Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất alkyl hóa của n methyl asimilobin

Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến. Sự phát triển nhanh chóng các thuốc từ cây cỏ không chỉ nhằm tăng cường tự điều trị, giảm lo lắng về các tác dụng bất lợi của chế phẩm hóa dược mà còn nâng cao nhận thức của cộng đồng về vai trò của thuốc từ dược liệu trong điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường 7. Hiện nay, các công ty đa quốc gia đang có xu hướng phát triển các dược phẩm chứa một hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược liệu) do các chế phẩm này có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa cao thuốc (extracts) hoặc hợp chất toàn phần chưa xác định được trong các công thức cổ truyền, kinh điển 7. Với lợi thế là một trong những quốc gia có nguồn dược liệu phong phú, đa dạng làm thuốc cùng những bài thuốc y học cổ truyền đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phòng và điều trị bệnh, việc phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu dần trở thành thế mạnh của ngành dược Việt Nam.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CẤN THỊ QUỲNH LIÊN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT ALKYL

HÓA CỦA

N-METHYL-ASIMILOBIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CẤN THỊ QUỲNH LIÊN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT ALKYL

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành

nhất tới PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, Trưởng Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội; TS Nguyễn Văn Hải, Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội; DS Đặng Vũ Thanh Tùng - những người

thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy ThS Nguyễn Văn Giang đã cho

tôi nhiều ý kiến trao đổi khoa học và nhận xét bổ ích trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành được đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn ở bên, giúp đỡ và là nguồn động viên to lớn giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Cấn Thị Quỳnh Liên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Cây sen 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Thành phần hóa học 3

1.1.3 Công dụng 4

1.2 Nuciferin (I) 4

1.2.1 Công thức, tính chất lý hóa 4

1.2.2 Tác dụng dược lý 5

1.2.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu 6

1.3 N-methyl-asimilobin (II) 9

1.3.1 Công thức, tính chất 9

1.3.2 Tác dụng dược lý 9

1.3.3 Phương pháp demethyl hóa nuciferin tạo N-methyl-asimilobin 10

1.4 Muối amoni bậc 4 - sản phẩm của phản ứng N-alkyl hóa 12

1.4.1 Tổng quan về các phương pháp N-alkyl hóa tạo muối amoni bậc 4 12

1.4.2 Tác dụng sinh học 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu 15

2.2 Thiết bị và dụng cụ 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen 17

2.3.2 Demethyl hóa nuciferin 17

2.3.3 N-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin đã thu được bằng tác nhân

2-cloroethanol 17

2.3.4 Thử tác dụng sinh học 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Chiết và phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen 18

2.4.2 Bán tổng hợp dẫn chất từ nuciferin 18

2.4.3 Xác định cấu trúc sản phẩm 19

2.4.4 Thử tác dụng sinh học 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIÊM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen 21

3.1.1 Quy trình chiết nuciferin 21

3.1.2 Tinh chế nuciferin 21

3.2 Bán tổng hợp N-methyl-asimilobin bằng phản ứng demethyl hóa nuciferin 22

3.2.1 Nguyên lý phản ứng 22

3.2.2 Quy trình phản ứng 22

3.2.3 Khảo sát 23

3.2.4 Kết quả: 24

3.3 Tổng hợp N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid (III) và N,O-di(2-hydroxyethyl)-methyl-asimilobini clorid (IV) bằng phản ứng alkyl hóa N-methyl-asimilobin 25

3.3.1 Nguyên lý phản ứng: 25

3.3.2 Lựa chọn thời gian và dung môi phản ứng 25

3.3.3 Đề xuất quy trình phản ứng 29

3.3.4 Kết quả 30

3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của các dẫn chất N-alkyl của N-methyl-asimilobin 31 3.4.1 Xác định cấu trúc sản phẩm N-(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid 31

3.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm N,O-di(2-hydroxyethyl)-N-methyl-asimilobini clorid 32

3.5 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi của 2 dẫn chất alkyl hóa của

N-methyl-asimilobin 34

3.5.1 Thiết bị nghiên cứu 34

3.5.2 Dòng tế bào 34

3.5.3 Phương pháp thử độc tế bào 34

3.5.4 Kết quả 34

3.6 Bàn luận 35

3.6.1 Về quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin 35

3.6.2 Về các phản ứng bán tổng hợp 36

3.6.3 Về xác định cấu trúc sản phẩm 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Ac2O Anhydrid acetic

ATCC American Type Culture Collection

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

ESI-MS Phổ khối lượng phun m điện tử

(Electrospray Ionization Mass Spectrometry)

EtSNa Natri thioethoxid

FBS Huyết thanh phôi bò

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

IC50 Nồng độ ức chế tối đa một nửa (The half maximal inhibitory

concentration)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

IUPAC Hiệp hội Hóa học Quốc tế thuần túy và ứng dụng

(International Union of Pure and Applied Chemistry)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây sen……… 3

Hình 1.2 Công thức một số alkaloid chính trong lá sen 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của nuciferin (I)……… 4

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của N-methyl-asimilobin (II)……… 9

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF……… 10

Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48% … 10

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac2O…… 11

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng didemethyl hóa nuciferin sử dụng AlBr3 trong acetonitril……… 12

Hình 1.9 Cơ chế của phản ứng Menshutkin ……… 12

Hình 1.10 Sơ đồ phản ứng của Nerinckx và cộng sự…… 12

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng của Colona và cộng sự……… 13

Hình 1.12 Sơ đồ phản ứng của James Brunelle và cộng sự……… 13

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% 22

Hình 3.2 Sơ đồ dụng cụ của phản ứng demethyl hóa……… 23

Hình 3.3 Nguyên lý của phản ứng N-alkyl hóa sử dụng tác nhân 2-cloroethanol……….……… 25

Hình 3.4 Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng N-alkyl hóa N-methyl-asimilobin……… 30

Hình 3.5 Cơ chế của phản ứng O-demethyl hóa nuciferin với tác nhân HBr 48% 36

Hình 3.6 Cấu trúc sản phẩm phụ của phản ứng O-demethyl hóa nuciferin……… 37

Hình 3.7 Cơ chế của phản ứng N-alkyl hóa N-methyl-asimilobin …… 38

Hình 3.8 Cấu trúc sản phẩm phụ của phản ứng N-alkyl hóa……… 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen……… 4

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm… 15

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm… 16

Bảng 3.1 Khảo sát lượng HBr 48% ảnh hưởng đến hiệu suất bán tổng hợp

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng N-alkyl

hóa được thực hiện trong dung môi DMF……… 27

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng N-alkyl

hóa được thực hiện trong dung môi acetonitril……… 28

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến Sự phát triển nhanh chóng các thuốc từ cây cỏ không chỉ nhằm tăng cường tự điều trị, giảm lo lắng về các tác dụng bất lợi của chế phẩm hóa dược mà còn nâng cao nhận thức của cộng đồng về vai trò của thuốc từ dược liệu trong điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường [7]

Hiện nay, các công ty đa quốc gia đang có xu hướng phát triển các dược phẩm chứa một hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược liệu) do các chế phẩm này có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa cao thuốc (extracts) hoặc hợp chất toàn phần chưa xác định được trong các công thức cổ truyền, kinh điển [7]

Với lợi thế là một trong những quốc gia có nguồn dược liệu phong phú, đa dạng làm thuốc cùng những bài thuốc y học cổ truyền đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phòng và điều trị bệnh, việc phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu dần trở thành thế mạnh của ngành dược Việt Nam

Trong rất nhiều loại dược liệu có ứng dụng trong điều trị phải kể đến Sen - một loài cây rất quen thuộc với người Việt với nhiều bộ phận ( hạt, lá, củ…) có tác dụng chữa bệnh rất tốt Ngó sen có tác dụng cầm máu, hạt sen là thuốc bổ, chữa di tinh, mất ngủ, suy nhược thần kinh Gương sen, lá sen có tác dụng chữa huyết ứ, băng huyết, tiểu tiện ra máu…[3]

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7 - 0,8%, với nuciferin là alkaloid chính Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra được rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các bộ phận cây sen cũng như của nuciferin, điển hình như tác dụng chống ung thư [30], chống HIV [34], chống tăng lipid máu [30], hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [29] Gần đây, ở Trung Quốc đã sản xuất nuciferin dưới dạng tinh khiết để bào chế thuốc và thực phẩm chức năng Nhiều sản phẩm chứa nuciferin của Trung Quốc được sử dụng để chống béo phì, làm giảm trọng lượng cơ thể Ở Việt Nam đã có nhiều loại thuốc được sản xuất từ cao tâm sen và cao lá sen nhưng chưa có cơ sở

nào sản xuất alkaloid tinh khiết của lá sen - nuciferin, bên cạnh đó việc nghiên cứu, bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh còn hạn chế

Để góp phần vào việc nghiên cứu các dẫn chất của nuciferin, cụ thể là

N-methyl-asimilobin và các dẫn chất alkyl hóa của nó, trên cơ sở học tập, kế thừa

và ứng dụng các nghiên cứu đã có trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất alkyl hóa của

N-methyl-asimilobin” Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:

 Chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin tinh khiết từ dược liệu

 Demethyl hóa nuciferin tạo N-methyl-asimilobin

 Tổng hợp các dẫn chất alkyl hóa của N-methyl-asimilobin

 Thử tác dụng sinh học các dẫn chất alkyl hóa của

N-methyl-asimilobin thu được

Sen là một loại cây mọc dưới nước, thân rễ

hình trụ, mọc trong bùn, lá mọc lên khỏi mặt nước,

cuống lá dài, có gai nhỏ, phiến lá hình khiên, có gân tỏa tròn Hoa to màu trắng hay

đỏ hồng, đều lưỡng tính Đài 3 - 5, màu lục Tràng gồm rất nhiều cánh màu hồng hay trắng một phần, những cánh ngoài có màu lục như lá đài Nhị nhiều, bao phấn 2

ô, nứt theo 1 kẽ dọc Noãn rời nhau Quả chứa 1 hạt, không nội nhũ Hai lá mầm dày [3]

 Phân bố, thu hái:

Sen được trồng ở nhiều nơi trong nước ta để ăn và d ng làm thuốc Mùa thu hái vào các tháng 7 - 9 [3]

1.1.2 Thành phần hóa học

Lá sen - hà diệp có chứa nhiều alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc

: nuciferin, nornuciferin, anonalin, roemetin, armepavin, methyl coclaurin,

N-methyl lizococlaurin, pronuciferin, liriodenin, dehydro nuciferin, spermatheridin, dehydro-roemetin, nelumboxit Trong đó nuciferin là alkaloid chính [3]

Liên tâm cũng chứa nhiều alkaloid như: liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, methylcoryparin, nuciferin, pronuciferin [3]

Hình 1.3: Công thức cấu

tạo của nuciferin (I)

Công thức hóa học của một số alkaloid chính trong lá sen (Hình 1.2 và Bảng 1.1):

1.1.3 Công dụng

Tâm sen: Dùng chữa tim hồi hộp, mất ngủ, di mộng tinh Ngày uống 4-10 g tâm sen khô dưới dạng thuốc sắc hay thuốc pha Ngoài ra, tâm sen có tác dụng thanh tâm khứ nhiệt, dùng chữa tâm phiền, thổ huyết

Lá sen: có tác dụng tiêu ứ, cầm máu, dùng chữa bệnh đi đại tiện ra máu, băng đới, băng huyết, nôn ra máu [3]

alkaloid chính trong lá sen

Bảng 1.1: Một số alkaloid chính trong lá sen

 Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-methyldiabenzo

quinolin (IUPAC) [2,8]; hoặc dibenzo [de,g]quinolin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo [de,g] quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin [10]

1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H- Tính chất lí - hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu

trắng ánh xanh, không mùi, không vị, tan tốt trong cloroform, methanol, ethanol nóng, hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165oC, Phổ UV (đo trong methanol) cho λmax tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [5]

1.2.2 Tác dụng dược lý

 Tác dụng trên hệ thần kinh, cơ: Nuciferin có tác dụng giãn co thắt cơ

trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác - vận động và thể lưới thân não trên chuột thí nghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm [2]

 Tác dụng tăng tiết insulin: Nuciferin có tác dụng kích thích tiểu đảo

tụy tiết insulin, chống bệnh đái tháo đường theo cơ chế đóng các kênh K+- ATPase Nuciferin kích thích tiết insulin ở cả nồng độ 3,3 và 16,7 mM So với

glibenclamide, nuciferin có tác dụng mạnh hơn và ít độc tế bào hơn [27]

 Tác dụng chống HIV: Theo Yoshiki Hashiwada và cộng sự, nuciferin

và một số alkaloid có trong dịch chiết lá sen trong cồn 95% có tác dụng kháng HIV Trong đó nồng độ 50% tác dụng tối đa EC50= 0,8 µg/ml, chỉ số trị liệu (TI) là 36,3 [34]

 Tác dụng chống ung thư: Nuciferin có tác dụng đáng kể trong việc ức

chế nicotin gây ra NSCLC (non small cell lung cancer) tiến triển thông qua việc làm giảm hoạt động của tín hiệu Wnt/β-catenin Thử nghiệm trên chuột cho thấy nuciferin không chỉ ức chế sự tăng trưởng của NSCLC mà còn làm giảm đáng kể

các tổn thương gây ra bởi nicotin trong chức năng gan [21]

Ung thư vú là một trong những nguyên nhân phổ biến gây tử vong ung thư ở phụ nữ và có xu hướng di căn đến xương Nuciferin và liensinin được thử nghiệm trên chuột ở nồng độ không gây độc tế bào cho thấy tác dụng ức chế sự hoạt hóa thụ thể của yếu tố gây hủy xương Ngoài ra, liensinin và nuciferin còn có tác dụng

ức chế việc tăng sinh tế bào ung thư vú ở người [18]

 Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của hạt Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình

invitro và invivo Tổng hàm lượng của các phenolic trong dịch chiết được tìm thấy

là 7,61 ± 0,04% (kl/kl) Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng dọn gốc tự do tốt thể hiện qua các giá trị IC50 thu được Tác dụng chống oxy hóa sử dụng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) cho IC50 có giá trị là 6,12 ± 0,41 µg/ml Còn với phương pháp sử dụng nitric oxid là 84,86 ± 3,56 µg/ml Các giá trị IC50 ở trên đều ít hơn so với giá trị IC50 ở rutin trong thử tác dụng chống oxy hóa với các phương pháp tương tự Ngoài ra, người ta đánh giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ, không thấy có dấu hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lượng cơ thể [5]

Với rất nhiều tác dụng sinh học có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị bênh đã và đang được tiếp tục nghiên cứu, nuciferin có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu quan trọng trong ngành dược không chỉ của Việt Nam mà của toàn thế giới

1.2.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu

1.2.3.1 Phương pháp chung chiết xuất, phân lập và tinh chế alkaloid

từ dược liệu [1,6]

a Phương pháp chiết xuất:

 Chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực:

 Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu

Xay nhỏ dược liệu trước khi chiết Kiềm hóa và làm trương nở dược liệu bằng dung dịch kiềm để chuyển alkaloid trong nguyên liệu sang dạng base

 Giai đoạn 2: Chiết xuất

Sử dụng dung môi chiết là các dung môi hữu cơ Trong phòng thí nghiệm thường sử dụng benzen, cloroform, ether + cloroform Trong sản xuất công nghiệp, thường dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khó cháy Có thể dùng chiết nguội hoặc chiết nóng

 Giai đoạn 3: Tinh chế

Tinh chế thu các alkaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid - base và phân chia chúng giữa hai pha đó để loại tạp không phải alkaloid

 Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn acid

 Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu

 Nguyên liệu được xay nhỏ, sau đó làm ẩm, cho trương nở bằng dung môi thích hợp (nước, nước acid, cồn acid)

 Giai đoạn 2: Chiết xuất

Chiết bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất Các alkaloid trong dược liệu ở dạng muối tan trong các dung môi trên (thông thường d ng nước nóng hoặc ethanol

có các nồng độ khác nhau)

 Giai đoạn 3: Tinh chế

Lọc dịch chiết, kiềm hóa về dạng base, cô dung môi dưới áp suất giảm Dùng dung mỗi hữu cơ thích hợp để chiết lấy alkaloid dạng base Cất thu hồi dung mỗi hữu cơ rồi sấy khô sẽ thu được hỗn hợp alkaloid tinh khiết

 Chiết bằng methanol, ethanol:

Một số alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan nhiều trong ethanol

ở môi trường trung tính, do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp, đem thấm ẩm và chiết bằng ethanol cho tới kiệt alkaloid Quá trình tiếp theo thực hiện như trên

Methanol là một loại dung môi có độ hòa tan cao hơn ethanol, nhưng lại rất độc nên ít được sử dụng

 Phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn – CO2 lỏng :

Là phương pháp hiện đại nhất hiện nay Phương pháp này cho hiệu suất cao, không gây cháy, khí CO2 được sử dụng nhiều lần và các alkaloid không bị thủy phân do quá trình chiết xuất tiến hành ở nhiệt độ thấp

b Phân lập và tinh chế:

 Kết tinh phân đoạn:

Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp dung môi Trong quá trình để yên để dung môi bốc hơi

từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước Lọc lấy phần tinh thể thô

và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh khiết Phần dung dịch còn lại có thể để bay hơi dung môi và kết tinh để tách các chất khác Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn Dung môi d ng để hòa tan/kết tinh phân đoạn thường là một dung môi nhưng cũng có thể là một hỗn hợp 2 hay 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh

 Phương pháp sắc ký cột:

Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp alcaloid có độ hấp phụ khác nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột, bột cellulose… khi cho dịch chiết alcaloid qua cột, các alcaloid sẽ phân bố lần lượt trong cột, ở phần trên của cột

sẽ tập trung chất bị hấp phụ mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất hấp phụ kém nhất

 Phương pháp sắc ký lớp điều chế:

Dựa theo nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng, dịch chiết đậm đặc alcaloid được chấm lên những tấm kính đã tráng chất hấp phụ tương đối dày thành một đường thẳng Sau khi khai triển bằng một hệ dung môi thích hợp, các chất khác nhau có tốc độ di chuyển khác nhau nên có thể quan sát một cách dễ dàng dưới ánh sáng tử ngoại Sau đó cạo lấy riêng từng phần chất hấp phụ có chứa các alkaloid riêng biệt, rồi chiết riêng lấy từng chất bằng dung môi thích hợp Sau khi bốc hơi dung môi sẽ thu được từng alkaloid riêng biệt

1.2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu

Sử dụng phương pháp chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm và phân lập, tinh chế bằng phương pháp kết tinh (như đã nêu trong phần

hoa và lá của hoa sen (Nelumbo nucifera, Nymphaeaceae) đã được chứng minh là

có tác dụng ức chế hoạt động tạo khối u ác tính tế bào B16 4A5 ở chuột Trong số

các thành phần phân lập được, nuciferin, N-methyl-asimilobin, lirinidin, và hydroxy-1-methoxy-6a, 7-dehydroaporphin đã cho thấy: Nuciferin và N-methyl-

2-asimilobin ức chế sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM, N-

methyl-asimilobin ức chế sự biểu hiện của TRP-1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế sự biểu hiện của TRP-2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [13,8]

Hình 1.4: Công thức cấu tạo

của N-methyl-asimilobin (II)

Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế acetylcholinesterase, cụ thể: N-methyl-asimilobin là một chất ức chế mạnh

acetylcholinesterase (AChE) (ức chế 50% hoạt động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2

µg ml -1 trong khi giá trị IC50 tiêu chuẩn của Physostigmine là 0,013 ± 0,002 µg ml1

-) và hai alkaloid aporphin có tác dụng kém hơn là nuciferin và nornuciferin được

tách ra từ Nelumbo nucifera [8,15]

1.3.3 Phương pháp demethyl hóa nuciferin tạo N-methyl-asimilobin

 Phương pháp monodemethyl hóa nuciferin :

 Phản ứng của Feutrill và cộng sự năm 1970 với tác nhân EtSNa

Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và natri thioethoxid (lượng gấp 2,6- 2,7

số mol của nuciferin) vào dung môi DMF đun hồi lưu (sục N2) ở nhiệt độ 100oC trong 3 giờ Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm monodemethyl nuciferin với hiệu suất khoảng 94 - 98% [12,20]

 Phản ứng của Nguyễn Đắc T ng năm 2014 với tác nhân HBr 48%

Hình 1.5: Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng

EtSNa trong DMF

Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%

Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và xúc tác KI vào dung dich HBr 48%, duy trì nhiệt độ 122-125oC và sục N2 trong suốt quá trình phản ứng Kết thúc phản

ứng sau 4 giờ, xử lý hỗn hợp và thu được sản phẩm N-methyl-asimilobin với hiệu

suất 62,9% [8]

 Phương pháp didemethyl hóa nuciferin :

 Phản ứng của của Neumeyer và cộng sự (1973) với tác nhân HI:

Tiến hành phản ứng: 4 g nuciferin, 6 ml HI 57% và 4,5 ml Ac2O được làm nóng ở 140oC trong 30 phút Kết thúc phản ứng: Xử lý thu được sản phẩm didemethyl nuciferin thu được tinh thể hình kim không màu, to

nc =286oC với hiệu suất 82%) [26]

 Phản ứng của Zhongduo và cộng sự năm 2014 với tác nhân AlBr3:

Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và AlBr3 vào dung môi acetonitril, duy trì nhiệt độ 70oC và sục N2 trong suốt thời gian 48 giờ Kết thúc phản ứng, xử lý hỗn hợp và thu được sản phẩm với hiệu suất là 65% [32]

Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac2O

Hình 1.8: Sơ đồ phản ứng didemethyl hóa nuciferin sử dụng AlBr3 trong

acetonitril

1.4 Muối amoni bậc 4 - sản phẩm của phản ứng N-alkyl hóa

1.4.1 Tổng quan về các phương pháp N-alkyl hóa tạo muối amoni bậc 4

1.4.1.1 Phản ứng N-alkyl hóa tạo muối amoni bậc 4 từ amin bậc 3 với tác nhân alkyl halid

Phương pháp chung nhất để tổng hợp các muối amoni bậc 4 là phản ứng Menshutkin với tác nhân alkyl halid

 Cơ chế của phản ứng như sau:

Các tác nhân alkyl hóa này thường là florid hay iodid, nhưng đối với các mục đích thực tế thì bromid là tác nhân phổ biến nhất Clorid thường chỉ được sử dụng với các chất nền phản ứng mạnh hơn như benzyl clorid

Dung môi được cho phản ứng là các dung môi phân cực, trong đó acetonitril

là dung môi hay được sử dụng [17,19,24]

 Một số nghiên cứu:

 Phản ứng tạo muối amoni bậc 4 của Nerinckx và cộng sự năm 1990

Hình 1.9: Cơ chế của phản ứng Menshutkin

Hình 1.10: Sơ đồ phản ứng của Nerinckx và cộng sự

Phản ứng thực hiện trong dung môi diclomethan, được hồi lưu trong 2 ngày

Kết tủa được lọc và kết tinh từ n-butanol Hiệu suất của phản ứng là 69% [25]

 Phản ứng tạo muối amoni bậc 4 của Colona và cộng sự năm 1978:

Tiến hành: Phản ứng thực hiện trong hỗn hợp dung môi benzen và ethanol Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong 5 ngày Sau khi các dung môi được làm bay hơi dưới áp suất thấp Phần còn lại được rửa bằng pentan Hiệu suất của phản ứng là 79% [11]

1.4.1.2 Phản ứng N-alkyl hóa tạo muối amoni bậc 4 từ amin bậc 3 với tác nhân sulfonat

Phản ứng của James Brunelle và cộng sự năm 1987:

Hình 1.11: Sơ đồ phản ứng của Colona và cộng sự

Hình 1.12: Sơ đồ phản ứng của James Brunelle và cộng sự

Tiến hành: Phản ứng được thực hiện trong dung môi là toluen, đun hồi lưu Kết thúc phản ứng sau 3 giờ, xử lý hỗn hợp và thu được sản phẩm với hiệu suất 73% [9]

1.4.2 Tác dụng sinh học

Các hợp chất amoni bậc 4 được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, tác dụng này lần đầu tiên được ghi nhận vào năm 1916 nhưng đến những năm 1930 mới được nghiên cứu rộng rãi và đưa vào ứng dụng [28] Các hợp chất này có tác dụng

mạnh trên động vật nguyên sinh, mycobacteria, đặc biệt là chống plasmodia thông

qua việc tấn công vào một tổ chức cụ thể hoặc ngăn cản quá trình trao đổi chất của

vi khuẩn Vì vậy, chúng được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như khử trùng nước, bề mặt và dụng cụ [22], hay trong lâm sàng như khử tr ng trước khi mổ với

da nguyên vẹn, khử trùng các bề mặt tổn thương nhẹ, khử trùng niêm mạc [23,31]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

 Nguyên liệu: lá sen được thu mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội được phơi khô Qua quá trình chiết, phân lập và tinh chế tại phòng Tổng hợp Hóa dược Bộ môn Công nghiệp Dược- Trường Đại học Dược Hà Nội thu được nuciferin làm nguyên liệu cho các phản ứng bán tổng hợp

 Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm được

thống kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm

2.2 Thiết bị và dụng cụ

Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm được liệt kê

trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm

14 Mao quản (chấm sắc ký, đo nhiệt độ nóng chảy) Việt Nam

15 Máy cất quay chân không Buchi R-210 Thụy Sỹ

17 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Ascend

500MHz

Mỹ

18 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500MHz Mỹ

19 Máy đo phổ khối lượng LC/MSD Trap - SL và

LC/MS/MS - Xevo TQ

Mỹ

21 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen

 Thực hiện chiết alkaloid toàn phần trong lá sen

 Phân lập và tinh chế nuciferin

 Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.2 Demethyl hóa nuciferin

 Thực hiện demethyl hóa nuciferin bằng dung dịch HBr 48%

 Tách, tinh chế để thu được sản phẩm demethyl hóa

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm demethyl bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.3 N-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin đã thu được bằng tác nhân cloroethanol

2- Thực hiện phản ứng các trong dung môi DMF và acetonitril với xúc tác K2CO3

 Tách sản phẩm tinh khiết bằng phương pháp sắc ký điều chế

 Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua kết quả phân tích các phổ 1H - NMR, phổ MS

2.3.4 Thử tác dụng sinh học

 Thử tác dụng chống ung thư phổi của sản phẩm N-alkyl hóa tại Viện

Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam theo phương pháp phương pháp MTT

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chiết và phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen

 Sử dụng phương pháp chiết alkaloid base bằng dung môi hữu cơ

không phân cực

 Phân lập, tinh chế nuciferin bằng phương pháp chiết, kết tinh (trong dung môi aceton), tẩy màu (bằng than hoạt tính)

2.4.2 Bán tổng hợp dẫn chất từ nuciferin

 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ

để tổng hợp các chất dự kiến: phương pháp demethyl hóa, N-alkyl hóa…

 Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) để theo dõi tiến triển của phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết

SKLM được thực hiện với bản mỏng silica gel GF254 Merck 70- 230 mesh

và hệ dung môi khai triển thích hợp: Hệ dung môi 1 là dicloromethan: methanol

(9:1); Hệ dung môi 2 là n-butanol: acid acetic: nước (6: 2: 2); pha dung dịch thử và

dung dịch mẫu (hòa tan chất thử, chất mẫu vào methanol nồng độ khoảng 0,25%);

để khô bản mỏng ngoài không khí sau đó triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

 Sử dụng các phương pháp chiết, kết tinh, sắc ký điều chế để tinh chế sản phẩm

 Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt để sơ bộ định tính và xác định độ tinh khiết

Chiết xuất và bán tổng hợp hóa học thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hóa dược,

Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.4.3 Xác định cấu trúc sản phẩm

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: Phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR)

 Phổ khối lượng phân tử (MS):

Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H - NMR):

Được ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Bruker AV-500MHz, sử dụng dung môi là MeOD với chất chuẩn nội là tetramethylsilan

Được ghi tại Khoa Hóa - Trường đại học Khoa học tự nhiên, trêm máy Bruker Ascend 500MHz, sử dụng dung môi là D2O với chất chuẩn nội là tetramethylsilan

Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32

g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml Bổ xung 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho LU-1 Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào 3 x 104 tế bào/ml Ủ ở

37oC/5% CO2 Sau 3 ngày thêm 50 l MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l