Sàng lọc và nghiên cứu một số chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam

VŨ HẢI SƠN Tên đề tài: SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RỪNG QUỐC GIA BA VÌ VÀ VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ CỦA VIỆT NAM

VŨ HẢI SƠN

Tên đề tài:

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ĐƯỢC PHÂN LẬP

TỪ RỪNG QUỐC GIA BA VÌ VÀ VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP

NÚI BÀ CỦA VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014

VŨ HẢI SƠN

Tên đề tài:

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ĐƯỢC PHÂN LẬP

TỪ RỪNG QUỐC GIA BA VÌ VÀ VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP

NÚI BÀ CỦA VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014

Người hướng dẫn:

1 T.S Đinh Thị Thu Hằng

(Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

2 T.S Dương Văn Cường

(Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên)

Thái Nguyên, năm 2014

Thắng và các cán bộ nghiên cứu của phòng phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Dương Văn Cường, cùng các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã ân cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như kinh nghiệm trong cuộc sống

Từ đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi có được nền tảng đạo đức và kiến thức vô giá

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

VŨ HẢI SƠN

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Enzyme ngoại bào 3

2.1.1 Laccase 3

2.1.2 Protease 8

2.1.3 Chitinase 9

2.1.4 Cellulase 11

2.2 Thuốc nhuộm 12

2.3 Một số phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm 15

2.3.1 Phương pháp hóa lý 15

2.3.2 Phương pháp oxy hóa bậc cao 15

2.3.3 Phương pháp sinh học 15

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 17

3.1.1 Vật liệu 17

3.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 17

3.1.3 Máy móc và thiết bị 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1 Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào (chitinase, cellulase, protease) 18

3.2.2 Sàng lọc vi khuẩn sinh laccase ngoại bào 19

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh laccase của chủng BBV11 20

3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 20

3.4 Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộmcủa chủng BBV11 21

3.4.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 21

3.4.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh một hoặc một số enzyme ngoại bào 24

4.1.1 Khả năng sinh protease, chitinase, cellulase 24

4.1.2 Khả năng sinh laccase 26

4.2 Phân loại chủng BBV1 27

4.2.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 27

4.2.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA 28

4.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh laccase ở chủng BBV11 29

4.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 29

4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 30

4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 31

4.3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường 32

4.4 Khả năng loại màu của chủng BBV11 34

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của phân tử laccase 5Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng BBV11 trên môi trường PDA-M

không bổ sung (A) và có bổ sung guaiacol (B) 26Hình 4.2 Hoạt tính laccase của 3 chủng vi khuẩn BBV11, BBD9 và

BBD38 27Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào được quan sát dưới

kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 13000 lần (B) 28Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến khả năng sinh laccase của

chủng BBV11 30Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh laccase của chủng BBV11 32Hình 4.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh laccase 33Hình 4.7 Hiệu quả loại màu và khả năng sinh laccase của chủng BBV11

sau 6 ngày nuôi 34Hình 4.8 Màu Dimaren Black CLS tại thời điểm ban đầu (A) và sau 6

ngày nuôi (B) 34

Bảng 2.1 Các vi sinh vật sinh laccase 4

Bảng 2.2 Một số vi sinh vật sinh laccase và ứng dụng 7

Bảng 2.3 Nguồn vi sinh vật sinh cellulase 12

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng xác định hoạt tính laccase 19

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 23

Bảng 4.1 Khả năng sinh chitinase, cellulase và protease của một số chủng vi khuẩn nghiên cứu 24

Bảng 4.2 Hoạt tính laccase của chủng BBV11 trên các môi trường khác nhau 29

POPs Persistent organic pollutants

RBBR Remazol Brilliant Blue R

TNT Trinitrotoluen

U/l Unit per litre

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong thế kỷ XXI, Các lĩnh vực sản xuất công nghiệp vẫn là xương sống của hầu hết quốc gia trên Thế giới Hiện nay ở Việt Nam, sự gia tăng dân số vượt ngưỡng 90 triệu người là cơ hội và cũng là thách thức không nhỏ Được thiên nhiên ưu đãi với nguồn tài nguyên, thiên nhiên phong phú, sự phát triển nhanh chóng của công nghiệp đang đem lại lợi ích không thể phủ nhận Tuy nhiên, cùng với sự phát triển đó thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm nghiêm trọng do những chất thải công nghiệp gây ra Môi trường đất và nước ở nhiều

đô thị, khu công nghiệp và làng nghề bị ô nhiễm do thiếu các công trình, thiết

bị và biện pháp xử lý chất thải hiệu quả Mỗi ngành công nghiệp khác nhau lại tạo ra nguồn ô nhiễm và gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí ở những mức độ khác nhau Tùy vào loại và mức độ ô nhiễm mà có những biện pháp xử lý riêng biệt Tuy nhiên, có một số phương pháp xử lý ô nhiễm chính

là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và sự kết hợp của các phương pháp này So với phương pháp vật lý và phương pháp hóa học thì phương pháp xứ lý ô nhiễm môi trường bằng sinh học sử dụng vi sinh vật đã và đang được đặc biệt quan tâm do lợi ích về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường mà phương pháp này đem lại

Vi sinh vật được sử dụng trong xử lý bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào có khả năng chuyển hóa và phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy Trong số các enzyme ngoại bào laccase, chitinase, cellulase, protease đã và đang được quan tâm nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam do khả năng những ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực Đặc biệt, laccase có phổ cơ chất rộng và được ứng dụng trong công nghệ sinh học môi trường (phân hủy các chất vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm v.v.), công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

Vi khuẩn Bacillus được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, được nghiên cứu

và ứng dụng rộng rãi do chúng có khả năng sinh bào tử, sinh trưởng trong những điều kiện khắc nghiệt và khả năng sinh một số enzyme ngoại bào đề

cập ở trên Một số đại diện của vi khuẩn này như Bacillus subtilis, Bacillus

thuringiensis…

Do đó đề tài “Sàng lọc và nghiên cứu một số chủng Bacillus có khả

năng sinh enzyme ngoại bào được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam” đã được tiến hành, với nội

dung sau:

•Sàng lọc các chủng vi khuẩn được phân lập từ lá mục và đất mùn rừng Quốc Gia Ba Vì và vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà có khả năng sinh một hoặc một số enzyme ngoại bào

•Phân loại và định tên chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào với hoạt tính cao theo phương pháp truyền thống và xác định trình tự gene mã hóa 16S rRNA

•Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như môi trường,

pH, nồng độ chất cảm ứng, nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Sàng lọc được chủng Bacillus có khả năng sinh một số enzyme ngoại

bào (laccase, proteinase, chitinase, cellulase)

Xác định một số điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Bacillus lựa chọn

sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có hoạt tính cao và ổn định

1.3 Mục đích nghiên cứu

Tăng cường, nâng cao kĩ năng thực hành, kiến thức chuyên môn và đóng góp một phần khả năng nghiên cứu khoa học của sinh viên

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Tuyển chọn được các chủng có họat tính enzyme tốt và ứng dụng trong

xử lý ô nhiễm môi trường

PHẦN 2:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Enzyme ngoại bào

2.1.1 Laccase

Giới thiệu về laccase

Laccase (p-benzenediol: oxygen oxyreductase, E.C.1.10.3.2) là một

polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxy hóa Trong phân tử có 4 nguyên

tử đồng có khả năng oxy hóa các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm và sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các enzyme, laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenthiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và

cả hợp chất vô cơ như iot Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và côn trùng

Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus vernicifera Các loại laccase

tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và các tính chất động học [46]

Nguồn laccase từ vi sinh vật

Laccase được phân bố rộng rãi ở nấm, thực vật bậc cao, vi khuẩn, xạ

khuẩn và côn trùng Hơn 60 chủng nấm thuộc nhiều lớp khác nhau như:

Ascomycete, Basidiomycetes và Deuteromycetes, được chứng minh là có

khả năng sinh laccase [22] Martins và cộng sự, cùng các tác giả khác đã

đưa ra 1 số loài vi khuẩn và nấm quan trọng sinh laccase với hoạt tính cao được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 2.1 Các vi sinh vật sinh laccase

Nguồn sinh vật Tài liệu tham

khảo

Nguồn sinh vật

Tài liệu tham khảo

Vi khuẩn Bacillus sinh laccasse:

Nghiên cứu về vi khuẩn sinh laccase đã được công bố lần đầu vào năm

1993 và tiếp tục đẩy mạnh nghiên cứu trong những năm sau đó [24]

Theo Hullo và cộng sự (2001), protein CotA từ áo bào tử của Bacillus

subtilis biểu hiện tương đồng với khả năng của các enzyme oxy hóa đa nhân

đồng, tuy nhiên không phải CotA từ các protein thuộc bào tử khác cũng có

khả năng này Từ đó chứng minh được CotA là 1 loại laccase [33] Một nghiên cứu khác của Meyer và cộng sự cho thấy khả năng sinh CotA-type

laccase từ chủng Bacillus pumilis [44]

Theo Kaushik và Thakur (2014), chủng Bacillussp được phân lập từ nhà

máy sản xuất rượu có khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào với hoạt tính cao nhất là 107,32 U/ml [20]

Held và cộng sự (2005) đã tìm được bào tử sinh tổng hợp laccase từ

chủng Bacillus sp SF và những bào tử tự do này có khả năng loại hoàn toàn

các loại thuốc nhuộm phổ biến như: Mordant Black 9, Mordant Brown 96/Mordant Brown 15 và Acid Blue 74 sau 90 phút [10]

Một nghiên cứu khác của Olukanni và cộng sự (2013) cho thấy, chủng vi

khuẩn Bacillus thuringiensis RUN1 được phân lập từ mẫu đất trồng bắp cải

có khả năng sinh laccase với hoạt tính cao nhất đạt 0,1043 ± U/min/mg protein, được xác định sau 24 giờ nuôi và sử dụng ABTS là cơ chất Cũng

trong nghiên cứu này, chủng B thuringiensis RUN1 có khả năng loại 84,67 ±

1,19% màu malachite green (MG) nồng độ 40mg/l trong 6 giờ [38]

Cấu trúc phân tử laccase

Phân tử laccase thường ở dạng monomeric protein, chỉ một số ở dạng oligomeric protein có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 - 90 kDa Tuy vậy, tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau của enzyme Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện

tử Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ

điện tử mạnh, trong khi cặp đồng nguyên tử T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [40]

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của phân tử laccase

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B ,C

có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đếu có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng

C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử

đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [32]

Ứng dụng của laccase

Loại màu: công nghiệp dệt sử dụng một lượng lớn nước và hóa chất để phục vụ cho xử lý ướt Những hóa chất này bao gồm các thành phần vô cơ và các thành phần hữu cơ Laccase có khả năng phân hủy và loại màu thuốc nhuộm và các màu tổng hợp, điều đó giải thích vì sao những nghiên cứu về enzyme này được phát triển và sử dụng hiệu quả trong nhiều ngành công

nghiệp [16] Cũng theo Blanquez và cộng sự (2004), nấm Trametes

versicolour loại được hoàn toàn màu Reactive Blue 15, Congo Red và

Reactive Black 5, trong khi chỉ loại được một phần màu Brilliant Red 3G-P, Brilliant Yellow 3B-A và RBBR

Trong công nghiệp giấy: các chất oxy hóa dựa vào clo và oxy được sử dụng để phân tách và phân hủy lignin – yêu cầu cần thiết để chuẩn bị cho giấy thành phẩm ở mức độ công nghiệp Khả năng phân hủy lignin bằng vi sinh vật đã được nghiên cứu sâu ở nấm, nhưng chưa được thực hiện nhiều ở vi khuẩn Bugg và cộng sự (2011) đã đưa ra gợi ý về một số vi khuẩn đất, thường là vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất thơm để phân giải lignin [9]

Hiện tại, Bacillus sinh laccase kiềm tính,chịu nhiệt đã được nghiên cứu

trong xử lý bột gỗ [51] Một vài ứng dụng của laccase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 2.1 Một số vi sinh vật sinh laccase và ứng dụng

Ứng dụng Nguồn laccase Tài liệu tham khảo

Loại màu thuốc

nhuộm

Cảm biến sinh học

Xử lý nước thải

Đối với công nghiệp thực phẩm, laccase được sử dụng để loại bỏ những

thành chứa phenolic khi làm bánh [14] Laccase cũng được dùng vào các quá trình tăng cường hoặc thay đổi màu sắc xuất hiện trong thực phẩm và đồ uống Trong ngành công nghiệp bia, laccase không chỉ đem lại sự ổn định mà còn giúp tăng thời hạn sử dụng sản phẩm [34], [45]

Trong lĩnh vực xử lý sinh học và phân hủy sinh học, y tế, dược phẩm,

mỹ phẩm và công nghệ nano: hiện tại, các nghiên cứu hữu ích được tập trung

vào ứng dụng của laccase như những chất xúc tác sinh học mới trong tổng hợp các hợp chất hữu cơ [7] Laccase được ứng dụng trong tổng hợp chất hữu

cơ oxy hóa của các nhóm chức, cặp chất phenol và steroid, tác nhân y sinh (gây mê, chống viêm, kháng sinh, an thần), cấu trúc của các liên kết nitrogen – carbon và trong tổng hợp các sản phẩm tự nhiên phức tạp [36]

Trong lĩnh vực xử lý đất ô nhiễm: PAHs kết hợp với các xenobiotics gây

độc cho đất, tuy nhiên với khả năng phân hủy triệt để các hợp chất đó, laccase

có vai trò vô cùng quan trọng với môi trường nhờ tính chất xúc tác tuyệt vời của chúng [14]

2.1.2 Protease

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một vài peptid ngắn, pepton Protease là một trong những nhóm enzyme quan trọng nhất của ngành công nghiệp enzyme, chiếm khoảng 60% thị trường các enzyme [37] Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay,

số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật Những kết quả đạt

được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy

mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế Trong thời gian gần đây, các nhà nghiên cứu cũng đã đưa ra những phương pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan của protease Kết quả này mở ra triển vọng

to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease

Protease là enzyme có giá trị thương mại to lớn và được ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là ngành công nghiệp chất tẩy rửa, thực phẩm và thuộc da [5] Một số protease kiềm tính được công

bố là có khả năng phân giải các protein dạng sợi từ sừng, lông và tóc [23], ngoài ra protease còn được ứng dụng trong xử lý các vết máu trên các dụng

cụ phẫu thuật [52]

Trên thế giới, khả năng sinh protease từ các chủng Bacillus là hết sức đa dạng, theo Afia và Shahida (2010) chủng Bacillus subtillis được phân lập từ

vườn ươm cây cảnh đã sinh protease ngoại bào với hoạt tính cao lên tới 198,543 U/ml [21]

Theo Nurullah Akcan và Fikret Uyar (2011), chủng Bacillus subtilis

RSKK96 sinh protease kiềm tính (alkaline protease) được lên men rắn, hoạt tính enzyme thu được lên đến 5759,2 U/mg [6]

2.1.3 Chitinase

Chitinase (EC 3.2.14) [polyβ-1,4-(2-acetamido-2-deoxy) – D-glucosid glucanohydrolase] thuộc nhóm emzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme có khả năng thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết 1,4-β-glucosid trong chitin [4] Chitinase có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật không xương sống và động vật có xương sống Chitinase thực vật là các enzyme có khả năng xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh Tuy nhiên không phải cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh Chitinase còn được tìm thấy trong vi

khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio,

Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp chitinase để

phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng làm nguồn cacbon cho sinh trưởng và phát triển của chúng [39] Vì vậy, việc tìm ra chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này với hoạt tính cao có ý nghĩa rất quan trọng

Ứng dụng của chitinase:

Trong phòng trừ nấm gây bệnh ở thực vật: theo Hiroshi [26], chitinase luôn

có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin Chitinase và 1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac, phenylalanin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật [3] Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại

β-các mầm bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất chitinase Vi khuẩn có khả năng chống lại nấm bệnh bằng cách sản xuất ra chitinase (Fridlender và cộng sự, 1993; Gay và cộng sự, 1992) Chitinase của Streptomyces có khả năng kì hãm sự phát triển của nấm [18], [28]

Toyoda đã bổ sung vào đất một lượng thích hợp chitin nhằm kích thích

sự phát triển của các chủng vi khuẩn sinh chititnase (những vi sinh vật này

chiếm ưu thế ở vùng rễ) [2] Xạ khuẩn Streptomyces anulatus đươc cố định

trong một giọt gel alginate canxi và đưa vào đất, chủng xạ khuẩn này phát triển mạnh trong đất có chứa chitin và ức chế một cách mạnh mẽ sự phát triển của những mầm bệnh từ nấm, như kiểm soát bệnh héo của cây cà chua gây ra

bởi nấm Fusarium oxysporum [15]

Trong lĩnh vực y dược, chitinase được ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh do vi nấm Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm truyền bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm, ở nấm men thì hiện diện trong vết chồi Do đó, một phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu chỉ đặc hiệu cho nấm, nhờ đó xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả các loài nấm gây bệnh [29]

Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới các bệnh truyền nhiễm do nấm là sử dụng chitinase hay protein kết hợp đặc

hiệu với chitin Một chitinase đã được phân lập và nhân dòng từ Vibrio

parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó có khả năng kết hợp chặt chẽ

với chitin và được sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh Bên cạnh đó, với các dịch cơ thể

có thể dùng một test xét nghiệm bằng bộ lọc (Spin-X, Costar Co.), hệ thống enzyme liên kết sẽ kiểm soát một lượng nhỏ những chất liệu của vách tế bào nấm hay vết chồi của nấm men hiện diện trong dịch cơ thể Chitinase VP1

được tạo dòng, biểu hiện và chuyển vào trong E.coli ở mức độ cao và sản xuất

ra khoảng 30mg/L trong môi trường trung tính [29]

Ngoài ra chitinase còn có 1 số ứng dụng khác như: sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetylGlucosamine [1], [4]

2.1.4 Cellulase

Cellulose là polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên, hàng năm có khoảng 1.5x1012 tấn sinh khối được sản xuất thông qua quá trình quang hợp,

đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và nó cũng được xem như một nguồn vật liệu

thô vô tận để tạo ra các sản phẩm khác nhau [43]

Cellulase là enzyme thủy phân cellulose tạo thành các sản phẩm sơ cấp như glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides Có 3 dạng cellulase chính là: cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobiose, EC 3.2.1.91), Endo-β-1,4-glucanase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase,

EC 3.2.14) và β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21)

Cellulase từ nấm có cấu trúc đơn giản hơn khi so sánh với cấu trúc hệ enzyme từ vi khuẩn [54] Cellulase điển hình từ nấm có 2 vùng riêng biệt: vùng xúc tác và phần còn lại là điểm bám của phân tử cellulose (cellulose binding molecular - CBM) CBM bao gồm khoảng 35 amino acids, vùng nối giữa 2 vùng riêng biệt chứa nhiều serine và threonine Điểm khác biệt chủ yếu giữa cellulosomes (là một phức hợp đa enzyme lớn) và các cellulase tự do là

ở trong thành phần của cellulosomes-cohesin chứa scaffolding và dockerine

Cellulases tự do chứa CBMs, là điểm được thay thế bởi một phân tử dockerine trong phức hợp cellulosomal và một scaffolding được tạo ra trực tiếp từ cellulosomes [17]

Cellulase được tổng hợp từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn, một số nguồn vi sinh vật sinh cellulase được trình bày ở Bảng 1.3 [43], [11], [31]

Bảng 2.2 Nguồn vi sinh vật sinh cellulase

Những sinh vật này có khả năng sinh trưởng trong điều kiện môi trường

đa dạng: hiếu khí, kị khí, chịu nhiệt và ưa nhiệt trung bình Trong số đó, các

loài thuộc chi Clostridium, Cellulomonas, Thermomonospora, Tricoderma và

Aspergillus đã được nghiên cứu về khả năng sinh cellulase [42] Cellulase

được ứng dụng trong chuyển hóa sinh khối, đưa ra một phương hướng nghiên

cứu mới ứng dụng vào các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và trong chăn nuôi [43]

2.2 Thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp,là những chất có màu, hấp thụ mạnh một phần nhất định của quang phổ ánh sáng nhìn thấy và có khả năng gắn kết vào các vật liệu dệt Hiện nay, hầu hết thuốc nhuộm được sử dụng là thuốc nhuộm tổng hợp Thuốc nhuộm được sử dụng

là những loại có độ bền màu cao, tuy nhiên đây cũng là vấn đề trong việc xử

lý nước thải chứa màu Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa học của chúng Thành phần của thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu

và nhóm trợ màu Nhóm mang màu là những nhóm có các liên kết đôi liên hợp với hệ điện tử π linh động như >C=C<, >C=N-, -COOH, -OH, -N=N- , nhóm trợ màu là nhóm thế cho hoặc nhận điện tử như –SOH, -COOH, -OH, -

chuyển năng lượng của hệ điện tử

Thuốc nhuộm tổng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc, phạm vi sử dụng Tùy thuộc cấu tạo, tính chất và phạm vi sử dụng, thuốc nhộm được phân chia thành các họ, các loại khác nhau Có hai cách phân loại thuốc nhuộm phổ biến nhất:

Phân loại theo cấu trúc hóa học (dựa vào nhóm mang màu – chromogen)

Phân loại theo lĩnh vực và phương pháp sử dụng

Phân loại theo cấu trúc hóa học

Cách phân loại này dựa trên bản chất của nhóm mang màu (chromogen),

có 12 chromogen chính, từ đây phân thành 20 - 30 họ thuốc nhuộm khác nhau Các họ chính là:

Thuốc nhuộm azo: Nhóm mang màu là nhóm azo (-N=N-), phân tử thuốc nhuộm có một hay nhiều nhóm azo Đây là họ thuốc nhuộm quan trọng nhất và có số lượng lớn nhất, chiếm khoảng 60-70% lượng các thuốc nhuộm tổng hợp, chiếm 2/3 các màu hữu cơ trọng bộ đại từ điển về thuốc nhuộm (Color Index (CI))

Thuốc nhuộm anthraquinon: trong phân tử thuốc nhuộm có chứa một hay nhiều nhóm antraquinon hoặc các dẫn xuất của nó:

Họ thuốc nhuộm này chiếm đến 15% số lượng thuốc nhuộm tổng hợp

Đây là họ phổ biến thứ 2 sau thuốc nhuộm azo trong các số các loại thuốc

nhuộm tổng hợp

Thuốc nhuộm triaryl metan: triaryl metan là dẫn xuất của metan mà trong đó nguyên tử C trung tâm sẽ tham gia liên kết vào mạch liên kết của hệ mang màu:

Họ thuốc nhuộm này phổ biến thứ 3, chiếm 3% tổng số thuốc nhuộm

Họ thuốc nhuộm phtaloxianin: nhóm mang màu trong phân tử của chúng

là hệ liên hợp khép kín Đặc điểm chung của họ thuốc nhuộm này là những nguyên tử H trong nhóm amin dể bị thay thế bởi ion kim loại, còn các nguyên

tử N thì tham gia tạo phức với kim loại làm màu của thuốc nhuộm thay đổi

Họ thuốc nhuộm này có độ bền màu với ánh sáng rất cao Chiếm khoảng 2% tổng số lượng thuốc nhuộm

Phân loại theo lĩnh vực, phương pháp sử dụng

Đây là cách phân loại thuốc nhuộm thương mại đã được thống nhất trên

toàn cầu và liệt kê trong CI, trong đó mỗi thuốc nhuộm được chỉ dẫn về cấu tạo hóa học, đặc điểm về màu sắc và phạm vi sử dụng Theo đặc tính áp dụng, thuốc nhuộm sử dụng cho xơ sợi cellulose (bông, visco…) đựơc tâm nhiều,

đó là các thuốc nhuộm hoàn nguyên, lưu hóa, hoạt tính và trực tiếp Sau đó là

các thuốc nhuộm cho xơ sợi tổng hợp, len, tơ tằm như: thuốc nhuộm phân tán, thuốc nhuộm bazo (cation), thuốc nhuộm acid

Thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi trong các ngành như: công nghiệp dệt nhuộm, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, in ấn và công nghiệp thuộc da Các ngành công nghiệp này đã tạo ra nước thải có độ màu cao, chứa các chất

độc tố, khó phân hủy Ở Việt Nam, ngành công nghiệp dệt nhuộm đang phát

triển ở những quy mô khác nhau Nước thải dệt nhuộm thường có nhiệt độ,

pH và độ màu cao, chứa nhiều loại hóa chất khó phân hủy Nếu không được

xử lý, nước thải dệt nhuộm sẽ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Do đó, việc xử lý nước thải dệt nhuộm trước khi xả thải ra môi trường là rất cần thiết,

đò hỏi phải có biện pháp xử lý triệt để

2.3 Một số phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm

Nhìn chung, các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm được áp dụng phổ biến ở các cơ sở dệt nhuộm ở nước ta hiện nay chủ yếu theo 3 phương pháp và thường được ứng dụng riêng rẽ hoặc kết hợp để xử lý nước thải dệt nhuộm là: phương pháp hóa lý, phương pháp oxy hóa bậc cao và phương pháp sinh học

2.3.1 Phương pháp hóa lý

Các phương pháp hóa lý như keo tụ tạo bông, tuyển nổi và hấp phụ chỉ chuyển chất màu từ pha này sang pha khác mà không làm biến đổi bản chất, cấu trúc chất màu Do đó, trong xử lý nước thải màu thì các phương pháp trên

có nhược điểm là không xử lý triệt để chất màu và các chất gây ô nhiễm, chất

ô nhiễm này sẽ tích lũy ở bùn hay chất hấp phụ và phải mất chi phí để xử lý bùn và chất hấp phụ này Riêng đối với thuốc nhuộm hoạt tính, keo tụ - tạo bông hiệu quả rất thấp, chi phí cho hóa chất cao, tạo thành nhiều bùn (0,5 – 2,5 kg TS/m3 nước thải xử lý) [8]

2.3.2 Phương pháp oxy hóa bậc cao

Đối với phương pháp oxy hóa bậc cao, các chất oxy hóa thường được sử

dụng là chloride (Cl2), hydroxyl peroxide (H2O2) và ozone (O3), trong đó Cl2

được đánh giá là chất oxy hóa kinh tế nhất [56]

2.3.3 Phương pháp sinh học

So với hai phương pháp trên thì phương pháp xử lý nước thải nhuộm bằng sinh học hiện đang được quan tâm, phương pháp này có chi phí rẻ hơn

và thân thiện với môi trường hơn

Xử lý sinh học nước thải dệt nhuộm bao gồm: hấp thụ sinh học, phân hủy bằng enzyme, kết tụ bông sinh học hoặc kết hợp cả ba biện pháp trên

[53] Hiệu quả loại màu phụ thuộc vào loại thuốc nhuộm cũng như các nhóm thế khác nhau của mỗi loại thuốc nhuộm và các đặc tính hóa lý của nước thải, chẳng hạn như nguồn carbon, nitrogen, pH, nhiệt độ, hàm lượng muối và nồng độ các chất hữu cơ trong nước thải

Dưới các điều kiện phù hợp, thuốc nhuộm có thể bị phân hủy bởi các enzyme reductase nội bào và ngoại bào Các enzyme reductase nội bào xúc tác cho phản ứng phân hủy thuốc nhuộm khi có sự hiện diện của các chất tương đương như FADA, NADH, NADPH [12] Hầu hết các loại thuốc nhuộm azo có nhóm thế sulfonate và trọng lượng phân tử cao không có khả năng đi qua màng tế bào Do đó, các hoạt động khử thuốc nhuộm azo không phụ thuộc nhiều vào sự hấp thu nội bào Sự oxy hóa thuốc nhuộm được xúc tác bởi các enzyme ngoại bào là peroxidases và phenoloxidases như laccase (Lac), manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), tyrosinase (Tyr), N-demethylase và cellobiose dehydrogenase Những enzyme ngoại bào này được tìm thấy trong nấm sợi, nấm men và vi khuẩn [48]

Trong đó laccase có tiềm năng trong phân hủy sinh học do khả năng oxy hóa không đặc hiệu của chúng, không đòi hỏi co-factor và sử dụng oxy có sẵn như một chất nhận điện tử [30]

PHẦN 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

3.1.1 Vật liệu

Chủng vi khuẩn:

Năm mươi tư chủng vi khuẩn được phân lập từ rừng Quốc Gia Ba Vì và vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam, nằm trong bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Cặp mồi: 27F và 1492R được sử dụng để nhân đoạn gene mã hóa 16S

rRNA có trình tự như sau:

Mồi xuôi (27F): 5’ – GTT TGA TCC TGG CTC AG – 3’

Mồi ngược (1492R): 5’ – GGY TAC CTT GTT ACG ACTT – 3’

3.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

Hóa chất

Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ Việt Nam, Trung Quốc, một số hóa chất tinh khiết được cung cấp bởi các hãng Sigma, Merk, Aldrich

o Môi trường thạch cơ chất định tính hoạt tính chitinase, cellulase, protease ngoại bào: môi trường cơ chất chitin, môi trường cơ chất casein, môi trường cơ chất CMC (g/l: Agar, 18; chitin, casein và CMC: 0,5; nước cất, 1000)