Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương phản trong siêu âm chẩn đoán

ĐẶT VẤN ĐỀ Siêu âm là phương pháp chẩn đoán hình ảnh quan trọng trong y học. Đây là phương pháp thăm khám không gây chảu máu, không nguy hiểm và rất kinh tế nên được ứng dụng rộng rãi tại các cơ sở y tế từ trung ương đến địa phương. Siêu âm được sử dụng phổ biến nhất trong các kỹ thuật chẩn đoán bằng hình ảnh trên thế giới. Ví dụ ở Hoa Kỳ có khoảng 75000 dụng cụ cho siêu âm, trong khi đó chỉ có 7000 dụng cụ cho chụp cắt lớp vi tính và 5000 dụng cụ cho hình ảnh cộng hưởng từ 22. Ở Việt Nam, siêu âm đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 1970. Tuy nhiên không giống các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, như X quang hay chụp cộng hưởng từ, siêu âm đã bị hạn chế nhiều trong chẩn đoán do thiếu tác nhân tăng cường độ tương phản. Ví dụ trong siêu âm tim có đến 20% các trường hợp không cung cấp chất lượng hình ảnh đầy đủ cho phép quan sát trực quan bên trong tim để chẩn đoán chính xác về rối loạn chức năng tâm thất. Do đó bắt buộc phải bổ sung thêm các quy trình kiểm tra khác mà những phương pháp đó thường xâm lấn, đắt tiền hơn và đôi khi rủi ro cao hơn 22. Tác nhân tương phản siêu âm được định nghĩa là tác nhân có thể làm thay đổi độ tương phản của hình ảnh siêu âm một cách có ý nghĩa giúp các chẩn đoán có thể phân biệt được điều kiện bình thường và bất thường 22. Trên thế giới, vi bọt đã được sử dụng phổ biến làm tác nhân tương phản lí tưởng cho siêu âm. Tuy vậy, ở Việt Nam, bào chế và ứng dụng vi bọt trong siêu âm tương phản là một vấn đề rất mới mẻ. Do vậy, đề tài: “Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương phản trong siêu âm chẩn đoán” được thực hiện nhằm mục đích: 1. Khảo sát lựa chọn nguyên liệu và thông số bào chế vi bọt 2. Đánh giá một số đặc tính hoá lý và độ bền của vi bọt

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG PHƯƠNG HẢO

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU

BÀO CHẾ VI BỌT DÙNG LÀM CHẤT TƯƠNG PHẢN TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG PHƯƠNG HẢO

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU

BÀO CHẾ VI BỌT DÙNG LÀM CHẤT TƯƠNG PHẢN TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Các cán bộ thuộc Viện công nghệ dược phẩm quốc gia

Các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ môn Tổng hợp Hoá Dược, bộ môn Vật lý- Hoá lý- Trường Đại học Dược Hà Nội

Và toàn thể các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện- Trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình vừa qua

Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Hoàng Phương Hảo

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Sự cần thiết của tác nhân siêu âm tương phản 2

1.2 Cơ chế tăng cường tương phản của vi bọt 2

1.3 Những vi bọt lý tưởng cho siêu âm tương phản 3

1.4 Cấu tạo vi bọt 4

1.4.1 Lõi khí 5

1.4.2 Vỏ ngoài 6

1.5 Phương pháp bào chế vi bọt bằng siêu âm 9

1.6 Cơ chế hoà tan vi bọt 10

1.6.1 Vi bọt với lõi không khí 10

1.6.2 Vi bọt với lõi không khí kết hợp với khí ổn định 11

1.6.3 Cơ chế hoà tan vi bọt có vỏ được ổn định bằng các chất diện hoạt 11

1.7 Ứng dụng khác của vi bọt trong y học 12

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Nguyên vật liệu 13

2.1.2 Thiết bị 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp bào chế vi bọt 14

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt 16

2.3.3 Phương pháp đánh giá độ bền vi bọt 16

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Thực nghiệm và kết quả 18

3.1.1 Khảo sát khả năng tạo bọt từ dịch tạo bọt một thành phần 18

3.1.2 Khảo sát khả năng tạo bọt từ dịch tạo bọt nhiều thành phần 20

3.1.3 Khảo sát thông số siêu âm tạo vi bọt từ nguyên liệu vỏ thích hợp 24

3.1.4 Đánh giá độ bền vi bọt 31

3.2 Bàn luận 32

3.2.1 Về phương pháp bào chế 32

3.2.2 Về nguyên liệu bào chế 33

3.2.3 Về thông số bào chế 33

3.2.4 Về phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt 34

3.2.5 Về đặc tính hoá lý của vi bọt 34

3.2.6 Về độ bền vi bọt 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

1 KẾT LUẬN 36

2 KIẾN NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PLGA Copolyme poly (D, L-lactide-co-glycolide)

DANH MỤC CÁC BẢNG

2 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 13

5 3.1 Thời gian phân lớp vi bọt của các dịch tạo bọt một

6 3.2 Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt

7 3.3 Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt

8 3.4 Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt

9 3.5 Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ

2 Hình 3.1 Cột bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) thời

điểm phân 3 lớp (trái) và phân 2 lớp (phải) 18

3 Hình 3.2 Vi bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) quan sát

ĐẶT VẤN ĐỀ

Siêu âm là phương pháp chẩn đoán hình ảnh quan trọng trong y học Đây là phương pháp thăm khám không gây chảu máu, không nguy hiểm và rất kinh tế nên được ứng dụng rộng rãi tại các cơ sở y tế từ trung ương đến địa phương

Siêu âm được sử dụng phổ biến nhất trong các kỹ thuật chẩn đoán bằng hình ảnh trên thế giới Ví dụ ở Hoa Kỳ có khoảng 75000 dụng cụ cho siêu âm, trong khi

đó chỉ có 7000 dụng cụ cho chụp cắt lớp vi tính và 5000 dụng cụ cho hình ảnh cộng hưởng từ [22] Ở Việt Nam, siêu âm đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 1970 Tuy nhiên không giống các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, như X- quang hay chụp cộng hưởng từ, siêu âm đã bị hạn chế nhiều trong chẩn đoán do thiếu tác nhân tăng cường độ tương phản Ví dụ trong siêu âm tim có đến 20% các trường hợp không cung cấp chất lượng hình ảnh đầy đủ cho phép quan sát trực quan bên trong tim để chẩn đoán chính xác về rối loạn chức năng tâm thất Do đó bắt buộc phải bổ sung thêm các quy trình kiểm tra khác mà những phương pháp đó thường xâm lấn, đắt tiền hơn và đôi khi rủi ro cao hơn [22]

Tác nhân tương phản siêu âm được định nghĩa là tác nhân có thể làm thay đổi

độ tương phản của hình ảnh siêu âm một cách có ý nghĩa giúp các chẩn đoán có thể phân biệt được điều kiện bình thường và bất thường [22] Trên thế giới, vi bọt đã

được sử dụng phổ biến làm tác nhân tương phản lí tưởng cho siêu âm Tuy vậy, ở Việt Nam, bào chế và ứng dụng vi bọt trong siêu âm tương phản là một vấn đề rất mới mẻ Do vậy, đề tài: “Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương phản trong siêu âm chẩn đoán” được thực hiện nhằm mục đích:

1 Khảo sát lựa chọn nguyên liệu và thông số bào chế vi bọt

2 Đánh giá một số đặc tính hoá lý và độ bền của vi bọt

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Sự cần thiết của tác nhân siêu âm tương phản

Vi bọt được sử dụng làm tác nhân tăng cường tương phản trong siêu âm vì:

- Phần lớn cơ thể người là nước (73%) nên cơ thể đồng nhất về âm Máu và mô xung quanh có cùng mức độ phản xạ âm nên khó phân biệt rõ ràng dòng máu, tưới máu hoặc mặt phân cách giữa mô và máu trong siêu âm [15]

- Siêu âm với tác nhân vi bọt có thể đánh giá dòng máu trong thời gian thực

- Siêu âm với tác nhân vi bọt an toàn hơn các hình ảnh học phân tử khác (ví dụ như hình ảnh học đồng vị phóng xạ sử dụng chất phóng xạ ảnh hưởng không tốt đến sức khoẻ bệnh nhân trong khi đó vi bọt khá an toàn) [16]

- Các hình ảnh học phân tử khác như chụp cộng hưởng từ, chụp cắt lớp bằng bức xạ positron và chụp cắt lớp đơn photon rất đắt tiền Trong khi đó siêu âm

là phương pháp chẩn đoán kinh tế và phổ biến[14]

- Vì vi bọt tạo phản xạ âm rất mạnh nên chỉ cần liều tiêm tĩnh mạch nhỏ khoảng microgram vi bọt Trong khi đó các phương pháp hình ảnh học phân tử khác (như chất tương phản của cộng hưởng từ) cần tới vài milligram tác nhân tương phản[14]

1.2 Cơ chế tăng cường tương phản của vi bọt

Âm trở (Z): Mỗi một môi trường có đặc điểm cấu trúc, tính chất và mật độ khác nhau gây ra những cản trở vận tốc siêu âm khác nhau Sự cản trở đó là âm trở của môi trường Âm trở của môi trường tỉ lệ với mật độ của môi trường và tốc độ lan truyền siêu âm

Bảng 1.1 Âm trở một số môi trường

Mặt khác, chất khí có khả năng nén cao hơn vài lần so với chất lỏng và chất rắn, điều này làm cho vi bọt có khả năng tăng cường âm tốt hơn Chỉ cần tiêm tĩnh mạch một lượng nhỏ tác nhân vi bọt thì phần không gian máu chứa vi bọt, bao gồm

cả các buồng tim sẽ trở nên sáng hơn, cho phép phân biệt máu với các mô xung quanh [22]

Ngoài việc tạo một chênh lệch âm trở lớn giữa vi bọt và các bộ phận cơ thể, vi bọt cũng cộng hưởng với sóng siêu âm, làm tăng mức phản xạ tại vị trí có vi bọt lên rất nhiều, điều này cho phép thiết bị siêu âm nhận được duy nhất tín hiệu phản xạ siêu

âm từ vi bọt [17] Đặc biệt, vi bọt với kích thước micromet thường cộng hưởng trong dải tần số siêu âm chẩn đoán thông thường (1-3 MHz) Các vỏ bao quanh các vi bọt

có thể cản trở khả năng cộng hưởng, mức độ cản trở này phụ thuộc vào bản chất của

vỏ

Tuy nhiên, quá nhiều vi bọt lại tạo ra một phản xạ âm quá lớn có thể cản trở

sự xâm nhập của chùm siêu âm vào sâu các mô tạo ra hình ảnh quá sáng gây khó khăn trong chẩn đoán [22]

1.3 Những vi bọt lý tưởng cho siêu âm tương phản

Vi bọt khi sử dụng làm tác nhân tương phản siêu âm thì đầu tiên, kích thước cần phải được kiểm soát trong giới hạn quy định (1- 10μm) và phân bố kích thước càng hẹp càng tốt Kích thước vi bọt quá nhỏ sẽ phản xạ âm kém và vi bọt không bền, kích thước quá lớn vi bọt sẽ không đi qua được lòng mao mạch và có thể gây tắc mạch Kích thước vi bọt cần phải được kiểm soát tại cả hai thời điểm trước khi tiêm

và trong suốt thời gian lưu thông trong cơ thể, cần phải hạn chế việc tăng kích thước

do hợp nhất các vi bọt

Thứ hai, vi bọt cần phải ổn định trong thời gian một cuộc siêu âm chẩn đoán

Vì vậy, thời gian bán thải thích hợp của vi bọt trong cơ thể là một yêu cầu quan trọng [24]

Ngoài ra, vi bọt sẽ tốt hơn nếu:

- Không chứa các thành phần có nguồn gốc từ protein máu

- Có một lớp vỏ đàn hồi giúp tăng khả năng cộng hưởng

- Đạt hiệu quả tăng cường tương phản ở liều thấp

- Dễ dàng chuyển hóa hoặc bài tiết và có rất ít tác dụng phụ

vi bọt, mức độ phản xạ âm được tăng cường sẽ cung cấp hình ảnh có chất lượng cao hơn, qua đó tăng độ chính xác và độ tin cậy của việc chẩn đoán bệnh Tuy nhiên, nếu chỉ riêng lõi khí tồn tại trong môi trường nước sẽ không ổn định do ảnh hưởng của sức căng bề mặt [24], vì thế vi bọt cần một vỏ bao quanh bên ngoài Vỏ ngoài bao

bọc có vai trò như một rào cản giữa lõi khí và môi trường nước xung quanh và giúp

ổn định vi bọt Vỏ có thể được tạo bởi chất diện hoạt, lipid, protein, polyme, hoặc kết hợp các vật liệu này

Hình 1.1 Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ khác nhau

1.4.1 Lõi khí

Lõi khí là phần quan trọng nhất của vi bọt vì nó quyết định mức độ phản xạ

âm Khi được siêu âm, vi bọt sẽ bị nén, dao động, và sau đó phản xạ lại âm Điều này tạo ra một hình ảnh có độ tương phản cao hơn hẳn trong siêu âm Lõi khí có thể là không khí, perfluorocarbon (PFC), hoặc nitơ [15] Những khí kém tan trong nước sẽ khó thoát khỏi vi bọt hơn và tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn máu [18]

Các dẫn chất PFC được dùng rất phổ biến trong bào chế vi bọt do tính tan trong nước thấp và áp suất hơi cao, các khí này giúp vi bọt đạt được sự ổn định cần thiết khi làm tác nhân siêu âm tương phản Độ tan trong nước thấp sẽ làm giảm sự thoát khí vào máu (một nguyên nhân gây co nhỏ vi bọt) Áp suất hơi cao sẽ làm khí chậm hoá lỏng hơn khi mà áp lực Laplace không ngừng tăng lên do vi bọt bị co nhỏ theo thời gian, mà khí hoá lỏng là nguyên nhân vi bọt bị méo mó, nhăn nhúm hoặc biến mất Khi tiêm vào cơ thể, vi bọt được phân phối trong khắp không gian mạch máu và tồn tại trong suốt thời gian của một cuộc kiểm tra siêu âm, do đó, độ tan thấp và áp suất hơi cao của khí sẽ kiểm soát chặt chẽ kích thước, sự phồng lên của vi bọt và đặc biệt tạo vỏ có biến dạng đàn hồi cao tránh gây vỡ bọt khi siêu âm [22]

Nitơ là chất khí không màu, không mùi, không vị, hơi nhẹ hơn không khí, hoá lỏng ở -196oC, hoá rắn ở -210oC Khí nitơ tan rất ít trong nước (ở điều kiện thường,

1 lít nước hoà tan được 0,015 lít khí nitơ) Nitơ không duy trì sự cháy và sự hô hấp

Vì có liên kết ba với năng lượng liên kết lớn nên phân tử nitơ rất bền Ở nhiệt độ thường, nitơ khá trơ về mặt hoá học Vì độ tan thấp trong nước nên nitơ cũng được dùng trong bào chế vi bọt

1.4.2 Vỏ ngoài

Nguyên liệu vỏ cần phải có sự tương thích sinh học, chất liệu càng ưa nước sẽ càng nhanh được thải trừ khỏi cơ thể sau khi đã siêu âm xong Chất liệu vỏ còn ảnh hưởng đến độ đàn hồi cơ học của vi bọt Chất liệu càng đàn hồi, càng chịu được năng lượng siêu âm cao trước khi bị phá vỡ Các nguyên liệu có thể sử dụng để tạo vỏ gồm lipid (vỏ dày ~ 3nm), protein (vỏ dày 15-20nm) và polyme (vỏ dày 100-200nm) Các phân tử lipid được liên kết chặt chẽ với nhau thông qua lực Van der Waals và do bản chất kỵ nước của chúng Các protein được liên kết bằng cầu nối disulfide giữa các nhóm thiol trong quá trình siêu âm Các chuỗi polyme liên kết ngang hoặc liên kết

chéo [24]

1.4.2.1 Vỏ protein

Albumin là thành phần cấu tạo vỏ vi bọt đầu tiên được sử dụng làm tác nhân tương phản trong hình ảnh siêu âm Công thức vi bọt albumin đầu tiên được sự chấp thuận của Cục Quản lý Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) là Albunex Albunex bao gồm khoảng 7x108 vi bọt/ ml với đường kính khoảng 1-15µm [5] Khi bảo quản lạnh, Albunex ổn định ít nhất hai năm Vi bọt vỏ albumin được tạo thành bằng cách siêu

âm dung dịch albumin huyết thanh nóng 5% (kl/tt) trong điều kiện có không khí Cần phải làm nóng để làm biến tính các albumin trước khi siêu âm và tạo điều kiện đóng

vỏ [19] Vỏ albumin được liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide giữa các phân

tử cystein trong quá trình tạo bọt [12]

Từ Albunex, một loại vi bọt vỏ albumin khác được tạo ra nhưng với lõi khí là perfluorocarbon, được đặt tên là Optison ™ [7] Độ hòa tan thấp của khí perfluorocarbon giúp các vi bọt lưu thông ổn định lâu dài trong cơ thể [21]

Một số protein khác cũng được sử dụng để làm vỏ vi bọt Cavalieri và đồng nghiệp sử dụng lysozyme để tạo vi bọt và nhận thấy chúng khá ổn định [3] Trong báo cáo của mình, Cavalieri và đồng nghiệp đã khẳng định vai trò của cầu nối disulfide trong việc hình thành lớp vỏ protein ổn định

1.4.2.2 Vỏ chất diện hoạt

Chất diện hoạt là một nhóm khá lớn của các hợp chất hoá học Do cấu tạo gồm hai phần: phần thân nước và phần thân dầu nên các chất diện hoạt có khả năng hấp phụ trên bề mặt phân cách pha và tạo thành một lớp đơn, đa phân tử hoặc các ion được định hướng làm thay đổi bản chất phân cực của lớp bề mặt và giảm năng lượng

bề mặt giữa hai pha [1] Nhờ vậy, vỏ chất diện hoạt dễ dàng hình thành bao quanh lõi khí và giúp vi bọt ổn định

Wheatley và đồng nghiệp đã xây dựng công thức vi bọt với vỏ là hỗn hợp các chất diện hoạt Span- 40 và Tween- 40 [23] [25] Dung dịch Span/ Tween với tỉ lệ 1:1 được siêu âm trong không khí để tạo thành các vi bọt ổn định Tỷ lệ này được xác định nhờ phương pháp màng phim Langmuir Blodgett [25]

Một công thức khác về vi bọt liên quan đến chất diện hoạt được Dressaire và đồng nghiệp thiết kế từ sucrose stearat (mono và di-ester) kết hợp với 75% khối lượng siro glucose ở 70°C [9] Những vi bọt này ổn định hơn một năm và cho thấy nhiều

ưu điểm đáng chú ý

1.4.2.3 Vỏ lipid

Vi bọt vỏ lipid là một trong những công thức có nhiều ứng dụng nhất trong hình ảnh y sinh học và phân phối thuốc Lipid có nhiều trong tự nhiên và khá tương thích sinh học

Vỏ lipid có khá nhiều ưu điểm Nhờ cấu tạo lưỡng cực một đầu thân nước và một đầu thân dầu, phospholipid sẽ dễ dàng tạo vỏ bao xung quanh lõi khí Mặt khác

vỏ lipid làm giảm sức căng bề mặt giúp ổn định các vi bọt [10], bởi vì sức căng bề mặt phân cách gây ra áp suất Laplace cao, là nguyên nhân chính làm lõi khí bị hoá lỏng [10] Ngoài ra, nhờ bản chất kỵ nước và lực liên kết Van der Waals giữa các chuỗi acyl mà các phân tử lipid liên kết rất chặt chẽ với nhau làm tăng khả năng đàn hồi của vi bọt và giảm sự thoát khí ra bên ngoài giúp chúng ổn định cho tới khi siêu

vi bọt Tuy nhiên đường kính vi bọt tạo ra khá lớn (từ 30 đến 40µm) nên không thể truyền tĩnh mạch

Bjerknes và đồng nghiệp (1997) đã mô tả một phương pháp để tạo vi bọt với

vỏ kép este polyme với các mắt xích ethylidene, sử dụng phương pháp bay hơi dung môi nhũ tương [2] Các vi bọt này có đường kính phân bố rộng từ 1-20µm Quan sát trên kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy các vi bọt đã

bị kéo dài ra, hình dạng nhăn nhúm Vỏ polyme thường dày 150-200nm

Nayaran và Wheatley (1999) đã báo cáo về vi bọt tạo thành bởi sự phân hủy sinh học copolyme poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) Các vi cầu đã được sử

dụng một lõi rắn dễ bay hơi, sau này có thể thăng hoa đi và tạo ra vi bọt Đường kính

vi bọt dao động trong khoảng 2-20µm

Vào năm 2005, Cavalieri và đồng nghiệp mô tả một phương pháp để tạo ra vi bọt có vỏ là PVA [4] Vi bọt được tạo ra bằng cách khuấy dung dịch PVA đã được

xử lý ở tốc độ cao (8000 vòng/ phút) Đường kính trung bình vi bọt là khoảng 6 ± 1µm Độ dày vỏ có thể được giảm từ 0,9 xuống 0,7µm khi giảm nhiệt độ tác động từ nhiệt độ phòng đến 4°C Vi bọt PVA có hạn sử dụng trong vài tháng và có khả năng vận chuyển thuốc kỵ nước, chất mang polyme (ví dụ DNA), phân phối thuốc tới đích

1.5 Phương pháp bào chế vi bọt bằng siêu âm

Siêu âm là phương pháp phổ biến nhất để bào chế vi bọt Khi sóng siêu âm đi qua một chất lỏng, sự giãn nở do siêu âm sẽ gây ra áp suất âm trong chất lỏng và kéo các phân tử ra xa nhau Khi áp suất âm này lớn hơn sức căng bề mặt của chất lỏng (sức căng cực đại này lại phụ thuộc vào từng chất) tức là cường độ siêu âm đủ mạnh thì sự giãn nở này sẽ tạo ra những lỗ hổng Sau đó nguyên liệu tạo vỏ sẽ bao phủ dần lên lỗ hổng và vi bọt được hình thành Nhiệt độ và áp suất cao do sóng siêu âm tạo ra những biến đổi hoá học của nguyên liệu tạo vỏ làm tăng độ ổn định cho vi bọt [12]

Phân bố kích thước vi bọt bào chế bằng siêu âm phụ thuộc vào tần số, cường

độ và xung siêu âm Phân bố kích thước này tương đối rộng nên cần phải kiểm soát chặt chẽ [20]

Trong đề tài này, máy siêu âm sử dụng bào chế vi bọt có các thông số sau: Cường độ, xung và thời gian siêu âm Các thông số này đều ảnh hưởng đến chất lượng

vi bọt bào chế được:

- Cường độ siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng tạo lỗ hổng để hình thành nên vi bọt và ảnh hưởng đến độ ổn định vi bọt tạo ra

- Xung siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng lấy khí tạo lõi khí cho vi bọt

- Thời gian siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng tạo lớp vỏ bền cho vi bọt

1.6 Cơ chế hoà tan vi bọt

1.6.1 Vi bọt với lõi không khí

Trong dung dịch, một vi bọt với lõi không khí chịu tác động của áp suất Laplace và áp suất khí quyển Áp suất không khí bên trong vi bọt (Pint) cân bằng với tổng áp suất Laplace (Plap) và áp suất khí quyển (Patm) theo phương trình:

Pint = Plap + Patm = 2σ

r + Patm (1) σ: sức căng bề mặt giữa vi bọt và môi trường; r: bán kính vi bọt

Theo định luật Henry: Ở nhiệt độ không đổi, lượng một chất khí tan trong một chất lỏng tỉ lệ thuận với áp suất riêng phần của chất khí đó trên chất lỏng

Ban đầu, áp suất không khí trong vi bọt đang rất cao nên nó có xu hướng chuyển dịch một phần không khí ra ngoài môi trường lỏng Điều này làm cho kích thước vi bọt giảm đi nhanh chóng [22]

Dựa theo phương trình (1), khi kích thước vi bọt (r) giảm đi, áp suất Laplace tăng lên càng khiến vi bọt co nhỏ nhanh hơn Phương trình mô tả động học hoà tan của một vi bọt lõi không khí trong môi trường nước được Epstein và Plesset đưa ra như sau:

𝑑𝑟

2σ patm.r

Từ phương trình (2) ta thấy để làm giảm tốc độ hoà tan của vi bọt cần sử dụng khí ổn định (như PFC hoặc nitơ) Khí sử dụng tốt nhất là không hoà tan trong nước,

có tốc độ hoà tan trong nước thấp và kích thước phân tử lớn

1.6.2 Vi bọt với lõi không khí kết hợp với khí ổn định

Với vi bọt có lõi khí gồm không khí và khí ổn định, sự thay đổi kích thước vi bọt sẽ theo ba bước [22]:

- Bước 1: Trong một vài giây ngay sau khi được tạo ra, khí ổn định vẫn giữ trong vi bọt Lúc này chỉ xảy ra sự trao đổi không khí nhằm cân bằng áp suất bên trong với áp suất khí quyển bên ngoài Nếu lượng khí ổn định nhiều, không khí sẽ từ bên ngoài khuếch tán vào bên trong vi bọt làm vi bọt to lên và ngược lại Như vậy, lượng khí ổn định ban đầu sẽ quyết định vi bọt to lên hay nhỏ đi nhờ lượng không khí đi ra hoặc vào vi bọt

- Bước 2: Khi đã có sự cân bằng về áp suất không khí, khí ổn định bắt đầu khuếch tán ra bên ngoài làm giảm kích thước vi bọt Khi kích thước vi bọt giảm, áp suất Laplace tăng lên do đó áp suất của khí ổn định cũng tăng lên để tạo cân bằng

- Cuối cùng, khi áp suất khí ổn định trong vi bọt quá lớn sẽ làm ngưng tụ khí ổn định Lúc này trong vi bọt khí ổn định tồn tại ở dạng lỏng, vi bọt bị biến dạng hoặc thậm chí biến mất

1.6.3 Cơ chế hoà tan vi bọt có vỏ được ổn định bằng các chất diện hoạt

Trong phần lớn các trường hợp, một màng chất diện hoạt tan trong nước bao quanh lõi khí có tác dụng làm chậm quá trình hoà tan vi bọt nhờ làm giảm áp suất Laplace đồng thời làm giảm khả năng khuếch tán khí ra ngoài

Thực tế, trên bề mặt vi bọt luôn tồn tại sự trao đổi các phân tử chất diện hoạt với môi trường xung quanh nhằm cân bằng nồng độ chất diện hoạt Sự hấp thụ hoặc rời đi của các chất diện hoạt khỏi bề mặt vi bọt sẽ tạo ra một lỗ trống tạm thời, cho phép các phân tử khí di chuyển tự do qua đó

Đối với màng phim chất diện hoạt không tan trong nước, sự trao đổi khí với môi trường xung quanh giảm đi một cách có ý nghĩa Borden và Longo đưa ra phương trình hoà tan vi bọt như sau:

𝒅𝒓

𝒅𝒕 = 𝒓−𝑳

𝑫𝒘+𝑹𝒑 ((𝟏 +

𝟐𝝈 𝑷𝒂𝒕𝒎.𝒓)−𝑭

𝟏 + 𝟒𝝈

𝑷𝒂𝒕𝒎.𝒓

) (3)Trong đó Rp là khả năng hạn chế sự khuếch tán khí của màng vi bọt

1.7 Ứng dụng khác của vi bọt trong y học

Ngoài vai trò là tác nhân tương phản trong siêu âm, vi bọt còn nhiều ứng dụng quan trọng trong y học như hình ảnh phân tử, liệu pháp gen và vận chuyển thuốc tới đích

Để ứng dụng trong hình ảnh phân tử, những vi bọt được thiết kế có khả năng chọn lọc các receptor đích và tại đó, vi bọt sẽ tăng cường mức độ phản xạ âm Nhờ vậy mà các tín hiệu từ receptor đích được ghi lại [6] [14] Một số bệnh sử dụng phương pháp này như viêm và xơ vữa động mạch [8] [11]

Trong liệu pháp gen, người ta tiêm đồng thời DNA plasmid với vi bọt DNA tạo liên kết tĩnh điện với bề mặt vi bọt, nhờ đó DNA được phân phối tới đích cùng với vi bọt Việc sử dụng vi bọt làm chất mang còn giúp bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của nuclease qua đó tăng thời gian lưu thông của DNA trong máu

Trong ứng dụng làm chất trung gian vận chuyển thuốc tới đích, các phân tử thuốc nhỏ sẽ gắn vào ngay hoặc dưới lớp vỏ vi bọt hoặc thuốc được nạp vào trong chất mang và sau đó liên kết với bề mặt vi bọt Thuốc có thể được giải phóng bằng cách siêu âm phá vỡ bọt [24] Vận chuyển thuốc thông qua vi bọt thường ứng dụng trong điều trị ung thư, khi vi bọt tiêm vào máu bệnh nhân và tiến tới vị trí khối u, sự

có mặt của vi bọt tại khối u có thể được theo dõi bằng hình ảnh siêu âm, và khi siêu

âm làm vỡ vi bọt, các thuốc chống ung thư được giải phóng tại vị trí khối u, qua đó giảm ảnh hưởng của thuốc tới các bộ phận khác trong cơ thể, giúp giảm tác dụng phụ không mong muốn của các thuốc đó

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã sử dụng một số nguyên liệu chính được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

2 Máy siêu âm Vibra cell Sonics & Materials- Mỹ

3 Kính hiển vi gắn camera Nikon Eclipse Ci-L

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát khả năng tạo bọt từ một số chất diên hoạt thường dùng trong phòng thí nghiệm

- Khảo sát ảnh hưởng của các thông số máy siêu âm đến khả năng tạo vi bọt

Với từng CT, tiến hành bào chế tương tự nhau:

- Chuẩn bị nguyên liệu như bảng 2.3

- Đun nóng 2 pha đến 65oC

- Siêu âm phân tán

 Đổ pha nước vào pha dầu

 Chọn thông số máy siêu âm:

Cường độ: I= 100W

Xung: Siêu âm liên tục

Thời gian: t= 5 phút

 Tiến hành siêu âm phân tán

Bước 2: Siêu âm tạo bọt

- Chỉnh máy siêu âm với các thông số cường độ, xung, thời gian thích hợp

- Đong 15ml dịch tạo bọt rồi đổ vào cốc có mỏ 50 ml

- Sục khí nitơ để bão hoà khí nitơ trong và ngoài dịch tạo bọt

 Cố định lưu lượng khí nitơ

 Sục sâu trong dịch tạo bọt 1 cm trong 1 phút

 Sau đó sục khí đuổi không khí bên ngoài bề mặt dịch tạo bọt

- Siêu âm bề mặt dịch tạo bọt để hình thành vi bọt mong muốn

- Chuyển phần dịch bọt vừa tạo vào ống nghiệm để thực hiện việc đánh giá

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt

- Thời gian phân lớp:

Sau khi tạo bọt, bấm thời gian từ lúc đổ bọt vào ống nghiệm (lúc này cột bọt phân 3 lớp) đến lúc cột bọt phân 2 lớp

- Kích thước trung bình:

 Làm tiêu bản: Sau khi tạo bọt, tiến hành hút bọt bằng micro pipet ở thời điểm

10 phút tại vi trí cố định, làm tiêu bản

 Soi dưới kính hiển vi gắn camera, chụp ảnh ở vật kính 40x, lưu ảnh

 Xử lý hình ảnh bằng phần mềm ImageJ cho kết quả là số lượng bọt và diện tích bọt tương ứng Từ diện tích S của vi bọt, tính ra đường kính vi bọt theo

2.3.3 Phương pháp đánh giá độ bền vi bọt

- Đánh giá độ ổn định vi bọt trong một tiêu bản

Sau khi tạo bọt, làm tiêu bản như mục 2.3.2, quan sát diễn biến quá trình thay đổi kích thước của hệ bọt trên một vi trường bọt cố định

Chụp lại ảnh ở vật kính 40x ở các thời điểm 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 180 phút, 240 phút, xử lý hình ảnh, dùng phần mềm ImageJ đếm số bọt còn trong giới hạn đường kích từ 1- 10μm

- Đánh giá độ ổn định vi bọt trong ống nghiệm

Sau khi tạo bọt, làm tiêu bản như mục 2.3.2, quan sát dưới kính hiển vi gắn camera và chụp ảnh

Làm thêm 5 mẫu tương tự như trên nhưng hút bọt ở các thời điểm 30 phút, 60 phút, 120 phút, 180 phút, 240 phút, làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi gắn camera, chụp ảnh

Chụp ảnh ở vật kính 40x Xử lý hình ảnh, dùng phần mềm ImageJ đếm số bọt còn trong giới hạn đường kích từ 1- 10μm

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thực nghiệm và kết quả

3.1.1 Khảo sát khả năng tạo bọt từ dịch tạo bọt một thành phần

Tiến hành: Tạo bọt với các dịch một thành phần: cremophor A25, poloxamer

188, tween 80, cremophor RH40 1% và 5% (kl/tt) như bước 2 mục 2.3.1 với thông

số siêu âm thích hợp ban đầu:

 Cường độ siêu âm: I= 200W

 Xung siêu âm d: d= 3:1 (siêu âm 3 giây rồi nghỉ 1 giây)

 Thời gian siêu âm: t= 3 phút

- Kết quả:

Hình 3.1 Cột bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) thời điểm phân 3 lớp (trái) và phân

2 lớp (phải )