Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ

ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotics được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận, giảm cholesterol máu…19, 23, 26. Tuy nhiên, vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm…48. Những yếu tố này giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột 39. Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp. Hiện nay, các dạng bào chế probiotics thông dụng trên thị trường là dạng bột và cốm. Tuy nhiên, việc đảm bảo số lượng vi sinh vật sống sót và bảo vệ chúng khi sử dụng đường uống là vấn đề lớn do khi sử dụng các vi sinh vật phải chịu tác động của các yếu tố bất lợi như: pH acid của dạ dày, enzyme tiêu hóa, muối mật…23. Nhiều phương pháp bào chế đã được nghiên cứu để giảm thiểu ảnh hưởng các yếu tố nêu trên đến vi khuẩn probiotics, trong đó có phương pháp vi nang hóa. Vi nang hóa giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi só sự thay đổi nhiệt độ, pH hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường. Do đó, làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng độ ổn định. Từ các lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Xây dựng được công thức bào chế vi nang probiotics chứa Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp đông tụ. 2. Xác định một số thông số quy trình bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ.

HÀ NỘI - 2015

Người hướng dẫn:

PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Công nghiệp Dược

2 Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn

chân thành tới: PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến - Giảng viên bộ môn Công nghiệp

Dược – trường Đại học Dược Hà Nội - người thầy đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và chỉ bảo tôi trên con đường học tập, rèn luyện và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân - Giảng viên bộ môn

Công nghiệp Dược - trường Đại học Dược Hà Nội - người cô đã luôn tận tình giúp

đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Hạnh Thủy, ThS Bùi Thị

Lan Phương, thầy giáo Nguyễn Ngọc Khánh cũng toàn thể các thầy giáo, cô giáo

và các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược - những người đã luôn giúp

đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Đại học Dược Hà Nội

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Phạm Thị Phương

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.1 Đại cương về probiotics 2

1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 3 1.3 Tổng quan về dạng bào chế vi nang 6

1.6 Một số nghiên cứu về dạng bào chế vi nang probiotics 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố công thức đến vi nang bào chế được 23 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố quy trình bào chế đến vi nang 37 3.3 Theo dõi độ ổn định của vi nang trong quá trình bảo quản 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ

(American Type Culture Collection)

Cfu Số đơn vị khuẩn lạc (Colony-Forming

Units)

CT Công thức

kl/tt Khối lượng trên thể tích

MRS Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de

Man, Rogosa, Sharpe)

MT Môi trường

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang 1.1 Tỷ lệ sống sót của A aerogenes khi được bảo quản với glycerol ở

-20oC

15

2.1 Các nguyên liệu pha môi trường 16 2.2 Tá dược sử dụng 17 2.3 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 17 2.4 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 19 3.1 Công thức bào chế vi nang alginat và chitosan 23 3.2 Kết quả của mẫu CT1 và CT2 trước và sau đông khô 25 3.3 Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ alginat 26 3.4 Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ glycerol 28 3.5 Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi tỷ lệ tinh bột 30 3.6 Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ CaCl2 32 3.7 Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ chitosan 33 3.8 Kết quả bảo vệ L acidophilus của alginat và chitosan trong môi

trường acid pH 1,2

34

3.9 So sánh khả năng bảo vệ VSV trong môi trường acid của các mẫu 36 3.10 Bảng công thức tốt nhất CT35 36 3.11 Đặc tính của vi nang bào chế được khi thay đổi thời gian ủ 37 3.12 Đặc tính của vi nang bào chế khi thay đổi tốc độ khuấy môi trường 38 3.13 Đặc tính của vi nang bào chế khi thay đổi tốc độ nhỏ giọt 39 3.14 Bảng biến thiên số lượng VSV và hàm ẩm trong thời gian bảo quản 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.2 Cấu trúc alginat 11 1.3 Cấu trúc chitosan 13 3.1 Đồ thị diễn số lượng VSV trong các mẫu vi nang khi thay đổi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn probiotics được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận, giảm cholesterol máu…[19], [23], [26] Tuy nhiên, vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm…[48] Những yếu tố này giảm

số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột [39]

Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp Hiện nay, các dạng bào chế probiotics thông dụng trên thị trường là dạng bột và cốm Tuy nhiên, việc đảm bảo số lượng vi sinh vật sống sót và bảo vệ chúng khi sử dụng đường uống là vấn đề lớn do khi sử dụng các

vi sinh vật phải chịu tác động của các yếu tố bất lợi như: pH acid của dạ dày, enzyme tiêu hóa, muối mật…[23] Nhiều phương pháp bào chế đã được nghiên cứu

để giảm thiểu ảnh hưởng các yếu tố nêu trên đến vi khuẩn probiotics, trong đó có phương pháp vi nang hóa

Vi nang hóa giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi só sự thay đổi nhiệt độ, pH hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường Do đó, làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng độ ổn định Từ các lý do trên, đề tài:

“Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ” được thực

hiện với các mục tiêu cụ thể sau:

1 Xây dựng được công thức bào chế vi nang probiotics chứa Lactobacillus

acidophilus bằng phương pháp đông tụ

2 Xác định một số thông số quy trình bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về probiotics

Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp Theo nghĩa gốc, “biotic” hay

“biosis” từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên probiotics có thể hiểu theo nghĩa là bất cứ cái gì “thân thiện với đời sống con người” Hiểu sát hơn, đó là chất bổ sung chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích Những loài VK hay sử dụng

trong chế phẩm probiotics thuộc chi Bifidobacterium và chi Lactobacillus [49]

Khái niệm probiotics đầu tiên được đưa ra bởi nhà khoa học Eli Metchnikoff, ghi trong cuốn sách “kéo dài sự sống” năm 1908 Ông cho rằng những người nông dân Bulgary sống lâu vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột [51]

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotics như sau:

“Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [49], [30] Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng khuẩn probiotics sử dụng dưới dạng thực phẩm là chủng đó phải có khả năng sống sót và phát triển trong đường ruột Do trong quá trình sử dụng, vi khuẩn probiotics bị ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện bất lợi của môi trường bên ngoài và đường tiêu hóa Nên để có tác dụng, bất cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng [15], [36]

Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết của con người về cơ chế tác dụng của các vi khuẩn probiotics còn rất hạn chế Một

số tác giả cho rằng vi khuẩn probiotics ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa Các cơ chế cụ thể được nêu ra như: cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột, ức chế sự phát triển của vi khuẩn có hại bằng kích thích hệ thống miễn dịch ruột, bằng các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn probiotics [17], [18]

Trong thời gian gần đây, đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản phẩm

y tế có nguồn gốc từ probiotics Probiotics ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang, pellet… và còn sử dụng cho đường khác như viên đặt, kem bôi da Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn

Để cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong suốt quá trình bảo quản và ở môi trường có độ pH thấp trong cơ thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics được bao tới thế hệ 1,2,3…[2]

Thế hệ 1 Không bao như cốm, pellet…( Non – Coated)

Thế hệ 2 Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

1.2 Loài Lactobacillus acidophilus

1.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy

Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân

của trẻ sơ sinh L acidophilus nằm trong chi Lactobacillus, chi lớn nhất của họ VK

lactic với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [33]

L acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 – 0,9µm, dài 1,5 – 6,0µm,

tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi, chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không có lông roi, không di động, không ưa muối, không ưa acid, calatase âm tính, kỵ khí tùy tiện và

có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic Nhiệt độ thích

hợp cho sinh trưởng là 37oC, có thể phát triển được ở nhiệt độ cao (45oC) không phát triển trong khoảng 20 - 22oC hoặc nhiệt độ cao hơn 48oC [8], [22]

L acidophilus là VK vi hiếu khí, do đó môi trường nuôi cấy thường là kỵ khí

hoặc là giảm áp oxy với 5-10% CO2 L acidophilus là đại diện chính của nhóm VK

sinh acid lactic, có khả năng chịu được điều kiện acid trong khoảng pH 5-6 trong

thời gian 24-36h L acidophilus phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt thấp

và có khả năng kháng lysozyme [10]

1.2.2 Tác dụng của Lactobacillus acidophilus đối với sức khỏe

a Cải thiện chức năng miễn dịch không đặc hiệu

Các VK sinh acid lactic có thể tăng các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như chức năng thực bào, tăng hoạt động các tế bào NK – natural killer cells và các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (hoạt động sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh các tế bào lympho,…) của vật chủ Sự gia tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (hoạt động thực bào của bạch cầu hạt) đã được ghi nhận ở những người tình nguyện sau

khi sử dụng hỗn hợp probiotics gồm Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium

bifidum [23]

b Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh

L acidophilus có tác dụng ức chế sự phát triển của các VK gây bệnh đường

ruột như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica

và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng VSV Bằng cách cạnh tranh

chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí bám lên niêm mạc ruột của các VK gây bệnh và sinh ra các chất có tác dụng kháng khuẩn làm cho VK có hại không phát triển được như: các barteriocin (như: nisin, lactobrevin, acidophilin, acidolin, lactobacillin, lactocidin và lactolin), acid lactic, acid acetic, hydrogen peroxid, carbon dioxid, diacetyl…[23]

c Phòng ngừa bệnh tiêu chảy

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, probiotics có tác dụng điều trị trong các trường hợp tiêu chảy do sử dụng kháng sinh ở người lớn, tiêu chảy khi đi du

lịch, cũng như tiêu chảy ở trẻ em do rotavirus Khi sữa có chứa L acidophilus,

S.thermophiles và B longum được dùng cho những bệnh nhân cao tuổi bị tiêu chảy

do thường xuyên dùng thuốc xổ, tần suất tiêu chảy của người bệnh đã giảm xuống, đồng thời tình trạng bệnh tiêu chảy cũng được cải thiện [10], [23]

d Hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân suy thận

Theo nghiên cứu in vitro của Satya Prakash và cộng sự, tác giả đã tiến hành thử nghiệm: vi nang alginat - chitosan bao gói VK Lactobacillus acidophilus và vi nang alginat - chitosan bao gói VK L acidophilus cùng với than hoạt Hai loại vi

nang này được cho vào mô hình mô phỏng dạ dày ruột có chứa 150mg/dL ure Kết quả cho thấy vi nang có chứa vi khuẩn làm giảm tối đa 57 mg/dL ure, còn vi nang

có chứa than hoạt và vi khuẩn làm giảm được nồng độ ure thấp hơn Nghiên cứu chỉ

ra rằng, vi khuẩn L acidophilus trong quá trình trao đổi chất, có khả năng hấp thụ ure vào tế bào Vi nang L acidophilus (có hay không có than hoạt) đều có khả năng

hấp thụ được từ 18-30% ure từ mô hình mô phỏng Do đó, sử dụng vi nang có chứa

VK L acidophilus có thể hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân suy thận [37]

e Giảm cholesterol máu

Theo nghiên cứu in vivo của Ying Huang và Yongchen Zheng cùng các cộng

sự, đã cho thấy rằng một số loài Lactobacilli có thể làm giảm cholesterol toàn phần

và làm giảm nồng độ cholesterol lipoprotein VK L acidophilus làm giảm sự hấp

thu cholesterol thông qua sự điều chỉnh Niemann-Pick C1-like 1(NPC1L1) trong tế bào Caco-2 (dòng tế bào ung thư biểu mô ruột) Cơ chế có thể được giải thích như

sau: L acidophilus có khả năng ức chế tuyến yên tác động tới NPC1L1, làm giảm

NPC1L1, làm giảm sự hấp thu cholesterol của tế bào Caco-2 [19]

Trong các nghiên cứu khác, Lactobacillus acidophilus có tác dụng phân giải

các acid mật thành các acid tự do, acid tự do này được đào thải khỏi đường tiêu hóa nhanh hơn nhiều so với các acid mật ở dạng kết hợp, khiến nồng độ acid mật giảm xuống, tác động lên quá trình tổng hợp acid mật từ cholesterol, làm cho quá trình tổng hợp này tăng lên, gây ra tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần trong cơ thể [9], [11], [28], [46]

f Cải thiện khả năng dung nạp lactose

Những người thiếu men lactase khi sử dụng một hoặc hai ly sữa thường bị rối

loạn tiêu hóa dẫn đến đầy hơi, tiêu chảy L acidophilus có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa

và cải thiện khả năng dung nạp lactose được giải thích qua các cơ chế sau [26]:

 Khi sử dụng sữa có chứa L acidophilus, vi khuẩn cung cấp một lượng men

lactase để dung nạp lactose Do đó làm giảm lactose bị phân hủy dẫn đến giảm hình thành các loại khí gây đầy hơi như khí hydro [26]

 L acidophilus trong các thử nghiệm in vitro gây đối kháng lại sự phát triển

của các loại VK sản sinh ra khí Do các VK này bị ức chế bởi các lactobacilli do

L acidophilus sinh ra [26]

 L acidophilus là VK lên men đồng hình, chuyển các loại đường hexose thành

acid lactic và không sinh khí Khi tỷ lệ VK lên men đồng hình tăng lên, thì lượng khí sinh ra từ các VK lên men dị hình sẽ giảm xuống [26]

1.3 Tổng quan về dạng bào chế vi nang

1.3.1 Khái niệm

Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, có kích thước từ 0,1 µm tới 5 mm (thông thường từ 100 - 500 µm) Các vi nang được bào chế qua quá trình bao dược chất lỏng hoặc rắn bằng một màng bao mỏng polyme liên tục [4]

Xét về hình thái học, có thể chia thành 2 loại:

Vi nang (microcapsule): hệ thống có cấu trúc kiểu “bình chứa “ (reservoir), gồm nhân và vỏ xác định Nhân có thể ở dạng rắn, lỏng, khí Vỏ là một màng polyme (có thể một hoặc nhiều polyme) liên tục, có cấu trúc xốp hoặc không [20]

Vi cầu (microsphere): cấu trúc đồng nhất hoặc nguyên khối tạo nên bởi chất nền liên tục (một hoặc nhiều polyme hòa trộn với nhau), phân tử thuốc được phân tán vào chất nền (matrix) [20]

Trên thực tế, sự phân biệt trên chỉ là tương đối [4], [5]

1.3.2 Cấu tạo, thành phần, đặc điểm

Vi nang được cấu tạo bởi hai thành phần:

Phần nhân: gồm một hoặc nhiều dược chất Dược chất rất phong phú, đa

dạng, có thể ở trạng thái rắn, lỏng hoặc dưới dạng một nhũ tương, hỗn dịch, có thể thêm các chất phụ nhằm mục đích ổn định hoặc điều chỉnh tốc độ giải phóng dược chất [4], [14], [20], [47]

Phần vỏ: thường là các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên như

gelatin, alginat, chitosan, cellulose hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl, pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)…, có tác dụng tạo màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200µm Lớp vỏ này xác định thuộc tính lý hóa của vi nang [4], [8]

Tỷ lệ nhân và vỏ biến động trong một khoảng rất rộng, từ 1:99 đến 99:1 Thông thường vỏ bao chiếm 70% khối lượng vi nang và quyết định phần lớn tính chất của vi nang [4]

Tính chất của vật liệu làm vỏ vi nang (bám dính, tính thấm, khả năng hút ẩm, khả năng hòa tan, độ ổn định) phải phù hợp với mục đích bào chế vi nang [47] Lớp

vỏ này phải có khả năng “bẫy”, “nhốt” và bao gói các dược chất, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ Lớp vỏ vi nang có độ bền tương đối để vừa có khả năng bảo vệ tế bào VK vừa có khả năng giải phóng dược chất khi cần thiết [25]

Vi khuẩn, dược chất được giải phóng theo cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng

Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu…thì

kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào VSV sử dụng trong các công đoạn lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [40], [28]

Nhược điểm

Trong quá trình trao đổi chất, tế bào VSV sản sinh ra nhiều enzym trong đó có những enzym có thể xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào [49]

Đa số các vật liệu vi nang như thạch, gelatin…đều là những nguồn dinh dưỡng

mà VSV có thể tiêu hóa được Điều này dẫn đến nhược điểm là VSV được bao gói bên trong hoặc VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể

1.3.4 Phương pháp bào chế vi nang

Có nhiều phương pháp chế tạo vi nang Về nguyên tắc, phương pháp chung chế tạo vi nang không bắt buộc phải có những thiết bị riêng Việc lựa chọn phương pháp chế tạo phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích thước vi nang…[4]

Có thể tạm phân chia như sau:

Phương pháp hóa lý: đông tụ (đơn giản, phức hợp); sử dụng các polyme không tương thích; bốc hơi dung môi; sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…

Phương pháp cơ lý: ly tâm, bao tầng sôi, xát hạt tầng sôi quay tròn, nồi bao viên thông thường, phun sấy…

Phương pháp hóa học: polyme hóa (tương tác các polyme, polyme hóa bề mặt)…[14]

Một số phương pháp được trình bày cụ thể sau:

Phương pháp tách pha đông tụ

Nguyên tắc: tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự muối hóa hoặc

khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang, làm thay đổi độ tan của polyme, kết quả là hình thành một pha mới Lúc này, hệ trở thành hai pha, một pha có nồng

độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ (coacervat) Sau đó các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ lên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng vi nang [4], [8]

Có thể chia thành 2 nhóm cơ bản:

Đông tụ đơn giản: Là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng

trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo Trong phương pháp này thường chỉ

sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose) Quá trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…) hoặc thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [1]

Đông tụ phức hợp: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và

tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, hoặc do sự thay đổi nồng

độ của chất tan cao phân tử Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4], [8]

Kĩ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel) Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan…Trong phương pháp này các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian

ba chiều bao gói lấy dược chất; hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ họa cao hơn và ngăn thấm tốt hơn Hydrogel được bào chế bằng 2 kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ (tùy thuộc vào kích cỡ của dược chất bao gói)

Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất bao gói có một số ưu điểm sau: đơn giản, dễ làm, không phải sử dụng đến dung môi hữu cơ (đối với một số trường hợp), không gây độc cho môi trường, điều kiện tiến hành không quá khó khăn…Tuy nhiên, nó vẫn có nhược điểm là gây thất thoát dược chất trong quá trình bào chế Hơn nữa, cấu trúc mạng lưới hình thành rất thấm nước, ít hoặc không kiểm soát giải phóng đối với các dược chất hòa tan, do đó hệ thuốc này

phù hợp hơn với các dược chất có độ tan thấp Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi nang có kích thước lớn Đối với kỹ thuật phun đông tụ sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp môi trường có tác nhân liên kết chéo Kỹ thuật này cho vi hạt có kích thước bé (5 - 15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc nghẽn cao [33]

Đã có nhiều nghiên cứu về vấn đề này, Himanshu K Solanki cùng các cộng sự

đã tạo vi nang probiotics trên cơ sở nguyên tắc đông tụ do tạo muối (phương pháp gel ion ngoại) Thử nghiệm được tiến hành gồm các bước: Chuẩn bị hỗn dịch alginat có chứa sinh khối, với nồng độ alginat từ 1 – 2%, dùng kim tiêm để nhỏ vào dung dịch calci clorid 0,005 – 1,5M, đường kính của hạt phụ thuộc vào nồng độ, độ nhớt của dung dịch alginat, khoảng cách giữa đầu kim với dung dịch alginat, đường kính trong của đầu kim nhỏ giọt Đường kính vi nang tạo ra trong khoảng từ 500µm đến 3mm [42]

Maria Chavarri và các cộng sự đã tạo vi nang probiotics bằng phương pháp

đông tụ tạo muối Sinh khối sau khi lên men thu được bằng cách ly tâm L gasseri

và B bifidum với tốc độ 1500 xG trong 5 phút ở nhiệt độ thấp (4oC), sau đó sinh khối thu được phối hợp vào 10ml dung dịch alginat 2% tạo hỗn dịch đồng nhất Hỗn dịch này được phun vào dung dịch chitosan - calci clorid với nồng độ chitosan 0,4% (kl/tt) và calci clorid 0,1M Các hạt vi nang được làm lạnh ở -20oC, được đông khô

ở nhiệt độ -40o

C trong 18h Hạt vi nang sau đông khô được bảo quản ở trong bình kín với nhiệt độ thấp (4oC) [13]

Kỹ thuật hóa rắn nhũ tương

Vi nang có thể được tạo ra từ nhũ tương gồm hai hay nhiều chất lỏng không đồng tan với nhau Nhũ tương tạo thành có thể là loại dầu/nước (D/N) hoặc nước/dầu (N/D) Dựa vào kỹ thuật hóa rắn nhũ tương mà có thể chia thành 3 phương pháp: bốc hơi dung môi, thay đổi dung môi và tạo liên kết chéo [20], [45], [32]

1.4 Alginat

a Cấu tạo

Alginat là một trong các loại chuỗi polysaccharid anion được chiết tách từ loài tảo nâu Phaeophyta, bao gồm: acid β-1,4-D-mannuronic (chuỗi M) và α-1,4-L-guluronic (chuỗi G) liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glycosid [29]

Hình1.2: Cấu trúc alginat

b Đặc điểm, tính chất có liên quan đến bào chế vi nang

Độ nhớt: khác nhau tùy số lượng nhánh của phân tử alginat Độ nhớt thay đổi phụ thuộc nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại [29]

Sự gel hóa: dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II, III Sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại 2 block, block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc, khi có mặt các ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+…) ở nồng

độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng Các ion

Ca2+ khớp vào các chỗ trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những tác động bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vật liệu được bao gói theo cách kiểm soát được [29]

c Ƣu, nhƣợc điểm của vật liệu bao vi nang alginat đối với probiotics

Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm Alginat là vật liệu

an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với calci clorid [29] Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong Hạt vi nang tạo thành đẹp và tương đối đồng đều [12], [21]

Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào VSV cũng có một số nhược điểm Độ bền gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion

Ca2+ Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm giảm độ bền của gel calci alginat và làm cho các tế bào thoát ra ngoài [12], [21]

d Ứng dụng trong vi nang

Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào sống, sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào, cố định enzym [16] Calci alginat tạo thành có tính trương nở trở lại phụ thuộc vào pH môi trường nên có thể sử dụng để tạo các vi nang bảo vệ các dược chất không bền trong môi trường pH dịch vị [33]

Ngoài ra trong dược phẩm, alginat được sử dụng trong các dạng bào chế đường uống, đường bôi ngoài da (làm tá dược dính trong viên nén, tá dược độn trong viên nang), còn dùng trong các dạng bào chế giải phóng kéo dài [29], [33]

1.5 Chitosan

Những năm gần đây, người ta nhận thấy những lợi ích đáng kể của việc sử dụng chitosan trong các ngành sinh dược, thực phẩm, công nghiệp và công nghệ sinh học Các ứng dụng mới mẻ của loại polyme này là do đặc điểm có những nhóm hoạt động, độc tính thấp, khả năng tự phân hủy và khả năng tương thích sinh học

Do vậy, chitosan được sử dụng rất nhiều trong các hệ phân tán thuốc [43]

Cấu tạo, tính chất lý hóa

Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng deacetyl hóa chitin – một polyaminosaccarid rất phong phú trong tự nhiên, là thành

phần cơ bản của lớp vỏ bảo vệ của các động vật giáp xác như tôm, cua…và thành tế bào của một số loài như aspegillus, mucor…[40], [41]

Hình 1.3: Cấu trúc chitosan

Phân tử lượng từ 3800 đến 2000000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 40 đến 98% Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, tỷ trọng, độ nhớt, mức độ acetyl hóa là những đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược trong kỹ thuật bào chế [40], [41]

Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ và phụ thuộc bản chất chitosan (mức độ deacetyl hóa cao)

Chitosan có một nhóm amin bậc 1 và hai nhóm hydroxyl liên kết với mỗi tiểu đơn vị C6 [41] Chitosan là một base yếu, không tan trong nước và dung môi hữu

cơ nhưng tan được trong dung dịch acid loãng (pH<6,5) do trong môi trường acid, những nhóm amin (các tiểu đơn vị glucosamine) của chitosan nhận proton tạo thành dạng polysaccharid tích điện dương (R-NH3) tan được Các muối của chitosan (muối glutamat, clorid) tan trong nước Chitosan không tan trong môi trường kiềm, môi trường trung tính Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang chitosan [41]

Chitosan có mức độ deacetyl hóa thấp (40%) có thể tan được trong môi trường

pH dưới 9,0 trong khi loại có mức độ deacetyl hoá cao (85%) chỉ có thể tan được trong môi trường pH dưới 6,5 [24] Do có các nhóm amin tự do, chitosan mang điện tích dương và có thể phản ứng với các phân tử mang điện tích âm và tạo phức với ion kim loại như Cobalt…[41]

1.6 Một số nghiên cứu về dạng bào chế vi nang probiotics

Theo nghiên cứu của Sepideh Abbaszadeh và các cộng sự, đã tiến hành tạo vi

nang L rhamnosus sử dụng chitosan- alginat như sau: sinh khối sau lên men, ly tâm

ở tốc độ 3200xg trong 10 phút ở 4oC để thu sinh khối và rửa sinh khối VK 2 lần bằng cách ly tâm với dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0.9% Dùng 5ml dung dịch nước muối sinh lý đã tiệt khuẩn để thu sinh khối trong các ống ly tâm Phân tán sinh khối vào 10ml dung dịch alginat (các nồng độ 20,30,40 g/L) bằng khuấy từ [38] Dung dịch chitosan với các nồng độ (2,4 và 10 g/L) được phân tán vào 90ml nước cất được acid hóa bằng 0,4ml acid acetic băng, điều chỉnh về pH 5,7 – 6 bằng dung dịch NaOH 0,1M Lọc qua giấy lọc để loại cặn, sau hấp tiệt khuẩn ở 121oC trong 15 phút Hỗn dịch sinh khối – alginat được đùn qua đầu kim có kích thước 0,11mm vào dung dịch CaCl2 0,1M đã hấp tiệt khuẩn Hạt được ủ trong 30 phút, khuấy từ với tốc độ 100 rpm Sau đó, rửa sạch hạt, ủ hạt trong dung dịch chitosan trong 40 phút kết hợp với khuấy từ nhẹ nhàng với tốc độ 100 rpm [38]

Nghiên cứu đánh giá vi nang trên các phương diện kích thước hạt, hiệu suất bao gói, khả năng sống sót của VSV ở các pH khác nhau khi ủ trong thời gian 0; 24

và 48 giờ Đánh giá khả năng sống sót của VSV trong môi trường muối mật, đánh giá khả năng bảo vệ VK của vi nang khi ủ trong các nhiệt độ 55, 60 và 65oC trong

30 phút [38] Kết quả cho thấy sự thay đổi nồng độ chitosan, alginat sẽ ảnh hưởng

đến kích thước của hạt, ảnh hưởng đến khả năng bảo vệ L.rhamnosus trong các điều

kiện thử nghiệm trên [38]

Trong nghiên cứu của Maria Chavarri và các cộng sự: tác giả không tách

riêng dung dịch chitosan và dung dịch CaCl2 mà phối hợp chúng tạo dung dịch chitosan - calci clorid như sau: chitosan được hòa tan trong 100ml nước cất được acid hóa bằng acid acetic để đạt nồng độc chitosan là 0,4% (kl/tt), sau đó phối hợp dung dịch CaCl2 0,1M vào dung dịch chitosan Hạt vi nang sau khi được tạo ra, được tiền đông ở -20oC sau đó đông khô ở nhiệt độ -40o

C trong 18 giờ Vi nang sau khi đông khô, dùng dung dịch natri citrat 0,1M khuấy trong 10 phút để hòa tan, đếm

số lượng VSV Lactobacillus gasseri và Bifidobacterium bifidum bằng cách pha

loãng với nồng độ thích hợp, sau đó cấy trên môi trường MRS thạch [13] Kết quả nghiên cứu của tác giả chỉ ra rằng Vi nang probiotics được bao gói trong vi nang chitosan - alginat khả năng tồn tại cao hơn với việc bao gói trong alginat [13]

Theo nghiên cứu của Postgate và Hunter: trong quá trình đông khô, tiền đông

A aerogenes và đông khô ở nhiệt độ thấp thì số lượng VSV sống sót giảm Tác giả

sử dụng glycerol 10% (kl/tt) làm chất bảo vệ VK A.aerogenes trong quá trình đông

khô và bảo quản ở nhiệt độ thấp Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ, tỉ lệ

A.aerogenes sống sót sau đông khô và bảo quản ở -20oC như sau:

Bảng 1.1: Tỷ lệ sống sót của A aerogenes khi được bảo quản với glycerol ở -20 o C

Thời gian bảo quản (ngày) 0 2 6 10 20 27 40

Tỉ lệ VSV sống sót (%) 95 92 91 86 92 85 85 Thử nghiệm cho thấy, khi dùng glycerol với nồng độ10 - 15% thì lượng VSV sống sót sau đông khô lớn, dùng glycerol với nồng độ <2% không có ý nghĩa bảo

vệ Tuy nhiên, khi dùng với nồng độ >30% làm giảm tỷ lệ sống sót của VSV [34]

Theo nghiên cứu của Nguyễn Mai Hương, tác giả đã sử dụng tinh bột vào

trong quá trình tạo vi nang L acidophilus như sau: Tinh bột, sinh khối VSV được

phân tán vào alginat tạo hỗn dịch Hỗn dịch này cho qua đầu kim có đường kính trong 900µm, nhỏ vào dung dịch CaCl2 2% (kl/tt) để tạo hạt Kết quả cho thấy việc phối hợp tinh bột đã cải thiện thể chất của nguyên liệu đông khô dạng vi nang Hạt

có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt giảm nhăn nhúm, giữ được độ cầu tốt hơn, màu sắc đẹp hơn [3]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu chứa vi sinh vật

Chủng vi sinh vật Lactobacillus acidophilus ATCC 4563 (Bộ môn Công

Nghiệp Dược –trường Đại học Dược Hà Nội)

Cốm nguyên liệu Antibiopro 1g chứa Lactobacillus acidophilus: của hãng Han

Wha Pharma (Hàn Quốc)

Nguyên liệu pha môi trường

Bảng 2.1: Các nguyên liệu pha môi trường

Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn Glucose Trung Quốc TCCS

Pepton Merk – Đức TCCS

Cao thịt Merk – Đức TCCS

Cao nấm men Merk – Đức TCCS

Kali dihydro phosphat Trung Quốc TCCS

Magnesi sulfat heptadihydrat Trung Quốc TCCS

Triamoni citrat Trung Quốc TCCS

Natri acetat Trung Quốc TCCS

Natri clorid Trung Quốc TCCS

Mangan sulfat tetrahyrat Trung Quốc TCCS

Natri citrat Trung Quốc TCCS

Natri hydroxyd Trung Quốc TCCS

Acid hydrochloric Trung Quốc TCCS

Thạch agar Việt Nam TCCS

Nước tinh khiết Việt Nam TCCS

Bảng 2.2: Tá dược sử dụng

Tên tá dược Nguồn gốc Tiêu chuẩn Chitosan Đức TCCS Natri alginat Ấn Độ TCCS Calci clorid Trung Quốc TCCS Tinh bột sắn Việt Nam TCCS Glycerol Malaysia TCCS

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Nguồn gốc

Bơm nhu động Đức (Longer pump)

Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo)

Nồi hấp tiệt khuẩn ALP – Nhật

Cân phân tích Đức (Sartorius)

Cân kỹ thuật Đức (Sartorius)

Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus)

Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd)

Máy lắc (vortex) Trung Quốc

Máy đo pH Mỹ (Mettler Toledo)

Đầu kim, đĩa petri, ống nghiệm,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng công thức bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ tạo muối

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công thức đến một số chỉ tiêu chất lượng của vi nang, khả năng sống sót của vi khuẩn L acidophilus bào chế được

 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu công thức đến chỉ tiêu chất lượng của vi nang bào chế được

 Khảo sát ảnh hưởng của thông số quá trình đến chỉ tiêu chất lượng của vi

nang bào chế được

 Thời gian ủ vi nang  Tốc độ khuấy dung dịch CaCl2 trong

quá trình nhỏ giọt

 Tốc độ nhỏ giọt

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ của vi nang trong môi trường acid

Đánh giá khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của alginat và chitosan

trong môi trường acid HCl pH 1,2

2.2.3 Theo dõi độ ổn định của vi nang trong quá trình bảo quản

Theo dõi hàm ẩm và số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá

trình bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức trong bảng 2.4) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Hút 10,0ml MRS lỏng vào mỗi ống nghiệm, đậy kín ống nghiệm (ống thủy tinh, kích thước 1,5 x 20cm) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở nhiệt độ 115oC trong 20 phút Để nguội, cấy giống vào các ống nghiệm trên Ủ trong tủ ấm ở điều kiện 37o

Bảng 2.4: Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường MRS lỏng (MT1)

Glucose 20g Natri acetat 5g

Pepton 10g Kali dihydro phosphat 2g

Cao thịt 10g Magnesi sulfat heptadihydrat 0,2g

Cao nấm men 5g Mangan sulfat tetrahydrat 0,05g

Triamoni citrat 2g Nước máy Vừa đủ 1000ml

pH 6,8 ÷ 7,0

Môi trường MRS thạch (MT2)

MT2 = MT1 + Thạch agar (20g/1000ml môi trường MRS lỏng)

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Pha 100ml môi trường MRS lỏng theo công thức ở bảng 2.4 Hòa tan hết các thành phần, cho vào bình nón có dung tích thích hợp Nút bông kín và hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 115oC trong 20 phút bằng nối hấp tiệt khuẩn Để nguội, cấy 10,0ml giống vào bình nón Ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ [6]

2.3.3 Thu sinh khối tế bào

Dịch nuôi cấy tế bào trong bình nón trên, lắc đều cho đồng nhất Li tâm thu sinh khối với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút Rửa sinh khối 2 lần với dung dịch nước muối sinh lý bằng cách ly tâm như trên Dùng 10,0ml dung dịch pepton 0,1% để thu cắn sinh khối

2.3.4 Phương pháp bào chế vi nang

Quy mô bào chế mỗi mẻ 5 - 6g vi nang

 Chuẩn bị 100ml hỗn dịch chứa sinh khối tế bào

- Nghiền tinh bột, hấp tiệt khuẩn, sấy khô

- Cân alginat, glycerol, chitosan, calci clorid

- Ngâm alginat trong 90ml nước cho trương nở hoàn toàn

- Cân glycerol cho vào dung dịch alginat đã trương nở

- Hấp tiệt khuẩn hỗn hợp alginat và glycerol ở 115oC trong 20 phút

- Để nguội, cho tinh bột đã rây và cân, cắn tế bào trên cho vào bình nón

- Khuấy từ đến để tạo hỗn dịch đồng nhất (trong 1 giờ)

 Dung dịch chitosan - calci clorid:

Cân chitosan, hòa tan trong dung dịch có chứa 90ml nước và 0,4 ml acid acetic băng, khuấy đều cho chitosan hòa tan hoàn toàn Chỉnh pH trong khoảng 5,5 – 6 bằng dung dịch NaOH 0,1M Bổ sung nước đủ 100,0ml Lọc, loại cắn bằng giấy lọc Cân calci clorid, phối hợp vào dung dịch chitosan trên, khuấy đều Hấp tiệt trùng dung dịch trên ở 115oC trong 20 phút [13]

 Thực hiện trong tủ cấy vô trùng, nhỏ giọt hỗn dịch thu được vào dung dịch chitosan - calci clorid qua hệ thống bơm nhu động (đã được tiệt trùng bằng cồn 96o) với đầu kim cỡ 25G Tốc độ nhỏ khoảng 100 giọt/phút, khuấy nhẹ môi trường để tránh kết dính vi nang

 Ủ khoảng 30 phút

 Gạn, rửa vi nang 2 lần bằng nước muối NaCl 0,9% đã hấp tiệt khuẩn Cân chính xác 1,00g hạt ướt, đếm số lượng VSV (theo phương pháp ở mục 2.3.8)

 Đựng vi nang trong các đĩa petri, đậy kín bằng giấy nhôm

 Tiền đông trong tủ lạnh sâu -80oC cho đông rắn hoàn toàn

 Đông khô trong 24 giờ

2.3.5 Phương pháp đông khô

Chuẩn bị mẫu

Các mẫu vi nang đã được tiền đông trong tủ lạnh sâu -80oC cho tới khi mẫu đông rắn hoàn toàn

Tiến hành

Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu -80oC trong khoảng 8 giờ Sau

đó được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô, ở nhiệt độ -76o

C, áp suất 0,001mbar trong 24 giờ Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị Cân khối lượng hạt vi nang khô thu được Cân chính xác khoảng 1,00g hạt khô để đếm

số lượng tế bào VSV bao gói được Mẫu bảo quản trong túi polyme có khóa, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 8oC

2.3.6 Phương pháp đo hàm ẩm

Tiến hành trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus theo phương pháp mất khối lượng do làm khô vi nang với các thông số sau: Khối lượng mẫu 0,5 - 1g, gia nhiệt độ đến

105oC, thời gian đo từ 3 – 5 phút

2.3.7 Phương pháp theo dõi độ ổn định của vi nang

Mẫu vi nang nghiên cứu được bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu, nút cao su kín ở nhiệt độ phòng Sau thời gian: ban đầu, 1 tuần, 4 tuần, 20 tuần, đo hàm ẩm theo phương pháp nêu ở mục 2.3.6 và đếm số lượng VSV theo phương pháp nêu ở mục 2.3.8

2.3.8 Phương pháp xác định số lượng VSV

Sử dụng phương pháp pha loãng liên tục

 Chuẩn bị môi trường

Chuẩn bị môi trường MRS thạch như trong mục 2.3.1 Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 115oC trong 20 phút Phân phối thạch đều lên các đĩa petri đã hấp tiệt khuẩn, sao cho thạch phủ kín bề mặt Bề dày lớp thạch trên đĩa khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại

Chuẩn bị các ống nghiệm, hút 9,0ml dung dịch pepton 0,1% (kl/tt) vào mỗi ống, đậy kín Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 0,6 atm trong 20 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 37 - 40o

C

Chuẩn bị mẫu nguyên liệu vi nang:

Mẫu vi nang sau đông khô: Đong 100,0ml dung dịch natri citrat 0,1M vào

bình nón, hấp tiệt khuẩn, để nguội Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang đông khô vào bình nón Khuấy từ với tốc độ 500 rpm trong khoảng 15 phút đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất [13]

Mẫu vi nang trước đông khô: Sau khi tạo hạt, rửa 2 lần với dung dịch nước

muối NaCl 0,9%, gạn vi nang trên rây, để ráo nước, dùng giấy thấm khô bề mặt, cân chính xác 1,00g vi nang, tiến hành như đối với vi nang sau đông khô

tủ ấm CO2 5%, ở nhiệt độ 37oC, sau 48 giờ đọc kết quả Chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300 Số lượng vi sinh vật có trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức [6]:

X: là số lượng vi sinh vật có trong 1g (hoặc 1ml) mẫu

An-1, An, An+1: là số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có nồng độ pha loãng tương ứng 10n-1

, 10n, 10n+1 m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng

2.3.9 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ L acidophilus trong môi trường acid

Chuẩn bị mẫu thử: Đong 100,0ml dung dịch nước muối sinh lí (NaCl 0,9%)

được điều chỉnh pH đến 1,2 bằng acid HCl 6M vào bình nón sau đó hấp tiệt khuẩn,

để nguội Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang đã đông khô vào bình nón trên Ủ bình nón trong tủ ấm ở nhiệt độ 37o

C, 5% CO2 trong 1h Gạn bỏ dung dịch acid, rửa

vi nang 2 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt khuẩn Đong 100,0ml dung dịch natri citrat 0,1M đã hấp tiệt khuẩn, để nguội vào bình nón Khuấy từ với tốc độ 500 rpm trong khoảng 15 phút đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất Tiến hành và đọc kết quả tương tự như mục 2.3.8

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố công thức đến vi nang bào chế được

Tiến hành bào chế các công thức trong bảng 3.1 theo quy trình đã được nêu ở mục 2.3.4 Quá trình bào chế cố định một số thông số sau:

- Cỡ kim là 25G có đường kính trong khoảng 0,26 ± 0,019 mm [50]

- Thời gian khuấy duy trì ở 1h, để có thể tạo ra hỗn dịch đồng nhất

- Nhiệt độ tạo vi nang duy trì khoảng 25o - 30oC

- Chiều cao từ đầu kim đến bề mặt dung dịch CaCl2 duy trì ở 6 -10 cm

- Tốc độ nhỏ giọt từ 80 - 100 giọt/phút

- Môi trường chitosan - calci clorid duy trì khuấy nhẹ ở bằng máy khuấy từ Wisd (khoảng 200 vòng/phút)

- Thời gian ủ vi nang cố định là 30 phút

Bảng 3.1: Công thức bào chế vi nang alginat và chitosan

Tỷ lệ tinh bột

Nồng độ glycerol

Nồng độ calci clorid

Nồng độ chitosan