Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất alkyl hóa của curcumin

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Nghệ vàng Curcuma longa L. thuộc họ gừng (Zingiberaceae), được trồng nhiều ở những vùng khí hậu nóng ẩm như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Jamaica, Peru… và Việt Nam. Củ nghệ từ lâu đã được sử dụng rộng rãi làm gia vị, chất bảo quản và chất tạo màu trong thực phẩm 23. Bên cạnh đó, củ nghệ còn được sử dụng trong y học cổ truyền để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, giải độc cơ thể, cân bằng tiêu hóa và chữa bệnh đau dạ dày...Trong những thập kỷ gần đây, rất nhiều các nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính sinh học và dược học của củ Nghệ vàng cũng như các thành phần chiết xuất từ củ nghệ, trong đó curcuminoid là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ. Hoạt tính sinh học của curcumin rất đa dạng: chống oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đường, ức chế phát triển khối u…2. Hiện nay curcumin được sử dụng như dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư trực tràng, bệnh vảy nến,..28. Không những thế, các nghiên cứu cũng chỉ ra curcumin có độ an toàn cao, không gây ra bất cứ tác dụng phụ nào, dung nạp tốt đối với cơ thể, không độc đến liều 8gngày 21.

NGUYỄN THỊ QUỲNH

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT ALKYL

HÓA CỦA CURCUMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

NGUYỄN THỊ QUỲNH

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT ALKYL

HÓA CỦA CURCUMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S.Phạm Thị Hiền và DS

Nguyễn Thị Hải Quỳnh, những người đã trực tiếp hướng dẫn, cho tôi những lời

khuyên quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc

biệt là PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Hải, Th.S Nguyễn Văn

Giang, và CN Phan Tiến Thành của tổ môn Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình

giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ môn Vi Sinh - Sinh học - Trường Đại học Dược Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô trong trường, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xin chân thành cảm ơn!

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến bố mẹ và bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Quỳnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 2

1.1.1. Cấu trúc phân tử curcumin 2

1.1.2 Tính chất hóa lý 3

1.1.3 Phương pháp điều chế 6

1.1.4 Độ ổn định 7

1.1.5 Tác dụng sinh học của curcumin 9

1.2 TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CÁC DƯỢC CHẤT MỚI THÔNG QUA VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN 10

1.3 CÁC PHẢN ỨNG ALKYL HÓA CURCUMIN 13

1.3.1 Phương pháp alkyl hóa 13

1.3.2 Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã được thực hiện 13

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT 15

2.2 DỤNG CỤ - THIẾT BỊ 16

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.4.1 Phân lập curcumin từ bột curcuminoid 17

2.4.2 Tổng hợp hóa học 17

2.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết 18

2.4.4 Xác định cấu trúc hóa học 18

2.4.5 Thử hoạt tính sinh học 18

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 PHÂN LẬP CURCUMIN 20

3.2 TỔNG HỢP HÓA HỌC 21

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất 4,4-dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin 21

3.1.1.1 Tổng hợp methyl cloroacetat 21

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất 4,4-dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin (QH-1) 21

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 4,4-diethoxycarbonylmethyl-O,O’-diethoxycarbonylmethyl-curcumin 25

3.1.2.1 Tổng hợp ethyl cloroacetat 25

3.1.2.2 Tổng hợp dẫn chất 4,4-diethoxycarbonylmethyl-O,O’-diethoxycarbonylmethyl-curcumin (QH-2) 25

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất (2-hydroxylethyl)-curcumin (QH-3) 28

3.1.4 Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học 30

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 31

3.3.1 Xác định cấu trúc sản phẩm QH-1 31

3.3.2 Xác định cấu trúc sản phẩm QH-2 33

3.3.3 Xác định cấu trúc sản phẩm QH-3 35

3.3.1 Tiến hành: 37

3.3.2 Kết quả thực nghiệm 38

3.4 BÀN LUẬN 38

3.4.1 Về tổng hợp hóa học 38

3.4.2 Về xác định cấu trúc 40

3.4.2.1 Về cấu trúc của QH-1 40

3.4.2.2 Về cấu trúc của QH-2 42

3.4.2.3 Về cấu trúc của QH-3 43

3.4.3 Về thử hoạt tính sinh học 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) BDMC Bisdemethoxycurcumin

H pylori Helicobacter pylori

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

(Human immunodeficiency virus)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High-performance liquid chromatography)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

KLsp Khối lượng sản phẩm

MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

PMA phorbol myristate acetate

Rf Hệ số lưu giữ (Retension factor)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Danh mục các nguyên liệu – hóa chất 15

Bảng 2 2 Danh mục các dụng cụ thiết bị 16

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng 23

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ tác nhân đến hiệu suất phản ứng23 Bảng 3 3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng 26

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát tỉ lệ ethylacetat:curcumin 27

Bảng 3 5 Kết quả khảo sát tỉ lệ 2-cloroethanol : curcumin 29

Bảng 3 6 Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học 30

Bảng 3 7 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của QH-1 31

Bảng 3 8 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của QH-1 32

Bảng 3 9 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR (500 MHz, aceton-d 6 ) của QH-1 32

Bảng 3 10 Kết quả phân tích phổ IR (KBr)của QH-2 33

Bảng 3 11 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của QH-2 34

Bảng 3 12 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) của QH-2 34

Bảng 3 13 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của QH-3 35

Bảng 3 14 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của QH-3 36

Bảng 3 15 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) của QH-3 36

Bảng 3 16 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, chống nấm 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 1.Cấu trúc phân tử của curcumin 2

Hình 1 2 Các đồng phân enol – ceton của curcumin 2

Hình 1 3 Dạng hỗ biến ceton – enol của curcumin trong dung dịch 3

Hình 1 4 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 4

Hình 1 5 Phản ứng của curcumin với gốc tự do 5

Hình 1 6 Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin 5

Hình 1 7 Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin 6

Hình 1 8 Công thức cấu tạo của curcumin (A), demethoxycurcumin(B), bisdemethoxycurcumin (C) 6

Hình 1 9 Sơ đồ tổng hợp curcumin 7

Hình 1 10 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm 8

Hình 1 11 Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng 8

Hình 1 12 Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin – sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylene (D), tạo phức hợp kim loại – curcumin (E) 11

Hình 1 13 Một số hợp chất bán tổng hợp từ curcumin 12

Hình 2 1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-hydroxyethyl, methoxycarbonylmethyl và ethoxycarbonylmethyl của curcumin 17

Hình 3 1 Dạng hỗ biến ceton - enol của di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Nghệ vàng Curcuma longa L thuộc họ gừng (Zingiberaceae), được

trồng nhiều ở những vùng khí hậu nóng ẩm như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Jamaica, Peru… và Việt Nam Củ nghệ từ lâu đã được sử dụng rộng rãi làm gia vị, chất bảo quản và chất tạo màu trong thực phẩm [23] Bên cạnh đó, củ nghệ còn được sử dụng trong y học cổ truyền để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, giải độc

cơ thể, cân bằng tiêu hóa và chữa bệnh đau dạ dày Trong những thập kỷ gần đây, rất nhiều các nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính sinh học và dược học của củ Nghệ vàng cũng như các thành phần chiết xuất từ củ nghệ, trong đó curcuminoid là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ Hoạt tính sinh học của curcumin rất đa dạng: chống oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đường, ức chế phát triển khối u…[2] Hiện nay curcumin được sử dụng như dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư trực tràng, bệnh vảy nến, [28] Không những thế, các nghiên cứu cũng chỉ ra curcumin có độ an toàn cao, không gây ra bất cứ tác dụng phụ nào, dung nạp tốt đối với cơ thể, không độc đến liều 8g/ngày [21]

Với các ưu điểm trên, curcumin mang lại tiềm năng rất lớn trong việc phát triển các hợp chất tương tự curcumin dùng làm thuốc Nhiều tác giả đã thực hiện việc biến đổi trong cấu trúc của curcumin như sửa đổi chuỗi bên aryl, chức diceton, các liên kết đôi, thay đổi chức methylen hoạt động, tạo phức kim loại của curcumin Những nghiên cứu này đã đạt được một số thành công nhất định trong việc nâng cao hoạt tính sinh học hoặc sinh khả dụng của curcumin [1], [10]

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất alkyl hóa của curcumin” Mục tiêu của đề tài này

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

1.1.1 Cấu trúc phân tử curcumin

- Cấu trúc phân tử (Hình 1.1)

Hình 1 1.Cấu trúc phân tử của curcumin

- Tên khoa học: 3,5-dion

(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-dien Tên khác: Diferuloylmethan, curcumin I

- CTPT: C21H20O6

- Khối lượng phân tử: 368,39 đvC

Hình 1 2 Các đồng phân enol – ceton của curcumin

Curcumin và các dẫn chất là những β-diceton tồn tại ở dạng đồng phân hỗ biến:

cis – diceton hoặc trans– diceton và dạng enol (cis– enol) [20] (Hình 1.2)

Trong dung dịch, curcumin và các dẫn chất tồn tại ở dạng cân bằng hỗ biến của

dạng diceton đối xứng và dạng ceton – enol được ổn định bằng liên kết hydro nội

phân tử (Hình 1.3) [18]

OMe OH

H

Hình 1 3 Dạng hỗ biến ceton – enol của curcumin trong dung dịch

Trong dung dịch nước, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dưới dạng diceton; ngược lại, ở pH > 8, dạng enol chiếm ưu thế hơn [9] Tùy theo từng dung môi thích hợp, có thể có trên 95% curcumin tồn tại ở dạng enol [18]

1.1.2 Tính chất hóa lý

a Tính chất vật lý

 Dạng thù hình: Curcumin tồn tại dưới dạng bột vô định hình hoặc tinh thể

hình kim màu vàng cam Theo các báo cáo của Samphui và cộng sự, tinh thể curcumin có 3 dạng thù hình khác nhau tùy thuộc vào dung môi và tốc độ kết tinh

- Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-,

HA2- và A3- lần lượt tương ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0 (Hình 1.4) [18]

Hình 1 4 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch

 Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vòng benzen

Các cặp electron chưa liên kết của oxy nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng benzen làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl trở nên linh động hơn Điều này giải thích tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin Ngoài ra, phản ứng với các gốc tự do còn liên quan đến sự chuyển nguyên tử hydro của nhóm methylen ở carbon giữa mạch, làm giảm hay mất hoạt tính của các gốc này Hai hướng phản ứng này góp phần giải thích tính chống oxy hóa mạnh của

curcuminoid khi ứng dụng nó trong ngành dược (Hình 1.5)

Hình 1 5 Phản ứng của curcumin với gốc tự do

 Phản ứng hydro hóa

Trong công thức cấu tạo của curcumin có chứa các hydrocarbon chưa no, do đó

có khả năng tham gia phản ứng cộng hợp 1 hoặc nhiều phân tử hydro khi có mặt xúc tác kim loại hay oxyd kim loại (Ni, PtO2…) tạo thành các dẫn chất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, thậm chí khử ceton Các sản phẩm này cũng

hydroxystiryl)-1-phenylpirazol Các sản phẩm này đều có hoạt tính chống nấm và

Curcuminoid có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại khác nhau: Mn2+,

Fe2+, Cu2+…Curcumin có khả năng cho đi một hay nhiều cặp electron tự do trên các nguyên tử oxy của cấu trúc ceton – enol và chất nhận là các ion kim loại với lớp vỏ electron còn trống Do vậy, liên kết cộng hóa trị giữa curcuminoid và kim loại được hình thành Phức của kim loại và curcuminoid có nhiều màu sắc khác nhau

1.1.3 Phương pháp điều chế

a Chiết xuất từ củ nghệ

Curcuminoid là tên gọi chung của một nhóm dẫn xuất diarylheptan có trong

củ nghệ vàng Curcuma longa L., bao gồm curcumin, demethoxycurcumin (DMC),

bisdemethoxycurcumin (BDMC) và một ít cyclocurcumin Chúng là những hợp

chất phenolic, các dẫn xuất đều khác nhau ở nhóm thế trên gốc phenyl (Hình 1.8)

Hình 1 8 Công thức cấu tạo của curcumin (A), demethoxycurcumin(B),

Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết từ bột củ nghệ, thu được 0,76-1,1% curcumin I tinh khiết, độ chảy 182-183°C [4]

Một trong các phương pháp để chiết curcumin là chiết bằng siêu âm Bột nghệ được chiết bằng dung môi thích hợp thu sản phẩm thô và tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, thu được curcumin tinh khiết [6]

b Tổng hợp toàn phần curcumin

Curcumin được tổng hợp bằng phương pháp hóa học lần đầu tiên vào năm

1913 bởi Lampe [26] Phương pháp thông thường sử dụng để tổng hợp curcumin là phương pháp đi từ valinin và aceton [11] Sơ đồ phản ứng chung được trình bày

trong Hình 1.9

Hình 1 9 Sơ đồ tổng hợp curcumin

1.1.4 Độ ổn định

 Phân hủy trong môi trường kiềm:

Curcumin tương đối ổn định ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH>7 Tonnesen và Karlsen (1985) đã nghiên cứu sự phân hủy của curcumin ở pH

= 7 – 10, sản phẩm phân hủy được xác định bằng phương pháp HPLC Sản phẩm phân hủy chính là acid ferulic và feruloylmethan, ngoài ra còn có các sản phẩm

ngưng tụ (Hình 1.10) [18]

Hình 1 10 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

 Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng:

Dưới tác dụng của ánh sáng, curcumin phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic, acid ferulic Curcumin cũng không bền ngay cả khi có và không có mặt của oxy Khi có mặt oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy tạo thành 4-

vinylguaialcol và vanillin (Hình 1.11) [18] Trong điều kiện không có oxy,

curcumin có thể bị vòng hóa

Hình 1 11 Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng

1.1.5 Tác dụng sinh học của curcumin

Curcumin đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, chống tăng sinh, ngăn ngừa ung thư, chống kí sinh trùng, chống sốt rét hiệu quả Các nghiên cứu trên động vật cho thấy curcumin có hiệu quả trên một số bệnh như tiểu đường, béo phì, bệnh thần kinh, rối loạn tâm thần [2] Dưới đây là một số hoạt tính sinh học nổi bật của curcumin

 Tác dụng chống oxy hóa

Các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa của curcumin mạnh tương đương với vitamin C, vitamin E và β-caroten Tác dụng chống oxy hóa của curcumin thông qua khả năng dọn các gốc tự do như anion superoxid (O2-) và gốc

tự do hydroxyl (OH·), từ đó ngăn cản sự peroxy hóa lipid [10]

 Tác dụng phòng và điều trị ung thư

Curcumin là chất hủy diệt tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính, có tác dụng kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối [24] Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện trên các tác động của curcumin trên các ung thư như ung thư đại trực tràng (CRC), ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, đa u tủy, ung thư phổi…[15] Một ưu điểm nổi bật của curcumin đó là tính an toàn cao Những thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy không có giới hạn liều dùng độc tính khi dùng liều tới 8 gam/ngày [7]

 Tác dụng chống viêm

Curcumin có khả năng ức chế một số lượng lớn các phân tử khác nhau liên quan đến phản ứng viêm, bao gồm phospholipase, LOX, COX-2, leukotrien, thromboxan, prostaglandin (PG)…Curcumin có tác dụng như một tác nhân kháng viêm bằng cách ức chế sản xuất các cytokin tiền viêm trong PMA hay bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi và các đại thực bào phế nang [25] Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy hiệu quả của curcumin trong việc điều trị bệnh viêm khớp do gout, viêm xương khớp và viêm khớp dạng thấp [25]

 Tác dụng điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng

Nghệ có tác dụng làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày - tá tràng; tăng gastrin, secretin, bicarbonat, và bài tiết enzym tuyến tụy Nghệ cũng đã được chứng minh là ức chế hình thành loét, chống lại tác động của các yếu tố gây loét như stress, rượu, một số thuốc như indomethacin, reserpin, làm tăng đáng kể chất nhầy ở thành dạ dày của chuột [8]

Curcumin ức chế quá trình tạo kháng nguyên gây viêm và ngăn chặn sự phát

triển của vi khuẩn H pylori Điều đó cho thấy curcumin rất có tiềm năng trong điều trị viêm loét dạ dày khởi phát từ H pylori [8]

 Tác dụng khác

Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng dịch chiết nghệ và curcumin có tác dụng

ức chế sự phát triển của một số loài vi khuẩn, trong đó điển hình là trực khuẩn lao

(Plasmodium falciparum), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), Salmonella paratyphi, Microcus pyogenes, [6] Curcumin còn có tiềm năng lớn trong việc điều

trị viêm gan B, viêm gan C, HIV [10]

Curcumin được sử dụng trong mỹ phẩm giúp nhanh lành vết thương, liền sẹo

Có được tác dụng này là nhờ khả năng chống oxy hóa, dọn các gốc tự do gây viêm loét Kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của collagen, curcumin đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thương ở mô [2]

Trong các nghiên cứu in vitro, curcumin được chứng minh là gián tiếp ảnh

hưởng tới bệnh Alzheimer thông qua 8 cơ chế khác nhau [10]

VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN

Curcumin được biết đến với ưu điểm nổi bật về tác dụng sinh học cũng như

độ an toàn cao Tuy nhiên, việc sử dụng curcumin qua đường uống để điều trị gặp phải một số khó khăn như sinh khả dụng của curcumin rất thấp do độ tan kém, bị chuyển hóa nhanh khi vào cơ thể, một số hoạt tính sinh học chưa có ý nghĩa lâm sàng [10] Gần đây, hướng tạo ra hợp chất mới từ khung curcuminoid có sẵn đã

nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Việc biến đổi trong cấu trúc của curcumin bao gồm sửa đổi chuỗi bên aryl, chức diceton, các liên kết đôi, thay đổi

chức methylen hoạt động, tạo phức kim loại của curcumin (Hình 1.12) [7] Những

nghiên cứu này đã đạt được một số thành công nhất định trong việc nâng cao hoạt tính sinh học hoặc sinh khả dụng của curcumin Dưới đây là một số ví dụ cụ thể về các dẫn chất bán tổng hợp từ curcuminoid

Hình 1 12 Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin – sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylene (D),

tạo phức hợp kim loại – curcumin (E)

Fuchs và cộng sự đã thực hiện việc biến đổi trên chức –OH của chuỗi aryl và đánh giá tác dụng của chúng chống lại dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt và ung

thư vú Hợp chất 1, 2 được đánh giá là chất gây độc tế bào mạnh chống lại tế bào

ung thư tuyến tiền liệt thể phụ thuộc androgen cũng như thể không phụ thuộc androgen Các hợp chất này cũng ức chế dòng tế bào ung thư vú thể phụ thuộc estrogen và không phụ thuộc estrogen [13]

Aggrwal và cộng sự đã tổng hợp phức [DLys6 ]-LHRH-curcumin (3) và

nghiên cứu tác dụng chống ung thư tuyến tụy trên cả in vivo và in vitro Kết quả cho thấy trên in vitro, [DLys6 ]-LHRH-curcumin ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư một

cách phụ thuộc vào So sánh tác dụng của curcumin và [DLys6 ]-LHRH-curcumin ở các nồng độ như nhau cho thấy hoạt động của curcumin và [DLys6 ]-LHRH-

curcumin là tương đương Trên in vivo, [DLys6]-LHRH-curcumin ngăn chặn sự

tăng trưởng của tế bào ung thư tuyến tụy ở chuột, làm giảm trọng lượng và khối lượng khối u một một cách đáng kể so với curcumin [7]

Al-Hujaily đã tổng hợp và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của hai chất

tương tự curcumin là (4) và (5), qua thực nghiệm cho thấy tác dụng chống ung thư của (4) và (5) gấp 5 lần curcumin ở liều 40 mM Bên cạnh đó các hợp chất này ổn

định trong máu và cho sinh khả dụng cao hơn curcumin khi nghiên cứu trên chuột thí nghiệm [9]

Handler và cộng sự đã tổng hợp các chất tương tự curcumin trong đó hợp

chất (6), (7) đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh enzym 1 và

COX-2 [14] Jankun và cộng sự đã thực hiện các nghiên cứu để xác định khả năng ức chế vượt trội của các dẫn xuất curcumin tổng hợp so với curcumin Hơn 75% các dẫn xuất của curcumin đã đến được đích tác dụng, ức chế P-12-LOX, trong khi các curcuminoid đã không thể tiếp cận được đích tác dụng và do đó không thể ức chế P-12-LOX [19]

Hình 1 13 Một số hợp chất bán tổng hợp từ curcumin

1.3 CÁC PHẢN ỨNG ALKYL HÓA CURCUMIN

1.3.1 Phương pháp alkyl hóa

a O-alkyl hóa

Bao gồm các phản ứng alkyl hóa nhóm –OH alcol hoặc phenol, sản phẩm là ether; nhóm –OH của acid carboxylic, sản phẩm là ester [5] Curcumin là một hợp chất diphenolic, để alkyl hóa sẽ sử dụng phản ứng tổng hợp ether (phản ứng Williamson) Đây là một phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử SN2, trong đó một ion alkoxid thay thế một halogen, sulfonyl hoặc một nhóm sulfat tùy thuộc vào tác nhân alkyl hóa được sử dụng Alkyl halogenid thường được sử dụng nhiều nhất [22]

b C-alkyl hóa

C-alkyl hóa thường là phản ứng alkyl hóa các hợp chất chứa nhóm methylen

hoạt động (là các hợp chất có nguyên tử hydro gần các nhóm hút điện tử mạnh) [5] Trong phân tử curcumin, C-4 thuộc cấu trúc ß-diceton nên 2 nguyên tử hydro ở vị trí C-4 trở lên rất linh động, liên kết C-H ở đây dễ dàng bị cắt đứt Chính vì vậy mà

vị trí C-4 trong phân tử curcumin có khả năng bị tấn công bởi các tác nhân alkyl

hóa, tạo ra dẫn chất C-alkyl hóa của curcumin

1.3.2 Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã được thực hiện

a Phản ứng tổng hợp diethyl-curcumin của Hemanta Chowdhury và cộng sự (2000)

Sơ đồ phản ứng:

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat,

sử dụng tác nhân ethylbromid, đun hồi lưu trong 24-48h [16] Sau phản ứng, lọc và cất loại dung môi, chiết cắn bằng dung môi hữu cơ Pha hữu cơ được rửa sạch bằng nước Làm khan và bốc hơi dung môi thu được sản phẩm

Hiệu suất phản ứng đạt 86,0%

b Phản ứng tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin của Hironori Ohtsu và cộng sự (2002) [17]

Sơ đồ phản ứng:

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat

và kali iodid, sử dụng tác nhân methyl cloroacetat, đun hồi lưu trong 24h Sản phẩm

được tách ra bằng sắc ký cột, thu được mono-O-methoxycarbonylmethyl-curcumin

và di-O- methoxycarbonylmethyl-curcumin với hiệu suất đều là 20%

c Phản ứng tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin của Changtam và cộng

sự (2010) [12]

Sơ đồ phản ứng:

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt kali carbonat,

sử dụng tác nhân 2-bromoethanol, đun hồi lưu trong 5h Sản phẩm được tách ra

bằng sắc ký cột, mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin và

di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin với hiệu suất lần lượt 47% là 32%

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là bột curcuminoid chiết xuất từ củ nghệ vàng tại Bộ môn Công nghiệp dược – Đại học Dược Hà Nội

Các nguyên vật liệu và hóa chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình

bày trong Bảng 2.1:

Bảng 2 1 Danh mục các nguyên liệu – hóa chất

6 Máy cấy quay chân không Buchi B480 Thụy Sĩ

8 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (

1

9 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ

10 Máy đo phổ khối lượng 1100 Series LC/MSD Trap Mỹ

11 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Phân lập curcumin từ bột curcuminoid

Tổng hợp một số dẫn chất alkyl hóa của curcumin thiên nhiên chiết từ củ nghệ vàng và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy

Xác định cấu trúc các sản phẩm tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

Thử tác dụng kháng khuẩn và chống nấm của curcumin và các sản phẩm tổng hợp thu được

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phân lập curcumin từ bột curcuminoid

Tinh chế bằng phương pháp kết tinh phân đoạn trong dung môi ethanol tuyệt đối

2.4.2 Tổng hợp hóa học

Tổng hợp hóa học được thực hiện bởi các phản ứng O-alkyl hóa, C-alkyl hóa

với các alkyl halogenid trong môi trường khan nước Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất 2-hydroxyethyl, methoxycarbonylmethyl và ethoxycarbonylmethyl của

curcumin được trình bày trên Hình 2.1

Tinh chế sản phẩm bằng các phương pháp: chiết, kết tinh, kết tủa

Hình 2 1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 2-hydroxyethyl, methoxycarbonylmethyl và

ethoxycarbonylmethyl của curcumin

2.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết

Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

SKLM được thực hiện trên bản mỏng silicagel GF254 Merck 70-230 mesh với hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Nhiệt độ nóng chảy được ghi trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

b Phổ khối lượng (MS):

Được ghi theo phương pháp ESI trên máy đo phổ khối lượng 1100 S1100 Series LC/MSD Trap

c Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR):

Được ghi trên máy Bruker AV-500

2.4.5 Thử hoạt tính sinh học

Thử tác dụng kháng khuẩn và chống nấm của các sản phẩm tổng hợp được bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh - Sinh học – Đại học Dược Hà Nội

 Nguyên tắc:

- Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định (vi khuẩn hoặc vi nấm), hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn (vô nấm)

- Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, vô nấm và được đánh vòng vô khuẩn, vô nấm được đánh giá theo công thức:

D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn, vô nấm

Di : Đường kính vòng vô khuẩn hoặc vô nấm thứ i s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song

 Giống vi sinh vật kiểm định gồm 5 vi khuẩn Gram(+) và 4 vi khuẩn Gram(-) và 4 vi nấm sau:

Staphylococcus aureus ATCC 1128

Bacillus pumilus ATCC 10241

Bacillus subtilis ATCC 6633

Bacillus cereus ATCC 9946

Sarcina lutea ATCC 9341

(S aureus) (B pumilus) (B subtilis) (B cereus) (S lutea)

Escheriachia coli ATCC 25922

Proteus mirabilis BV 108

Shighella flexneri DT 112

Salmonella typhi DT 220

(E coli) (P mirabilis) (S flexneri) (S typhi)

- Benzathin penicillin 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gr(+)

- Streptomycin 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gr(-)

- Kháng sinh chống nấm itraconazol 300 μg/mL pha trong MeOH

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 PHÂN LẬP CURCUMIN

 Tiến hành:

Bột curcuminoid có thành phần curcumin I (khoảng 70%), curcumin II (DMC) và curcumin III (BDMC) được kết tinh lại 3 lần trong ethanol tuyệt đối, các bước thực hiện như sau:

- Hòa tan 10,00 g curcuminoid trong 1000 mL ethanol tuyệt đối ở 50°C, lọc loại bỏ tạp vô cơ không tan Để kết tinh dịch lọc ở 10°C trong 24h

- Tinh thể kết tinh được lọc hút chân không, rửa, kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng SKLM Kiểm tra sơ bộ dịch lọc bằng SKLM, cất quay chân không đến kiệt thu sản phẩm thô

- Tinh thể thu được tiếp tục đem kết tinh lại lần 2, 3 tương tự như lần 1

 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

- SKLM được thực hiện trên bản mỏng silicagel GF254 Sản phẩm được hòa tan trong EtOH để chấm sắc ký Pha động để chạy sắc ký là hệ dung môi dicloromethan : methanol = 20: 1 Sau khi chạy sắc ký, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, chất thử cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ và trùng với chất chuẩn curcumin I Kết quả Rf = 0,80 (CH2Cl2:MeOH = 20:1)

- Đồng thời, tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm Kết quả đo nhiệt

độ nóng chảy cho thấy các mẫu thử đều có điểm chảy rõ ràng trong khoảng 184,0°C

3.2 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Trong khóa luận này, chúng tôi thực hiện phản ứng alkyl hóa curcumin với

ba tác nhân là 2-cloroethanol (ethylen clorohydrin), methyl cloroacetat và ethyl cloroacetat Phản ứng được thực hiện theo qui trình kinh điển của phản ứng tổng hợp ether Williamson trong môi trường khan nước

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất dimethoxycarbonylmethyl-curcumin

 Tiến hành phản ứng

Đun hồi lưu hỗn hợp của curcumin (1,0 g, 2,71 mmol), kali iodid (0,22 g, 1,3 mmol) và kali carbonat khan (0,9 g, 6,5 mmol) trong 80 mL dung môi (đã làm khan với kali carbonat khan) trong một bình cầu hai cổ 250 mL Thêm dần tác nhân methyl cloroacetat trong quá trình hồi lưu Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol = 30:1 để xác định thời gian và tỉ lệ tác nhân phản ứng thích hợp

 Cất loại toàn bộ ethylacetat Thu cắn, hòa tan hoàn toàn cắn trong 150

mL hỗn hợp dung môi ethylacetat : ethanol (1:1) nóng (70°C) trong bình nón Làm lạnh dung dịch bằng nước đá, chờ cho kết tinh và lọc thu lấy phần chất rắn

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát dung môi phản ứng và tỉ lệ tác nhân alkyl hóa Với mỗi dung môi và mỗi tỉ lệ tác nhân thực hiện phản ứng 3 lần, lấy kết quả trung bình

Tiến hành khảo sát với 3 dung môi là: aceton, acetonitril và DMF Kết quả

khảo sát dung môi được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng

STT Dung môi Tỷ lệ tác nhân

: curcumin

Thời gian (h)

KLSP (g)

Hpư (%)

T°nc (°C)

Từ đó chúng tôi lựa chọn aceton làm dung môi cho các phản ứng tiếp theo

b Khảo sát tỉ lệ tác nhân phản ứng

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng tác nhân so với nguyên liệu curcumin ở các tỉ lệ 20:1, 40:1, 45:1, 50:1 và 60:1 Kết quả khảo sát tỉ lệ tác nhân phản ứng

được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ tác nhân đến hiệu suất phản ứng

STT Tỉ lệ tác

nhân:curcumin

Thời gian (h)

KLSP (g)

Hpư (%)

 Khi sử dụng các tỉ lệ các tác nhân alkyl hóa khác nhau thì sản phẩm thu được

có nhiệt độ nóng chảy khá tương đồng, dao động từ 164,4-167,2°C

 Khi tăng tỉ lệ tác nhân, hiệu suất của phản ứng tăng lên rõ rệt Sau khi tăng đến tỉ lệ tác nhân : curcumin = 45:1, dù có tăng thêm lượng tác nhân thì hiệu suất cũng hầu như không tăng, thậm chí bị giảm khi tăng tới tỉ lệ 60:1 Nguyên nhân là

do tác nhân còn dư nhiều ảnh hưởng tới quá trình tinh chế sản phẩm

Từ các nhận xét trên, chúng tôi lựa chọn tỉ lệ methyl cloroacetat : curcumin là 45:1 để thực hiện phản ứng

Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi đã chọn điều kiện của phản ứng là:

- Dung môi phản ứng : aceton

- Tỉ lệ methyl cloroacetat : curcumin = 45:1

và ethylacetat : n-hexan = 7: 3 Sau khi chạy sắc ký, soi bản mỏng dưới đèn tử

ngoại ở bước sóng 254 nm cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ Kết quả: Rf = 0,58 (CH2Cl2 : MeOH = 30:1); Rf = 0,64 (EtOAc : n-hexan = 7:3)

- Đồng thời, tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp được Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm có điểm chảy rõ ràng

trong khoảng 165,5 - 167,0°C

cloroacetat trong quá trình hồi lưu Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol = 20:1 để xác định thời gian và tỉ lệ tác nhân phản ứng thích hợp

 Cất loại toàn bộ ethylacetat, chất rắn được hòa tan hoàn toàn trong

100 mL ethanol nóng (70°C) trong bình nón Làm lạnh dung dịch bằng nước

đá, chờ cho kết tinh hết và lọc thu lấy phần chất rắn

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát dung môi phản ứng và tỉ lệ tác nhân alkyl hóa Với mỗi dung môi và mỗi tỉ lệ tác nhân thực hiện phản ứng 3 lần, lấy kết quả trung bình

a Khảo sát dung môi phản ứng

Tiến hành khảo sát với 3 dung môi là aceton, acetonitril và DMF Kết quả

khảo sát dung môi được trình bày trong Bảng 3.3

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng

STT Dung môi Tỷ lệ tác nhân

: curcumin

Thời gian (h)

KLSP (g)

Hpư (%)

- Trong 3 dung môi sử dụng, aceton cho hiệu suất phản ứng cao nhất

Từ đó chúng tôi lựa chọn aceton làm dung môi cho các phản ứng tiếp theo

b Khảo sát tỉ lệ tác nhân phản ứng

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng tác nhân so với nguyên liệu ở các tỉ lệ

40:1, 50:1 và 60:1 Kết quả được khảo sát được trình bày trong Bảng 3.4

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát tỉ lệ ethylacetat:curcumin

STT Tỉ lệ ethyl

cloroacetat:curcumin

Thời gian (h)

KLSP (g)

Hpư (%)

T°nc (°C)

Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi đã chọn điều kiện của phản ứng là:

- Dung môi phản ứng: aceton

- Tỉ lệ ethyl cloroacetat : curcumin = 50:1

- Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254 Sản phẩm được hòa tan trong dicloromethan để chấm sắc ký Pha động để chạy sắc ký là hệ dung môi dicloromethan :

methanol = 20: 1 và hệ ethylacetat : n-hexan = 7: 3 Sau khi chạy sắc ký, soi

bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm cho một vết gọn, rõ, không

có vết phụ Kết quả: Rf = 0,67 (CH2Cl2 : MeOH = 20:1), Rf = 0,79 (EtOAc :

n-hexan = 7:3)

- Đồng thời, tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp được Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm có điểm chảy rõ ràng trong khoảng 133,8 – 135,3°C