Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất lai hóa của benzimidazol và oxadiazol

MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2 1.1 Khái quát chung về 1Hbenzodimidazol và oxadiazol ................................... 2 1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học các dẫn chất lai hóa của 1Hbenzodimidazol và oxadiazol ............................................................................................................. 4 1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ............................................................. 4 1.2.2 Tác dụng chống viêm .................................................................................. 7 1.2.3 Tác dụng chống ung thư .............................................................................. 9 1.2.4 Tác dụng chống oxy hóa ........................................................................... 10 1.3 Các phản ứng tổng hợp nhân 1Hbenzodimidazol và 1,3,4oxadiazol ......... 12 1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1Hbenzodimidazol và các dẫn chất ..................... 12 1.3.2 Đóng vòng tạo dẫn chất 1,3,4oxadiazol ................................................... 13 1.3.3 Phản ứng alkyl hóa .................................................................................... 14 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 16 2.1 Nguyên liệu và thiết bị ..................................................................................... 16 2.2 Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19 2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết .............................................. 19 2.3.2 Xác định cấu trúc ....................................................................................... 20 2.3.3 Thử tác dụng sinh học ............................................................................... 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................... 23 3.1 Tổng hợp hóa học ............................................................................................ 23 3.1.1 Tổng hợp 2methyl1Hbenzodimidazol (1) .......................................... 24

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ

THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT LAI HÓA CỦA BENZIMIDAZOL VÀ

OXADIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ

THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT LAI HÓA CỦA BENZIMIDAZOL VÀ

OXADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Không có thành công nào mà không có sự nỗ lực của những người đầy tâm huyết Vì vậy, tôi cần phải cảm ơn rất nhiều người tuyệt vời vì sự cống hiến quý báu của họ trong việc hoàn thành đề tài khóa luận này

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS

Nguyễn Đình Luyện, Ths Phạm Thị Hiền những người thầy đã nhiệt tình hướng

dẫn, cho tôi những lời khuyên quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc

biệt là Ths Nguyễn Văn Giang, TS Nguyễn Văn Hải và CN Phan Tiến Thành

của phòng thực tập Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ Phòng Phân tích phổ, Phòng Hóa sinh Ứng dụng - Viện Hóa học của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học - Trường Đại học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô trong trường, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xin chân thành cảm ơn!

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến bố mẹ và bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Trần Ngọc Mai

MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát chung về 1H-benzo[d]imidazol và oxadiazol 2

1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học các dẫn chất lai hóa của 1H-benzo[d]imidazol và oxadiazol 4

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 4

1.2.2 Tác dụng chống viêm 7

1.2.3 Tác dụng chống ung thư 9

1.2.4 Tác dụng chống oxy hóa 10

1.3 Các phản ứng tổng hợp nhân 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol 12

1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1H-benzo[d]imidazol và các dẫn chất 12

1.3.2 Đóng vòng tạo dẫn chất 1,3,4-oxadiazol 13

1.3.3 Phản ứng alkyl hóa 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 19

2.3.2 Xác định cấu trúc 20

2.3.3 Thử tác dụng sinh học 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Tổng hợp hóa học 23

3.1.1 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (1) 24

3.1.2 Tổng hợp ethyl 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (2) 24

3.1.3 Tổng hợp 2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3) 25

3.1.4 Tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (4) 26

3.1.5 Tổng hợp 2-([5-{(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetonitril (4a) 27

3.1.6 Tổng hợp 5-{(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-N-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-amin (4b) 28

3.1.7 Tổng hợp N-(3,4-diclorophenyl)-5-{(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-2-amin (4c) 29

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 31

3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 32

3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 32

3.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 32

3.3.3 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 33

3.4 Thử tác dụng sinh học 34

3.5 Bàn luận 35

3.5.1 Về tổng hợp hóa học và xác định cấu trúc các hợp chất 35

3.5.2 Về tác dụng sinh học: Tác dụng gây độc tế bào 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu, viết tắt Chú thích

resonance)

concentration)

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 4a, 4b, 4c 32

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của 4a, 4b, 4c 33

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1

H-NMR của 4a, 4b, 4c

33

Bảng 3.6 Kết quả thử tác dụng gây độc tế bào 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc vòng 1H-benzo[d]imidazol 2

Hình 1.2 Các thuốc mang khung 1H-benzo[d]imidazol 2

Hình 1.3 Cấu trúc vòng oxadiazol 3

Hình 1.4 Các thuốc là dẫn chất của dẫn chất oxadiazol 3

Hình 1.5 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari 4

Hình 1.6 Các dẫn chất trong nghiên cứu của R V Patel 5

Hình 1.7 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của

Hình 1.8 Công thức cấu tạo các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

Hình 1.9 Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol trong nghiên cứu

Hình 1.10 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Asif Husain 9

Hình 1.11 Dẫn chất 10e trong nghiên cứu của S Rajasekaran 10

Hình 1.12 Các hợp chất được I Kerimov tổng hợp 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội phát triển, con người ngày càng quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe thì vai trò của ngành y dược ngày càng trở nên quan trọng trong đời sống, nhu cầu sử dụng thuốc trong phòng ngừa và chữa trị ngày càng lớn Là một nước đang phát triển, Việt Nam tuy đã đạt được nhiều thành tựu tích cực trong cải thiện việc khám chữa bệnh cho người dân, nhưng vẫn còn gặp phải nhiều khó khăn, mức sống bình quân thấp, khả năng chi trả cho y tế còn hạn chế, trong khi giá thuốc nhập khẩu lại cao gấp hàng chục lần so với mặt bằng chung ở trong nước Tất cả những điều này đòi hỏi ngành Dược trong nước phải tự mình sản xuất và cung ứng các loại thuốc mới để hạ giá thành sản phẩm, nâng cao chất lượng chữa bệnh cho người dân

Vì vậy, việc tìm kiếm thuốc mới là rất cần thiết Hướng nghiên cứu và phát triển thuốc mới dựa vào thuốc sẵn có hoặc các chất có tác dụng sinh học đang chiếm một

tỉ lệ chủ yếu trong ngành tổng hợp hóa dược

Benzimidazol và oxadiazol là hai dị vòng đã và đang thu hút nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới tiến hành nghiên cứu Từ hai dị vòng này, rất nhiều các dẫn chất đã được tổng hợp và cho thấy các tác dụng sinh học đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, diệt virus, chống ung thư, chống lao, chống co giật… [17, 22, 26, 29]

Với những triển vọng khả quan đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất lai hóa của benzimidazol và oxadiazol” với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp một số dẫn chất lai hóa của 1H-benzo[d]imidazol và

1,3,4-oxadiazol

2 Thử tác dụng gây độc tế bào các dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát chung về 1H-benzo[d]imidazol và oxadiazol

1H-benzo[d]imidazol có cấu trúc là một hệ vòng bicyclo, bao gồm vòng benzen

6 cạnh kết hợp với dị vòng 5 cạnh imidazol (Xem hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc vòng 1H-benzo[d]imidazol

Các benzimidazol bắt đầu được chú ý tới nhiều vào những năm 1950 sau phát hiện 5,6-dimethyl-l-(AD-ribofuranosyl)benzimidazol là một phần trong cấu trúc của vitamin B12 Dẫn xuất benzimidazol đầu tiên được phát triển và cấp phép sử dụng cho con người là thiabendazol vào năm 1962 Một số dẫn xuất khác của benzimidazol đã được sử dụng trên lâm sàng như: albendazol, mebendazol (thuốc trừ giun); omeprazol, lansoprazol (thuốc ức chế bơm proton); astemizol (kháng

histamin); enviradin (kháng virus); telmisartan (thuốc hạ huyết áp) … [13, 31] (Xem hình 1.2)

Hình 1.2 Các thuốc mang khung 1H-benzo[d]imidazol

Nhiều nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các tác dụng kháng khuẩn,

kháng nấm, diệt kí sinh trùng, chống ung thư, chống viêm, kháng lao của benzo[d]imidazol và các dẫn chất của nó [11, 18, 19, 28]

1H-Oxadiazol là một dị vòng thu hút được sự chú ý rộng rãi của các nhà hóa dược để phát triển các loại thuốc mới Oxadiazol có nguồn gốc từ furan bằng sự

thay thế của hai nhóm =CH- bằng hai nguyên tử N (Xem hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc vòng oxadiazol

Có bốn đồng phân của oxadiazol: 1,2,4-oxadiazol, 1,3,4-oxadiazol, oxadiazol, 1,2,3-oxadiazol được biết đến Trong số chúng, các dẫn chất của 1,3,4-oxadiazol đã thể hiện một loạt các đặc tính sinh học bao gồm chống vi khuẩn, chống virus, chống nấm, chống ung thư, kháng viêm, chống co giật và tác dụng đường huyết Những tiềm năng sinh học rất lớn của dị vòng 1,3,4-oxadiazol là do khả năng phản ứng đa dạng và cấu trúc đặc biệt của nó đem lại [14, 10, 17]

1,2,5-Các dẫn xuất của oxadiazol được sử dụng trong các thị trường như

Raltegravir, Nosapidil, Furamizol,… (Xem hình 1.4)

Hình 1.4 Các thuốc là dẫn chất của dẫn chất oxadiazol

Nhìn vào tầm quan trọng của 2 cấu trúc benzimidazol và oxadiazol, người ta nghĩ rằng sẽ có giá trị để thiết kế và tổng hợp một số dẫn xuất benzimidazol mới mang oxadiazol và tìm ra những tác dụng sinh học tiềm năng của chúng

1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học các dẫn chất lai hóa của benzo[d]imidazol và oxadiazol

1H-1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Năm 2009, K.F Ansari cùng cộng sự đã tổng hợp được một số dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol mang khung oxadiazol (1a÷1l) (xem hình 1.5), sau đó thử tác

dụng ức chế in vitro vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tiếp Tác dụng kháng khuẩn được thử với 3 dòng Gram(+): Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus subtilis MTCC 121, Streptococcus mutans MTCC 890 và 3 dòng vi khuẩn Gram(-) là: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa MTCC 741, Salmonella typhi MTCC733 Ciprofloxacin và ampicillin được sử dụng làm thuốc đối chiếu Trong khi đó tác dụng chống nấm được thử với nấm: Candida albicans MTCC 1637, Aspergillus niger, Aspergillus flavus với thuốc đối chiếu là

amphotericin B [7]

Hình 1.5 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari

Kết quả cho thấy các chất tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn tốt

{[5-(4-clorophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-2-methyl}-1H-benzo[d]midazol (1g) và chất {[5-(4-methoxyphenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-2-methyl}-1H-benzo[d]imidazol (1k)

1-có nồng độ ức chế tối thiểu đối với S aureus rất thấp (MIC=2 𝜇g/ml) Hầu hết các

chất đều cho tác dụng tốt với vi khuẩn Gram(+), tuy nhiên không có chất nào có tác

dụng với E coli cũng như P aeruginosa và S typhii Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dẫn chất có chứa nhóm thế ở vị trí para trên vòng benzen có tác dụng tốt hơn so

với các chất còn lại

Đối với tác dụng kháng nấm, các chất 1a, 1g, 1l, 1k cho tác dụng tốt hơn với

nấm C albicans Bên cạnh đó, các chất còn lại ít có tác dụng đối với A niger và A

flavus

Năm 2012, Rahul V Patel và cộng sự tiến hành tổng hợp và thử tác dụng

sinh học một số dẫn chất (benzimidazolyl-1,3,4-oxadiazol-2yl)thio-N-phenyl (benzothiazolyl)acetamid (xem hình 1.6) Sử dụng phương pháp khuếch tán trên

thạch với 8 chủng vi khuẩn và 4 chủng nấm với các thuốc đối chiếu là ciprofloxacin với các chủng vi khuẩn và ketoconazol với các chủng nấm, kết quả cho thấy nhiều hợp chất có khả năng kháng khuẩn và chống nấm tốt Kết quả cho thấy các dẫn chất

N-benzothiazolylacetamid có tác dụng tốt hơn các dẫn chất N-phenylacetamid [20]

Hình 1.6 Các dẫn chất trong nghiên cứu của R V Patel

Hai hợp chất 2c (nhóm thế là –Cl), 2d (nhóm thế là –F) có tác dụng ức chế

tốt với S aureus (MIC=3,12 µg/ml), S typhi (MIC=25 µg/ml), B cereus ( 2c MIC=

25 µg/ml, 2d MIC=6,25 µg/ml) Các chất 2b, 2c, 2d với nhóm thế halogen cũng có

tác dụng mạnh với vi khuẩn P aeruginosa với giá trị MIC=12,5 µg/ml Với tác

dụng kháng nấm 3f, 3k cho thấy tác dụng tốt chống lại A niger (MIC=12,5 µg/ml),

3f cũng có hiệu quả chống lại A clavatus tiềm năng (MIC=25 µg/ml) Đối với C

albican, các hợp chất 3i, 3j và 2i với nhóm thế alkoxy thể hiện tác dụng mạnh nhất

khuếch tán trên thạch (ofloxacin và ketoconazol được dùng làm thuốc đối chiếu)

[24] (Xem hình 1.7)

Hình 1.7 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của Salahuddin

Kết quả thu được cho thấy hầu hết các hợp chất đều có tác dụng kháng

khuẩn, trong đó các chất 4d, 4f, 4h có tác dụng mạnh nhất chống lại vi khuẩn E coli ở nồng độ 100 μg/ml, các hợp chất 4d, 4f, 4l hoạt động tốt chống lại S aureus

cũng ở nồng độ này

Về khả năng chống nấm, các chất tổng hợp 4d, 4f, 4l có hoạt tính mạnh nhất

chống lại nấm A flavus và C albicans ở nồng độ 100 μg/ml

-Cl trên vòng oxadiazol đều không cho tác dụng với E coli và S aureus, ngược lại

dụng rất khả quan trên chủng nấm A flavus và C albicans

Gần đây nhất, năm 2014, N C Desai cùng G M Kotadiya đã tổng hợp được

một số dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol, đồng thời thử tác dụng ức chế sinh vật in vitro theo phương pháp pha loãng (xem hình 1.8) Tác dụng kháng khuẩn được thử với 2 dòng vi khuẩn Gram(+): Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, 3 dòng vi khuẩn Gram(-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Tác dụng kháng nấm được thử với 3 dòng: Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus Chất đối chiếu được dùng là

cloramphenicol và griseofulvin [8]

Đánh giá các dẫn chất tổng hợp cho kết quả khả quan Đặc biệt với vi khuẩn

E coli và nấm A clavatus, dẫn chất 5h cho MIC rất thấp, lần lượt là 6,25 μg/ml và

12,5 μg/ml, thấp hơn chất đối chiếu rất nhiều lần (với cloramphenicol có MIC=50

μg/ml, griseofulvin có MIC=100 μg/ml) Các hợp chất 5b, 5c, 5d, 5g, 5h với nhóm

thế hút điện tử (nitro, fluoro) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh,

trong đó tác dụng sinh học mạnh nhất khi các nhóm thế này ở vị trí para hoặc meta

5d, 5h

Hình 1.8 Công thức cấu tạo các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol trong nghiên cứu của N C Desai

1.2.2 Tác dụng chống viêm

Năm 2014, Ankita Rathore cùng đồng sự tiến hành thiết kế và tổng hợp các

dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol có tác dụng ức chế COX-2 chọn lọc (xem hình 1.9) Các hợp chất tổng hợp được được thử tác dụng in vitro để xác định khả

năng ức chế COX-1 và COX-2 Những dẫn chất có tác dụng tốt nhất lại tiếp tục được thử tác dụng chống viêm bằng phương pháp sử dụng mô hình giảm phù chân chuột [23]

Hình 1.9 Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol trong nghiên cứu của

Ankita Rathore

Hầu hết các chất có khả năng ức chế COX, và ức chế COX-2 chọn lọc hơn

COX-1 Trong các hợp chất tổng hợp được, 6l là chất có tác dụng ức chế COX-2

vào tính chất điện tử của các nhóm thế Các nhóm hút điện tử làm tăng khả năng ức

chế và chọn lọc COX-2 Các hợp chất 6m-r có các nhóm thế đẩy điện tử nên có

Trong 18 hợp chất tổng hợp, 6 chất được đem thử hoạt tính chống viêm, kết quả có 3 hợp chất cho thấy có tác dụng chống viêm hứa hẹn so với thuốc đối chứng

indomethacin Chất 6l thể hiện tác dụng chống viêm tốt nhất 68,4% Các chất 6b, 6j

cũng thể hiện khả năng chống viêm đáng chú ý (59,2% và 65,2%) so với indomethacin là 57,9% Từ kết quả thu được có thể kết luận rằng, các chất có khả

năng ức chế COX-2 tốt cũng cho hiệu quả chống viêm đầy hứa hẹn (Xem bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tỉ lệ ức chế viêm của các chất trong nghiên cứu của Ankita Rathore Hợp chất % Ức chế

1.2.3 Tác dụng chống ung thư

Năm 2012, Asif Husain cùng cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất

benzimidazol lai hóa oxadiazol và triazol-thiadiazol (xem hình 1.10) Các hợp chất

tổng hợp được đem thử hoạt tính chống ung thư tại Viện ung thư quốc gia, Mỹ với nồng độ thử duy nhất là 10 µM trên 60 dòng tế bào ung thư: bệnh bạch cầu, ung thư phổi, đại tràng, vú, buồng trứng, thận, tuyến tiền liệt [12]

Hình 1.10 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Asif Husain

Kết quả của nghiên cứu cho thấy các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol cho tác dụng chống ung thư tốt hơn dẫn chất lai hóa triazol-thiadiazol Tác dụng chống ung thư được tăng lên bởi sự có mặt của các nhóm hút điện tử như

–Br ở các vị trí trên vòng thơm Hợp chất 7j

3(5(4amino2,6dibromophenyl)1,3,4oxadiazol2yl)1(1Hbenzo[d]imidazol2yl)propan1on có hai nhóm thế

-Br ở vị trí ortho làm tăng tính nhạy cảm trên tế bào (70,63%) Trong khi đó các

nhóm đẩy điện tử như –OH gắn vào vòng thơm lại làm giảm tác dụng Trong 14

hợp chất được đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro, tất cả các hợp chất đều cho

thấy hiệu quả chống ung thư tốt và phổ tác dụng rộng 7j có tác dụng ức chế tế bào

trên dòng tế bào NSLC HOP-92 (Non small lung cancer HOP-92)

Cùng trong năm đó, tại học viện Hamdard, R Mohd cùng cộng sự đã tổng

hợp thành công và thử tác dụng chống ung thư của 25 dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol Tất cả các dẫn chất đã được nghiên

cứu tác dụng chống ung thư với 60 dòng tế bào Trong đó dẫn chất 9a cho hoạt

động chống ung thư là tốt nhất Liên quan định lượng giữa cấu trúc đến tác dụng,

-2,4-diCl) trên vòng phenyl ở vị trí số 5-oxadiazol trong tác dụng chống ung thư Còn

thiện hoạt tính chống ung thư Các nhóm thế hút điện tử như -COOH, -C=O không cho thấy vai trò rõ ràng của mình [16]

1.2.4 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2012, S Rajasekaran cùng đồng sự nghiên cứu tổng hợp và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số dẫn xuất của benzimidazol dựa vào khả năng loại bỏ gốc tự do bằng phương pháp khử DPPH, thuốc đối chứng là acid ascorbic

(xem hình 1.11) Kết quả các hợp chất đều có khả năng chống oxy hóa, không phụ

thuộc vào loại nhóm thế Tuy nhiên chất 10e với nhóm thế vào vòng oxadiazol là

pyridin cho thấy tác dụng tốt nhất với phần trăm ức chế ở các nồng độ 10 µg/ml và

40 µg/ml lần lượt là 34,77% và 52,16% (acid ascorbic đạt 65,03% và 68,55%) [21]

Hình 1.11 Dẫn chất 10e trong nghiên cứu của S Rajasekaran

Cũng trong năm 2012, I Kerimov và cộng sự đã thiết kế, tổng hợp các dẫn

chất 2-amino/5-aryl-1,3,4-oxadiazol lai hóa benzimidazol (xem hình 1.12) Đặc tính chống oxy hóa của các hợp chất này được nghiên cứu in vitro bằng 3 phương pháp:

xác định microsom NADPH-phụ thuộc sự ức chế mức độ peroxid hóa lipid (LP), các hoạt động của microsom ethoxyresorufin O-deethylase (EROD), và hiệu quả loại trừ gốc tự do DPPH Trong số các hợp chất được thử nghiệm, 2-[(2-(4-

clorophenyl)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl]-5-(4-florophenyl)-1,3,4-oxadiazol

(12e) được nhận thấy là chất hoạt động nhất trong cả 3 hệ thống in vitro [15]

Hình 1.12 Các hợp chất được I Kerimov tổng hợp

Các hợp chất 11a, 12b, 12e và 12k cho thấy hoạt động loại bỏ gốc tự do

DPPH khá tốt (tương ứng là 32, 47, 40, và 40%) khi so sánh với BHT (88%) Khả

năng dọn dẹp gốc tự do DPPH ở các hợp chất 11b (19%), 11d (26%), 12g (10%),

12h (15%), 12l (10%) và 12o (17%) hạn chế hơn

Hoạt động của microsom ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) mạnh mẽ đã

được thấy ở hợp chất 12e (70%), 12f (68%), 12g (71%), và 12l (71%) gần với chất

quan sát thấy ở các hợp chất khác trong phạm vi 47-66% Các hợp chất có chứa flo, brom, hoặc methoxy nhóm thế ở vị trí thứ 4 của vòng phenyl có hoạt tính tốt hơn so

với các hợp chất khác trừ chất 12l

Các NADPH phụ thuộc sự ức chế quá trình peroxid hóa lipid (LP) được sản xuất bởi các hợp chất mới trong microsom gan chuột được kiểm tra bằng cách đo sự

hình thành của chất phản ứng acid 2-thiobarbituric (TBARS) cho khả năng chống

oxy hóa của chúng Hợp chất 12e được nhận thấy là một chất ức chế tốt (54%) mức

cũng làm giảm mức độ LP tương ứng 31% và 26%

1.3 Các phản ứng tổng hợp nhân 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol

1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1H-benzo[d]imidazol và các dẫn chất

Nghiên cứu cho thấy hầu hết các phương pháp tổng hợp benzo[d]imidazol và dẫn chất đều đi từ các hợp chất có vòng benzen với 2 nhóm thế mang N ở vị trí ortho với nhau

1.3.1.2 Đi từ o-aminoazo

Hợp chất o-aminoazo được ngưng tụ với aldehyd để tạo các base nitơ, sau đó

các base nitơ này được chuyển dạng đồng phân (bằng cách đun sôi với acid acetic)

để tạo thành N-arylamino-1H-benzo[d]imidazol [12]

1.3.1.3 Các tác nhân khác

Các tác nhân khác như: monoacyl- và diacyl-o-phenylendiamin, phenylenurethan… cũng có thể sử dụng để tổng hợp các dẫn chất của 1H- benzo[d]imidazol

1.3.2 Đóng vòng tạo dẫn chất 1,3,4-oxadiazol

1.3.2.1 Phản ứng tạo dẫn chất 5-R-2-amino-1,3,4-oxadiazol

1.3.2.2 Phản ứng tạo dẫn chất 5-R-1,3,4-oxadiazol-2-thiol

Phương pháp thường dùng để tổng hợp dẫn chất 5-R-1,3,4-oxadiazol-2-thiol

là cho các acylhydrazid phản ứng với carbon disulfid trong môi trường kiềm, với dung môi là EtOH Sản phẩm tồn tại ở hai dạng đồng phân thiol-thion [17]

1.3.2.3 Phản ứng tạo dẫn chất 2,5-diaryl(alkyl)-1,3,4-oxadiazol

Nguyên liệu được dùng để tổng hợp các dẫn chất oxadiazol là các diacylhydrazin hoặc acylhydrazid Tác nhân thường dùng là phosphoryl clorid (tuy nhiên đã dần được thay thế do là chất rất độc), ngoài ra các tác nhân khác cũng hay được sử dụng đó là: acid sulfuric, acid phosphoric, acid trifloroacetic, phosphoryl pentaclorid, thionyl clorid, phosphoryl pentoxid… [17]

sulfonic, muối amoni bậc 4 [4]

1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho đề tài

Như vậy, thông qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi nhận thấy rằng

các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol có nhiều tác dụng

sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống ung thư, chống oxi hóa…Tiếp nối các nghiên cứu đó, chúng tôi dự kiến tổng hợp một số dẫn chất lai

hóa của 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol, và thử tác dụng gây độc tế bào

của chúng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Khóa luận đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược – Bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược

Hà Nội

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị, dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị Xuất xứ

2.2 Nội dung nghiên cứu

Tổng hợp các chất theo sơ đồ như sau :

Bảng 2.3 Công thức các chất dự kiến tổng hợp được

Chất Công thức Tên khoa học

1

benzo[d]imidazol

(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat

3

benzo[d]imidazol-1-

2-(2-methyl-1H-yl)acetohydrazid

4

oxadiazol-5-yl)methyl]-2-

1-[(2-mercapto-1,3,4-methyl-1H-benzo[d]imidazol

4a

benzo[d]imidazol-1-

2-([5-{(2-methyl-1H-2-yl]thio)acetonitril

yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-4b

benzo[d]imidazol-1- yl)methyl}-N-phenyl-1,3,4-

5-{(2-methyl-1H-oxadiazol-2-amin

4c

methyl-1H-

N-(3,4-diclorophenyl)-5-{(2-

benzo[d]imidazol-1-2-amin

yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-Kiểm tra độ tinh khiết của 7 chất 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc các chất 4a, 4b, 4c tổng hợp được bằng phổ

Thử tác dụng chống ung thư với chất 4a, 4b, 4c

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng các phản ứng hóa học hữu cơ cơ bản để tổng hợp các chất trung gian và sản phẩm: phản ứng ngưng tụ đóng vòng, phản ứng alkyl hóa, phản ứng hydrazid hóa, phản ứng halogen hóa, phản ứng acyl hóa

Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi tiến triển của phản ứng, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

2.3.2 Xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ

H-NMR)

 Phổ hồng ngoại (IR):

Tại phòng phân tích cấu trúc phân tử Khoa Hóa Vô Cơ - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, các chất tổng hợp được đã được ghi phổ hồng ngoại (IR) trên máy IRAffinity-1S với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong

 Phổ khối lượng (MS)

Được ghi phổ khối lượng trên máy LC/MS-Xevo TQ tại phòng phân tích khối phổ của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap X tại phòng phân tích khối phổ phân giải cao, Khoa Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với chế độ đo ESI [3, 6]

Được ghi trên máy Bruker AV-500MHz, tại Viện Hóa Học-Viện Hàn lâm

học-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng dung môi là DMSO [2]

2.3.3 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng gây độc tế bào tại Phòng Hóa sinh Ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp MTT

2.3.3.1 Thiết bị nghiên cứu

đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo

quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.3.3.2 Các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi Ngân hàng Tế bào Hoa

Kỳ (American Type Culture Collection): Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi

tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 2 µg/ml; 0,5 µg/ml Bổ sung 200 µl dung dịch tế bào ở pha log

1640 cho các dòng tế bào Hep-G2; môi trường DMEM cho dòng tế bào LU Giếng

ngày thêm 50 µl MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở

sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào µg/ml được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD (Optical Density) trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

OD điều khiển – OD mẫu

GI =

OD điều khiển

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát

g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN

LUẬN

3.1 Tổng hợp hóa học

Thông qua các tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã

tiến hành tổng hợp một số dẫn chất lai hóa của 1H-benzo[d]imidazol và

1,3,4-oxadiazol theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1 Các giai đoạn tổng hợp một số dẫn chất

lai hóa 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol

Điều kiện phản ứng: a) acid acetic, HCl đặc, 45’; b) Ethyl cloroacetat, aceton

khan, K 2 CO 3 , 15h; c) hydrazin hydrat, EtOH, 90 0 C, 4h; d) CS 2 , EtOH, 90 0 C, 5h; e) cloroacetonitril, DMF, K 2 CO 3 , KI, 60 0 C, 6h; f) SOCl 2 , 4h ;g) anilin, acid acetic, 1h; h) 3,4-dicloroanilin, acid acetic, 1h; i) 2-cloro-N-phenylacetamid, aceton, K 2 CO 3 ,

KI, 50 0 C, 3h; j) 2-cloro-N-(3,4-diclorophenyl)acetamid , DMF, K 2 CO 3 , KI, 90 0 C, 24h

3.1.1 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (1)

Sơ đồ phản ứng:

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (1)

Tiến hành:

Thêm 5,4 g (0,05 mol) o-phenylendiamin, 8,5 ml dung dịch HCl đặc và 8,5

ml (0,09 mol) acid acetic băng vào bình cầu 100 ml Lắp sinh hàn và đun hồi lưu

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với pha động ethyl acetat :

n-hexan - 7:3, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254 nm

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được đổ từ từ vào cốc có mỏ có chứa 50

Lọc qua phễu Buchner thu được tinh thể hình kim, rửa tinh thể 3 lần với 10 ml nước, hút kiệt và sấy khô thu sản phẩm

Kết quả:

- Khối lượng: 5,02 g (Hiệu suất 76,1%)

- Cảm quan: tinh thể hình kim màu trắng