Bước đầu khảo sát khả năng tạo mk 7 từ môi trường nuôi cấy bacillus subtilis natto

ĐẶT VẤN ĐÈ Acid ascorbic (vitamin C) là một chất có nhiều trong trái cây và là chất rất cần thiết cho sự sống của sinh vật. ở lĩnh VỊĨC hóa sinh, nó là chất chống oxy hóa, tliain gia vào các quá trìnli tổng hợp enzym, tăng sức đề kliáng, phục hồi sức kliỏe, đặc biệt ngăn ngìra bệnli scorbut ở Iigirời. Acid ascorbic còn được dùng làm chất bảo quản tlụrc phẩm và làm hương vị cho một số loại nước uống. Với nliiềii vai trò quan trọng cùng với sự có mặt của vitamin c từ trái cây cho đến nước uống, từ viên thuốc cho đến kẹo ngậm, có thể nói vitamin c là một thuốc sử dimg rất phổ biến trên thực tế. Cimg cấp đều đặn vitamin c cho cơ thể có ý nghĩa lớn để góp phần duy trì và nâng cao sức Idiỏe cho con ngirời. Là vitamin dễ tan trong nước, có thời gian bán thải nhanh, do đó khi sử dimg vitamin c trong điều trị, người bệnh phải dùng thuốc nhiều lần trong ngày, gây khó khăn trong việc sử dụng thuốc, giảm hiệu quả điều trị. Vì vậy việc nghiên cứu phát triển dạng thuốc viên tác dụng kéo dài của vitamin c có ý nghĩa lớn về thực tế. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài; ‘‘Nghiên cứu bào chế viên nén vitamin c tác dụng kéo dài bằng phương pháp dập thẳng vói tá dược HPMC” với các mục tiêu sau: ỉ. Nghiên cứu bào chế viên vitamin c tác dụng kéo dài với tá dược HPMC 4K và HPMC lOOK. 2. Khảo sát yểu tổ về thành phần trong công thức bào chế ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất của viên vitamin c từ viên. 3. Khảo sát yếu tổ về kĩ thuật bào chế ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN CƯỜNG

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7

TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN CƯỜNG

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7

TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn

chân thành tới thầy giáo DS Lê Ngọc Khánh – Giảng viên bộ môn Công

nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn cô giáo TS Đàm Thanh Xuân cùng toàn

thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Lê Xuân Cường

MỤC LỤC Trang

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 3

1.1.1 Giới thiệu 3

1.1.2 Phân loại khoa học 3

1.1.3 Nguồn gốc 3

1.1.4 Đặc điểm hình thái 4

1.1.5 Đặc điểm sinh lý 4

1.1.6 Đặc điểm sinh dưỡng 4

1.2 MK-7 - sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto 5

1.2.1 Nguồn gốc 5

1.2.2 Cấu trúc 6

1.2.3 Tính chất 6

1.3 Cơ chế tác dụng của MK-7 7

1.3.1 MK-7 với sức khỏe của xương 7

1.3.2 MK-7 với sức khỏe tim mạch 8

1.4 Công dụng 9

1.5 Lên men tạo MK-7 từ Bacillus subtilis natto 10

1.5.1 Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7 10

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp, chiết tách các chất từ

dịch lên men của Bacillus subtilis natto 11

1.6 Một số nghiên cứu về B subtilis natto và MK-7 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 15

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 15

2.1.3 Môi trường 15

2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto 16

2.2.2 Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy B subtilis natto 17

2.3.2 Phương pháp chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy 18

2.3.3 Phương pháp định tính MK-7 bằng sắc kí lớp mỏng 19

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22

3.1 Khảo sát có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto.22 3.1.1 Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong phần sinh khối B subtilis natto22 3.1.2 Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong dịch lọc môi trường nuôi cấy B subtilis natto 24

3.2 Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B subtilis

natto 28

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo nucleic

B subtilis natto Bacillus subtilis natto

GGCX γ-glutamate carboxylase

Gla Axit γ-carboxyglutamic

HPLC High-performance liquid chromatography MK-7 Menaquinone 7

mmHg Milimet thủy ngân

mARN messenger Acid ribonucleic

TLC Thin layer chromatography

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang 1.1 Hình thái vi khuẩn B subtilis natto 4

1.2 Công thức cấu tạo của MK-7 6

1.3 MK-7 ngăn chặn con đường của NF-κB truyền tín hiệu 8

1.4 Quá trình loại bỏ Calci ra khỏi động mạch 9

1.5 Các sản phẩm có chứa MK-7 11

2.1 Dụng cụ bình sắc kí 19

2.2 Bản mỏng sắc kí 21

3.1 Bản mỏng chạy sắc kí phần sinh khối với pha động sắc kí là

n-hexan:CH2Cl2 (1:1, v/v)

23

3.2 Bản mỏng tiến hành sắc kí với các hệ dung môi 25

3.3 Bản mỏng tiến hành sắc kí lớp mỏng với pha động

n-hexan:CH2Cl2 (1:1, v/v) 30

Trước đây, con người thường ít quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe của xương từ lúc ban đầu và thường chỉ phát hiện ở giai đoạn sau của bệnh và thường phải dùng thuốc điều trị triệu chứng Các thuốc điều trị loãng xương như Calci, vitamin D, Calcitonin Tuy nhiên các thuốc này thường gây ra các tác dụng không mong muốn Hiện nay, một số loại thực phẩm giúp phòng và điều trị loãng xương, giúp xương chắc khỏe có tác dụng rất tốt

Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7 [46] Ngoài tác dụng trên xương MK-7 cũng đã được chứng minh ngăn ngừa quá trình vôi hóa thành mạch, cải thiện sức khỏe tim mạch [22] Từ đây con người mới bắt đầu chú ý

và nghiên cứu MK-7 MK-7 là một loại vitamin K2 có nguồn gốc tự nhiên, có trong các thực phẩm lên men đặc biệt có nhiều trong Natto - một loại thực phẩm truyền thống của người Nhật được lên men bằng cách ủ đậu tương nấu

chín với Bacillus subtilis natto [9] B subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp

MK-7 và khi thay đổi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, cấp khí, dinh

dưỡng, thời gian lên men có thể ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp

MK-7 của vi khuẩn Các nghiên cứu về MK-MK-7 phần lớn là ở nước ngoài còn trong nước vẫn chưa nghiên cứu được nhiều Dó đó, khóa luận “Bước đầu khảo sát

khả năng tạo MK-7 từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto” được thực

hiện với hai mục tiêu:

1 Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B subtilis

natto

2 Lựa chọn dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtillis natto

1.1.1 Giới thiệu

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacilus, loài Bacillus subtilis

được giáo sư S Sawamura phân lập lần đầu tiên từ quá trình lên men natto năm 1905 [36]

Tên khác: Bacillus subtilis subsp natto; Bacillus subtilis var natto,

Bacillus natto [36], B subtilis (natto) [24]

1.1.2 Phân loại khoa học

Bacillus subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc:

Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ:

Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [48] Phân loại dưới loài:

Bacillus subtilis natto [36]

Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể Bacillus subtilis natto và Bacillus

subtilis của Seki năm 1975 [36] và kết quả phân tích gen 16S rARN của

Tamang năm 2002 [43] cho thấy B subtilis natto thuộc loài B subtilis, các khóa phân loại đã xếp B subtilis natto là một dòng thuộc loài B subtilis

nhưng phân biệt với các dòng khác là khả năng lên men tạo natto [44], [38]

Dòng B subtilis natto có nhiều loại như B subtilis natto N441 [1], B

subtilis N18 [5], B subtilis natto B-12 [55], B subtilis natto N-77 [39]

1.1.3 Nguồn gốc

B subtilis natto được giáo sư Shin Sawamura phân lập từ Natto, một loại

thực phẩm lên men từ đậu tương là món ăn truyền thống của người nhật Bản [24] Vi khuẩn này có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển trên các loại ngũ cốc, các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, cá đặc biệt phát triển tốt trên đậu tương đã nấu chín [47], [42]

1.1.4 Đặc điểm hình thái

B subtilis natto là trực khuẩn hình que, Gram (+) Nội bào tử hình que có

kích thước dưới 1μm Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi (Hình 1.1) Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn hơn hay hình dạng bất định Bề mặt hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [38]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn B subtilis natto [60]

1.1.5 Đặc điểm sinh lý

B subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ

oxy lớn hơn 3% Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30oC –

50oC); pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là

7,2 – 7,6 Sự phát triển của B subtilis natto bị ức chế bởi nhiệt độ lớn hơn

55oC và pH ≤ 4,5 Vi sinh vật có khả năng sinh bào tử, nhiệt độ thích hợp cho

sự nảy mầm của bào tử là 40 oC, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản

ở 0oC [38], [23]

1.1.6 Đặc điểm sinh dưỡng

B subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, nguồn hydrocarbon có thể sử dụng từ

nhiều nguồn khác nhau như: đường đơn (glucose, fructose); đường đôi (saccarose, maltose); polysaccharid (tinh bột, dextrin) Nguồn nitơ cần thiết

cho sự phát triển của B subtilis là các acid amin, protein được cung cấp từ các

nguồn như cao ngô, cao nấm men, cao thịt VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginine, asparagine nhưng không sử dụng được threonin, methinonin, phenylalamin [38], [23]

1.2 MK-7 - sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển B subtilis natto có khả năng sinh

ra nhiều sản phẩm trao đổi chất như các enzym: phytase theo M Shimizu năm

1992 [39]; amylase theo Elif Demirkan năm 2011 [19]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [40]; protease theo M Fujita năm 1993 [20]; nhóm enzym γ–transpeptidase theo Noda năm 1989 [29] Ngoài ra còn có các sản phẩm khác:

γ-PGA theo Bhat năm 2013 [12]; levan (fructan) theo Santos năm 2013 [21],

trong đó có các ứng dụng được quan tâm đó là:

Natto là thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản được cho là có lịch

sử trên 1.000 năm Natto được sản xuất trên nguyên liệu đậu nành với vi

khuẩn Bacillus subtilis natto Hiện nay, Nhật Bản sản xuất trên 300.000

tấn/năm [5] Hai chất được tìm thấy trong natto là nattokinase và menaquinone 7 Nattokinase tiêu fibrin là enzyme làm tan huyết khối, được phát hiện trong Natto vào năm 1980 [43] và menaquinone 7 một sản phẩm cũng đang được nghiên cứu rất nhiều hiện nay [41], [45], [50], [13], [26]

-ene-multiprenyl-1,4-naphthoquinone) [15] Vitamin K tổng hợp gồm 3 loại là vitamin K3, vitamin K4, vitamin K5 [21]

Vitamin K2 (MK-n) gồm có các chất được phân biệt với nhau dựa vào số lượng isoprene-5-carbon ở mạch nhánh, chiều dài chuỗi khác nhau từ 2 đến

15 đơn vị isoprene [42] (n từ 2 đến 15) Trong đó MK-4, MK-7 là được nghiên cứu nhiều nhất

MK-7 là vitamin K2 có nguồn gốc từ thiên nhiên, có nhiều trong những thực phẩm lên men như phomat, miso, và đặc biệt là ở natto Cứ 100 g natto cung cấp 870 µg vitamin K2 chủ yếu dưới dạng MK-7 [9]

1.2.2 Cấu trúc

Công thức cấu tạo

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của MK-7 [56]

Màu sắc: tinh thể, màu vàng [31]

Điểm sôi: 200 oC tại 0,0002 mmHg [31]

Điểm nóng chảy: 54 oC [25]

Độ hòa tan: ít tan hơn so với vitamin K1 trong cùng một dung môi hữu cơ [45], không tan trong nước, tan được trong dầu, mỡ [30], [35]

1.3 Cơ chế tác dụng của MK-7

1.3.1 MK-7 với sức khỏe của xương

MK-7 đã được chứng minh tác dụng kích thích vôi hóa xương trong các

mô xương đùi chuột [18] Ở nồng độ MK-7 (10 -6 hoặc 10 -5 M), MK-7 làm tăng đáng kể các thành phần sinh hóa (phosphatase kiềm, ADN và canxi) ở các mô xương đùi chuột trong ống nghiệm [52] Hơn nữa, MK-7 làm tăng đáng kể phosphatase kiềm, protein (osteocalcin) và ADN trong các tế bào sinh xương MC3T3-E1 trong ống nghiệm [53] Hiệu quả của MK-7 trong các

tế bào sinh xương bị ức chế bởi cycloheximide [52], [18], [16] Như vậy, MK-7 đã được chứng minh kích thích sự hình thành tế bào sinh xương do tăng tổng hợp protein [51] Mặt khác, trong tế bào sinh xương có chứa một protein là osteocalcin Osteocalcin là một protein không thuộc dạng collagen, quan trọng nhất trong cấu trúc xương, là protein gắn kết calci chuyên biệt cho xương phụ thuộc vào vitamin K [4] Osteocalcin tạo ra từ tế bào sinh xương nhờ được cảm ứng bởi vitamin D3 nhưng ở dạng chưa hoạt hóa Khi đó, MK-

7 sẽ hoạt hóa osteocalcin giúp protein này có thể gắn và vận chuyển calci vào xương, hình thành xương và giúp xương vững chắc [33]

MK-7 cũng đã được chứng minh có tác dụng ức chế tái hấp thu tế bào hủy xương [16] MK-7 ức chế các yếu tố bao gồm hormone tuyến cận giáp (PTH)

và prostaglandin E2 (PGE2) Tế bào hủy xương được hình thành khi có mặt của các yếu tố như PTH, PGE2 và các yếu tố khác [16] Ở nồng độ từ (10 -8 -

10 -5 M), MK-7 giúp ngăn chặn PTH- hoặc PGE2 là các chất hình thành tế bào hủy xương

Hiệu quả của MK-7 trên tế bào hủy xương trưởng thành được phân lập từ

mô xương đùi chuột cũng đã được kiểm tra MK-7 làm giảm số lượng các tế

bào hủy xương trưởng thành trong ống nghiệm [16]

Hình 1.3 MK-7 ngăn chặn con đường của NF-κB truyền tín hiệu [49]

MK-7 kích thích sự hình thành tế bào sinh xương và ức chế tái hấp thu tế bào hủy xương MK-7 tăng tổng hợp protein bao gồm osteocalcin và kích hoạt γ-carboxylase trong tế bào sinh xương Hơn nữa, MK-7 cũng đã được biết đến trong việc ngăn chặn sự hoạt hóa của tín hiệu NF-κB trong cả osteoblastogenesis và osteoclastogenesis Hoạt hóa NF- κB là con đường truyền tín hiệu cần thiết cho sự hình thành tế bào hủy xương [49] NF-κB hoạt hóa cytokin gây ra ức chế các tế bào tiền sinh xương và kích thích sự hình thành của các tế bào hủy xương [49] MK-7 đối kháng thụ thể của NF-κB (RANK) ligand (RANKL) –induced là những tiền chất của tế bào hủy xương MK-7 kích thích IκB mRNA biểu hiện [49] Những phát hiện này cung cấp một cơ chế mới của vitamin K2, kích thích sự hình thành xương và

ức chế các tế bào hủy xương

1.3.2 MK-7 với sức khỏe tim mạch

MK-7 kiểm soát các protein điều hòa calci trong mô mạch máu đó là matrix GLA protein và osteocalcin Bằng cách loại bỏ calci ra khỏi động mạch giúp

ngăn quá trình vôi hóa thành mạch máu Điều này giúp làm giảm nguy cơ calci tích tụ tạo thành các mảng xơ vữa động mạch [54]

Hình 1.4 Quá trình loại bỏ Calci ra khỏi động mạch [57]

1.4 Công dụng

Dự phòng và giúp điều trị loãng xương, còi xương, gãy xương, giúp xây

dựng và bảo vệ xương khỏe mạnh, làm chậm quá trình mất xương do tuổi, cải thiện chất lượng xương trong nhiều nguyên nhân bệnh lý như mãn kinh, do dùng thuốc (như corticoid), bệnh Parkinson, xơ gan, đột qụy, đái tháo đường, bệnh tiêu hóa [57]

Bảo vệ sức khỏe hệ tim mạch, chống xơ vữa động mạch, chống tắc nghẽn mạch, tránh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực Nghiên cứu chỉ ra rằng, nếu cung cấp đủ MK7 thì có thể giảm nguy cơ tử vong vì vôi hóa động mạch và các bệnh tim mạch lên đến 50%, mà không gây ra tác dụng phụ nào [57]

MK7 làm tăng lượng Collagen ở lớp thượng bì trên da Đồng thời, giúp giảm lượng Canxi tích tụ trên da, nhờ đó, giúp da khỏe mạnh và giảm nếp nhăn [57]

Các sản phẩm có chứa MK-7:

Natto: là nguồn thực phẩm từ đậu nành lên men có nguồn gốc từ Nhật Bản [44]

Một số loại thực phẩm lên cũng có chứa MK-7 như phô mai, sữa đông [9]

Một số loại thực phẩm chức năng có chứa MK-7 như: MenaQ7, Vững cốt, Vipteen

Hình 1.5 Các sản phẩm có chứa MK-7

1.5 Lên men tạo MK-7 từ Bacillus subtilis natto

1.5.1 Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7

Phương pháp lên men bề mặt:

Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng Môi trường này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, khô cám, cám mỳ, ngô (chiếm 90 - 95%) có bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (khoảng 5 - 10%) để làm xốp canh trường khiến oxy dễ thâm nhập Các nguyên liệu trên cung cấp các chất dinh dưỡng như: nitơ, carbon, vitamin, muối khoáng cho VSV phát triển Môi trường được làm ẩm (50 - 60%) và tiệt khuẩn (1atm, 120 oC) sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40oC để gieo vi sinh vật [10], [2]

Phương pháp lên men chìm:

Người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có sục khí liên tục Thành phần dinh dưỡng gồm: nguồn carbon (các loại đường

dễ đồng hóa: glucose, maltose, hoặc tinh bột đã thủy phân sơ bộ…); nguồn

nitơ (nitơ vô cơ: amoni sulfat, ure…; nitơ hữu cơ: cao ngô, pepton, cao thịt,…); muối khoáng và vitamin (biotin, K2HPO4, MgSO4…) Môi trường dinh dưỡng được tiệt khuẩn trực tiếp trong thiết bị lên men bằng hơi nước nóng (118 – 125oC/45 – 60 phút)

Hạ nhiệt độ và bổ sung VSV, nuôi 2 – 4 ngày Nuôi cấy chìm thường tạo nhiều bọt, nên có thể sử dụng một số chất phá bọt như tween 20, acid oleic [10], [2]

So với lên men bề mặt, phương pháp lên men chìm có ưu điểm: tính liên tục, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, cho năng suất cao, enzym thu được ít lẫn tạp Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là: nồng độ enzym thấp, tốn nhiều điện năng Với những ưu nhược điểm trên, ngày nay phương pháp lên men chìm được sử dụng cho việc sản xuất hầu hết các enzym trong công nghiệp [10]

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp, chiết tách các chất

từ dịch lên men của Bacillus subtilis natto

a) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các chất của B subtilis natto

Vi sinh vật là những cơ thể sống, ngoài những nhu cầu về dinh dưỡng còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, PH, thời gian lên men Các yếu tố này có thể kích thích vi sinh vật phát triển tạo nhiều sản phẩm nhưng cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ môi trường và vi sinh vật có quan hệ mật thiết với nhau Nhiệt

độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp các chất của vi sinh vật Mỗi vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thiểu, tối thích, tối đa mà chúng có thể chịu đựng Khi nhiệt độ lên quá cao vi sinh vật sẽ bị

chết hoặc nhiệt độ xuống quá thấp màng sinh chất bị đông kết lại như vậy đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp các chất của vi sinh vật [2], [7]

Theo Aydin Berenjian và cộng sự khi lên men trong máy lắc nhiệt độ tối

ưu để tạo MK-7 là 37oC [13]

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng tới sự phát triển và tổng

hợp các chất của vi sinh vật [2] Với cùng một giống vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau thì sẽ có thu được các sản phẩm cũng như nồng độ các sản phẩm khác nhau Tùy vào sản phẩm muốn thu nhận sẽ có các môi trường dinh dưỡng phù hợp

Theo nghiên cứu của Aydin Berenjian và cộng sự thì môi trường có peptone đậu tương, glycerol, cao nấm men, K2HPO4 là môi trường tốt nhất để tổng hợp MK-7 [13]

Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian lên men thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định là khoảng thời gian tạo sản phẩm nhiều nhất có thể Thời gian đó phụ thuộc và từng loại vi sinh vật

Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật trải qua bốn pha là pha tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng, pha suy vong Độ dài pha tiềm phát phụ thuộc vào ba yếu tố chính là tuổi của giống, lượng giống và thành phần môi trường [2] Theo một số nghiên cứu thời gian lên men tạo MK-7 thích hợp là 6 ngày

[41], [45], [13]

b) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách MK-7

Loại dung môi

Dung môi chiết có ảnh hưởng đến độ tinh khiết cũng như nồng độ sản

phẩm Nếu dung môi không thích hợp thì sẽ không thu được sản phẩm hoặc

sản phẩm thu được không tối đa, có nhiều tạp

Dung môi thường dùng để chiết MK-7 là n-hexan và 2-propanol [41], [45], [13]

Độ tinh khiết của dung môi

Độ tinh khiết của dung môi dùng chiết ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm muốn tách Nếu dung môi có lẫn nhiều tạp thì sản phẩm thu được cũng không tinh khiết như vậy sẽ khó tinh chế

Tỉ lệ dung môi chiết

Tỉ lệ dung môi chiết có ảnh hưởng đến lượng chất thu được Tỉ lệ các dung môi thích hợp sẽ thu được nhiều sản phẩm nhất

Tỉ lệ dung môi chiết thu được lượng MK-7 lớn nhất khi sử dụng hệ dung môi n-hexan:2-propanol (2:1, v/v), với tỉ lệ dịch lên men:dung môi chiết (1:4, v/v) [41], [45], [13], [14]

1.6 Một số nghiên cứu về B subtilis natto và MK-7

Các nghiên cứu về tổng hợp, chiết tách MK-7:

Ở trong nước: Chưa có một công trình nghiên cứu nào về quá trình tổng

hợp, tách chiết MK-7

Ở ngoài nước:

Surya Rosa-Putra và cộng sự đã nghiên cứu sinh tổng hợp MK-7 từ

Sphingobacterium multivorum thông qua con đường methylerythritol

phosphate và tiến hành tinh chế MK-7 bằng TLC (CH2Cl2:n-hexan, 1:1, Rf = 0,4) [32]

Các nghiên cứu về tác dụng của MK-7:

Năm 1999, Yamaguchi đã nghiên cứu MK-7 trong việc ngăn ngừa loãng

xương ở chuột, kết quả cho thấy MK-7 có tác dụng ngăn ngừa loãng xương

[50]

Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7 Kết quả cho thấy MK-7

tác động đến quá trình hình thành xương và đóng vao trò quan trọng trong việc ngăn ngừa loãng xương [46].

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng

Bacillus subtilis natto - Chủng Nhật Bản được lưu giữ tại phòng Vi

sinh-kháng sinh bộ môn Công nghiệp Dược - Đại học Dược hà Nội

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất