Nghiên cứu một số phản ứng trên nguyên tử nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào của sản phẩm tạo thành

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện DS. Đặng Vũ Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2015

ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA

NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH

TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA

NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH

TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Tùng những thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi, truyền đạt cho tôi những kiến

thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình làm khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn

Giang, ThS Đào Nguyệt Sương Huyền, ThS Phạm Thị Hiền cùng các thầy

giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập ở trường

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Đoàn Quốc Phương

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Cây Sen 2

1.1.1 Cây sen 2

1.1.2 Chiết xuất alkaloid trong lá sen 3

1.1.3 Phương pháp tách alkaloid dưới dạng tinh khiết 4

1.2 Hợp chất nuciferin 4

1.2.1 Công thức, tính chất 4

1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu 5

1.2.3 Tác dụng dược lý 5

1.3 Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid 7

1.3.1 Sử dụng tác nhân oxy hóa 7

1.3.2 Sử dụng tác nhân alkyl halogenid tác dụng với hydroxylamine 10

1.3.3 Sử dụng phản ứng loại Cope 10

1.3.4 Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin 10

1.4 Các phương pháp N-demethyl hóa 11

1.4.1 Khử hóa N-oxid 11

1.4.2 Sử dụng K3Fe(CN)6 12

1.4.3 Sử dụng gốc phthalimide-N-oxyl 12

1.4.4 Sử dụng este cloroformat 13

1.5 Lựa chọn hướng nghiên cứu 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu 14

2.2 Thiết bị và dụng cụ 15

2.3.3 Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl 16

2.3.4 Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO4.7H2O 16

2.3.5 Thử tác dụng sinh học 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 17

2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm 17

2.4.3 Thử tác dụng sinh học 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 20

3.1.1 Quy trình chiết nuciferin 20

3.1.2 Tinh chế nuciferin 20

3.2 Kết quả nghiên cứu các phản ứng trên nguyên tử N của nuciferin 21

3.2.1 Phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid 21

3.2.2 Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl 24

3.2.3 Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO4.7H2O 25

3.3 Kết quả xác định cấu trúc 26

3.3.1 Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng oxy hóa (nuciferin N-oxid) 26

3.3.2 Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng khử hóa (nuciferin) 28

3.3.3 Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng demethyl hóa (nornuciferin) 29

3.4 Thử tác dụng sinh học 31

3.5 BÀN LUẬN 32

3.5.1 Về quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin 32

3.5.2 Về các phản ứng bán tổng hợp 33

3.6.3 Về phần xác định cấu trúc 35

3.6.4 Về phần thử hoạt tính sinh học 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

1H-NMR

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) AcOEt Ethyl acetat

AcOH Acid acetic

ATCC American Type Culture Collection

CTCT Công thức cấu tạo

ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử

(Electrospray Ionization Mass Spectrometry)

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

(Human immunodeficiency virus)

IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

(Inhibition concentration at 50%)

i-PrOH Isopropanol

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

IUPAC Hiệp hội Hóa học Quốc tế thuần túy và ứng dụng

(International Union of Pure and Applied Chemistry)

m-CPBA acid m-cloroperbenzoic (m-chloroperbenzoic acid)

MeCN Acetonitril

MTO Methyltrioxorheni

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid

RANKL Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand

Rf Hệ số lưu giữ (retension factor)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen……… 3 Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 14 Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm………… 15 Bảng 3.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến thời gian phản ứng phản ứng bán

tổng hợp nuciferin N-oxid ……… 21 Bảng 3.2 Khảo sát dung môi ảnh hưởng đến thời gian phản ứng phản ứng bán

tổng hợp nuciferin N-oxid……… 22 Bảng 3.3 Khảo sát tỉ lệ mol H2O2:nuciferin ảnh hưởng đến thời gian phản ứng

(1H-NMR, 500MHz CDCl3)………… ……… 28 Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 của

nuciferin (13C-NMR, 125MHz, CDCl3)……… 29 Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR, KBr) của nornuciferin……… 30 Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin… 30 Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của

nornuciferin (1H-NMR, 500MHz, CDCl3)……… 31 Bảng 3.13 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF7 và

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)……… 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của nuciferin ……… ……… 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo nhân aporphin ……… 6

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H2O2 30% 8

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA……… 8

Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB……… 8

Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng UHP……… 9

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPC……… 9

Hình 1.9 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng ozon……… 9

Hình 1.10 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid……… 10

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope……… 10

Hình 1.12 Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid bằng H2O2……… 11

Hình 1.13 Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO4.7H2O 11

Hình 1.14 Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng Fe(II)TPPS)……… 12

Hình 1.15 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng CuCl… ……… 12

Hình 1.16 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng K3Fe(CN)6……… 12

Hình 1.17 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng gốc phthalimide-N-oxyl…… 13

Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng ester cloroformat………… 13

Hình 1.19 Sơ đồ định hướng tổng hợp dẫn chất N-demethyl hóa của nuciferin hướng chống ung thư……… 13

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid sử dụng H2O2 30% 21 Hình 3.2 Sơ đồ đề xuất phản ứng oxy hóa nuciferin bằng H2O2 30% 23

Hình 3.3 Sơ đồ khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl.

Hình 3.4 Sơ đồ khử nuciferin N-oxid bằng FeSO4.7H2O

24

25

Hình 3.6 Cơ chế phản ứng khử N-oxid bằng FeSO4.7H2O 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam có một hệ sinh thái đa dạng và phong phú một tiềm năng lớn về tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung và tài nguyên cây dược liệu nói riêng Nước ta đã biết có 12000 loài thực vật có mạch Trong đó có trên 4000 loài cây thuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước [7]

Trong rất nhiều loại dược liệu được sử dụng để chữa bệnh, Sen là một loài rất

phổ biến ở Việt Nam Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae Ngó sen có tác dụng cầm máu, hạt sen là thuốc bổ, chữa di tinh, mất

ngủ, suy nhược thần kinh Gương sen, lá sen có tác dụng chữa huyết ứ, băng huyết, tiểu tiện ra máu [4]

Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra được rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các

bộ phận cây sen cũng như của nuciferin, đó là tác dụng chống ung thư [19,22], chống HIV [38] hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [22] Mặt khác, gần đây người ta đã chiết tách ra được nuciferin tinh khiết để bào chế thực phẩm chức năng, mở ra tiềm năng về nguyên liệu tổng hợp thuốc mới

Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin có triển vọng trong ngành tổng hợp thuốc mới Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các dẫn chất của nuciferin có tác dụng đa dạng và phong phú như: tác dụng chống ung thư[15],ức chế acetylcholinesterase [16,37] Nhờ có ưu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng như là tiềm năng của nó trong

y dược học, cây sen trong những năm gần đây được đưa vào nghiên cứu rất nhiều ở Việt nam Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách chiết với hiệu suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là một hướng phát triển để tìm ra

các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là bệnh ung thư Đề tài “Nghiên cứu một số phản ứng trên nguyên tử nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào của sản phẩm tạo thành” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Tạo dẫn chất N-oxid, khử hóa N-oxid tạo N-demethyl nuciferin (nornuciferin)

2 Thử tác dụng chống ung thư của các dẫn chất bán tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Cây Sen

1.1.1 Cây sen

Tên khoa học: Nelumbo

nucifera Gaertn., họ Sen –

Nelumbonaceae

Phân bố: Vùng nhiệt đới châu

Á, Châu Mĩ và ở Việt Nam

Đặc điểm thực vật: Sen là một

loài cây ở dưới nước, thân rễ hình

trụ mọc ở trong bùn thường gọi là

ngó sen hay ngẫu tiết, ăn được Lá

(liên diệp) mọc lên khỏi mặt nước, có cuống lá dài, có gai nhỏ, phiến lá hình khiên,

to, đường kính 60-70 cm có gân tỏa tròn Hoa to màu trắng hay đỏ hồng, đều lưỡng tính Quả (thường gọi là hạt sen) chứa một hạt (liên nhục) không có nội nhũ Hai lá mầm dày Chồi mầm (liên tâm) gồm 4 lá non gập vào phía trong Sen được trông nhiều ở nhiều nơi nước ta để ăn và làm thuốc Mùa thu hái vào các tháng 7-9 [4]

Thành phần hóa học: Lá sen có chứa alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O-norciferin,

armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin, dehydroemerin,

dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin Trong đó nuciferin là

alcaloid chính Ngoài ra trong lá sen còn có flavonoid, tanin, acid hữu cơ Trong tâm sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin,

lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin (xem Bảng 1.1)

[3,9]

Công dụng: Alcaloid toàn phần trong lá sen có tác dụng an thần, hạ huyết áp nhẹ Lá sen được dùng để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20 g/ngày Lá sen kết hợp với một số dược liệu khác làm thuốc an thần Tâm sen chữa mất ngủ, an thần, di mộng tinh Ngày dùng 4 – 10 g dưới dạng thuốc hãm hay sắc uống [3,9]

Hình 1.1 Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)

1.1.2 Chiết xuất alkaloid trong lá sen

1.1.2.1 Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (EtOH, MeOH)

 Tiến hành

Bột dược liệu được làm ẩm bằng NH4OH 10% sau đó chiết bằng cồn 70o Dịch chiết cồn được cất dưới áp suất giảm để thu hồi cồn Hòa tan cắn vào nước, acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 2 Lọc loại bỏ cặn Dịch lọc acid được chiết bằng ether dầu hỏa để loại tạp Dich chiết acid được thêm NH4OH 10% đến pH = 10 – 11 rồi chiết bằng CHCl3 Dịch chiết CHCl3 được cất thu hồi dung môi, còn lại cắn alcaloid toàn phần [5]

1.1.2.2 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực:

 Tiến hành:

Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong trong 24h Cho bột dược liệu đã kiềm hóa vào bình chiết, chiết bằng dung môi dầu hỏa bằng phương pháp chiết nóng Thời gian chiết 4h, chiết 3 lần cho dung môi ngập dược liệu Thu dịch chiết đem lắc với

H2SO4 0,5% đến pH=2 Lấy lớp acid thêm Na2CO3 bão hòa đến pH=10-11, để yên cho tủa Lọc tủa, rửa tủa bằng nước cất đến pH=7 Thu lấy tủa đem sấy được alkaloid toàn phần [1]

Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen

1.1.3 Phương pháp tách alkaloid dưới dạng tinh khiết

1.1.3.1 Giải phóng phân đoạn

Một số nhóm các hợp chất tự nhiên có thể giải phóng phân đoạn từ một hỗn hợp Có thể lấy ví dụ một hỗn hợp alkaloid trong dung dịch nước nếu thêm từ từ vừa

đủ từng phần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng tự do Tăng dần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần, Mối lần thêm kiềm ta lắc hỗn hợp với dung môi hữu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân đoạn base [2]

1.1.3.2 Sắc kí hấp phụ

Trong các trường hợp khác nhau tách và phân lập các hợp chất từ thực vật, kỹ thuật sắc kí là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất Kỹ thuật này dựa trên sự hấp phụ khác nhau của các chất lên bề mặt chất rắn Các chất rắn này được nhồi qua một cột thích hợp, sau đó cho dung dịch cần tách qua Các chất này sẽ lần lượt hấp phụ lên cột tạo thành các dải hấp phụ Sau đó dùng dung môi khác để rửa giải chất đó ra khỏi cột (gọi là phản hấp phụ) Các chất sẽ lần lượt tách ra khỏi cột, nhờ đó mà ta tách riêng được từng chất [2]

5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-dibenzo[de,g]quinolin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-

hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165oC, phổ UV (đo trong MeOH) cho λmax tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [4,5]

- Phổ 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 7,48 (3H, s, N-CH3), 6,40 (3H, s, C1-OCH3), 6,16 (3H, s, C2-OCH3), 3,38 (1H, s, C3-H) 2,74 (3H, m, C8-H + C9-H + C10-H) 1,60 (1H, d, C11-H) [6]

1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu

- Chiết xuất: Sử dụng phương pháp chiết như phần 1.1.2 thu được alkaloid toàn phần

- Phân lập và tinh chế: Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong cồn nóng thu được tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt [1]

1.2.3 Tác dụng dược lý

Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin

Với y học cổ truyền, người ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong những bài thuốc khác nhau dùng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày nay khoa học

đã chứng minh được nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính) cũng như tìm ra nhiều tác dụng mới của sen

- Tác dụng chống ung thư:

 Nghiên cứu thấy rằng nuciferin ức chế sự hoạt hóa thụ thể của yếu tố nhân ligand kappa-B (RANKL) – yếu tố này hình thành tế bào hủy xương trong các tế bào đại thực bào tủy xương chuột Ngoài ra, nuciferin tăng sinh tế bào ức chế và apoptosis cảm ứng trong tế bào MDA-MB-231 ung thư vú ở người Hơn nữa, nuciferin có thể điều chỉnh phân phối chu kỳ tế bào và biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình apoptosis trong tế bào MDA-MB-231 và ức chế ung thư vú từ đó ức chế sự tiêu xương trong cơ thể Vì vậy, nuciferin có thể có tiềm năng để ngăn chặn ung thư vú [19]

 Nghiên cứu đã xem xét các hoạt động gia tăng của hợp chất cô lập, chất này

có tác dụng chống lại khối u ác tính của con người, tuyến tiền liệt và các tế bào ung

thư dạ dày Kết quả chỉ ra rằng 7- hydroxydehydronuciferine ức chế đáng kể sự phát triển của khối u ác tính, tuyến tiền liệt và các tế bào ung thư dạ dày [22].

- Tác dụng chống oxy hóa: 15 hợp chất được chiết xuất và tinh chế từ lá của Nelumbo nucifera Gaertn Các hoạt động chống oxy hóa của các hợp chất đã được xem xét

bằng cách dọn dẹp gốc tự do, phức kim loại và khử sắt III Các kết quả đã cho thấy

các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa Phát hiện này cho thấy rằng lá của Nelumbo nucifera Gaertn cv Rosa-Plena là một tiềm năng để đạt được các hoạt chất sinh học

có đặc tính chống oxy hóa [22]

- Tác dụng chống HIV: Người ta chứng minh tác dụng chống HIV của một số

alkaloid phân lập từ cây Nelumbo nucifera: coclaurin, norcoclaurin, nuciferin,

liensinin, negferin và isoliensinin… thông qua các đánh giá các giá trị EC50 và TI (chỉ

số điều trị) Nuciferin là alkaloid chính trong lá và phôi của Nelumbo nucifera, tác

dụng chống HIV ở EC50 là 0,8 µg/ml và TI là 36 [38]

- Tác dụng chống béo phì: người ta đã khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết của lá cây

Nelumbo nucifera về hoạt động của enzym tiêu hóa, chuyển hóa lipid và đánh giá khả

năng chống béo phì bằng cách cho chế độ ăn gây ra béo phì ở chuột và sử dụng dịch

chiết Nelumbo nucifera trong 5 tuần Dịch chiết Nelumbo nucifera gây ra sự ức chế

phụ thuộc nồng độ của các hoạt động của α-amylase và

lipase, làm tăng chuyển hóa lipid và biểu hiện của mRNA

UCP3 Dịch chiết ngăn chặn sự gia tăng trọng lượng cơ

thể, cân nặng và mô mỡ gan triacylglycerol ở chuột mắc

bệnh béo phì gây ra bởi một chế độ ăn giàu chất béo Vì

vậy làm giảm tiêu hóa, hấp thụ của chất béo và ức chế

carbohydrat, tăng tốc quá trình chuyển hóa lipid và điều

chỉnh tăng tiêu hao năng lượng Do đó, dịch chiết lá

Nelumbo nucifera có lợi về ngăn chặn bệnh béo phì [29]

- Tác dụng chống giun sán: người ta tách các alkaloid từ

lá sen trong đó liriodenin, lysicamin, anonain, asimilobin, caaverin,

N-methylasimilobin, nuciferin, nornuciferin, roemerin, 7-hydroxydehydronuciferin và

Hình 1.3 Công thức cấu tạo nhân aporphin

cepharadion B và thử tác dụng đối với Anisakis simplex và Hymenolepis nana Nghiên

cứu này cho thấy rằng các thành phần trên giết hoặc giảm sự chuyển động chủ động

của H nana [21]

- Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid được chiết được từ lá sen đã được thử nghiệm Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã được thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống nấm Tuy nuciferin không

có tác dụng này, nhưng người ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có

liên quan mật thiết với nhóm thế ở vị trí C1 và C2 trên vòng aporphin (xem Hình 1.3)

Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [11]

- Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích tiết insulin

in vitro tốt hơn Glyburid Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách đóng các kênh K+

- ATPase , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đường của Nelumbo nucifera [25, 26]

Có thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid với nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác dụng tốt với nhiều bệnh mà hiện con người vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và chưa tìm

ra phương pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid trong sen có một giá trị tiềm năng lớn về mặt khoa học trong tương lai

1.3 Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid

1.3.1 Sử dụng tác nhân oxy hóa

1.3.1.1 Sử dụng tác nhân H 2 O 2

Điều kiện phản ứng: codein được hòa tan trong MeOH, làm lạnh về 0oC thêm

H2O2 (dư 11 lần) Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 18h Hỗn hợp thêm MnO2 để loại H2O2 Xử lý hỗn hợp thu được codein N-oxid với hiệu suất 100%

(xem Hình 1.4) [23]

1.3.1.2 Sử dụng acid m-cloroperbenzoic (m-CPBA)

Điều kiện phản ứng: codein được hòa tan trong i-PrOH/CHCl3 (1:3) làm lạnh đưa về -5oC Thêm m-CPBA, khuấy trong 10 phút thu được codein N- oxid với hiệu

suất 100% (Xem Hình 1.5) [20]

1.3.1.3 Sử dụng natri perborate tetrahydrat (NPB)

Điều kiện phản ứng: isonicotinonitril được hòa tan trong AcOH băng thêm

NPB đưa nhiệt độ phản ứng lên 40oC Khuấy tiếp theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) đến khi phản ứng kết thúc Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được

isonicotinonitril N-oxid với hiệu suất 81% (Xem Hình 1.6) [24]

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H 2 O 2 30%

Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB

1.3.1.4 Sử dụng Urea−Hydrogen Peroxid

Điều kiện phản ứng: pyridin được thêm UHP, đưa nhiệt độ hỗn hợp phản ứng

lên 85oC trong 45 phút Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được pyridin N-oxid với hiệu

suất 85% (xem Hình 1.7) [36]

1.3.1.5 Sử dụng natri percarbonat

Điều kiện phản ứng: thêm N-ethyl-N-methylanilin thêm xúc tác MTO, NPB,

AcOH, MeCN, sục khí N2, đưa nhiệt độ phản ứng lên 50oC trong 1h Xử lý hỗn hợp

phản ứng thu được N-ethyl-N-methylanilin N-oxid với hiệu suất 94% (xem Hình

1.8) [18]

1.3.1.6 Sử dụng ozon

Điều kiện phản ứng: hòa tan quinuclidin trong Et2O, làm lạnh xuống -78oC

Sục khí ozon trong 3h Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được quinuclidin N-oxid với hiệu

suất 95% (xem Hình 1.9) [28]

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng UHP

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPC

Hình 1.9 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng ozon

1.3.2 Sử dụng tác nhân alkyl halogenid tác dụng với hydroxylamine

Điều kiện phản ứng: hòa tan 4- tert-butyl-1-hydroxypiperidin và methyl

iodid trong EtOH có chứa NaHCO3 Phản ứng được đưa lên nhiệt độ 50oC trong 5

ngày Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm N-oxid với hiệu suất 15% (xem

Hình 1.10) [33]

1.3.3 Sử dụng phản ứng loại Cope

Điều kiện phản ứng: Hòa tan 1,(2S)-oxiranyl-prop-2-en-(1R)-ol trong MeOH,

thêm N-benzylhydroxylamin.HCl và NaOMe Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được benzyl-(2S)methyl-(1S)-N-oxy-pyrrolidin-(3R),(4S)-diol với hiệu suất 72% (xem

1-Hình 1.11) [27]

1.3.4 Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin

Ở khóa luận này chúng tôi sử dụng tác nhân H2O2 để oxy hóa nuciferin tạo sản

phẩm nuciferin N-oxid bởi vì tác nhân H2O2 rẻ tiền và dễ kiếm, thường có hầu hết ở các phòng tổng hợp hóa dược

Hình 1.10 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope

Điều kiện phản ứng: nuciferin được hòa tan trong MeOH thêm H2O2 khuấy ở

nhiệt độ phòng, theo dõi bằng SKLM Xử lý hỗn hợp thu được nuciferin N-oxid với

hiệu suất 90% (xem Hình 1.12) [37]

1.4 Các phương pháp N-demethyl hóa

1.4.1 Khử hóa N-oxid

1.4.1.1 Sử dụng FeSO 4 7H 2 O

Điều kiện phản ứng:Hòa tan Codein N-oxid trong MeOH điều chỉnh pH đến

1 bởi HCl 6M, cất quay đến cắn được codein N-oxid.HCl Sau đó chất rắn được hòa

tan trong MeOH thêm FeSO4.7H2O ở 0oC Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1h Xử lý

hỗn hợp phản ứng thu được nor-cordein với hiệu suất 49% (xem Hình 1.13) [23]

1.4.1.2 Dùng tetranatri 5,10,15,20-Tetra(4-sulfophenyl)porphyrinatoiron(II)

(Fe(II)TPPS)

Điều kiện phản ứng: codein methyl ether N-oxide.HCl hòa tan trong MeOH

thêm Fe(II)TPPS Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 72h Xử lý hỗn hợp phản ứng thu

được norcodein methyl ether với hiệu suất 91% (xem Hình 1.14) [14]

Hình 1.12 Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid bằng H 2 O 2

Hình 1.13 Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO 4 7H 2 O

1.4.1.3 Sử dụng CuCl

Điều kiện phản ứng: N,N-dimethylanilin hòa tan trong t-BuOH Thêm vào hỗn

hợp phản ứng CuCl và TBHP Đưa hỗn hợp phản ứng lên 35oC trong 6h Xử lý hỗn

hợp phản ứng thu được N-methylanilin với hiệu suất 64% (xem Hình 1.15) [32]

1.4.2 Sử dụng K 3 Fe(CN) 6

Điều kiện phản ứng: 3-dimethylaminocyclohexanol thêm nước, thêm

K3Fe(CN)6 và KOH trong điều kiện nhiệt độ <5oC trong 45 phút Sau đó hỗn hợp được đưa đến nhiệt độ phòng và để qua đêm Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được 3-

monomethylaminocyclohexanol với hiệu suất 93% (xem Hình 1.16) [31]

1.4.3 Sử dụng gốc phthalimide-N-oxyl

Điều kiện phản ứng: N,N-dimethylanilin thêm CH3CN, thêm chì (IV) acetat (Pb(OAc)4) trong AcOH và MeCN, thêm N-hydroxylphtalimid trong MeCN, sục khí

Argon trong 20 phút Hỗn hợp được khuấy ở 25oC trong 10 phút Xử lý hỗn hợp sản

phẩm thu được N-methylanilin với hiệu suất từ 12-20% (xem Hình 1.17) [12]

Hình 1.16 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng K3Fe(CN)6

Hình 1.14 Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng Fe(II)TPPS)

Hình 1.15 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng CuCl

1.4.4 Sử dụng este cloroformat

Điều kiện phản ứng:Khuấy hỗn hợp gồm morphin, KHCO3 trong CHCl3 Thêm phenyl cloroformat, đun hồi lưu trong 60h Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được

N-Carbophenoxynormorphin với hiệu suất 91% N-Carbophenoxynormorphin được

hòa tan trong C2H5OH, KOH sục khí N2 đun hồi lưu trong 24h Xử lý hỗn hợp phản

ứng thu được normorphin với hiệu suất 43,5% (xem Hình 1.18) [10]

1.5 Lựa chọn hướng nghiên cứu

- Với một số hoạt tính đã được nghiên cứu của các amin N-oxid như tác dụng

chống ung thư[17], kháng khuẩn [34], ức chế cytochrome P450 [35].Vì vậy chúng tôi oxy hóa nuciferin tạo thành nuciferin N-oxid

- Tổng hợp các hợp chất tương tự tác nhân alkyl hóa như melphalan, clorambucil,

cyclophosphamid đã sử dụng làm thuốc ung thư Chúng tôi dự định chọn hướng

N-demethyl hóa nuciferin sau đó đưa nhóm alkyl vào nguyên tử N Đó là tiềm năng về tổng hợp thuốc mới có tác dụng chống ung thư

Hình 1.19 Sơ đồ định hướng tổng hợp dẫn chất N-demethyl hóa của nuciferin

hướng chống ung thư Hình 1.17 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng gốc phthalimide-N-oxyl

Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng este cloroformat

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

 Nguyên liệu: lá Sen mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội đã được phơi khô Qua quá trình chiết, phân lập và tinh chế tại phòng Tổng hợp Hóa dược Bộ môn Công nghiệp Dược- Trường Đại học Dược Hà Nội thu được nuciferin làm nguyên liệu cho các phản ứng bán tổng hợp

 Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã được thống kê

trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm

2.2 Thiết bị và dụng cụ

Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm được liệt kê trong

bảng 2.2

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm

14 Mao quản (chấm sắc ký, đo nhiệt độ nóng chảy) Việt Nam

15 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ

17 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

18 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

AV-500MHz

Mỹ

19 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ

20 Máy đo phổ khối lượng LC/MSD Trap - SL và

LC/MS/MS - Xevo TQ

Mỹ

22 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen

- Thực hiện chiết alkaloid toàn phần trong lá sen

- Phân lập và tinh chế alkaloid toàn phần thu được nuciferin

- Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin bằng phương pháp SKLM và đo to

nc

2.3.2 Thực hiện oxy hóa nuciferin tạo nuciferin N-oxid

- Thực hiện oxy hóa nuciferin bằng H2O2 30%

- Tách, tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm nuciferin N-oxid thu được

- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ IR, phổ MS và

phổ 1H-NMR

2.3.3 Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl

- Thực hiện khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl

- Tách, tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm nuciferin N-oxid thu được

- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ MS, phổ 1H-NMR

và phổ 13C-NMR

2.3.4 Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO 4 7H 2 O

- Thực hiện khử nuciferin N-oxide bằng FeSO4.7H2O

- Tách, tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm N-demethyl thu được

- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ IR, phổ MS và

1H-NMR

2.3.5 Thử tác dụng sinh học

- Thử tác dụng chống ung thư vú và ung thư phổi của nuciferin và nuciferin N-oxid

tại Phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin

- Sử dụng phương pháp chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm

- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp

các chất dự kiến: tạo dẫn chất N-oxid, khử hóa N-oxid tạo N-demethyl nuciferin

- Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silica gel GF254

Merck 70-230 mesh và hệ dung môi khai triển thích hợp (Hệ dung môi = cloroform

: methanol = 9 : 1); pha dung dịch thử và dung dịch mẫu (hòa tan chất thử, chất mẫu vào methanol nồng độ khoảng 0,25%); để khô bản mỏng ngoài không khí sau đó triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết

- Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy Melt để sơ bộ định tính và xác định độ tinh khiết

EZ Sử dụng các phương pháp kết tinh, sắc ký điều chế để tách và tinh chế sản phẩm

Tổng hợp hóa học thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR)

Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr

trong vùng 4000-400cm-1 Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại

bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng phân tử (MS):

Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và khoa Hóa học – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo

TQ

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H - NMR):

Được ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và khoa Hóa học – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là CDCl3 với chất chuẩn nội là tetramethylsilan

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 ( 13 C-NMR)

Được ghi tại khoa Hóa học – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là CDCl3 với chất chuẩn nội là tetramethylsilan

2.4.3 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng chống ung thư: chống ung thư phổi và chống ung thư vú Thử

độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng

kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

2.4.3.1 Thiết bị nghiên cứu

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm

tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.4.3.2 Các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú

2.4.3.3 Phương pháp thử độc tế bào

Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các chất

có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32

g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml Bổ sung 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng

độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào MCF-7; môi trường DMEM cho LU Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml Ủ ở 37oC / 5% CO2 Sau 3 ngày thêm 50 l MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC /4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition)

% kìm hãm = OD điều khiển – OD mẫu

OD điều khiển × 100%

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của

tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen

3.1.1 Quy trình chiết nuciferin

- Nguyên liệu: 10,0 kg lá sen được xay nhỏ thành bột Chia làm 2 mẻ

- Quy trình: Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong (ủ trong 24h để thấm đều dược liệu), sau đó chiết nóng bằng dầu hỏa: 1 kg bột lá sen với 6 lít dầu hỏa ở nhiệt độ khoảng 100oC trong 2h Dịch chiết dầu hỏa được lắc với 0,5 lít acid H2SO4

0,3% Sau đó gạn lấy lớp dầu đổ lại vào chiết tiếp bã lá sen vừa rồi trong 1,5h sau đó lại gạn lấy lớp dầu và chiết bằng 0,5 lít acid H2SO4 0,3% Như vậy cứ 1 kg lá sen sẽ

sử dụng 6 lít dầu hỏa và 1 lít H2SO4 0,3% (chiết 2 lần) Gộp dịch acid thu được, kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho đến pH=10, lọc thu được tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC

- Kết quả: Khối lượng alkaloid toàn phần thu được từ 5,0 kg lá sen là 31,0 g (0,62%)

3.1.2 Tinh chế nuciferin

- Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong aceton

- Cứ 10g alkaloid toàn phần hòa tan nóng hoàn toàn vào 250 ml aceton Tẩy màu bằng than hoạt (đun nóng, khuấy trong vong 10 phút), để lạnh cho kết tinh sau 24h thu được 4,3 g nuciferin

- Kết quả

 Khối lượng nuciferin thu được khi chiết 10,0 kg lá sen: mnuciferin=25,0 g

 Đo to

nc: 165-166oC

 Cảm quan: chất rắn màu trắng ánh xanh

 SKLM (triển khai bản mỏng bằng hệ dung môi CHCl3 : MeOH = 9 : 1): Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin

Rf=0,78

3.2 Kết quả nghiên cứu các phản ứng trên nguyên tử N của nuciferin

3.2.1 Phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid

- Sơ đồ phản ứng:

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid sử dụng H 2 O 2 30%

Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,30 g, 1,02 mmol), dung môi (15 ml),

H2O2 30%, bình cầu 1 cổ 50 ml, khuấy từ, và sinh hàn hồi lưu

Tiến hành phản ứng: Cho vào bình cầu 1 cổ (50 ml) 15 ml dung môi thêm

vào 0,3 g nuciferin Thêm thể tích H2O2 thích hợp Đun phản ứng ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp Theo dõi phản ứng bằng SKLM

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Dịch được chiết bằng CHCl3 Chiết 3 lần lấy lớp dịch CHCl3 Sau đó rửa lại bằng nước cất đến pH=7 Dịch làm khan bằng Na2SO4 và cất dưới áp suất giảm đến kiệt dung môi

- Các khảo sát chúng tôi đã thực hiện:

 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản đến hiệu suất phản ứng tạo nuciferin

N-oxid

Chúng tôi khảo sát ở nhiệt độ 25oC, 50oC, 65oC Sử dụng dung môi MeOH, tác nhân

H2O2 30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol) Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp

nuciferin N-oxid

STT Nguyên liệu

(g)

Nhiệt độ (oC)

Dung môi

Thời gian (h)

Hiệu suất (%)

Nhận xét: Nhiệt độ cao làm giảm thời gian phản ứng

 Khảo sát dung môi phản ứng ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin

N-oxid

Các dung môi được khảo sát là MeOH, EtOH, i-prOH Sử dụng tác nhân H2O2

30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol) Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2

Bảng 3.2 Khảo sát dung môi ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp

Hiệu suất (%)

Nhận xét: với dung môi i-PrOH giảm thời gian phản ứng

 Khảo sát tỉ lệ mol H2O2:nuciferin ảnh hưởng đến thời gian phản ứng

Chúng tôi sử dụng nuciferin (0,30 g, 1,02 mmol), tác nhân H2O2 30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol); 3 ml (7,35 mmol); 7 ml (17,15 mmol) Nhiệt độ hồi lưu Chúng

tôi sử dụng dung môi i-PrOH do trong khảo sát sử dụng dung môi (Bảng 3.2) chúng

tôi thấy sử dụng i-PrOH cho thời gian phản ứng ngắn nhất và hiệu suất cao nhất Kết

quả khảo sát được thể hiện trên Bảng 3.3

Bảng 3.3 Khảo sát tỉ lệ mol H 2 O 2 :nuciferin ảnh hưởng đến thời gian phản

Thời gian (h)

Hiệu suất (%)

- Đề xuất quy trình:

Chuẩn bị phản ứng: nuciferin (0,3 g; 1,02 ml), i-PrOH (15 ml), H2O2 30% (0,25 ml; 2,45 mmol) vào bình cầu 1 cổ 50 ml, khuấy từ, và sinh hàn hồi lưu

Tiến hành phản ứng: Cân 0,3 g nuciferin hòa tan trong 15 ml i-PrOH trong bình

cầu 1 cổ 50 ml Thêm 0,25 ml H2O2 30% Đun phản ứng ổn định phản ứng nhiệt ở độ

82oC Đun phản ứng ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian 2,5h Theo dõi phản ứng bằng SKLM

Hình 3.2 Sơ đồ đề xuất phản ứng oxy hóa nuciferin bằng H 2 O 2

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Dịch được chiết bằng CHCl3 Chiết 3 lần lấy lớp dịch CHCl3 Sau đó rửa lại bằng nước cất đến pH=7 Dịch làm khan bằng Na2SO4 và cất dưới áp suất giảm đến kiệt dung môi

- Kết quả:

 Cảm quan: chất lỏng màu xanh

 Khối lượng: m=0,29 g (hiệu suất 91,7%)

 SKLM (triển khai với hệ dung môi CHCl3:MeOH=9:1) Quan sát bản mỏng dưởi

đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin N-oxid Rf = 0,21

Kết luận: Sau khi phân tích sản phẩm bằng phổ IR, phổ MS và phổ 1H-NMR

chúng tôi chứng minh được sản phẩm là nuciferin N-oxid

3.2.2 Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl