh trong 12 giờ Cho đậu tương vào máy làm sữa đậu Đong chính xác 1000ml nước cất vào máy Khởi động máy, bật máy đến khi đậu tương hoàn toàn mịn thì tắt máy Giữ sữa đậu nành trong ngăn mát tủ lạnh, sử dụng trong vòng 2 tuần

2.3.3 Phương pháp làm đậu natto

Rửa sạch 20g đậu nành hạt Ngâm trong nước lạnh 12 giờ Cho đậu đã ngâm vào đĩa petri, hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm/20 phút Sau tiệt khuẩn, để nguội xuống