Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 nhập nội.

Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159.. Việc nghiên cứu nhân nhanh các giống mía mới bằng

PHAN ĐÌNH NHÂN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN IN VITRO

CÁC GIỐNG MÍA BR2, BR7515 VÀ QĐ 93-159 NHẬP NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên, 2014

PHAN ĐÌNH NHÂN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN IN VITRO

CÁC GIỐNG MÍA BR2, BR7515 VÀ QĐ 93-159 NHẬP NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn : 1 TS Hà Thị Thúy

Thái Nguyên, 2014

chân thành và sâu sắc tới TS Hà Thị Thúy, phó Viện trưởng Viện Di Truyền Nông Nghiệp Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn tôi trong toàn bộ quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới cô Th.s Nguyễn Thị Tình khoa CNTP, trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, giúp tôi thực tập và hoàn thành khóa luận

CNSH-Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chị Đỗ Thị Vân đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập khoa luận tại trạm thực nghiệm Sinh học Công nghệ cao Văn Giang – Hưng Yên

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cô chú, anh chị làm việc tại trạm thực nghiệm Sinh Học Công nghệ cao, Văn Giang, Hưng Yên; trực thuộc Viện Di Truyền Nông Nghiệp, đã tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập

Tôi xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy cô giảng dạy tại khoa CNSH – CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Thái Nguyên, ngày 01 tháng 06 năm 2014

Sinh viên

Phan Đình Nhân

sau 3 tuần nuôi cấy 29 Bảng 4.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với

Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía Br2 và Br7515 31 Bảng 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với

Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của giống mía

QĐ 93-159 32 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus ở 2 giống mía

BR2 và BR7515 35 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus ở2 giống mía

QĐ 93-159 35 Bảng 4.6: Ảnh hưởng BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi

của của giống mía Br2, Br7515 sau 4 tuần nuôi cấy 38

Bảng 4.7: Ảnh hưởng BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi

của của giống mía QĐ93-159 39 Bảng 4.8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ

của của giống mía Br2 sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) 42 Bảng 4.9: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ

của của giống mía Br7515 sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) 42 Bảng 4.10:Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ

của của giống QĐ93-159 sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) 43 Bảng 4.11: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sốngcủa cây trên vườn

ươm 46

Hình 4.1: Chồi mía trong môi trường nuôi cấy 28 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện Khả năng tạo chồi của chồi của ba giống mía

Br7515, Br2 và QĐ93-159 sau 3 tuần nuôi cấy 29 Hình 4.3: Chồi tái sinh từ callus sau 1 tuần cấy chuyển 31 Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết

hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của

ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 32 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tái sinh chồi từ callus

cau 3 tuần nuôi cấy 34 Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi

từ callus của ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159 36 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nước dừa đến dự hình thành chồi từ callus sau 3

tuần nuôi cấy 37 Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên

quá trình nhân nhanh chồi của ba giống mía BR2, QĐ 93-159 và BR7515 39 Hình 4.9 Ảnh hưởng của BAP trong kéo dài chồi sau 4 tuần nuôi cấy 41 Hình 4.10: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình

thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh 43 Hình 4.11: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ sau 2

tuần nuôi cấy 45 Hình 4.12: Cây sau khi được rửa sạch môi trường và hóa chất 45 Hình 4.13: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của cây

trên vườn ươm 46 Hình 4.14: Mía nuôi cấy mô ngoài vườn ươm sau 30 ngày 47

BAP : 6- Benzyl Amino Purin

IAA : Indol-3-Axetic acid

IBA : 3-Indol Butyric acid

NAA : α-Naphthyl Axetic acid

2,4 – D : 2,4-Dichlorophenoxy Axetic acid

MS : Mura Shige và Skoog

CTMT : Công thức môi trường

TB : Trung bình

CV : Độ tin cậy

LSD : Sai số nhỏ nhất có ý nghĩa

Phần 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất 3

Phần 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 4

2.1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

2.1.2.1 Môi trường nuôi cấy 4

2.1.2.2 Vật liệu nuôi cấy 8

2.1.2.3 Điều kiện vô trùng 8

2.1.3 Các hướng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.1.3.1 Tạo dòng sạch bệnh 8

2.1.3.2 Vi nhân giống bảo tồn gen 9

2.1.4 Các phương pháp vi nhân giống 9

2.1.4.1 Hoạt hóa chồi nách 9

2.1.4.2 Phương pháp tạo chồi bất định 10

2.1.4.3 Phương pháp tạo phôi vô tính 10

2.1.4.4 Các bước chính trong nhân giống in vitro 11

2.2 Giới thiệu về cây mía 13

2.2.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại cây mía 13

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây mía 13

2.2.5 Tình hình sản xuất mía trên thế giới và Việt Nam 15

2.2.5.1 Trên thế giới 15

2.2.5.2 Việt Nam 16

2.2.6 Tình hình nhân giống cây mía bằng phương pháp in vitro trên thế giới 17

2.2.7 Tình hình nhân giống cây mía bằng phương pháp in vitro ở Việt Nam18 Phần 3 : ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 19

3.3 Hóa chất và thiết bị 19

3.3.1 Hóa chất 19

3.3.2 Thiết bị 19

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

3.5.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 20

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 21

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 24

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4 24

3.6 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá 25

Phần 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 28

4.2 Ngiên cứu ảnh hưởng của các chất đến quá trính tái sinh và nhân nhanh chồi mía 30

Br7515, Br2 và QĐ93-159 30

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159 34

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của ba giống mía BR2, QĐ 93-159 và BR7515 38

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh 41

4.4 Giai đoạn ngoài vườn ươm 45

Phần 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

I Tài liệu tiếng Việt 49

II Tài liệu tiếng nước ngoài 50

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Mía là tên gọi chung của một số loài thuộc chi mía (Saccharum), chúng là các loài sống lâu năm, thuộc tông Andropogoneae của họ hòa thảo (Poacea) Thân

mía to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2- 6m Hầu hết các vùng trồng mía hiện nay đều dùng để cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất đường

Năm 2007, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành Mía đường đến năm 2010, định hướng đến năm 2020 với các chỉ tiêu chủ yếu đến năm 2010 như diện tích mía 300.000 ha; năng suất mía bình quân 65 tấn/ha; sản lượng mía cả nước 19,5 triệu tấn; tổng sản lượng đường sản xuất 1,5 triệu tấn (trong

đó sản lượng đường công nghiệp đạt 1,4 triệu tấn) Định hướng đến năm 2020 tổng

diện tích khoảng 300, 000 ha, năng suất bình quân đạt 80 tấn/ha, tổng sản lượng đạt

24 triệu tấn

Tuy nhiên tất cả các chỉ tiêu đặt ra cho ngành mía đường đều đã không đạt

kế hoạch Vụ mía đường 2012 - 2013 kết thúc với những thống kê, tổng sản lượng

đường chỉ đạt 19, 4 triệu tấn Công suất chế biến của các nhà máy chỉ đạt

72,5%-74,4% so với thiết kế Các chỉ tiêu thực tế năm 2013đạt được là: Diện tích mía 298.200 ha; năng suất mía bình quân 63, 9 tấn/ha (vẫn chưa đạt được mức dự kiến

đặt ra năm 2010)

Để tăng năng suất mía khi mà diện tích reo trồng vẫn giữ nguyên đòi hỏi

phải cải tiến về kĩ thuật canh tác cũng như cải tiến chất lượng giống

Việc nghiên cứu nhân nhanh các giống mía mới bằng phương pháp nuôi cấy

mô phục vụ cho sản xuất mía đường ở Việt Nam cũng như trên thế giới là một trong những hướng đi nhằm tạo ra giống nhanh có chất lượng,cũng như là nguồn cung cấp cây giống đồng đều sạch bệnh cho các vùng sản xuất Chính vì thế chúng tôi đã

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro các giống

mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 nhập nội”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được ảnh hưởng của chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

- Xác định được ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau khi kết hợp với Kinetin 0.2mg/l lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và

QĐ 93-159

.- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá trình tái sinh

chồi của giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

- Xác định được ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159

- Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng và phát triển của cây mía ngoài vườn ươm

1.3 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân nhanh các giống mía mới

bằng phuơng pháp in vitro

- Tạo tập đoàn giống mía in vitro ban đầu sẵn sàng cung ứng vật liệu giống

mới cho nhân giống sản xuất tại các vùng nguyên liệu mía khác nhau trong nước

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học

Nghiên cứu quy trình nhân nhanh thích hợp nhất với một số giống mía mới nhập nội từ đó hoàn thiện công nghệ nhân nhanh các giống mía duy trì và nhân nhanh các nguồn giống tốt phục vụ cho học tập và nghiên cứu khoa học

Tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các nghiên cứu tế bào học, di truyền học, chuyển gene… nhằm cải tiến giống địa phương đồng thời tạo các giống mới với năng suất và chất lượng cao

Nuôi cấy mô thực vật nói chung và cây mía nói riêng là phương tiện hữu hiệu nhất được dùng để kiểm tra kết quả sau chuyển gene ở thực vật, xác định biểu hiện gene chuyển một cách nhanh chóng

Kiểm tra các khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh (chống chua, mặn, khả năng chịu nóng, lạnh…) của thực vật nhanh chóng, chính xác, tiết kiệm tối thiểu thời gian và chi phí thấp hơn nhiều so với việc tiến hành ngoài đồng ruộng

Đánh giá được sức sinh trưởng của mía nuôi cấy mô và mía hom ngoài sản

xuất

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất

- Tạo cơ cấu giống phù hợp cho từng vùng nguyên liệu với tốc độ nhanh: Hiện nay các nhà máy sản xuất được xây dựng ngày càng nhiều, dẫn tới nguồn nguyên liệu của từng vùng sản xuất phù hợp cần được tìm hiểu và nghiên cứu Sau khi xác định được giống ưu việt nhân nhanh giống mới thay thế giống cũ phù hợp với từng vùng

- Đảm bảo an toàn sinh học: Gây dựng bước đầu một vùng nguyên liệu mía mới bằng các giống cấy mô sạch bệnh Nuôi cấy mô là biện pháp cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hóa học , giúp cho việc nhập nội giống an toàn sinh học

- Nuôi cấy mô làm trẻ hóa, sạch bệnh, tăng năng suất mía một cách đáng kể: Kinh nghiệm của hầu hết các nước trồng mía đều cho thấy vai trò quan trọng của công nghệ cấy mô đối với nhân giống mía

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

2.1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào

do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Theo quan niệm của khoa học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đều mang toàn bộ lượng thông tin đi truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Để thể hiện tính toàn năng tế bào phải trải qua 3 giai đoạn;

+ Giai đoạn 1: Là giai đoạn tế bào phản phân hóa với sự phát sinh của tế bào khả biến

+ Giai đoạn 2: Tế bào trải qua sự định hướng phân hóa

+ Giai đoạn 3: Sự phát sinh hình thái và phát triển cơ quan

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.2.1 Môi trường nuôi cấy

a Môi trường vật lý

- Ánh sáng:

Theo tác giả Vũ Văn Vụ, sự phát sinh hình thái của mô cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý như thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với đa số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp là từ 12-18h/ngày Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô là 1000-2500 lux [13] Chất lượng ánh sáng cũng ảnh

hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro Ánh sáng đỏ làm tăng

chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng

xanh thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo [13]

b Môi trường hóa học:

Môi trường hóa học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng phát sinh mô trong suốt quá trình sinh hóa của cây Cơ sở của việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm:

- Các nguyên tố đa lượng và vi lượng:

+ Nguyên tố đa lượng: Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm Những nguyên tố N, S,

P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tượng (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [15]

Nitơ: Dùng ở dạng muối NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau

Photpho: Là nguyên tố mà mô tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu cao và thường được đua vào môi trường dạng đường photpho

Lưu huỳnh: Được sử dụng ở dạng muối SO4-2- nồng độ thấp còn dạng SO3

2-và SO22- kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trường nuôi cấy

Na+ và Cl-: Cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng với muối khoáng khi diều chỉnh pH môi trường

`- Các nguyên tố vi lượng:

Theo tác giả O.L Gamborg, các nguyên tố vi lượng là những nguyên tố được

sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (< 30mg/l) các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Zn,

Bo, Co, I2 Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của

enzyme Chúng được sử dụng ở nồng độ thấp hơn so với các nguyên tố đa lượng [19]

Fe: Thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia

Mn: Thiếu Mn làm cho ADN và các axit amin tự do tăng lên nhưng lượng mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm làm giảm sự phân bào

Bo: Thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây nên biểu hiện thừa Auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào phát triển

Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhưng thường là mô xốp, mọng nước, kém tái sinh

- Nguồn Cacbon:

Theo tác giả Đỗ Năng Vịnh, cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức

dị dưỡng (hoàn toàn sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường) Để sử dụng dược thì nhờ nguồn cacbon từ môi trường đưa vào thông qua các loại dường khác nhau như: Saccarose, Mantose, Fructose…[15] Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào mô nuôi cấy

- Vitamin:

Nuôi cấy in vitro khi chồi tái sinh chồi vẫn tự tổng hợp được vitamin nhưng không đủ do vậy phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy đặc biệt là vitamin nhóm B (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [15] Tùy thuộc vào các loại mô nuôi cấy và giai

đoạn nuôi cấy mà hàm lượng vitamin bổ sung vào khác nhau

Dịch chiết nấm men: Thành phần chủ yếu chứa đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin, muối khoáng…

Agar: Đây là thành phần polycaccharit của tảo có tác dụng làm đông môi trường ở nhiệt độ <40 oC Thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 5g/l đến 6g/l

- Các chất điều hòa sinh trưởng:

Theo tác giả Vũ Văn Vụ, các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất ở một mức độ hợp lý chúng ta có thể điều chỉnh được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy [13] Auxin và Cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được

sử dụng phổ biến nhất hiện nay

Auxin cần bổ sung vào giai đoạn tạo callus, kéo dài chồi và nhân nhanh in

vitro

Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn ra rễ và nhân chồi

Tỷ lệ thích hợp giữa Auxin và Cytokinin phù hợp sẽ định hướng cho cây tạo

rẽ hay tạo chồi:

Auxin/Cytokinin >1 Mẫu nuôi cấy định hướng ưu tiên phát triển rễ

Auxin/Cytokinin<1 Mẫu nuôi cấy định hướng ưu tiên phát triển chồi

- Trạng thái môi trường:

Theo tác giả Vũ Văn Vụ, trong nuôi cấy cấy tĩnh sử dụng môi trường lỏng, các mô thực vật bị chìm trong môi trường dẫn đến thiếu oxy và bị chết Đối với các mảnh nuôi cấy đủ lớn để tiếp xúc không khí thì lại dễ bị mọng nước [13] Vì vậy cần có chất làm đông kết môi trường thành giá thể Thạch (agar) được sử dụng phổ biến nhất do có khả năng ngậm nước cao(tới 99,5%) Nồng độ agar thường được sử dụng là 0, 6 – 1, 2% [13]

- pH môi trường:

pH môi trường có ảnh hưởng tới khả năng trao đổi chất với môi trường dinh dưỡng của tế bào, mô nuôi cấy pH thích hợp cho nuôi cấy là 5,6 – 6 Nếu pH thấp

môi trường không thể đông kết còn pH cao làm cho môi trường đông cứng lại ức chế trao đổi chất của mô, tế bào nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999) [13]

2.1.2.2 Vật liệu nuôi cấy

Theo tác giả Vũ Văn Vụ, các bộ phận trên cơ thể thực vật có thể sử dụng nuôi cấy rất đa dạng Tùy theo đặc điểm của từng đối tượng cũng như mục đích

nghiên cứu mà lựa chọn mô nuôi cấy cho phù hợp Ví dụ trong vi nhân giống in

vitro người ta thường sử dụng đỉnh chồi, mắt ngủ, vẩy củ….; Để tạo cây đơn bội thì

ta nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, túi noãn; mô sẹo thường được tạo từ lát cắt lá non hoặc chóp rễ…[13] Tuy vậy cũng có những nguyên tắc chung cho việc lựa chọn nguyên liệu nuôi cấy để đạt hiệu quả cao Cây cho mẫu phải là cây khỏe mạnh, sạch bệnh, sinh trưởng tốt Nên thu mẫu vào đầu mùa sinh trưởng và vào buổi sáng sớm (S.Narayanaswamy, 1994) [22] Cơ quan nuôi cấy được lựa chọn theo mục đích nghiên cứu, mẫu cấy càng non (chưa biệt hóa sâu) cho hiệu quả càng cao( O.L Gamborg và cs, 1995) [19]

2.1.2.3 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy nô tế bào

Môi trường và các thiết bị sử dụng cấy phải được vô trùng tuyệt đối Nếu điều kiện, thiết bị không đảm bảo thì môi trường sẽ bị nhiễm, mô cấy sẽ bị chết

2.1.3 Các hướng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.3.1 Tạo dòng sạch bệnh

Các cây sinh sản vô tính thường nhiễm virus Nghiên cứu tạo cây sạch bệnh

được Morel và Martin(1992) thực hiện đầu tiên trên cây thược dược bằng cách nuôi

cấy đỉnh sinh trưởng [17] Tạo dòng sạch bệnh có thể thực hiện bằng hai phương pháp:

- Xử lý nhiệt: Theo tác giả Moskover, virus gây bệnh ở thực vật thường bị ức chế sinh trưởng ở 39-400C trong khi mô phân sinh vẫn phát triển nên các đỉnh sinh trưởng sẽ không chứa virus Nhiệt độ thấp cũng có tác dụng ức chế hoạt động của một số virus [1]

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Virus giảm dần ở gần đỉnh sinh trưởng, riêng

đỉnh sinh trưởng hoàn toàn sạch virus, ta có thể tách đỉnh sinh trưởng và nuôi

cấy thành cây hoàn chỉnh sạch bệnh Mẫu mô nuôi cấy càng nhỏ và càng gần

đỉnh sinh trưởng thì khả năng sạch bệnh càng lớn Nhưng có một số ngoại lệ khả

năng loại trừ virus khó khăn, không phụ thuộc vào kích thước mẫu và một số loài virus có khả năng sinh sản và chuyển dịch nhanh đến vùng sinh trưởng Việc phối hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng với xử lý nhiệt, hóa chất sẽ nâng cao hiệu quả loại trừ bệnh virus và tạo giống sạch bệnh ở những cây trồng này [19]

2.1.3.2 Vi nhân giống bảo tồn gen

Theo tác giả Lê Trần Bình, do có tính khả thi rộng và tiềm năng công nghiệp hóa cao, vi nhân giống hiện đã trở nên phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý hiếm, các dòng tốt, bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và đặc biệt là sản xuất giống thương mại ở quy

mô công nghiệp [1]

2.1.4 Các phương pháp vi nhân giống

Theo tác giả Đỗ Năng Vịnh vi nhân giống (nhân giống vô tính in vitro) là

phương pháp sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh các giống cây trong điều kiện vô trùng Phương pháp này cho phép tạo ra một số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh trong một thời gian ngắn với hệ số nhân cao mà không tốn diện tích, do đó rất thích hợp với những loại cây khó nhân giống hữu tính, hoặc có số lượng giống ban đầu hạn chế nhưng lại cần nhân nhanh [12]

Có ba phương pháp nhân giống in vitro:

2.1.4.1 Hoạt hóa chồi nách

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hay đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:

- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi nách hoặc chồi đỉnh hiện tương này xảy ra khi cây nuôi cấy là loài cây ba lá mầm như khoai tây, hoa cúc

- Cách 2: Tạo cụm chồi: Hiện tượng này xảy ra với các cây có một lá mầm như cây mía, cây lúa

2.1.4.2 Phương pháp tạo chồi bất định

Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác nhau của cây mà không phải là hợp tử như chồi hình thành từ callus

Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá… Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để

tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo

2.1.4.3 Phương pháp tạo phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể được hình thành từ các tế

bào soma gọi là phôi vô tính Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để tách các tế bào soma, hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua phát triển mô sẹo Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính:

Bước 1: Sự phân hóa tế bào có khả năng phát sinh phôi Trong quá trình cần môi trường giàu Auxin vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo thành phôi,

đồng thời Auxin giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng tế bào thông

qua việc liên tiếp phân chia tế bào Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các

tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm

đặc, giàu protein, ARN thông tin

Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành Môi trường nuôi cấy của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, nếu nồng độ của Auxin kích thích sự tạo thành phôi nhưng lại ức chế cho quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo của phôi này Như vậy nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp

2.1.4.4 Các bước chính trong nhân giống in vitro

Theo George (1993), quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm năm

bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Trước khi tến hành nhân giống in

vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ vì đây là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy Các

cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt phải sạch virus và đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu

nhiễm, tăng khẳ năng sống và sinh trưởng của mẫu nuôi cấy in vitro

Bước 2: Nuôi cấy khởi động: Là giai đoạn khử trùng đa mẫu cấy in vitro

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách được sử dụng để nhân nhanh một số cây như mía, măng tây, khoai tây, hoa cúc…

Bước 3: Nhân nhanh: Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái

và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất

định, tạo phôi vô tính Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại

cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16h chiếu sáng/1 ngày, cường độ ánh sáng là 2000-4000 lux Tuy nhiên đối với từng đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi

từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường bổ sung một lượng nhỏ Auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau chuyển sang môi trường không có chứa chất diều hòa sinh trưởng

Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm: Để cây đưa ra ngoài vườn ươm được phát triển tốt cần đảm bảo một số yêu cấu sau:

+ Cây phải đảm bảo về chiều dài của rễ, lá, thân…

+ Giá thể dùng để trồng cây phải tơi, xốp, thoát nước tốt

+ Phải điều chỉnh độ ẩm, cường độ chiếu sáng, chế độ dinh dưỡng phù hợp

Quy trình nhân nhanh của các giống mía được thể hiện trong sơ đồ dưới đây:

Hình 2.1 Quy trình nhân nhanh tổng quát

Nuôi cấy chồi

đỉnh

Chọn cây ưu việt

từ giống

ưu việt

Tái sinh chồi

Kéo dài chồi Tạo cụm chồi

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Đưa cây ra vườn ươm

Đưa cây ra ngoài đồng ruộng

2.2 Giới thiệu về cây mía

2.2.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại cây mía

Tên Việt Nam: Cây mía

Tên khoa học: Succharum officinarum

Ngành: Spermatophyta

Lớp: Monocotyledoneae

Họ Hòa thảo: (Poaceae)

Chi: Saccharum

Theo tác giả Trần Văn Sỏi mía là thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới, phân bố

từ 350 Bắc đến 350 Nam, ít ở xích đạo, tập chung ở chí tuyến, phân bố theo độ cao

từ đất thấp duyên hải đến 1000-1200m (ở xích đạo) và 700m (chí tuyến) [7]

Cây mía được thuần hóa từ khoảng 8000 năm trước Công Nguyên ở New Ghine, lan dần sang Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ và các châu lục khác Hơn

100 giống mía trồng hiện nay được tuyển chọn từ các loài thuần dưỡng hoặc là sản phẩm lai tự nhiên hoặc nhân tạo giữa các loài [7]

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây mía

Cây mía là cây thuộc họ hào thảo, sống ở các vùng có khí hậu nhiệt đới và ôn

đới ẩm Thân cây mía to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2-6m Trên thân

cây mía thường thì phần ngọn nhạt hơn phần gốc do phần ngọn chứa thêm một lượng nước lớn để cung cấp cho lá và ngọn Lá mía cứng, dài, có lông, khi dài chuyển sang mầu nâu Cây mía thuộc cây rễ chùm ăn trên bề mặt đất khoảng 0-

60 cm

Nhiệt độ thích hợp từ 15-26 0C, thời kỳ mía nảy mầm thì cần nhiệt độ tốt nhất là 26-33 0C Thời gian chiếu sáng phải đạt từ 1200-2000 lux/ ngày Độ ẩm cần 100-170mm nước/ tháng, khi mía sắp tới thời kỳ thu hoạch cần khô khoảng 2 tháng như vậy thì tỷ kệ đường trong cây sẽ cao Mía là loại cây công nghiệp khỏe, không kén đất, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, từ 70% sét đến 70% cát Đất thích hợp nhất cho mía là những loại đất xốp, tầng canh tác sâu, có độ phì cao, giữ

ẩm tốt và dễ thoát nước Tuy nhiên pH của đất phải giới hạn từ 4-9, pH thích

hợp nhất cho cây mía phát triển từ 5, 5-7, 5

2.2.3 Phân loại giống mía ở Việt Nam

Trên thực tế hiện nay ở Việt Nam, cây mía được chia thành hai loại mía chính: Mía ăn và mía ép công nghiệp

- Mía ăn: Nhóm này chiếm diện tích rất ít, chỉ một phần nhỏ và tập trung chủ yếu ở các tỉnh như: Hà Tây, Hưng Yên, Hòa Bình… Đây là nhóm mía nhiệt đới, thân mềm, nhỏ, hàm lượng đường glucose và fructose cao hơn các nhóm khác nên rất bổ và mát Nhóm mía này hoàn toàn là nhóm mía nguyên thủy chưa trải qua công nghệ chuyển gen hiện đại Nhóm mía này có thể trồng quang năm không theo mùa vụ chính, không chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, tuy nhiên yêu cầu

về chế độ dinh dưỡng cao không thích hợp để trồng cây công nghiệp Một số giống tiêu biểu như: mía tím, mía chân gà…

- Mía ép công nghiệp: Đây là các giống mía dùng để phục vụ cho công nghiệp chế biến đường, phần lớn các giống mía này được nhập từ Đài Loan, Ấn Độ, Trung Quốc Căn cứ vào thời điểm chín công nghiệp của mía người ta chia mía ép thành các nhóm chính như sau:

+ Nhóm mía chín sớm: Nhóm này chiếm khoảng 20-30% diện tích của vụ, thu hoạch vào đầu tháng 10 Nhóm này gồm: Giống Việt đường 54-143, giống Neo

320, giống Ja 60-5…

+ Nhóm mía chín trung bình: Đây là nhóm mía trồng chính của ngành công nghiệp mía, diện tích trồng chiếm 40-50% diện tích cả vụ Bao gồm các giống: giống F156, giống Co 715, giống F134…

+ Nhóm mía chín muộn: Nhóm này chiếm tỷ lệ 20-30% diện tích của mía ép công nghiệp, gồm giốn My 514 là gióng mía gốc Cuba hiện dâng được trồng phổ biến ở Nam bộ

2.2.4 Ý nghĩa kinh tế của cây mía

Theo tác giả Trần Văn Sỏi về mặt sinh học, mía là cây cao sản Do có diện tích lá gấp 7-8 lần diện tích đất, thời gian hoạt động của lá ổn định, kéo dài, không

bão hòa ánh sáng nên hiệu quả quang hợp cao, có thể tận dụng 6-7% ánh sáng mặt trời (so với 1-2% trung bình ở các thực vật khác) Do vậy khả năng tạo sinh khối lớn (200-250 tấn/ha/năm) [7]

Cây mía có khả năng tái sinh mạnh, là cây một năm nhưng lại có khả năng lưu gốc đến năm sau nên một lần trồng có thể thu hoạch nhiều vụ Thậm chí năng suất ở vụ gốc đầu còn lớn hơn năng suất ở vụ mía tơ [7]

Mía có thể thích ứng rộng trên các vùng sinh thái khác nhau, chống chịu tốt với môi trường, thích nghi với các trình độ sản xuất, dễ canh tác [2]

Về công nghiệp, mía là nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến đường

Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, đường là nhu cầu không thể thiếu và có thị

trường tiêu thụ ổn định Ngoài để bán trực tiếp, đường là nguyên liệu trong sản xuất bánh kẹo, bia rượu, nước giải khát…[2]

Không chỉ là nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm, mía là cây năng lượng hàng đầu để sản xuất cồn công nghiệp trong tương lai, khi nguồn nguyên liệu hóa thạch ngày càng cạn kiệt [7]

Cùng sản phẩm là đường, cây mía cho một số sản phẩm phụ là nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác Bã mía (chiếm 25-30% trọng lượng mía cây) được dùng để sản xuất than hoạt tính, bột giấy, ván ép và đặc biệt là sợi tổng hợp trong công nghiệp dệt hiện đại Mật gỉ (chiếm 3-5% trọng lượng mía cây) là nguyên liệu

để sản xuất rượu, cồn công nghiệp, men các loại, axit hữu cơ, bột ngọt…Bùn lọc

(chiếm 1, 5-3%) có thể chế biến thành sơn, dược phẩm, thức ăn gia súc, phân bón…[2]

Với hiệu quả kinh tế cao như vậy, mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nhân dân trung du, miền núi Nhiều vùng trung cư khó khăn ở Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Quảng Ngãi đã nhờ trồng mía mà mức sống đã tăng lên đáng kể [7]

2.2.5 Tình hình sản xuất mía trên thế giới và Việt Nam

2.2.5.1 Trên thế giới

Người Ấn Độ biết dùng mía làm đường đầu tiên (3000 năm trước Công Nguyên), đến thế kỷ thứ IV trước Công Nguyên đã chế được đường kết tinh Công

nghệ chế biến đường kết tinh lan dần sang Châu Á, Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Úc [7] Hiện nay mía được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Gần

120 nước trên thế giới sản xuất đường , trong đó 63% đường làm từ mía [7]

Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc (FAO) dự báo sản lượng đường toàn

cầu sẽ tăng khoảng 5% trong niên vụ 2011-2012, có thể đạt 172, 8 triệu tấn Nhu

cầu tiêu thụ đường của thế giới cũng được dự báo tăng, lên mức 167, 4 triệu tấn, do giá đường rẻ và nguồn cung dồi dào Triển vọng thị trường đường năm 2012 sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có mức tăng nhu cầu, và sản lượng ở nước sản xuất/xuất khẩu lớn nhất là Brazil - nước luôn linh hoạt chuyển đổi sản xuất giữa

đường và ethanol tuỳ theo biến động giá Czarnikow dự đoán sản lượng đường của

Brazil sẽ tăng 900 ngàn tấn trong niên vụ 2012/13 lên 39, 5 triệu tấn nhờ sản lượng

đường tại khu vực sản xuất quan trọng Trung Nam Brazil bật tăng trở lại Theo

Czarnikow, sản lượng đường tại khu vực này sẽ bật tăng 1 triệu tấn lên mức 32, 3 triệu tấn, sản xuất từ 505 triệu tấn mía Theo nhận định của Czarnikow, những bất

ổn địa chính trị có thể làm gián đoạn luồng cung ứng đường vật chất, sự chấp nhận

mức giá hiện tại của người tiêu dùng và khả năng giảm sử dụng các chất làm ngọt thay thế trong các ngành công nghiệp sẽ là những động lực chính cho tăng trưởng tiêu dùng trong năm 2013

2.2.5.2 Việt Nam

Nghề mía đường Việt Nam có từ rất sớm, du nhập sang Trung Quốc thời Chiến Quốc (Trần Văn Sỏi, 1977) [7] Thời Pháp thuộc nước ta đã có công nghiệp

đường với ba nhà máy Tuy Hòa và Hiệp Hòa Từ năm 1955 nghề trồng mía được

khôi phục Những năm đầu thập kỉ 1980, diện tích trồng mía bắt đầu tăng MISPA, 2004) [18]

(ICARD-Trước năm 1994, nước ta chủ yếu sử dụng các giống mía cũ năng suất thấp (dưới 40 tấn/ha) Sản lượng tăng chủ yếu nhờ mở rộng diện tích Năm 1994 tổng sản lượng mía cả nước là 7,5 triệu tấn Trong 5 năm của trương trình một triệu tấn

đường (1995-2000), diện tích trồng mía đã tăng từ 170.000 ha lên đến 315.000 ha

(trung bình mỗi năm tăng 15,2%) Năng suất tăng từ 40 tấn/ha lên 51,6 tấn/ha Sản

lượng mía năm 2000 là 17,8 tấn, gấp đôi năm 1995 Tuy nhiên sau chương trình, cả diện tích, sản lượng, năng suất đều không tăng đáng kể thậm chí còn giảm (ICARD-MISPA, 2004) [18]

Hiện nay ở Việt Nam mía được trồng khắp nơi thành các vùng tập trung Trong vài năm qua, ba vùng mía chính đã được thiêt lập là: Thanh Hóa – Nghệ An, Quảng Nghãi – Bình Định – Phú Yên – Khánh Hòa và Tây Ninh – Long An (ICARD-MISPA, 2004) [18]

Ngoài các giống mía cũ, Việt Nam cũng nhập giống từ Đài Loan, Trung Quốc, Cuba, Úc, Ấn Độ, Pháp và đã tuyển chọn được 10 giống nhập nội năng suất cao, hàm lượng đường cao để phục vụ sản xuất (ICARD-MISPA, 2004) [18]

Về công ngiệp chế biến đường, cho đến năm 1995 cả nước có 12 nhà máy chế biến dường với tổng công suất 13.300 tấn mía/ ngày Do thiếu nguyên liệu, phần lớn các nhà máy chỉ hoạt động với 70% công suất tối đa Năm 1992 tổng sản lượng đường cả nước là 270.000 tấn, hầu hết là đường thô (ICARD-MISPA, 2004) [18]

2.2.6 Tình hình nhân giống cây mía bằng phương pháp in vitro trên thế giới

Năm 1961, cây mía bắt đầu được nghiên cứu nuôi cấy mô tại trạm thực nghiệm Nông nghiệp thuộc liên hội mía đường Hawaii bởi Nickell Những thành công đầu tiên thu được bởi Heinz and Mee (1969) và Barba and Nickell (1969) (G.R Nail, 2001) [17] Từ mô non của giống mía H50-7290 người ta đã tạo được

mô sẹo và tái sinh dược thành cây Mô sẹo tạo được từ hầu hết các mô: mô phân sinh đỉnh, chóp rẽ, lá non, mắt non, cụm hoa chưa trưởng thành, nhu mô lõi (Liu và

cs, 1972) Năm 1966, các nhà nghiên cứu ở trạm thực nghiệm Nông nghiệp (AES) ở Laudoka đã nghiên cứu môi trường dịch đường để bảo quản hoa trong ống nghiệm làm vật liệu lai mía, đồng thời cũng bắt đầu nuôi cấy phôi nhằm khắc phục tình trạng không hợp giữ phôi và nội nhũ khi lai khác loài Ở viện nghiên cứu mía đường

Đài Loan, nuôi cấy mô tế bào được áp dụng để tạo giống sạch bệnh khảm (Lin,

1971) Năm 1975 các nhà nghiên cứu ở trạm nghiên cứu mía Canal đã thành công trong việc tạo ra một số giống mía bằng phương pháp nuôi cấy mô Sau đó nuôi cấy

mô tế bào mía đã phát trẻn ở Florida, Lousiana, Maryland, Pháp, Trung Quốc, Ấn

Độ, Nhật Bản và Bangladesh (G.R Nail, 2001) [17]

Chuyển gen bằng súng bắn gen ở mía đã được Tayloretal, Bower and Bireh thực hiện từ năm 1992 (Y.P.S Bhojwani và cs, 1983) [22]

2.2.7 Tình hình nhân giống cây mía bằng phương pháp in vitro ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô mía đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu

Viện Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã áp dụng công nghệ nuôi cấy mô trong nhân nhanh một số giống mía Trong những năm qua nước ta đã nhập nội một số giống mía , chủ yếu là các giống mía ROC của Đài Loan Tuy nhiên do giá thành cao, hệ số nhân của các phương pháp nhân giống truyền thống lại thấp không đủ đáp ứng đủ nhu cầu về giống mía Gần đây một số

Viện nghiên cứu đã tiến hành nhân giông mía in vitro (Viện Di truyền Nông nghiệp,

Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu Mía đường) Ngoài ra chúng ta đã bươc đầu chọn tạo giống mới bằng đột biến, dung hợp tế bào trần, chuyển gen (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [12]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện trên đối tượng là cây mía (Succharum officinarum), sử

dụng giống mía BR7515, Br2 và QĐ93-159 nhập nội

Mẫu dùng để nuôi cấy được trồng tại vườn ươm mía Trạm thực nghiệm sinh học công nghệ cao Văn Giang – Hưng Yên, thuộc Viện di truyền Nông nghiệp – Từ Liêm – Hà Nội

Vật liệu đưa vào là chồi đỉnh, chồi nách gần ngọn của các cây mía đang giữa thời kỳ sinh trưởng mạnh và callus phát sinh từ mẫu lá non hiện có tại cơ sở

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

Địa điểm: Trạm thực nghiệm Sinh học Công nghệ cao, Văn Giang – Hưng

Yên; trực thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, Km số 2 – Đường Phạm Văn Đồng –

- Lò vi sóng

- Tủ sấy

- Nồi hấp vô trùng

- Box cấy vô trùng

3.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi

nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Nội dung 2: Ngiên cứu ảnh hưởng của các chất đến quá trính tái sinh và

nhân nhanh chồi mía

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin =0.2mg/l khi kết hợp với BAP

ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515

và QĐ 93-159

.- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến khả năng tái sinh chồi

của giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình

thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh

phát triển của cây mía ngoài vườn ươm

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1

Phương pháp lựa chọn và xử lý vật liệu cấy đưa mẫu vào ống nghiệm

Chọn những khóm mía to khoẻ không bị sâu bệnh, lấy ngọn hoặc chặt những cây non có từ 2-4 lóng Cây mía còn non sức nẩy mầm và khả năng tái sinh cao Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc bỏ tất cả phần bẹ lá già và các lá đã tiếp xúc với không khí và có màu lục, lau sạch bằng cồn etanol 700 Sau đó đưa ngọn vào buồng vô trùng, bóc bỏ lần lượt các lớp bẹ và lá non bên ngoài cho đến khi chỉ còn

lại phần ngọn với lá non trắng nằm sát chồi đỉnh Sau đó tách lấy phần chồi nách, chồi đỉnh hoặc lá non trắng nằm sát đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nuôi cấy Đối với cây mía, mắt mía non (chồi ngủ) và chồi đỉnh thường được bao bọc trong nhiều lớp

bẹ lá, do vậy rất sạch Dựa vào những đặc tính cơ bản đó mà chúng tôi đưa mẫu vào

ống nghiệm mà không sử dụng hoá chất khử trùng

Kích thước mẫu nuôi cấy như sau:

- Chồi nách: Đường kính 1, 0 cm x 1, 0 cm

- Chồi đỉnh: Bóc bỏ lá non, lấy chồi non đường kính 1, 5cm x 1, 5 cm

Sau khi cấy, các đĩa peptri và bình nuôi được đặt trong phòng nuôi cây với

điều kiện nhiệt độ duy trì ở 25±20C và cường độ ánh sáng là 2.500lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày

Thí ngiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi

nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi

giống được cấy vào 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức Loại chồi CT1 Chồi đỉnh CT2 Chồi nách

Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 3 tuần tỷ lệ mẫu tạo chồi

Môi trường sử dụng: MS + 3% đường sucrose + 0,6% agar

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2

- Phương pháp tái sinh chôi in vitro:

Mô sẹo được cắt miếng 0,2cm x 0,2cm và đưa vào nuôi cấy trong môi trường + Sử dụng môi trường: MS + đường saccharose 30 g/l + agar 6 g/l + BAP (0-2,5 mg/lMT) + Kinetin (0, 2 mg/lMT)

+ Chồi được cấy trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ phòng từ 22-250C, cường độ

chiếu sáng 2000-2500 lux, ẩm độ 60-65% quang chu kì 16h sáng/8h tối Tiến hành theo dõi số chồi, chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường)

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết

hợp với Kinetin(0, 2mg/lMT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với 6 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 3 tuần: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi

MT Nền= MS + đường saccharose 30 g/l + agar 6 g/l

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình tái sinh

chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 2 bình, mỗi bình 5 chồi Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức Nồng độ nước dừa (%)

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi

Chú ý:

MT nền = MS + 3% đường saccharose + 0, 6% agar, pH = 5,6-5,8

Nồng độ nước dừa thích hợp nhất cho tái sinh chồi mía xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

- Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro dưới ảnh hưởng của BAP

+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng

pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước

+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong

đưa vào phòng nuôi Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát

bằng mắt thường)

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau

lên quá trình nhân nhanh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 7

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 2 bình, mỗi bình cấy

25 chồi BAP được bổ sung vào MT nền và A (nồng độ nước dừa thích hợp cho nhân nhanh chồi mía xác định ở thí nghiệm 3) với các nồng độ sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy: Hệ số nhân, chất lượng chồi

Chú ý:

MT nền = MS + 3% đường saccharose + 0, 6% agar, pH = 5,6-5,8

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3

- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro:

Lựa chọn chồi mía có từ 2-3 lá chuyển sang môi trường ra rễ Môi trường ra rễ dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất

định, hình thành cây con hoàn chỉnh

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình

thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 1 bình, mỗi bình cấy

25 chồi Thí nghiệm được bố trí như sau:

MT nền = MS + 3% đường saccharose + 0, 6% agar, pH = 5,6-5,8

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4

- Sau khi chồi đạt tiêu chuẩn với chiều cao khoảng 3-4cm, có từ 4-5 lá, 3-4

rễ trở lên đưa cây ra ngoài vườn ươm

- Việc chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện tự nhiên bên ngoài vườn

ươm là giai đoạn rất quan trọng Trong giai đoạn này, sự thay đổi đột ngột của điều

kiện sống, từ môi trường dị dưỡng ra môi trường tự dưỡng hoàn toàn đòi hỏi cây phải có quá trình thích nghi Sự thành công của giai đoạn này góp phần quan trọng cho sự thành công của phương pháp nhân giống

- Để phù hợp về độ ẩm trong quá trình cây thích nghi với môi trường sống ngoài tự nhiên là rất cần thiết Để cho cây lan có quá trình thích nghi tốt cần được luyện cây trước khi đưa cây ra giá thể phù hợp

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng và

phát triển của cây mía ngoài vườn ươm

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 1 khay, mỗi khay 240 cây Cây được trồng vào các loại giá thể khác nhau như sau:

4 Đất mùn + trấu hun + ¼ phân vi sinh

5 Đất mùn + cát + trấu hun +1/4 phân vi sinh

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tỷ lệ cây sống

3.6 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá

- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (mẫu nhiễm):

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (mẫu sống):

Tỷ lệ mẫu sống (%) =

Tổng số mẫu sống (mẫu)

x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Tỷ lệ mẫu chết:

Tỷ lệ mẫu chết (%) =

Tổng số mẫu chết (mẫu)

x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Tỷ lệ tái sinh:

Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu) x 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Hệ số nhân:

Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi)

Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Chất lượng chồi bật:

+ Chồi mập, xanh đậm: Chồi khoẻ, xanh

+ Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt + Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt

- Số rễ trung bình/cây:

Số rễ trung bình/cây (rễ) =

Tổng số rễ ra (rễ) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt : Rễ khoẻ, dài

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn

- Tỷ lệ cây sống:

Tỷ lệ cây sống (%) =

Tổng số cây sống (cây)

X 100% Tổng số cây ban đầu (cây)

Tỷ lệ cây chết:

Tỷ lệ cây chết (%) =

Tổng số cây chết (cây)

X 100%

Tổng số cây ban đầu (cây)

Chất lượng cây con (tình trạng, màu sắc)

- Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel 2003 và phần mềm IRRISTAT 5.0

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Trong nuôi cấy mô của đa số cây trồng, khi đưa mẫu từ ngoài vào trong ống nghiệm người ta thường phải khử trùng mẫu nuôi cấy Các chất khử trùng có tác dụng diệt nấm, vi khuẩn, nhưng cũng gây độc cho mô nuôi cấy

Đỉnh sinh trưởng và các chồi ngủ gần ngọn được lớp lá non bao bọc nên khá

sạch, nếu được lấy trong điều kiện thời tiết nắng ráo thì không cần khử trùng cũng

có thể nuôi cấy được với tỷ lệ nhiễm khá thấp Do vậy chúng tôi không tìm chất khử trùng mà chỉ nghiên cứu khả năng tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi ngủ của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159

Chồi đỉnh bóc hết lá, chồi nách gạt bỏ lớp vảy, cắt miếng 1cm × 1cm, cấy vào môi trường MS để kích thích bật chồi, theo dõi và cấy chuyển 3 lần trong 3 tuần Kết quả được trình bày trên bảng 1:

Hình 4.1: Chồi mía trong môi trường nuôi cấy