Nghiên cứu bào chế hệ tự vi nhũ hóa chứa rotundin

ĐẶT VẤN ĐỀSinh khả dụng của thuốc là một thông số quan trọng trong việc đánh giá một dạng bào chế. Đối với các thuốc dùng đường uống, sinh khả dụng của một thuốc thấp có thể do thuốc có vấn đề về độ tan hay khả năng thấm.Để cải thiện hai vấn đềnày, một số biện pháp có thể áp dụng như: giảm kích thước tiểu phân, hệ phân tán rắn, hệ tự nhũ hóa2, 11, 20. Trong các giải pháp này, hệ tự vi nhũ hóa đã chứng minh được hiệu quả cải thiện sinh khả dụng cho các thuốc khó tan trong nước, có tính thân dầu cao ví dụ như cyclosporin A, simvastatin14, 32. Ưu điểm của hệ tự vi nhũ hóa là dược chất đã được hòa tan trong lipid, khi gặp môi trường tiêu hóa sẽ tự nhũ hóa tạo ra vi nhũ tương cókích thước cỡ nanomet, làm tăng diện tích tiếp xúc của thuốc với biểu mô đường tiêu hóa29. Bên cạnh đó, các thành phần lipid trong hệ cũng đã được chứng minh có khả năng làm tăng hấp thu các thuốc đường uống19.Củ bình vôi đã được dân gian sử dụng từ lâu trong điều trị mất ngủ, ho hen hay đau bụng. Đến năm 1941, Bonnet và Bùi Đình Sang đã chiết được hoạt chất trong củ bình vôi, đặt tên là rotundin(RTD)4. Đây là một alkaloid có tính bazơ, không tan trong nước và độ tan phụ thuộc vào pH môi trường6. Khi dùng theo đường uống, RTD có thểtan ở dạ dày với pH 1,2 nhưng khi xuống ruột pH đường tiêu hóa tăng dần, nguy cơ RTD có thể bị tủa lại, làm giảm hấp thu. Với mục đích tìm hướng khắc phục khả năng hòa tan kém của RTD nhằm cải thiện sinh khả dụng, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu bào chế hệ tự vi nhũ hóa chứa rotundin” với mục tiêu sau: Nghiên cứu bào chế và đánh giá hệ tự vi nhũ hóa chứa rotundinnhằm cải thiện độ tan và sinh khả dụng cho rotundin.

BÙI THỊ BÍCH HƯỜNG

ỨU BÀO CHẾ HỆ TỰ HÓA CHỨA ROTUNDIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thạch Tùng, người thầy

đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Cao Sơn (Viện vệ sinh an toàn thực

phẩm Quốc gia) đã giúp đỡ tôi trong suốt quá đánh giásinh khả dụng của thuốc

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệđã hỗ trợ nguyên

liệu để tôi thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn Công ty Gattefossé đã cung cấp tá dược để tôi thực hiện đề

tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên thuộc bộ môn Bào chếđã có những giúp đỡ quý báu trong quá trình tôi học tập và thực nghiệm tại bộ môn Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược lực vàViện công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành được khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, phòng đào tạo và các phòng ban liên quan trong nhà trường đã có nhiều giúp đỡ thiết thực về cơ sở vật chất, trang thiết bị và hóa chất thí nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người

đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt năm năm qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Bùi Thị Bích Hường

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về rotundin 2

1.1.1 Công thức phân tử 2

1.1.2.Tính chất lí hóa 2

1.1.3.Tác dụng dược lí 3

1.1.4.Một số chế phẩm chứa rotundin và chỉ định 3

1.2.Tổng quan về các hệ mang thuốc đường uống sử dụng lipid(lipid based formulations -LBf) 4

1.2.1.Hệ thống phân loại 4

1.2.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới việc lựa chọn tá dược cho LBf 6

1.3.Tổng quan về hệ tự vi nhũ hóa( Self-microemulsifying drug delivery system – SMEDDS) 8

1.3.1.Khái niệm 8

1.3.2.Ưu điểm 8

1.3.3.Nhược điểm 9

1.3.4.Thành phần của hệ 10

1.3.5.Một số nghiên cứu về hệ tự vi nhũ hóa 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1.Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.2.2 Thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.Phương pháp bào chế 16

2.3.1 Xác định độ tan bão hòa 16

2.3.2.Lập giản đồ pha 16

2.3.3.Xác định lượng dược chất nạp vào hệ 17

2.3.4 Bào chế hệ tự vi nhũ hóa 17

2.3.5.Thiết kế thí nghiệm bằng quy hoạch thực nghiệm 17

2.4 Phương pháp đánh giá 18

2.4.1 Phương pháp định lượng 18

2.4.2.Các phương pháp đánh giá vi nhũ tương 19

2.4.3 Đánh giá hiệu quả hòa tan rotundin của hệ tự vi nhũ hóa 19

2.4.4 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng trên thỏ 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1.Kết quả xây dựng phương pháp định lượng rotundin 23

3.1.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp đo quang 23

3.1.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp HPLC 24

3.1.3.Kết quả xây dựng phương pháp định lượng RTD bằng LC-MS/MS 24

3.2 Kết quả độ tan bão hòa của rotundin trong một số tá dược 26

3.3.Kết quả xây dựng giản đồ pha 27

3.4 Kết quả thí nghiệm lựa chọn lượng dược chất nạp vào hệ 29

3.4.1.Kết quả thử sơ bộ khả năng nạp dược chất của hệ 29

3.4.2.Kết quả đánh giá ảnh hưởng của lượng dược chất tới KTTP và PDI 30

3.5.Thiết kế thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm 31

3.5.1 Biến đầu vào 31

3.5.2.Biến đầu ra và tiêu chí đánh giá 31

3.5.3.Kết quả thiết kế thí nghiệm 32

3.6.Kết quả đánh giá một số đặc tính của hệ tự nhũ hóa 34

3.6.1 Kết quả đánh giá KTTP, PDI của vi nhũ tương tạo thành 35

3.6.2 Kết quả đánh giá khả năng tự vi nhũ hóa của hệ 35

3.6.3 Kết quả thí nghiệm so sánh khả năng cải thiện hòa tan của hệ tự vi nhũ hóa với nguyên liệu 36

3.6.4.Kết quả đánh giá sinh khả dụng trên thỏ 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

European Pharmacopoiea – Dược điển Châu Âu EP

U.S Food and Drug Administration – Cục quản lý thực phẩm và

Self-microemulsifying drug deliverysystems – hệ tự vi nhũ hóa SMEDDS

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ thống phân loại LBf của C.W.Pouton 4 Bảng 1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến lựa chọn tá dược cho FBf 6 Bảng 1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cấu trúc triglyceride dùng trong hệ

TVNH tới các thông số dược động học 13

Bảng 2.1.Nguyên liệu được sử dụng trong quá trình thực nghiệm 15 Bảng 3.1 Kết quả thẩm định độ lặp lại và thu hồi của phương pháp định lượng

RTD trong máu thỏ 25

Bảng 3.2 Độ tan bão hòa của rotundin trong một số tá dược 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của lượng RTD tới cảm quan của vi nhũ tương ngay sau bào

chế và sau 3 ngày bảo quản ở điều kiện thường 29

Bảng 3.4.Kết quả KTTP, PDI của các công thức với lượng RTD nạp vào khác nhau 30 Bảng 3.5.Giá trị các biến đầu vào trong mô hình thiết kế thí nghiệm 31 Bảng 3.6 Các biến đầu ra và tiêu chí đánh giá 31 Bảng 3.7.Kết quả mô hình thiết kế thí nghiệm với 3 biến đầu ra 32 Bảng 3.8.Bảng kết quả KTTP, PDI của vi nhũ tương tạo thành tại các thời điểm 35 Bảng 3.9 Kết quả phần trăm rotundin giải phóng tại các thời điểm 36 Bảng 3.10.Thông số dược động học của mẫu nguyên liệu và mẫu TVNH 38 Bảng PL.2.1.Các ion phân tử và ion con trong phân tích khối phổ

BảngPL.2.2 Các thông số kỹ thuật của MS

Bảng PL.3.1.Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn định

lượng RTD trong máu thỏ

Bảng PL.4.1.% RTD hòa tan tại các thời điểm của CT 7-11 trong thiết kế thí

nghiệm

Bảng PL.4.2.% RTD hòa tan tại cácthời điểm của CT 1-6 trong thiết kế thí

nghiệm

Bảng PL.5.1.Nồng độ RTD trong máu thỏ tại các thời điểm

Bảng PL.5.2.Nồng độ RTD trung bình trong máu thỏ và SD tại các thời điểm

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo phân tử rotundin 2 Hình 3.1.Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và CRTD trong methanol 23

Hình3.2.Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ rotundin 24 Hình 3.3.Giản đồ pha ở các tỉ lệ Smix 28 Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hường của khối lượng dầu (moil) và khối lượng Smix( mSmix) đến KTTP của vi nhũ tương tạo thành 33

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của khối lượng dầu và khối lượng Smix đến

PDI của vi nhũ tương tạo thành 33

Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của khối lượng dầu và khối lượng Smix đến

hiệu quả hòa tan RTD của hệ tự vi nhũ hóa 34

Hình 3.7.Đồ thị biểu diễn % rotundin giải phóng theo thời gian với mẫu nguyên

liệu và mẫu TVNH (SMEDDS) khi thay đổi pH môi trường từ 1,2 sang 6,8 37

Hình 3.8.Nồng độ rotundin trong huyết tương thỏ của mẫu nguyên liệu, mẫu TVNH 39 HìnhPL.3.1.Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ rotundin

trong dung môi pH 1,2

HìnhPL.3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn trong định lượng RTD bằng HPLC

HìnhPL.3.3.Sắc ký đồ mẫu thử hòa tan hệ tự vi nhũ hóa(HPLC)

Hình PL.3.4 Pic sắc ký dung dịch berberin chuẩn 50ng/ml trong methanol

Hình PL3.5 Pic sắc ký dung dịch rotundin chuẩn 50ng/ml trong methanol

HìnhPL.3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa SpicRTD/SpicIS và nồng độ RTD

Hình PL.3.7 A, B, C, D, E lần lượt là sắc ký đồ của huyết tương trắng, huyết

tương trắng thêm chuẩn rotundin 50ppb, huyết tương trắng thêm nội chuẩn berberin 50ppb, mẫu chuẩn rotundin/MeOH 50ppb và mẫu chuẩn berberin/MeOH 50ppb

HìnhPL.3.8 Kết quả đánh giá KTTP, PDI của hệ TVNH tối ưu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh khả dụng của thuốc là một thông số quan trọng trong việc đánh giá một dạng bào chế Đối với các thuốc dùng đường uống, sinh khả dụng của một thuốc thấp có thể do thuốc có vấn đề về độ tan hay khả năng thấm.Để cải thiện hai vấn đề này, một số biện pháp có thể áp dụng như: giảm kích thước tiểu phân, hệ phân tán rắn, hệ tự nhũ hóa[2], [11], [20] Trong các giải pháp này, hệ tự vi nhũ hóa đã chứng minh được hiệu quả cải thiện sinh khả dụng cho các thuốc khó tan trong nước, có tính thân dầu cao ví dụ như cyclosporin A, simvastatin[14], [32] Ưu điểm của hệ tự vi nhũ hóa là dược chất đã được hòa tan trong lipid, khi gặp môi trường tiêu hóa sẽ tự nhũ hóa tạo ra vi nhũ tương cókích thước cỡ nanomet, làm tăng diện tích tiếp xúc của thuốc với biểu mô đường tiêu hóa[29] Bên cạnh đó, các thành phần lipid trong hệ cũng đã được chứng minh có khả năng làm tăng hấp thu các thuốc đường uống[19]

Củ bình vôi đã được dân gian sử dụng từ lâu trong điều trị mất ngủ, ho hen hay đau bụng Đến năm 1941, Bonnet và Bùi Đình Sang đã chiết được hoạt chất trong củ bình vôi, đặt tên là rotundin(RTD)[4] Đây là một alkaloid có tính bazơ, không tan trong nước và độ tan phụ thuộc vào pH môi trường[6] Khi dùng theo đường uống, RTD có thểtan ở dạ dày với pH 1,2 nhưng khi xuống ruột pH đường tiêu hóa tăng dần, nguy cơ RTD có thể bị tủa lại, làm giảm hấp thu Với mục đích tìm hướng khắc phục khả năng hòa tan kém của RTD nhằm cải thiện sinh khả dụng,

chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu bào chế hệ tự vi nhũ hóa chứa rotundin”

với mục tiêu sau:

Nghiên cứu bào chế và đánh giá hệ tự vi nhũ hóa chứa rotundinnhằm cải thiện độ tan và sinh khả dụng cho rotundin

Hình 1.1.Công thức cấu tạo phân tử rotundin

- Tên khoa học:

5,8,13,13a - tetrahydro - 2,3,9,10 -tetramethoxy -6H - dibenzo[a,g]quinolizin

- Tên khác: gindarin, caseanin, hyndarin

- Phổ hồng ngoại (IR) đặc trưng[6]

Tính chất hóa học:

- l-tetrahydropalmatin mang đặc trưng hóa tính của N bậc 3: phản ứng với thuốc thử chung của alkaloid, tạo muối với các acid vô cơ

- Mạch kép: oxy hóa l-tetrahydropalmatin (màu trắng) bằng iod sẽtạo thành palmatin có màu vàng [6]

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ởmức độphân tử, RTD có ái lực gắn cao với receptor α1A và α2A adrenergic, receptor D1, D2 và D3của dopamin, receptor 5-HT1A, 5-HT1D, 5-HT4 và 5-HT7 của serotonin[16] Tác dụng an thần của RTD được cho rằng có thểdo hoạt động đối kháng của nó trên receptor D1, D2 và D3 Tác dụng giảm đau của RTD được chứng minh cũng có liên quan tới tác dụng ức chế receptor dopamin D2 RTD đối kháng tác dụng hoạt hóa các receptor serotonin, noradrenalin và dopamin của cocain[16], [34]

Trong nghiên cứu, Hong Xue và cộng sự đã phát hiện:RTD ởcác mức liều từ0,1 mg/kg đến 2,5 mg/kg tính theo trọng lượng chuột thểhiện tác dụng giải lo âu

rõ rệt Tác dụng an thần xuất hiện ở mức liều cao (5 mg/kg), đồng thời cơ chế tác dụng có thể liên quan đến khảnăng RTD là những chất chủvận tại vị trí gắn benzodiazepin trên receptor GABA [33]

1.1.4.Một số chế phẩm chứa rotundin và chỉ định

a.Một số chế phẩm chứa rotundin

- Dạng viên nén: Rotundin TW3 (Foripharm), Rotunda (Dopharma), Stilux 60

(Traphaco), Rotundin 30 (Saokimpharma)

- Dạng thuốc tiêm: Ống tiêm rotundin sulfat 60mg/2ml (Phabaco)

b.Chỉ định

 Điều trị chứng lo âu mất ngủ

 Điều trị giảm đau như: đau nhức đầu, đau dây thần kinh

 Hỗ trợ điều trị cai nghiện

1.2.Tổng quan về các hệ mang thuốc đường uống sử dụng lipid(lipid based formulations -LBf)

1.2.1.Hệ thống phân loại

LBf làhệ lỏng đồng nhất có thể có một hay nhiều thành phầnsau: dầu, chất diện hoạt hay đồng dung môi.Hệ thống phân loại các hệ mang thuốc đường uống sử dụng lipid(LBf) đã được C.W.Pouton xây dựng mô hình từ năm 2000 và được bổ sung năm 2006 LBfđược chia ra 4 nhóm dựa trên tiêu chí vềthành phần tá dược trong công thức[20], [23]

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại LBf của C.W.Pouton

(VD:

tri-, di-/monoglycerid)

Không phân tán

Đơn giản

Dễ dàng đóng nang

Khả năng hòa tan kém trừ

DC thân dầu

Chất diện hoạt không

tan trong nước

Hệ tự nhũ hóa

Không mất khả năng hòa tan khi phân tán

Tạo nhũ tương đục có KTTP 0,25-2μm III Dầu

Phân tán tốt, thuốc được hấp thu tốt

Có thể bị tủa

DC khi pha loãng

IV Chất diện hoạt tan

trong nước

Đồng dung môi

Phân tán thường tạo thành các micelle

Khả năng hòa tan nhiều DC

Mất khả năng hòa tan DC khi phân tán

a Nhóm I

Côngthức nhóm I có bản chất là dung dịch DC trong dung môi lipid Các lipid được sử dụng thường là các dầu thực vật, bởi chúng an toàn cho đường uống, được tiêu hóa nhanh và hấp thu hoàn toàn trong ruột Thành phần của công thức nhóm I chỉ có các lipid đơn thuần mà không có chất diện hoạt hay đồng dung môi,do đó các LBf nhóm I chỉ có khả năng hòa tan DC rất thân dầu Mặc dùđôi khi

DC trong công thức nhómI cũng bị tủa lại trong đường tiêu hóa nhưng khi lựa chọn được các lipd hòa tan tốt DC thì công thức nhóm I vẫn là một lựa chọn tốt So với nhóm II/III công thức nhóm I có ưu điểm hơn về độ an toàn và độ ổn định.Sinh khả dụng của nhóm có thể tương đương với các công thức nhóm II và III [23]

b.Nhóm II

Nhóm II là các công thức chứa dầu và các chất diện hoạt không tan trong nước Công thức điển hình là hỗn hợp của triglyceridee mạch trung bình và Span 85[22]hay hỗn hợp của triglyceride mạch trung bình và polyoxyethylene-(25)-glyceryl trioleate (Tagat TO)[21] Các công thức nhóm II có khả năng tự nhũ hóa

tạo nhũ tươngcó kích thước tiểu phân từ 0,25-2μm Thử nghiệm in vivo của một

công thức nhóm II là hệ tự nhũ hóa chứa WIN 54954 – một dẫn chất của methylisoxazol[9]đã được tiến hành trên chó và được công bố năm 1992 tuy nhiêntừ đó đến nay không có chế phẩm nào của các công thức nhóm II có mặt trên thị trường Một trong những lí do có thể là những chất diện hoạt có hiệu quả cho công thức nhóm II không có trong danh mục các tá dược cho phép của FDA[23]

c.Nhóm III

Nhóm III là nhóm có chứa nhiều thành phần nhất trong hệ thông phân loại của LBf Trong công thức nhóm III gồm có: dầu, chất diện hoạt (tan/không tan trong nước) và đồng dung môi

Nhóm III có khả năng tự nhũ hóa hay tựvi nhũ hóa Trong công thức nhóm IIIcó tỉ lệ lớn chất diện hoạt do đó chúng có khả năng phân tán tốt trong nước tạo ra nhũ tương với kích thước từ 50-250nm[20] và chúng có thể được hấp thu mà không cần quá trình phân giải, tiêu hóa thành phần lipid của hệ trong đường ruột Trên thị

trường, chế phẩm Sandimmune Neoral là hệ TVNH được ghi nhận tăng sinh khả dụng của cyclosporine A đến 239% so với chế phẩm Sandimmune trước đó[32] Đây là dấu mốc cho việc thay đổi định hướng trong việc xây dựng công thức với những DC khó tan trong nước và cũng mở đường cho việc xây dựng hệ thống LBf[12], [17] Khả năng cải thiện hấp thu thuốc qua đường uống của hệ TVNH được giải thích dựa trên tác dụng của thành phần có trong hệ là chất diện hoạt, dầu

IV là thành phần chứa một lượng rất lớn chất diện hoạt có thể gây kích ứng đường tiêu hóa, thêm vào đó hầu như các chất diện hoạt đều khó được phân giải để tiêu hóa trong ruột[23]

1.2.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới việc lựa chọn tá dược cho LBf

Khi xây dựng công thức LBf cho một DC cụ thể thì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến việc lựa chọn tá dược Dưới đây là một số yếu tố ảnh hưởng đến việc lựa chọn tá dược cho LBf do C.W Pouton đưa ra[23]

Bảng 1.2.Một số yếu tố ảnh hưởng đến lựa chọn tá dược cho LBf

STT Yếu tố ảnh hưởng đến lựa chọn tá dược cho LBf

1 Khả năng hòa tan DC

2 Độc tính, khả năng gây kích ứng

3 Khả năng trộn lẫn

4 Thể chất ở nhiệt độ phòng

5 Khả năng tự phân tán

6 Khả năng được tiêu hóa trong cơ thể

7 Độ tinh khiết, độ ổn định hóa học

8 Giá thành

Trong nhữngyếu tố ảnh hưởng thì khả năng hòa tan DC của tá dược là một yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn cho công thức tối ưu Khi xây dựng công thức cho một dược chất cụ thể cần lựa chọn được tá dược có khả năng hòa tan tốt DC.Trong nhóm tá dược tướng dầu, triglyceride không phải là một dung môi lí tưởng, chúng chỉ có khả năng hòa tan tốt các dược chất thân dầu Vì vậy, trong hầu hết các LBf đều có thêm đồng dung môi Trong nghiên cứu, C.W.Pouton và cộng sự

đã chỉ ra rằng, độ tan DC trong hỗn hợp tá dượccó thể bằng với tổng độ tan DC trong từng thành phần và khả năng hòa tan DC thuộc vào tỉ lệ các thành phần trong hỗn hợp Khả năng hòa tan DC của đồng dung môi sẽ giảm đáng kể khi bị pha loãng bởi nước Do đó, lựa chọn đồng dung môi và tỉ lệ đồng dung môi sử dụng cần được cân nhắc để cân bằng giữa khả năng hòa tan dượcchất và khả năng dược chất

bị tủa lại khi pha loãng với nước[20]

Trong công thức LBf có thể có nhiều thành phần tá dược lỏng khác nhau, do

đó các tá dược có khả năng trộn lẫn tốt với nhau là điều cần thiết để bào chế được một công thức đồng nhất và ổn định Các tướng dầu là triglyceride mạch dàikhó trộn lẫn với các chất diện hoạt hòa tan trong nước và các đồng dung môi Trong các công thức nhóm III thường sử dụng thêm các dầu có cực (polar oil) hay chất đồng diện hoạt để cải thiện khả năng trộn lẫn của hỗn hợp Đối với các công thức nhóm II

số lượng tá dược sử dụng thường chỉ là 2, do chất diện hoạt không hòa tan trong nước dễ dàng trộn lẫn với các triglyceridee mạch dàivàtriglyceridee mạch trung bình Thể chất của các tá dược sử dụng tại điều kiện thường là một yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trộn lẫn của chúng Một số tá dược lipd sử dụng ở thể rắn hay bán rắn trong điều kiện thường nên trước và trong quá trình bào chế hệ, cần gia nhiệt để tá dược trộn lẫn tốt trong hệ Và với những công thức có sử dụng tá dược rắn hay bán rắn thì cần phải theo dõi độ ổn định vật lí của hệ hàng ngày trong quá trình phát triển công thức[23]

Một yếu tốcũng ảnh hưởng quan trọng đến lựa chọn tá dược cho công thức

đó là độc tính của tá dược Nhóm tá dược cần được xem xét kỹ về mức độ an toàn, độc tính là nhóm chất diện hoạt do các chất diện hoạt có khả năng gây kích ứng khi

sử dụng Các tài liệu nghiên cứu đã chỉ ra rằng: tất cả các chất diện hoạt có khả năng kích ứng với hệ thống sinh học và mức độ kích ứng khác nhau đối với các chất diện hoạt Với hai nhóm chất diện hoạt: ion hóa và không ion hóa thì nhóm chất diện hoạt không ion hóa ít độc tính hơn Trong nhóm chất diện hoạt ion hóa, các chất diện hoạt anion ít độc hơn các chất diện hoạtcation Do vậy, trong LBf thông thường chỉ sử dụng các chất diện hoạt không ion hóa Giá trị LD50 hầu hết các chất diện hoạt nhóm không ion hóa đều lớn hơn 50 g/kg với đường uống và lớn hơn 5 g/kg với đường tiêm tĩnh mạch[8], [24].Tuy nhiên trong thực tế sản xuất, cần thận trọng trong việc lựa chọn chất diện hoạt trong công thức và thường các nhàsản xuất hay lựa chọn các chất diện hoạt đã được sử dụng trong các dạng bào chế đã lưu hành trên thị trường[23]

Một nhược điểm của các tá dược dầu là kém ổn định hóa học dễ bị ôi khét nênkhi lựa chọn tá dược dầu nên lựa chọn các chất ít bị oxy hóa Cần thực hiện bước tiền công thức để sàng lọc tá dượcvà cần quan tâm đến độ ổn định của DC trong pha dầu[23]

1.3 Tổng quan về hệ tự vi nhũ hóa(Self-microemulsifying drug delivery system – SMEDDS)

1.3.1.Khái niệm

Hệ tự vi nhũ hóa (TVNH) là một hỗn hợp chứa các thành phần: dược chất, dầu, chất diện hoạt, đồng dung môi.Hệ TVNH là hệ lỏng, thường được đóng vào nang mềm hay nang cứng để phân liều Hệ có đặc điểm khi được pha loãng với nước dưới sự khuấy trộn nhẹ nhàng sẽ tự nhũ hóa tạo ra vi nhũ tương[11], [18], [23]

1.3.2.Ưu điểm

Với các thành phần có trong công thức bào chế TVNH, khi bị pha loãng bởi dịch tiêu hóa sẽ tự phân tán tạo ra vi nhũ tương Hệ TVNH có các ưu điểm sau đây:

- Độ ổn định của chế phẩm tốt hơn dạng nhũ tương Nhũ tương có thểkhông

ổn định sau một khoảng thời gian bảo quản, tạo ra các kích thước giọt dạng

marco Khác với nhũ tương, hệ TVNH không có pha nước, do đó, hệ ổn định hơn trong một thời gian bảo quản dài[31]

- Hấp thu thuốc từ hệ TVNH ít bị ảnh hưởng của thức ăn.Trong nghiên cứu của Woo và cộng sự đã chỉ ra rằng, thức ăn có ảnh hưởng tới việc hấp thu của dược chất itraconazole với các chế phẩm trên thị trường nhưng lại ít có ảnh hưởng đối với hệ tự nhũ hóa chứa itraconazole (viên nang mềm ITRA-GSMP) trên các tình nguyện viên[28]

- Hệ TVNH có khả năng giúp cho thuốc được hấp thu nhanh hơn sau khi uống Kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng: khi sử dụng viên nang mềm TVNH chứa simvastatin thì thời gian nồng độ thuốc đạt cực đại tmax giảmxuống đáng kể [14]

- Hệ TVNH giúp cải thiện sinh khả dụng của thuốc Các dược chất khó tan trong nước, có tính thân dầu có thể cải thiện được sinh khả dụng khi được bào chế dạng tự vi nhũ hóa[19], [23].Trên thị trường, chế phẩm Sandimmune Neoral là hệ TVNH được ghi nhận tăng sinh khả dụng của cyclosporine A đến 239% so với chế phẩm Sandimmune trước đó[32]

- Dễ dàng nâng quy mô sản xuất Hệ TVNH có thể dễ dàng sản xuất ở quy

mô lớn với yêu cầu thiết bị đơn giản: để bào chế hệ chỉ cần máy trộn đơn giản với cánh khuấy và thiết bị đóng nang[11]

1.3.3.Nhược điểm

Bên cạnh những ưu điểm có được, hệ TVNH cũng có những nhược điểm sau:

- Dược chất có thể bị tủa lại khi hệ TVNHbị pha loãng bởi dịch tiêu hóa

Xu hướng dược chất bị tủa lại khi pha loãng sẽ tăng lên nếu dịch pha loãng là các dung môi thân nước Việc tủa lại dược chất sẽ mất đi những

ưu điểm của hệ TVNH về hấp thu dược chất[19], [23]

- Bảo quản hệ TVNH lỏng trong một thời gian dài có thể gặp vấn đề về độ

ổn định vật lí như: tá dược phân lớp do không trộn lẫn[23] Để giải quyết

vấn đề này, hệ TVNH lỏng được hấp thụ vào chất mang để bào chế dạng

lực học (in vitrodynamic lipolysis model)[10] Tuy nhiên, chưa có phương pháp nào được công nhận là phương pháp chuẩn để đánh giá in vitro cho

hệTVNH[23]

- Các lipid sử dụng trong công thức có thể bị oxy hóa, vì thế để đảm bảo độ

ổn định nên có thêm chất chống oxy hóa tan trong dầu ở trong công thức[11], [23]

1.3.4.Thành phần của hệ

a.Dược chất

Các DC trong hệTVNH thường là các DC ít hay khó tan trong nước DC này được hòa tan trong thành phần lipid của hệ nhằm mục đích cải thiện hấp thu DC qua đường uống từ đó giúp cải thiện sinh khả dụng của thuốc[20]

b.Dầu

Dầu là một thành phần tá dược quan trọng nhất trong công thức TVNH bởi dầu không chỉ là thành phần giúp hòa tan DC khó tan trong nước hay thuận lợi cho việc tự nhũ hóa mà dầu còn có vai trò quan trọng trong việc làm tăng hấp thu thuốc qua đường uống Chúng có khả năng giúp cải thiện hấp thu thuốc qua biểu mô đường ruột theo hai cơ chế Thứ nhất, sự có mặt của tướng dầu trong hệ làm thay đổi quá trình ly giải và hấp thu thuốc trong ruột, tạo ra các micell, micell hỗn hợp hay hệ mang thuốc (vesicles) giúp thuốc được hấp thu tốt hơn Thứ 2, tướng dầu có tác động tới các tế bào hấp thu ruột(enterocyte) từ đó làm thay đổi quá trình vận chuyển thuốc[19] Dầu được sử dụng trong hệTVNH có thể chia ra làm 2 loại: dầu thực vật và dầu bán tổng hợp.Tá dược dầu hay được sử dụng trong các TVNH là

dầu bán tổng hợp bởi chúng ít bị oxi hóa hơn và khả năng hòa tan tốt nhiều dược chất Ngoài ra, với các trigliceride thì khả năng hòa tan dược chất còn phụ thuộc vào độ dài mạch cacbon trong phân tử Các trglyceride mạch trung bình có khả năng hòa tan tốt hơn, chính vì lí do đó mà chúng thường được sử dụng trong công thức hệ tự nhũ hóa[11] Tuy nhiênkhi sử dụng cáctriglyceride mạch dài có ưu điểm: thuốc sẽ được vận chuyển qua hệ bạch huyết rồi đi vào vòng tuần hoàn chung mà không qua gan, tránh bị chuyển hóa bước 1 Và đó cũng là một cơ chế giúp cải thiện sinh khả dụng của hệ TVNH[15], [19]

b.Chất diện hoạt

Chất diện hoạt thường sử dụng trong hệ TVNH là các chất diện hoạt tan được trong nước Chất diện hoạt tạo lớp màng bao quanh pha dầu làm giảm sức căng bề mặt giúp cho quá trình tự nhũ hóa diễn ra[23] Khi lựa chọn chất diện hoạt cho công thức cần quan tâm đến giá trị HLB và nồng độ chất diện hoạt sẽ sử dụng Để hệ TVNH có khả năng tự nhũ hóa tốt, giá trị HLB của chất diện hoạt nên lớn hơn 12 Các nhóm chất diện hoạt không ion hóa thường được sử dụng cho TVNH bởi chúng

ít độc hơn[11]

c.Đồng dung môi

Các chất hay được sử dụng làm đồng dung môi trong các chế phẩm hệ TVNH trên thị trường như: PEG 400, ethanol, glyceryl và propylen glycol Đồng dung môi là chất có khả năng hòa tan tốt DC, có mặt trong công thức với các mục đích: làm tăng khả năng hòa tan dược chất của TVNH, làm tăng khả năng phân tán của hệkhi trong hệ chứa một lượng lớn chất diện hoạt tan trong nước Tuy nhiên, khả năng hòa tan dược chất của chất đồng diện hoạt giảm đi khi pha loãng với nước,

đó cũng là yếu tố dẫn đến dược chất trong hệ có thể bị tủa lại Do đó khi sử dụng đồng dung môi trong hệ nên sử dụng ở nồng độ thấp Ngoài ra, khi lựa chọn đồng dung môi cũng cần phải quan tâm khả năng trộn lẫn của chúng với các thành phần khác trong hệ và khả năng tương tác với vỏ nang thuốc[23]

d.Các chất khác

Ngoài các thành phần chính của TVNH là dầu, chất diện hoạt và đồng dung môi, hệ còn có thể có thêm thành phần chất chống oxi hóa nhằm hạn chế khả năng

bị oxi hóa của thành phần lipid chưa bão hòa hay dược chất dễ bị oxi hóa Nhóm chất được sử dụng là các chất chống oxi hóa tan trong dầu như α-tocopherol,β-carotene, butylated hydroxytoluene(BHT), butylated hydroxyanisole(BHA) hay propyl gallate[23]

1.3.5 Một số nghiên cứu về hệ tự vi nhũ hóa

Từ lâu, trên thế giới đã nghiên cứu nhiều về hệ TVNH, nhiều công thức bào chế hệ tự nhũ hóa đã được xây dựng với các dược chất khác nhau Các nghiên cứu không chỉ dừng lại ở việc bào chế và đánh giá hệ TVNH mà còn đi sâu vào tìm hiểu yếu tố ảnh hưởng hấp thu thuốc từ hệ vi nhũ hóa Dưới đây là tổng hợp ngắn gọn về phương pháp và kết quả của một số nghiên cứu

Năm 2004, Kang Bok Gi và cộng sự đã tiến hành bào chế hệ TVNH chứa simvastatin Simvastatin thuộc nhóm điều trị lipid máu, khó tan trong nước và kém hấp thu trong đường tiêu hóa Nghiên cứu sàng lọc lựa chọn tá dược thông qua xác định độ tan bão hòa của DC trong tá dược, tiến hành lập giản đồ pha lựa chọn tỉ lệ

các thành phần của hệ, đánh giá thử nghiệm in vivo trên chó Kết quả bào chế hệ

TVNH tối ưu(A) có thành phần 300mg simvastatin;1,6g dầu Capryol 90; 1,2g chất

diện hoạt Cremophor EL; 1,2g đồng dung môi Carbitol Kết quả thử nghiệm in vivo

đối chiếu với viên nén Zocor® 20mg cho thấy sinh khả dụng tương đối của hệ TVNH chứa simvastatin so với viên nén đối chiếu là 158,9% Cmax của hệ TVNH là 35,35±8,22 ng/ml trong khi đó Cmax củaviên nén chỉ đạt 18,19±7,01 ng/ml Tmax hệ giảm xuống còn 1,54±0,3 giờ trong khi với viên nén là 2,81±0,56 giờ Trong nghiên cứu cũng đánh giá sinh khả dụng của công thức TVNH chứa simvastatin có % nạp

DC gấp đôi hệ tối ưu(B) KTTP của công thức TVNHtối ưu là 33 nm và công thức

B là 150nm Kết quả cho thấy hệ TVNH có KTTP 33nm (A)cho kết quả sinh khả dụng tương đối (RB) cao hơn, RB công thức A đạt 158,9% trong khi RB của hệ TVNH có KTTP l50nm là 142,85% Thời gian Tmax khác nhau đáng kể giữa 2 công thức Công thức A có thời gian Tmaxsớm hơn 0,34 giờ so với công thức B[14]

Chế phẩm Sandimmune Neoral là dạng bào chế hệ TVNH chứa cyclosporin

A của Novartis đã được tiến hành thử nghiệm đánh giá sinh khả dụng trên người Công thức bào chế của chế phẩm gồm thành phần hydrolyzed corn oil, polyglycolized glycerides,POE−castor oil derivative, ethanol, dược chất cyclosporin

A Nghiên cứu đã cho kết quả Sandimmune Neoral có sinh khả dụng tương đối so với chế phẩm Sandimmuneđạt 174- 239% tùy thuộc vào liều cyclosporin A sử dụng[32]

Năm 2003, René Holmvà cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm in

vivotrên chó nhằmđánh giá ảnh hưởng của cấu trúc triglyceride– tướng dầu đến việc

hấp thu thuốc từ hệ TVNH[13] Hai công thức hệ TVNHgồm thành phần: halofantrine: triglyceride: Maisine-35-1: Cremophor EL: ethanol = 5:29:29:30:7 (%

w/w) Công thức 1 cótriglyceride là 1,3-dioctanoyl-2-linoleyl-sn-glycerol C18:2-C8:0) (MLM) còn công thức 2 triglyceride là 1,3-dilinoyl-2-octanoyl-sn-

(C8:0-glycerol (C18:2-C8:0-C18:2) (LML)

Bảng 1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cấu trúc triglyceride dùng trong hệ

TVNHtới các thông số dược động học

STT Thông số dược động học Công thức 1

(MLM)

Công thức 2 (LML)

1 Thuốc hấp thu qua hệ bạch

huyết sau 12 giờ (%liều±SE) 17,96± 1,3 27,46± 1,3

2 Lượng triglicerid trong hệ

bạch huyết sau 12giờ

Nghiên cứu đã cho thấy rằng cấu trúc mạch cacbon trong triglyceride ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết Với cấu trúc phân tửtriglyceride nhiều mạch cacbon trung bình hơn thì khả năng vận chuyển thuốc qua

hệ bạch kém hơn so với phân tử có nhiều mạch cacbon dài hơn.Kết quả cho thấy phần trăm sinh khả dụng của thuốc do vận chuyển qua hệ bạch huyết ở LML cao hơn Tuy nhiên giá trị AUC1-24h của hai công thức khác nhau không có ý nghĩa Kết quả nghiên cứu sẽ là công cụ giúp cho các nhà bào chếđịnh hướng việc sử dụng tá dược trong hệ TVNH nhằm mục đích hướng DC hấp thu qua hệ bạch huyết, tránh chuyển hóa bước 1 tại gan

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1.Nguyên liệu được sử dụng trong quá trình thực nghiệm

9 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

12 Acid hydrochloric Trung Quốc Tinh khiết phân tích

13 Acetonitril J.T.Baker-USA Tinh khiết phân tích

2.2.2 Thiết bị

- Thiết bị thử độ hòa tan Erweka-DT (Đức)

- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90(Anh)

- Tủ lạnh

- Máy quang phổ UV-VIS OPTIMA SP-3000 (Nhật)

- Tủ vi khí hậu Climacell

- Bể lắc điều nhiệt

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent(Mỹ)

- Thiết bị lọc nén Sartorius SM 16249 (Đức); màng lọc cellulose acetat, kích thước lỗ lọc 0,2 µm; 0,45 μm

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Anh)

- Máy lắc xoáy Vortex

- Máy lọc nước PURELAB Classic UV, ELGA (Anh)

- Túi thẩm tích 14000 Dalton

- Cân phân tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh khác…

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Sàng lọc, lựa chọn tá dược và bào chế được hệ tự vi nhũ hóa chứa rotundin Đánh giá lựa chọn công thức tối ưu dựa trên thiết kế thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm

 Đánh giá một số đặc tính của hệtự vi nhũ hóa chứa rotundin: Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thời gian tự nhũ hóa, khả năng cải thiện

hòa tan của hệ tự vi nhũ hóa, đánh giá sinh khả dụng trên mô hình thỏ

2.3.Phương pháp bào chế

2.3.1 Xác định độ tan bão hòa

Phương pháp tiến hành xác định độ tan bão hòa được tham khảo theo nghiên cứu củaKang Bok Ki và cộng sự[14] Cho vào mỗi ống thủy tinh có nắp đậy khoảng 5ml tá dược lỏng, cho một lượng dư RTD vào ống Đậy chặt nắp và cho vào bể lắc điều nhiệt ở nhiệt độ 250 C trong 48 giờ Sau đó lấy các ống thử, li tâm ở tốc độ 3000rpm trong 10 phút,hút lớp dịch phía trên đem pha loãng bằng methanol và đinh lượng Nồng độ RTD hòa tan trong các tá dược được xác định bằng phương pháp

đo quang tại bước sóng 281 nm

2.3.2.Lập giản đồ pha

Xây dựng giản đồ pha bằng phương pháp chuẩn độ Nước được thêm chậm vào hỗn hợp dầu, diện hoạt, đồng dung môi tới khi thu được vi nhũ tương Từ bảng

độ tan của dược chất trong các tá dược, lựa chọn tá dược dầu, diện hoạt, đồng dung môi

 Chuẩn bị hỗn hợp diện hoạt/đồng dung môi (Smix) ở các tỉ lệ: 5:1; 4:1; 3:1; 2:1; 1:1; 1:2

 Với mỗi tỉ lệ Smix, tiến hành trộn với dầu (O) theo các tỉ lệ: O/Smix = 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4; 7:3

 Nhỏ từ từ nước cất vào hỗn hợp O/Smix và quan sát bằng mắt đến khi thu được vi nhũ tương dầu trong nước thì ghi lại lượng nước

Lặp lại thí nghiệm với các tỉ lệ O/Smix khác nhau để lập giản đồ pha

2.3.3.Xác định lượng dược chất nạp vào hệ

Sau khi khảo sát, tỉ lệ hỗn hợp chất diện hoạt và đồng dung môi (Smix) được lựa chọn cho hệ TVNH tối ưu là 3:1 Chuẩn bị các mẫu O/Simx lần lượt ở các tỉ lệ

là O/Smix = 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4 để tiến hành thử sơ bộ khả năng nạp dược chất

Với mỗi tỉ lệ O/Smix được chuẩn bị ở trên, bào chế các công thức hệ TVNH với tỉ lệ %DC so với tổng khối lượng pha dầu và Smix là 0,33%; 0,67%; 1%, 1,33%, 2%; 3%; 7%

Sau đó pha loãng các hệ với 25ml nước và quan sát nhũ tương tạo thành ngay sau khi bào chế và sau 3 ngày bảo quản ở điều kiện thường Hệ có khả năng nạp tốt có thể chất trong và không có hiện tượng kết tủa DC

2.3.4 Bào chế hệ tự vi nhũ hóa

Hòa tan dược chất trong pha dầu, sau đó cho hỗn hợp Smix, đồng nhất bằng máy lắc xoáy Hệ sau khi đồng nhất chính là hệ TVNH chứa RTD

2.3.5.Thiết kế thí nghiệm bằng quy hoạch thực nghiệm

Tiến hành thiết kế thí nghiệm bằng mô hình thiết kế bậc 2 với 2 biến đầu vào

là khối lượng dầu và Smix, thực hiện 11 công thức, trong đó 3 công thức lặp lại tại tâm.Các biến đầu ra là kích thước tiểu phân(KTTP), chỉ số đa phân tán(PDI) và hiệu quả hòa tan Phần mềm sử dụng để phân tích xử lý số liệu là MODDE 8.0

2.4 Phương pháp đánh giá

2.4.1 Phương pháp định lượng

a Định lượng RTD bằng phương pháp đo quang

Tham khảo DĐ VN IV, phát triển phương pháp định lượng RTD trong các dung môi hòa tan khác nhau: methanol, dd HCl pH 1,2[1]

Mẫu thử: pha loãng mẫu thử bằng dung môi ở tỉ lệ nhất định để được nồng

độ dung dịch thử trong khoảng 5-50μg/ml.Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 281nm Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ độ hấp thụ và nồng độ RTD để tính toán kết quả

b Định lượng RTD bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Điều kiện tiến hành định lượng RTD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được tham khảo trong DĐ VN IV[1]

Pha động: Dung dịch đệmphosphat pH 4,5(0,05M) - acetonitril (70 : 30)

Lọc qua màng lọc cellulose acetate (CA)có cỡ lỗ 0,45 µm, siêu âm đuổi bọt trong

30 phút

Dung dịch chuẩn: Hoà tan RTDtrong pha động để thu được dung dịch có

nồng độ khoảng 0,05 mg/ml

Điều kiện sắc ký:

 Cột thép không gỉ Agilent (250 mm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 m)

 Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 283 nm

 Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

 Thể tích tiêm: 20 l

Cách tính nồng độ RTD trong mẫu thử được ghi trong phụ lục 1

2.4.2.Các phương pháp đánh giá vi nhũ tương

a Đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân

Sử dụng phương pháp tán xạ laser trên thiết bị Zetasizer NanoZS90(Anh) Chuẩn bị mẫu: 0,5g hệ TVNH được phân tán vào khoảng 30 ml nước cất,lắc

nhẹ để tạo vi nhũ tương Nhũ tương tạo được có tốc độ đếm tiểu phân (count rate)

nằm trong khoảng 200-400 kcps.Sử dụng cuvet thuỷ tinh, chỉ số khúc xạ RI là 1,34

và độ hấp thụ là 0,001

b Đánh giá khả năng tự vi nhũ hóa của hệ

Tiến hành đánh giá khả năng tự nhũ hóa của hệ theo phương pháp của Holm

R và cộng sự [13] Cho200ml nước cất vào cốc thử hòa tan của thiết bị thử độ hòa tan Erweka-DT (Đức) sau đó cho 3g hệ TVNH, bật cánh khuấy với tốc độ 50 rpm, nhiệt độ môi trường t0= 37 ± 0,5 0C Sau khoảng 1 phút hút nhũ tương 1 lần và đo kích thước và phân bố kích thước tiểu phân

2.4.3 Đánh giá hiệu quả hòa tan rotundin của hệ tự vi nhũ hóa

a Thí nghiệm so sánh hiệu quả hòa tan của các hệ tự vi nhũ hóa

Đểso sánh hiệu quả hòa tan rotundin từ các hệ TVNHtiến hành qua các bước như sau:

- Bào chế các công thức TVNH với khối lượng thành phần theo thiết kế thí nghiệm.Mỗi công thức TVNH chứa 20mg RTD được pha loãng với 10 ml nước cất để tạo nhũ tương.Cho nhũ tương vào túi thẩm tích 14000 Dalton sau đó cho vào môi trường hòa tan

- Sử dụng thiết bị thử độ hòa tan có cánh khuấy với các thông số máy:

 t0= 37 ± 0,5 0C

 Tốc độ quay: 100 rpm

 Môi trường hòa tan: 500ml dd HCl pH 1,2

- Hút 5ml mẫu tại các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ, 2,5 giờ, 3 giờ và lọc qua màng lọc CA 0,45µm Sau mỗi lần hút,bổ sung 5ml môi trường.Dịch lọc thu được đem định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 281 nm

Hiệu quả hòa tan RTD của mỗi công thức hệ TVNH được tính theo công thức[36]:

Hiệu quả hòa tan(%) = 100 S1: Diện tích dười đường cong % DC hòa tan S0: Diện tích hình chữ nhật y100, Tcuối

Tcuối là thời gian cuối cùng lấy mẫu

y100 là phần trăm DC hòa tan tối đa 100 (%)

nguyên liệu

RTD là dược chất có độ tan thay đổi theo pH, RTD tan tốt trong pH 1,2 và tan kém trong pH kiềm Nên khi sử dụng theo đường uống, RTD khi đi từ vùng dạ dày xuống ruột, pH môi trường tiêu hóa tăng dần sang pH kiềm, độ tan của RTD giảm đi và có nguy cơ bị kết tinh lại Thí nghiệm được thiết kế nhằm so sánh ảnh hưởng của thay đổi pH tới khả năng hòa tan DC của hệ TVNHvà nguyên liệu qua

đó chứng minh được khả năng cải thiện hòa tan của hệTVNH

Mẫu thử: Hệ TVNH tối ưu chứa 20mg RTD được đóng vào nang cứng số 0 Mẫu đối chiếu: 20mg nguyên liệu thô được đóng vào nang cứng số 0

Tiến hành thử hòa tan nang chứa hệ TVNH và nang chứa nguyên liệu qua 2 môi trường pH 1,2 và pH 6,8 Tại thời điểm 2 giờ,môi trường pH 1,2 được thay đổi sang pH 6,8 bằng cách thêm vào 250ml dd Na2HPO4 0,40M

Sử dụng thiết bị thử độ hòa tan có cánh khuấyvới các thông số:

 t0

= 37± 0,50C

 Tốc độ quay: 100 rpm

 Thể tích môi trường hòa tan pH 1,2: 500ml

 Thể tích môi trường hòa tan pH 6,8: 750ml

 Thời gian hòa tan trong pH 1,2: 2 giờ

 Thời gian hòa tan trong pH 6,8: 3 giờ

Hút mẫu tại các thời điểm 15 phút, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ Mỗi lần hút 5ml, lọc qua màng lọc CA 0,2μm và bổ sung 5ml môi trường mới

- Mẫu thử hệ TVNH: lấy dịch lọc thu được pha loãng 2,5 lần bằng methanol

- Mẫu nguyên liệu: dịch lọc thu được tiến hành chạy sắc kí định lượng RTD Tiến hành chạy sắc ký định lượng RTD trong các mẫu thử hệ TVNH và mẫu nguyên liệu

2.4.4 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng trên thỏ

a Thiết kế mô hình đánh giá sinh khả dụng (SKD)

 Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 6 con thỏ trưởng thành có trọng lượng 2-3 kg được nuôi trong phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực Đại học Dược Hà Nội Cho thỏ nhịn ăn trong vòng 24 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm

 Chuẩn bị mẫu thuốc: hệ TVNH dạng lỏng được phân tán đồng nhất trong môi trường nước Nguyên liệu rotundin được bào chế dưới dạng hỗn dịch phân tán trong dung dịch NaCMC 0,5%

- Mô hình đánh giá SKD: 6 con thỏ sẽ được chia là 2 nhóm (mỗi nhóm 3 con)

- Nhóm 1: cho uống dạng nguyên liệu ở mức liều 3mg RTD/con

 Nhóm 2: cho uống một lượng chính xác hệ TVNH dạng lỏng đã phân tán trong nước, tương đương 3 mg RTD/con

 Lấy mẫu và xử lý huyết tương: tại các thời điểm 5 phút, 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 24 giờsau khi cho thỏ uống, tiến hành hút 2ml máu ở động mạch tai thỏ cho vào ống có tráng heparin Ly tâm mẫu máu ở tốc độ 6000 rpm trong 10 phút Thu huyết tương, bảo quản ở nhiệt độ -10ºC trước khi đưa đi phân tích bằng LC-MS/MS

b Phương pháp chiết QuEChERS

Tham khảo phương pháp chiết QuEChERS trong tài liệu với quy trình như sau[7]: Hút chính xác 0,5ml huyết tương cho vào ống ly tâm 2ml Thêm 25µl dd berberin (BBR) 50 ng/ml và 0,5ml acetonitril Tiến hành lắc xoáy trong 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất Tiếp tục thêm 0,2g MgSO4 và 0,05 g NaCl Lắc xoáy trong

1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 10 phút Hút lớp dịch lỏng phía trên cùng đưa đi định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS

c Phương pháp đinh lượng rotuntin bằng phương pháp LC-MS/MS

 Thẩm định phương pháp định lượng

Sau khi khảo sát phương pháp để lựa chọn điều kiện tiến hành định lượng RTD trong máu thỏ bằng LC-MS/MS (trình bày trong phụ lục 2), tiến hành thẩm định phương pháp định lượng Quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo hướng dẫn của FDA gồm các chỉ tiêu thẩm định sau:tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi

 Phương pháp định lượng rotundin trong huyết tương bằng LC-MS/MS

Sử dụng phương pháp thêm nội chuẩn (IS): berberin Tiến hành phân tích định lượng rotundin trong dịch chiết huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện và thông số như sau:

- Điều kiện HPLC: Cột sắc ký C18 (150mm × 4,6mm × 5μm), tốc độ dòng: 0,5ml/phút,thể tích tiêm mẫu: 5µl

- Pha động gồm acetonitril(ACN) và dd amoniaceat 5mM.Sử dụng chương trình gradien nồng độ như sau: từ 0 – 1 phút, tỉ lệ ACN là 50% Từ 1 – 2 phút,

tỉ lệACN tăng dần từ 50 lên 100% Từ 2-6 phút, tỉ lệ ACN là 100% Từ 6 - 7,5 phút, tỉ lệ ACN giảm dần từ 100% xuống 50% và từ phút thứ 7,5 trở đi tỉ

lệ ACN là 50%

- Các thông số bộ phận phân tích MS được ghi trong phụ lục 2