Thiết kế t - vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme xcmi

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng p

LƯƠNG THỊ THÚY HẰNG

Tên đề tài:

“THIẾT KẾ T- VECTOR DÙNG CHO TÁCH DÒNG PHÂN TỬ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME XcmI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá học : 2010 – 2014

Giảng viên hướng dẫn : TS Dương Văn Cường

Khoa CNTP – CNSH - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

nghiệp ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học

và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn KS Ma Thị Trang cùng các cán bộ, các anh chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Xin trân trọng cảm ơn !

Thái nguyên, ngày 05 tháng 06 năm 2014

Sinh viên

Lương Thị Thúy Hằng

E coli : Escherichia coli

IPTG : Isopropyl Thiogalactoside

LB : Lauria Broth

NIT : Vector NTI Advance 11.5

Kb : Kilo base- Kilo bazo nito

PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction X-gal : 5-brome-4chloro-3-indoly-β-D-galactoside

Hình 2.1: Mô hình minh họa phương pháp tách dòng TA (Hermosa,

Grondona et al 2001) 7

Hình 2.2: Quy trình tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase 8

Hình 2.3: Thiết kế T-vector sử dụng enzyme Eam1105I 9

Hình 2.4: Trình tự và vị trí cắt của enzyme XcmI 10

Hình 2.5: A- Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối 35

Hình 3.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T 13

Hình 3.2 Quy t thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm ……… ….19

Hình 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR……… 28

Hình 4.1: A- Kết quả tạo vector pTZ57R/T dạng vòng 31

Hình 4.2 Kết quả thiết kế adapter in silico 32

Hình 4.3: Kết quả tạo adapter 33

Hình 4.4: Cắt mở vòng vector pTZ57R/T 34

Hình 4.6: Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI 36

Hình 4.7: Kết quả tạo T-vector pTUAF 37

Hình 4.8: A: Kết quả biến nạp gen ech vào T-vector pTUAF B: Kết quả biến nạp gen ech vào T-vector thương mại InsTAcloneTM của hãng thermo scientific………38

Hình 4.9: Kết quả sàng lọc dòng bằng kích thước 39

Hình 4.10: Kết quả chọn lọc dòng bằng phương pháp PCR 39

Hình 4.11: Kết quả cắt kiểm tra gen ech 40

Hình 4.12: A-thiết kế adapter với hai đầu dính là trình tự nhận biết của enzyme Bam HI 41

Bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất 2

Bảng 3.1 Các thành phần của InsTAclone PCR cloning 15

Bảng3.2: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 16

Bảng 3.3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 17

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng lai hai đoạn oligonucleotid 20

Bảng 3.5: Chu trình nhiệt lai tạo adapter 21

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt đồng thời hai enzyme giới hạn (tổng thể tích 30 µl) 23

Bảng 3.7:Thành phần phản ứng gắn nối 25

Bảng 3.8: Thành phần phản ứng cắt một enzyme (tổng thể tích 30 µl) 26

Bảng 3.9: Thành phần phản ứng gắn nối (tổng thể tích 30 µl) 26

Bảng 3.10: Thành phần phản ứng PCR 28

Bảng 3.11: thành phần phản ứng cắt đồng thời với SacI và EcoRI 29

Bảng 4.1: So sánh quy trình tạo T-vector 43

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cơ sở khoa học 4

2.1.1 Tách dòng gene từ sản phẩm PCR 4

2.1.1.1 Phương pháp tách dòng đầu bằng 4

2.1.1.2 Phương pháp tách dòng đầu dính 5

2.1.1.3 Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector 6

2.1.2 Các phương pháp tạo T-vector 7

2.1.2.1 Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase 7

2.1.2.2 Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I 9

2.1.2.3 Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI 9

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11

Hình 2.4: Kết quả tạo adapter (Aranishi and Okimoto 2004) 11

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 18

hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAclone của hãng Thermo scientific 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

Hình 3.2 Quy trình thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm 19

3.3.1 Thiết kế T-vector pTUAF 20

3.3.1.1 Thiết kế adapter 20

3.3.1.2 Gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T 21

3.3.2 Ứng dụng T–vector pTUAF trong tách dòng TA và đánh giá hiệu quả tách dòng 26

3.3.2.1 Thực hiện phản ứng TA cloning 26

3.3.2.2 Phương pháp biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt 27

3.3.2.3 Đánh giá hiệu quả tách dòng 27

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả 30

4.1.1 Kết quả thiết kế T-vector pTUAF 30

4.1.1.1 Kết quả lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu 30

4.1.1.4 Kết quả gắn adapter vào vector PTZ57R/T tạo ra T-vector pTUAF 33 4.1.2 Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM 37

4.1.2.1 Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng 37

4.1.2.3 Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR 39

4.1.2.4 Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn 40

4.2 Thảo luận 41

4.2.2 So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq

DNA polymerase 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

1 Tài liệu trong nước 46

2 Tài liệu nước ngoài 46

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Tách dòng gene là một phương pháp phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp Phương pháp tách dòng phổ biến nhất là sử dụng enzyme DNA ligase để tạo liên kết hóa trị giữa các đầu tương thích của đoạn DNA cần tách dòng và vector plasmid

Polymerase Chain Reaction (PCR) là một phản ứng khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu Kĩ thuật này được phát minh cách đây hơn một thập kỉ và cho đến nay đã trở thành kĩ thuật nền tảng căn bản cho tất cả các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử trên toàn thế giới (Kolmodin and Birch 2002) Mặc dù sản phẩm PCR có thể sử dụng trực tiếp trong nhiều ứng dụng, nhưng một số ứng dụng yêu cầu sản phẩm PCR phải được tách dòng và duy trì trong một vector (Kolmodin and Birch 2002) Vì hầu hết sản phẩm PCR đều có gốc Adenine ở 2 đầu 3’ bởi hoạt tính

Terminal transferase của enzyme Taq polymerase nên T-vector được thiết kế

có thymidine ở 2 đầu 3’ của T-vector và Adenosine ở đầu 3’ của sản phẩm PCR được gọi là “ TA cloning” (Vries 1998)

Do hiệu quả của tách dòng TA cao, phương pháp này đã được thương mại hóa dưới dạng các bộ KIT Mỗi bộ KIT tách dòng bao gồm 2 thành phần chính đó là T-vector và enzyme T4 DNA ligase, trong đó thành phần thứ 2 có thể được mua riêng biệt với giá rẻ hơn đáng kể Vì vậy, giá trị của bộ KIT tách dòng TA thực chất nằm ở T-vector Trong thực tiễn nghiên cứu tại Việt nam các nguồn vật liệu dùng trong tách dòng gen chủ yếu là sản phẩm thương mại T-vector thương mại thường được sử dụng tại các phòng thí nghiệm cho hiệu quả tách dòng cao nhưng chi phí cũng cao (bảng 1.1)

Bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất

Hiện nay T-vector được tạo ra bằng một số phương pháp bao gồm

terminal trasferase và dùng enzyme giới hạn như EcoRV, Eam1105I (Chen, Songkumarn et al 2009), XcmI (Borovkov and Rivkin 1997) (Testori, Listowsky et al 1994) Trong đó phương pháp sử dụng enzyme XcmI để tạo

T-vector là phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả tách dòng cao (93%) (Arashi-Heese, Miwa et al 1999)

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo

ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tạo được T-vector pTUAF

- Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng phân tử

1.3 Mục đích nghiên cứu

Thiết kế thành công T-vector pTUAF bằng phương pháp sử dụng

enzyme XcmI phục vụ cho tách dòng phân tử

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo điều kiện để phát triển các hướng

nghiên cứu thiết kế T-vector bằng việc sử dụng enzyme XcmI trên các vector

khác nhau

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản phẩm T-vector có thể được tạo ra với số lượng lớn nhằm đáp ứng nhu cầu tách dòng gene trong các phòng thí nghiệm và làm giảm chi phí cho các nghiên cứu về sinh học phân tử

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Tách dòng gene từ sản phẩm PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ thuật phân tử ngày càng phổ biến trong ngành khoa học sinh học và y học hiện đại Vì vậy hệ thống tách dòng của sản phẩm PCR nhanh chóng trở thành

sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học (Ido and Hayami 1997)

Tách dòng gen thành công từ sản phẩm PCR là một bước quan trọng để phân tích đoạn DNA kép được khuếch đại, mặc dù việc này còn gặp khó khăn Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng cho tách dòng sản phẩm PCR (Borovkov and Rivkin 1997) như: Tách dòng đầu bằng, tách dòng đầu dính và tách dòng TA Để chọn một phương pháp tách dòng phù hợp cần dựa vào mục đích tách dòng, vector tách dòng (đầu bằng hoặc đầu dính) và sản phẩm PCR được tạo ra có đầu treo hoặc đầu bằng do các DNA polymerase khác nhau tạo ra sản phẩm PCR với kết thúc khác nhau, phù hợp cho vector tách dòng đầu bằng hoặc đầu dính Đối với tách dòng sản phẩm PCR có kích thước lớn (ví dụ hơn 10kb) vượt quá khả năng tách dòng của các vector thông thường thì dùng vector cosmid hoặc λDNA (Bi 2002)

2.1.1.1 Phương pháp tách dòng đầu bằng

Tách dòng đầu bằng là một trong các phương án được sử dụng để tách dòng sản phẩm PCR Trong phương pháp này sản phẩm PCR đầu bằng và vector cũng có đầu bằng có thể được nối lại với nhau (Bi 2002)

Để tạo sản phẩm PCR với kết thúc đầu bằng mà không qua các bước biến đổi sau PCR thì cách đơn giản nhất là lựa chọn enzyme DNA

polymerase chịu nhiệt tạo sản phẩm PCR đầu bằng, ví dụ như Vent và Tth, do

chúng có hoạt tính 3’-5’ exonuclease (Lohff and Cease 1992) Tuy nhiên, ở

khoảng thời điểm những năm 1990 thì những enzyme DNA polymerase chịu

nhiệt tạo ra sản phẩm đầu bằng có tỉ lệ lỗi cao hơn so với enzyme Taq DNA polymerase Vấn đề đặt ra khi sử dụng Taq cho mục đích tách dòng đầu bằng

đó là enzyme này có hoạt tính terminal transferase có thể gắn thêm một nucleotide adenine vào đầu 3’-OH cuối cùng mỗi mạch của sản phẩm PCR (Clark 1988) gây cản trở việc nối sản phẩm PCR với vector đầu bằng Để khắc phục khó khăn này, đã có một số giải pháp đề ra Thứ nhất, sản phẩm PCR được

xử lý với đoạn Klenow của DNA polymerase I Thứ hai, sử dụng T4 (Skryabin

and Vassilacopoulou 1993, Costa and Weiner 1994) hoặc pfu polymerase (Costa

and Weiner 1994) để tạo đầu bằng của đoạn DNA cuối cùng

Mặc dù có thể sử dụng một số phương pháp để khắc phục nhược điểm nhưng khi đó thao tác thí nghiệm trở nên cồng kềnh, phức tạp, mất nhiều thời gian Hơn nữa, tách dòng đầu bằng còn có một yếu điểm rất đáng kể đó là xu hướng tự nối của vector cao dẫn đến các dòng mang vector tái tổ hợp thấp (Costa, Grafsky et al 1994)

2.1.1.2 Phương pháp tách dòng đầu dính

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp sử dụng đầu bằng trong tách dòng sản phẩm PCR thì một phương án khác có thể cân nhắc đó là tách dòng đầu dính Trên thực tế phương pháp này đã được sử dụng trong một

số phòng thí nghiệm Vị tri cắt giới hạn của enzyme bất kì có thể được đưa vào đầu 5’ kết thúc của mồi và bám vào trong sản phẩm PCR Sau khi cắt bởi các enzyme giới hạn tương ứng thì hai đầu kết thúc của sản phẩm PCR được tạo ra là đầu dính Sản phẩm PCR được cắt tạo đầu dính nối với vector cũng được cắt tạo đầu dính tương ứng, hiệu quả trong tách dòng đầu dính là tương đối hiệu quả (Scharf, Horn et al 1986, Gal, Schnell et al 1999)

Tuy nhiên một vài khó khăn thường gặp trong tách dòng đầu dính đó là nhiều enzyme cắt hạn chế cắt không hiệu quả khi vị trí nhận biết của enzyme

nằm ở đầu 5’ của sản phẩm PCR mạch kép Đặc biệt những vị trí này ở gần hoặc gần cuối cùng của đầu 5’ (Jung, Pestka et al 1990, Kaufman and Evans 1990) Điều này có thể dẫn đến kết quả là sự liên kết không ổn định của enzyme cắt giới hạn với điểm cuối của DNA Một giải pháp có thể khắc phục được vấn đề này là thêm một nucleotide vào đầu 5’ ngoài vị trí cắt giới hạn, nhưng điều này làm tăng chi phí tổng hợp mồi và cũng có thể làm giảm hiệu quả nối của mồi với khuôn

2.1.1.3 Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector

Khắc phục những nhược điểm của hai phương pháp trên thì việc sử dụng T-vector cho tách dòng phân tử được coi là phương pháp dễ dàng, tiết kiệm thời gian, công sức và có hiệu quả cao Nền tảng của phương pháp này

dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase đã

thêm một nucleotide đơn vào đầu 3’-OH cuối cùng của đoạn khuếch đại, điển hình là adenosine (Clark, 1988) Sản phẩm PCR có một nucleotide adenosine nhô ra ở đầu 3’-OH ở hai đầu đoạn DNA khuếch đại Do đó, sản phẩm PCR này có thể được tách dòng bằng cách đưa vào một vector có một nucleotide đơn Thymidine nhô ra ở đầu 3’-OH (Hình 2.1) mà không cần qua các bước xử

lí sản phẩm sau PCR Phương pháp này được gọi là Tách dòng TA (TA cloning) và vector đó được gọi là T-vector (Clark 1988)

Hình 2.1: Mô hình minh họa phương pháp tách dòng TA (Hermosa,

Grondona et al 2001) 2.1.2 Các phương pháp tạo T-vector

2.1.2.1 Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase

Dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase gắn thêm một trong 4 loại nucleotid vào đầu 3’-OH cuối cùng của sản phẩm PCR, một phương pháp thiết kế T-vector được tạo ra sử dụng enzyme cắt đầu bằng kết hợp với hoạt tính terminal transferase

Vector được cắt với enzyme giới hạn tạo đầu bằng EcoRV hoặc các

enzyme tạo vector đầu bằng khác có vị trí nhận biết trên vector, được ủ với Taq polymerase (1 đơn vị/µg cho tổng thể tích là 20µl), sử dụng buffer

(50mM KCl, 10mM Tris pH: 8.3, 1.5mM MgCl2 và 200µg/ml BSA) trong sự

có mặt của 2mM dTTP, ủ ở 70oC trong 2 giờ, kết quả là thêm một thymidine vào đầu 3’ cuối cùng của mỗi mạch của vector mạch thẳng T-vector sau khi được tinh sạch và cô đặc (hình 2.2), được sử dụng cho tách dòng sản phẩm PCR (Hong, Choi et al 2009)

Hình 2.2: Quy trình tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase

Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel và được nối với T-vector ở 14oC Vector và sản phẩm PCR được nối với nhau bởi liên kết phosphodiester giữa đầu 5’-P của vector và nhóm 3’-OH của sản phẩm PCR Phương pháp này hạn chế được khả năng vector tự đóng vòng do có một nucleotide thymidine thò ra ở đầu 3’-OH (Holton and Graham 1991) Giải trình tự của các dòng

Cắt mở vòngvector

bằng EcoRV

dTTP, Taq và thu

nhận T-vector

chứa đoạn chèn cho thấy có sự liên kết của một cặp T:A giữa vị trí của enzyme

EcoRV và trình tự mồi của sản phẩm PCR Chứng tỏ T-vector đã được tạo thành

công Phương pháp này tạo vector có đầu dính cho hiệu quả tách dòng cao hơn so với tách dòng đầu bằng mà không cần sửa đổi sản phẩm PCR

2.1.2.2 Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I

Dựa vào đặc diểm khi cắt bằng enzyme Eam1105I, sẽ tạo ra một đầu

thò T (Thymidine), do đó đã có nghiên cứu thiết kế hai đoạn oligonucleotid

chứa hai vị trí cắt của Eam1105I được lai với nhau tạo thành mạch kép, sau

đó gắn vào vector mong muốn Vector được gắn đoạn oligonucleotide mạch

kép chứa vị trí cắt của Eam1105I được cắt bằng enzyme Eam1105I tạo ra

T-vector với sự thò ra của nucleotide T ở hai đầu phục vụ cho tách dòng sản phẩm PCR (Ido and Hayami 1997) Kết quả thiết kế adapter được thể hiện ở hình 2.3

Hình 2.3: Thiết kế T-vector sử dụng enzyme Eam1105I

2.1.2.3 Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI

Cũng giống như enzyme Eam1105, khi cắt tại vị trí nhận biết enzyme XcmI tạo ra 1 nucleotid thymidine đơn thò ra ở đầu 3’ của mỗi mạch đơn của

đoạn DNA Tuy nhiên, thiết kế một vị trí duy nhất như vậy sẽ tạo ra một Adenosine ở đầu 5’-OH trên một sợi và một thydimidine thò ra ở sợi đối

diện Chính vì lý do này nên đòi hỏi cần có hai vị trí của enzyme XcmI để khi cắt ở hai vị trí nhận biết của XcmI sẽ tạo ra T ở đầu 3’-OH của mỗi sợi

Cùng có đặc điểm tạo ra đầu thò T khi cắt enzyme song XcmI có ưu điểm hơn so với Eam1105 trong thiết kế T-vector Bởi vì trên các vector tách dòng thường có vị trí cắt của Eam1105, nhưng lại không nằm trong vùng đa

tách dòng do vậy không thể sử dụng luôn để tách dòng sàng lọc khuẩn lạc xanh trắng, nếu chèn trình tự của enzyme này vào vùng đa tách dòng, khi cắt cấu trúc của vector sẽ bị phá hỏng thay vì chỉ cắt mở vòng theo mong đợi

Trong khi đó, enzyme XcmI hầu như không có trên các vector tách dòng, vì

vậy ta có thể chèn trình tự nhận biết enzyme này vào vùng MCS của vector

mà vẫn duy trì hoạt động của một T-vector bình thường

Hình 2.4: Trình tự và vị trí cắt của enzyme XcmI

Theo cách này có thể thiết kế một T-vector bằng cách chèn một đoạn

oligonucleotid ngắn chứa hai vị trí cắt của enzyme XcmI Khi đưa vào trong vector, vị trí này cho phép có thể thiết kế T-vector khi cắt với XcmI Trình tự nhận biết của enzyme XcmI là 5’CCANNNNNNNNNTGG 3’, các nucleotide

ở giữa có thể thay đổi (Arashi-Heese, Miwa et al 1999),

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, năm 2005 Phan Trọng Hoàng và cộng sự đã thiết kế thành công vector tách dòng TA bằng việc chèn đoạn adapter dài 36bp, hai đầu của

adapter là vị trí nhận biết của enzyme BamHI và đoạn adapter được chèn vào

vị trí đa tách dòng của vector pUC được cắt mở vòng với BamHI Hiệu quả

tách dòng đạt 91,4 % khi tiến hành tách dòng sản phẩm PCR dài 953 bp (Phan Trọng Hoàng et al, 2005)

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1999, tác giả Norika Arashi-Heese và cộng sự đã thiết kế thành công T-vector với đoạn oligonucleotid mạch kép với hai đầu là vị trí nhận biết

của enzyme EcoRI, chứa hai vị trí nhận biết của enzyme XcmI Đoạn oligonucleotid này đươc đưa vào vector pGEMTA cắt mở vòng bằng EcoRI

Sử dụng T-vector tạo ra tách dòng sản phẩm PCR, hiệu suất tách dòng đạt hơn 90% (Arashi-Heese, Miwa et al 1999)

Năm 2001, Chulman Jo và Sanngmee Ahn Jo đã thiết kế thành công vector với đoạn chèn được thiết kế đầu dính là vị trí nhận biết của enzyme

T-BamHI và NcoI, chứa hai vị trí cắt của enzyme XcmI được đưa vào vector

pNB-T phát triển từ vector pBluescrips SK(+) cũng được tạo đầu dính bằng

cắt mở vòng với hai enzyme BamHI và NcoI Hiệu quả tách dòng được đánh

giá khi tiến hành tách dòng đoạn DNA có độ dài hơn 500bp ( 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene) và đạt hiệu suất tách dòng gần 90% (Jo and Jo 2001)

glyceraldehyde-Năm 2004, Futoshi Ananishi và Takane Okimoto thiết kế T-vector bằng việc đưa đoạn adapter có độ dài 36bp được thiết kế hai đầu là vị trí của

enzyme Xbal chứa vị trí cắt của enzyme XcmI và vector pEMBL19 được cắt

mở vòng bằng enzyme Xbal Kết quả thiết kế được thể hiện ở hình 2.5

Hình 2.5: Kết quả tạo adapter (Aranishi and Okimoto 2004)

Tiến hành tách dòng thử nghiệm với sản phẩm PCR chọn lọc được 86 trên 108 khuẩn lạc trắng (hiệu suất tách dòng gần 80%) (Aranishi and Okimoto 2004)

Năm 2009, Yaofeng Zhao và cộng sự đã đưa đoạn oligonucleotid mạch

kép được thiết kế hai đầu là vị trí nhận biết của enzyme bamHI, chứa hai vị trí cắt của enzyme XcmI vào vector pGEM 5Zf(+) được cắt với enzyme tương

ứng Tiến hành thử nghiệm T-vector bằng việc tách dòng sản phẩm PCR có kích thước 80bp và đạt hiệu suất tách dòng 90%

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thiết kế pTUAF dựa trên vector pTZ57R/T thương mại của hãng Thermo Scientific

Vector pPTZ57R/T là vector tách dòng TA, mạch thẳng có kích thước

2886 bp được thiết kế có đầu dính là một nucleotide Thymine sử dụng để tách dòng gene trực tiếp từ phản ứng PCR

Hệ thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa cho enzyme β-lactamase phân hủy kháng sinh, cho phép chọn lọc các tế bào vi khuẩn chứa vector pTZ57R/T và ngăn ngừa sự nhiễm của các vi sinh vật khác

Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống Lac-Operon, chứa gen LacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase, enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân lactose thành glucose và galactose cung cấp năng lượng cho tế bào, đồng thời enzyme này còn xúc tác chuyển hóa một phần lactose thành allolactose có tác dụng kích thích sự biểu hiện của Operon Lac Trong vector pTZ57R/T, gene LacZ được thiết kế nằm ở hai đầu đoạn xen, khi không có đoạn xen vào trong vector thì gene LacZ là một gene hoàn chỉnh và có khả năng tạo ra enzyme β-galactosidase lên men lactose Nếu có đoạn chèn trong vector thì gene LacZ không hoàn chỉnh, do đó nó sẽ không thể tạo ra enzyme β-galactosidase và không thể lên men lactose được Hệ thống chọn lọc này dùng để xác định xem plasmid của các vi khuẩn phát triển trên môi trường chọn lọc có mang đoạn chèn hay không bằng cách xác định hoạt tính lên men lactose của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy có chứa đường lactose Có thể xác định hoạt tính của β-galactosidase bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch có chứa cơ chất màu X-gal cùng chất cảm ứng IPTG Khi gene LacZ hoạt động sẽ kết hợp với X-gal giải phóng phần mang màu tạo khuẩn lạc có màu xanh đậm, điều này cũng có nghĩa là đoạn chèn không được gắn vào vector Khi gene LacZ bị bất hoạt phần mang màu không được giải phóng nên khuẩn lạc có màu trắng, đồng nghĩa với việc đoạn chèn đã được nối vào vector và đó là những khuẩn lạc mong muốn

Trong vị trí của Lac-operon còn có vị trí đa tách dòng gồm vị trí cắt của

các enzyme giới hạn: EcoRI, EcI136II, SacI, Acc65I, KpnI, Bsp68I, Mva1269I, Mph1103I, XbaI, BamHI, Cfr9I, Eco88I, SmaI, ApaI, Bsp120I, HincII, SacII, XmiI, pstI, AlfI, Eco147I, paeI, HindIII Tại vị trí đa tách dòng,

vị trí của enzyme giới hạn được quan tâm trong đề tài này là enzyme EcoRI

và BamHI, hai enzyme này được sử dụng để cắt mở vòng vector pTZ57R/T phục vụ cho việc tạo T-vector Ngoài ra vị trí của enzyme XcmI trên vector

pTZ57R/T được quan tâm nhất bởi nó liên quan đến khả năng sử dụng vector

thích hợp cho việc tạo T-vector bằng enzyme XcmI Nếu trên vector có chứa vị trí cắt của enzyme XcmI thì việc tạo T-vector bằng enzyme này là không thể

Ngoài các thành phần trên vector pTZ57R/T còn có một số thành phần khác được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Các thành phần của InsTAclone PCR cloning

hợp

1896-2756

Gene LacZ Sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng của các

dòng tái tổ hợp 449-739

Vị trí đa tách dòng Cho phép thiết kế bản đồ, sàng lọc và

cắt kiểm tra đoạn xen 615-695

Phiên mã in vitro của đoạn chèn DNA

với T7 RNA polymerase 697-716 M13/pUC trình tự mối

xuôi Trình tự của đoạn chèn, colony PCR 599-614 M13/pUC trình tự mồi

ngược

Trình tự của đoạn chèn, colony PCR

735-751 Trình tự mồi T7

promoter Trình tự của đoạn chèn, colony PCR 697-716

Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

a) Hóa chất

Bảng 3.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tris Base, for Molecular Biology Gam Merck

Cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cặp Thermo scientific

Kít tinh sạch DNA từ gel agarose Bộ Thermo scientific

b) Thiết bị

Bảng 3.3 Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

Máy lọc nước siêu sạch Pall Co – UK

Bể rửa sóng siêu âm Jeiotech – korea

Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500 – Kodak – USA

Máy cất nước Canada Bio Water system – Pall

Co.UK

Tủ lạnh -20oC; -80oC Super freezer Eco130 – Ficchtti –

Italy Pipette 8- channel Thermo Labsystem – Finland

Nồi hấp khử trùng HV - 110 – Hirayama – Japan

Genmany/china

Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu- 425 - 400E - Nuaire – USA

Taiwan/USA

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nội dung 1: Thiết kế T-vector pTUAF

- Lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu

- Thiết kế adapter silico

- Lai hai đoạn oligonucleotide

- Gắn adapter vào vector pTZ5&R/T đã mở vòng

+ Cắt mở vòng vector pTZ57R/T

+ Nối đoạn adapter vào vector pTZ57R/T đã mở vòng và chọn lọc dòng

3.2.2 Nội dung 2: Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh

hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM của hãng Thermo scientific

- PCR gen ech

- Gắn nối gen ech vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng

- Kiểm tra bằng phương pháp sàng lọc kích thước

- Kiểm tra bằng phương pháp PCR

- Kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Để thiết kế và kiểm tra thành công T-vector tạo được, phải trải qua quy trình như sau:

Hình 3.2 Quy trình thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm

T-vector sản phẩm

Cắt XcmI, thôi gel

Thử nghiệm

3.3.1 Thiết kế T-vector pTUAF

Chú giải:

Tên gọi pTUAF được đặt theo tên tiếng Anh của Trường Đại học Nông

lâm Thái Nguyên (Thainguyen University of Agriculture and Forestry) Trong đó, kí hiệu đầu tiên, chữ p, là kí hiệu của plasmid theo quy chuẩn quốc

tế Chữ T trong cụm TUAF vừa có ý nghĩa là T-vector vừa trùng với chữ cái

đầu tiêu trong cụm từ viết tắt của Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.3.1.1 Thiết kế adapter

a) Thiết kế hai đoạn oligonucleotide

Hai đoạn oligonucleotide được thiết kế, mỗi đoạn dài 36 bp Ở mỗi đầu

5’ có treo 4 nucleotide là phần trình tự nhận biết của các enzyme BamHI và EcoRI Phần bắt cặp bao gồm 2 trình tự nhận biết của enzyme XcmI (30 nucleotide), ở giữa hai trình tự enzyme XcmI được bổ sung thêm 2 nucleotide

bất kì mà không làm lệch khung đọc của gen

b) Lai adapter

Phản ứng lai hai đoạn oligonucleotide tạo adapter

Hai đoạn oligonucleotide được pha với nồng độ 100pmoles/µl Phản ứng lai hai đoạn oligonucleotide được thực hiện với các thành phần ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng lai hai đoạn oligonucleotid