Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự nhiên từ cây táo mèo Docynia Indica (Wall.)Decne có tách dụng kháng khuẩn và chống rối loạn trao đổi Gluxit, Lipit (LV00289)

- Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên - Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định - Đánh giá tác dụng hạ lipid mỡ máu, đường huyết của các phân đoạn dịch chiết quả táo mèo tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

  

-HOÀNG THỊ MINH TÂN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ HỢP CHẤT

TỰ NHIÊN TỪ CÂY TÁO MÈO “DOCYNIA INDICA

(WALL.)DECNE” CÓ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN

VÀ CHỐNG RỐI LOẠN TRAO ĐỔI GLUXIT, LIPIT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2009

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ bộ môn Sinh lý thực vật

và Hóa sinh, khoa Sinh học, phòng Sau đại học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 và Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội cùng các bạn học viên cao học K10 đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Học viên

Hoàng Thị Minh Tân

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này được hoàn thành dưới sự hướng dẫn của GS.TS Đỗ Ngọc Liên

Tôi xin cam đoan:

- Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi

- Kết quả này không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã được công bố

Nếu sai tôi xin hoàn thành chịu trách nhiệm

Học viên

Hoàng Thị Minh Tân

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh……… 4

1.2 Bệnh béo phì………10

1.3 Enzyme lipase……… 19

1.4 Vi sinh vật………19

1.5 Vài nét về cây táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne)……… 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu……….24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………33

3.1 Quy trình tách chiết các cao phân đoạn từ quả và lá táo mèo………… 33

3.2 Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các cao phân đoạn dịch chiết từ quả và lá táo mèo………34

3.3 Định lượng hợp chất polyphenol tổng số trong các cao phân đoạn dịch chiết từ quả và lá táo mèo……… 37

3.4 Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng……38

3.5 Thử hoạt tính kháng khuẩn ……….41

3.6 Tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ quả táo mèo lên chuột béo phì thực nghiệm……… 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………61

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 63

PHỤ LỤC……… 66

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHE : Cholesterol esterase

CHO : Cholesterol oxydase

Hiện nay, trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại, cuộc sống của con người được đáp ứng đầy đủ cả về mặt vật chất cũng như tinh thần Tuy nhiên, chế độ dinh dưỡng chưa khoa học, xu hướng ăn thiên về các thức ăn chế biến sẵn, giàu chất dinh dưỡng, ít chất xơ nên đã dẫn đến một số bệnh rối loạn trao đổi lipid, gluxit như: béo phí, tiểu đường…

Tình hình thừa cân và béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động không những ở các quốc gia phát triển mà ở cả các quốc gia đang phát triển Đây thực sự là mối đe dọa tiềm ẩn trong tương lai Do tốc độ phát triển nhanh của bệnh nên nhu cầu thuốc điều trị ngày càng tăng

Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được sản xuất Thuốc tổng hợp hóa học có tác dụng nhanh, hiệu quả nhưng nhiều tác dụng phụ Vì vậy, các nhà khoa học đang hướng sự quan tâm của mình sang các thuốc có nguồn gốc thảo dược Loại thuốc này ít độc tính, ít tác dụng phụ, dễ sử dụng, giá thành rẻ do nguồn nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên

Việc nghiên cứu khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của các loại cây thuốc có giá trị ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, hiệu quả giữ tầm quan trọng đặc biệt Trong các công trình nghiên cứu khoa học gần đây, dược liệu thuộc họ Hoa hồng

(Rosaceae) đang được chú ý Một trong các loài có triển vọng là táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne)

Táo mèo thường mọc ở vùng núi cao Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Lai Châu… là loại cây mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân nơi đây Quả táo mèo không chỉ dùng để ăn mà còn là vị thuốc rất tốt Trong đông y, táo mèo được sử dụng chữa bệnh cao huyết áp, kích thích tiêu hoá, tăng cường sức miễn dịch của cơ thể, chữa ho, trấn tĩnh an thần…

Trên cơ sở những đặc tính sinh học, khả năng chữa bệnh của táo mèo, kết hợp với xu thế hiện nay trong việc nghiên cứu thảo dược chữa bệnh,

chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự nhiên

từ cây táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne) có tác dụng kháng khuẩn và chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid”

Nghiên cứu này góp phần đánh giá khả năng chữa bệnh của táo mèo,

bổ sung vào nguồn thảo dược chữa bệnh Đây là vấn đề có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn quan trọng

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình tách chiết một số hợp chất tự nhiên, khả năng kháng khuẩn và tác động hạ lipid (mỡ máu), đường huyết trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm của táo mèo

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu sử dụng các hệ dung môi khác nhau để tách chiết một số hợp chất tự nhiên trong quả và lá táo mèo có tác dụng kháng khuẩn, chống rối loạn trao đổi lipid, gluxit từ đó thiết lập quy trình hoàn thiện

- Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên

- Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Đánh giá tác dụng hạ lipid (mỡ máu), đường huyết của các phân đoạn dịch chiết quả táo mèo trên mô hình chuột gây béo phì

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Mẫu thực vật

Quả và lá táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne), được thu hái vào

tháng 9 năm 2008, tại huyện Văn Chấn - Yên Bái

4.2 Mẫu động vật và vi sinh vật

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14g/con) được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

Các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Salmonella typhi, Bacillus subtilis

4.3 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết từ quả táo mèo

lên 4 chủng vi khuẩn: Escherchia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella

typhi, Bacillus subtilis và chuột béo phì thực nghiệm, xem xét khả năng kháng

khuẩn và tác dụng của chúng lên các chỉ số cholesterol, triglycerid, HDL, lipase, glucose huyết của chuột béo phì sau 16 ngày điều trị

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp tách chiết

5.2 Phương pháp định tính

5.3 Phương pháp định lượng

5.4 Phương pháp phân lập các chất

5.5 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

5.6 Phương pháp gây rối loạn trao đổi gluxit, lipid trên mô hình động vật 5.7 Phương pháp thử hoạt tính sinh học trên mô hình chuột béo phì

6 Giả thuyết khoa học

6.1 Đưa ra quy trình tách chiết

6.2 Phân lập xác định định tính (phản ứng đặc trưng và sắc ký lớp mỏng) 6.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

6.4 Tạo mô hình chuột béo phì, xác định các chỉ tiêu: khối lượng cơ thể và chỉ số mỡ máu chứng minh là chuột béo phì

6.5 Đánh giá khả năng điều trị của các cao phân đoạn dịch chiết

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

đó Nhiều chất thuộc nhóm này ở mức độ đáng kể quyết định phẩm chất thực phẩm và mùi vị các sản phẩm khác nhau chế biến từ thực vật Ngoài ra, còn

có một số chất được dùng trong công nghiệp và y học

Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học và tính chất lý học của chúng mà các hợp chất thực vật thứ sinh được chia ra làm 3 nhóm chính là: terpene, các hợp chất phenolic, ankaloid

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, các hợp chất polyphenol (thuộc nhóm các hợp chất phenollic) đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh như: ung thư, viêm gan, béo phì…

1.1.1.1 Nhóm hợp chất terpene

Terpene là nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến nhất, được hình thành từ quá trình polyme hóa các tiểu đơn vị isopren, có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Đó là thành phần chính của các loại tinh dầu thường được dùng trong công nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Trong thực vật terpene được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevanolate hoặc con đường glyceraldehyde - 3 - phosphate/pyruvat Hầu hết các terpene đều

thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxi hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như: alcohl, ketone, acid và

aldehyde

1.1.1.2 Nhóm hợp chất phenolic

Hợp chất phenolic là một nhóm lớn các hợp chất thực vật thứ sinh Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có chứa vòng thơm mang một hay nhiều nhóm thế hydroxyl Dựa vào thành phần và cấu trúc hóa học,người ta chia hợp chất phenolic thành 2 nhóm lớn là nhóm phenol đơn giản (simple phenols) và nhóm pholyphenol Nhóm phenol đơn giản gồm 2 nhóm chính là nhóm phenolic acid và nhóm coumarin Nhóm polyphenol cũng gồm 2 nhóm chính là nhóm flavonoid và nhóm tannin

Phân nhóm phenolic acid

Phenolic acid trong thực vật là tất cả các hợp chất thực vật thứ sinh có tối thiểu một nhóm hydroxyl phenolic, gần đây các nhà khoa học thường giới hạn phân nhóm phenolic acid chỉ gồm các chất là dẫn xuất của acid benzoic (C6-C1) và acid cinamic (C6-C3)

Gallic acid Procatechuic acid Phân nhóm coumarin

Coumarin là dẫn xuất của α-pyrone có cấu trúc C6-C3, dị vòng chứa oxy

và có trong nhiều loại cây Chúng là những chất kết tinh không màu hoặc có màu vàng nhạt, vị đắng, một số lớn dễ thăng hoa, có mùi thơm giống như mùi thơm của valinin Về mặt hóa học, coumarin có thể tồn tại trong cây ở dạng aglycon tan nhiều trong các dung môi kém phân cực và dạng kết hợp với

đường glucose tạo thành glycoside dễ tan trong nước Trong cây, coumarin được coi là một trong số các chất “phòng thủ hóa học hữu hiệu” giúp thực vật chống lại những điều kiện bất lợi do môi trường và dịch bệnh gây ra Trong đời sống, coumarin được sử dụng làm nước hoa, hương liệu, bán tổng hợp các chất hóa học khác nhau, đặc biệt là các chất chống đông máu và chất diệt loài gậm nhấm Trong y học, đáng chú ý là dẫn xuất coumarin có tác dụng chống

co thắt, làm giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch Nhiều chất coumarin có tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán, giảm đau và hạ nhiệt

Về mặt hóa học, khung carbon của flavonoid là C6-C3-C6, gồm 15 nguyên tử carbon, hai vòng benzene A và B nối với nhau qua vòng khép kín

có chứa oxy (được gọi là pirano) C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman

9

10 8

3' 2'

B

Flavan (2-phenyl chroman)

Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2, C3 và nhóm carbonyl ở C4 mà flavonoid được chia thành nhiều phân nhóm phụ khác nhau

Flavonoid có thể tham gia vào nhiều phản ứng hóa học khác nhau như: phản ứng của nhóm hydroxyl (OH), phản ứng của vòng thơm (diazo hóa), phản ứng của nhóm carbonyl (phản ứng shinoza, phản ứng tạo phức với kim loại)

Hiện nay, đã có hơn 4500 các loại flavonoid khác nhau tồn tại trong thực vật được nhận dạng Chúng giữ nhiều vai trò quan trọng trong cây như: điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây (flavonol, anthocyane), làm tăng hiệu quả quang hợp, bảo vệ cây tránh được những bức xạ sóng ngắn,

có tính kháng khuẩn, kháng nấm, hấp dẫn động vật thụ phấn cho hoa… Trong

y học, flavonoid được sử dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau như: thuốc làm bền thành mạch, thuốc chống oxy hóa, thuốc kháng viêm, chống nấm, chống dị ứng, chống ung thư…

Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon, sự có mặt hay không của nối đôi giữa C2, C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà flavonid được chia thành nhiều phân nhóm phụ khác nhau

Cyanidin Epicatechin Quercetin

do hoặc ở dạng glycoside kết hợp với đường

Tannin thường là hợp chất vô định hình hoặc tinh thể, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ

bị oxy hóa khi đun nóng Chúng tan nhiều trong nước (nhất là trong nước nóng), tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone, ethylacetate và hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực như chloroform, benzene… Tannin tạo phức màu đặc trưng với các kim loại nặng, với protein, tinh bột và muối khoáng

Tác dụng sinh học: tannin là các chất bảo vệ cho cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh, các loài động vật và côn trùng ăn lá

Trong y học: tannin được sử dụng làm thuốc cầm máu, thuốc chữa đi ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chống ung thư, chữa trĩ, viêm miệng, viêm

xoang, điều trị cao huyết áp và chứng đột quỵ

1.1.1.3 Nhóm hợp chất alkaloid

Alkaloid là những hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và thường gặp ở cả thực vật và động vật Chúng có cấu tạo phân tử phức tạp, có hoạt

tính sinh học mạnh Hiện nay đã có hơn 12000 loại alkaloid được phân lập Trong cây, alkaloid tồn tại dưới 3 dạng: dạng tự do, dạng muối của các acid citric, lactic, oxalic, malic… và dạng oxit nitơ Alkaloid chỉ tập trung ở một

số ít loài thực vật, chủ yếu được tìm thấy trong các loài thực vật có hoa nhưng cũng chỉ 20% số loài thực vật này là sản sinh được ra alkaloid Đa số alkaloid không có mùi, vị đắng, một số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin)

Về vai trò sinh học, các alkaloid bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và các loại côn trùng, sâu bệnh ăn lá Trong y học, alkaloid được sử dụng làm thuốc ức chế hoặc kích thích hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hòa huyết áp, chữa loạn nhịp tim, thuốc diệt côn trùng, kháng khuẩn, thuốc chống ung thư và nhiều tác dụng quan trọng khác

Ba dạng alkaloid điển hình là:

N

N O

Năm 1973, Ingham đã đưa ra định nghĩa “Phytoalexin” để chỉ các chất kháng sinh được hình thành trong cơ thể thực vật thông qua một chuỗi liên tiếp các quá trình chuyển hóa trước những biến đổi sinh học hoặc để phản ứng lại với điều kiện môi trường nhằm thích nghi với điều kiện sống tốt hơn hay chống lại sự tấn công của côn trùng và vi sinh vật Phytoalexin được tìm thấy dưới nhiều dạng khác nhau như: alkaloid, flavonoid, glycoside, quinol, các tinh dầu…

1.2 Bệnh béo phì [2], [10], [17]

1.2.1 Khái niệm và phân loại bệnh béo phì

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn cơ thể, ảnh hưởng đến sức khỏe WHO thường dùng chỉ số khối BMI (Body Mass Index)

để nhận định tình trạng gầy béo Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức:

W: Cân nặng (kg) H: Chiều cao (m)

Để đánh giá mức độ béo phì, tổ chức Y tế thế giới đưa ra các ngưỡng sau:

Đối với người trưởng thành châu Âu (WHO - 1998):

Người gầy: BMI < 18,5 Bình thường: BMI từ 18,5 - 24,9 Béo phì độ I: BMI từ 25 - 29,9 Béo phì độ II: BMI từ 30 - 34,9 Béo phì độ III: BMI ≥ 35 Đối với người trưởng thành châu Á:

Người gầy: BMI < 18,5

Bình thường: BMI từ 18,5 - 22,9 Béo phì độ I: BMI từ 23 - 24,9 Béo phì độ II: BMI từ 25 - 29,9

Béo phì độ III: BMI ≥ 30

1.2.2 Thực trạng béo phì trên thế giới và Việt Nam [2], [10]

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) hiện nay số người béo phì trên thế giới đã lên đến 1,7 tỉ người, trong đó cứ 4 người trưởng thành thì có 1 người béo phì, tức là số người béo phì ở tuổi trưởng thành chiếm 25% Tình trạng béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động, không chỉ ở các nước phát triển

mà ở cả các nước đang phát triển Tỷ lệ người béo phì ở Mỹ chiếm hơn 30%, Trung Quốc có hơn 20% số người thừa cân và béo phì Số người thừa cân và béo phì cũng đang báo động ở châu Âu, đứng đầu là Anh với hơn 23% số người béo phì và châu Âu hiện có hơn 14 triệu trẻ em thừa cân, béo phì Ở châu Mỹ thì Braxin là nước có tỷ lệ người dân béo phì cao (chiếm khoảng 16%)

Theo tiêu chuẩn châu Á, Việt Nam hiện có 16,8% số người ở độ tuổi từ

25 - 64 thừa cân, béo phì Theo đó thì cứ 100 người trong độ tuổi trưởng thành thì có 17 người béo phì và tỷ lệ người béo phì ở thành phố gấp 3 lần ở nông thôn Tình trạng thừa cân, béo phì cũng tăng nhanh ở tuổi ngoài 45 (chiếm 2/3 số người béo phì) và nữ giới có tỷ lệ béo phì cao hơn nam giới Đối với trẻ em thì tình trạng béo phì cũng ở mức đáng ngại Theo kết quả điều tra của Viện dinh dưỡng: ở Hà Nội có 4,9% số trẻ ở độ tuổi từ 4 - 6 bị thừa cân, béo phì Ở Thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ này cao hơn nhiều, có tới 6% số trẻ dưới 5 tuổi và 22,7% số trẻ đang học cấp I bị thừa cân, béo phì Thực sự đây là mối đe dọa tiềm ẩn trong tương lai, ảnh hưởng đến sức khỏe của mỗi người và sự phát triển của kinh tế - xã hội

1.2.3 Nguyên nhân gây bệnh béo phì [8], [9]

Cơ thể giữ được cân nặng ổn định là nhờ trạng thái cân bằng giữa năng lượng do thức ăn cung cấp và năng lượng tiêu hao cho lao động cùng các hoạt động khác của cơ thể Cân nặng của cơ thể tăng lên dẫn đến béo phì có thể do chế độ ăn dư thừa vượt quá nhu cầu hoặc do nếp sống làm việc tĩnh tại ít tiêu hao năng lượng

Khẩu phần ăn và thói quen ăn uống: Năng lượng (calorie) được đưa

vào cơ thể qua thức ăn, đồ uống được hấp thụ và oxy hóa để tạo thành năng lượng Năng lượng ăn quá nhu cầu sẽ được dự trữ dưới dạng mỡ Chế độ ăn giàu chất béo (lipid) có liên quan chặt chẽ với gia tăng tỷ lệ béo phì Các thức

ăn này thường ngon nên người ta ăn quá thừa mà không biết Ngoài ra, ăn nhiều chất bột, đường, đồ ngọt cũng gây béo phì Việc thích ăn nhiều đường, các món xào, những thức ăn nhanh nấu sẵn và miễn cưỡng ăn rau quả là một đặc trưng của trẻ béo phì Thói quen ăn nhiều vào bữa tối cũng là một điểm khác nhau giữa người béo phì và người bình thường

Hoạt động thể lực kém: Cùng với yếu tố ăn uống, sự gia tăng tỷ lệ béo

phì song song với sự giảm hoạt động thể lực trong một lối sống tĩnh tại hơn, thời gian dành cho xem tivi, đọc báo, làm việc bằng máy tính, nói chuyện qua điện thoại nhiều hơn Kiểu sống tĩnh tại cũng giữ vai trò quan trọng gây nên béo phì Những người hoạt động thể lực nhiều thường ăn thức ăn giàu năng lượng, khi họ thay đổi lối sống và ít hoạt động nhưng vẫn giữ thói quen ăn nhiều đó cũng là nguyên nhân béo phì Điều này giải thích béo phì biểu hiện ở tuổi trung niên, hiện tượng béo phì ở các vận động viên sau khi giải nghệ và công nhân lao động chân tay có xu hướng béo phì khi về hưu

Yếu tố di truyền: Yếu tố di truyền có vai trò nhất định đối với những

trẻ béo phì mà có cha mẹ béo phì, tuy nhiên xét trên phương diện cộng đồng thì yếu tố này không lớn

Yếu tố xã hội: Ở các nước đang phát triển, tỷ lệ người béo phì ở tầng

lớp nghèo thường thấp (thiếu ăn, lao động chân tay nặng nhọc, phương tiện đi lại khó khăn) và béo phì thường được coi là một đặc điểm của người giàu có

Ở các nước phát triển, khi thiếu ăn không còn phổ biến nữa thì tỷ lệ béo phì lại thường cao ở tầng lớp nghèo do thói quen ăn uống thiếu khoa học Ở Việt Nam tỷ lệ béo phì thấp nhưng đang có khuynh hướng gia tăng nhanh ở các đô thị

1.2.4 Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì [2], [17]

Bệnh béo phì gây ra rất nhiều tác hại cho con người như:

Mất thoải mái trong cuộc sống: Người béo phì thường có cảm giác khó

chịu về mùa hè do lớp mỡ dày như một hệ thống cách nhiệt, mệt mỏi chung toàn thân, hay nhức đầu, tê buốt ở hai chân làm cho cuộc sống thiếu thoải mái

Giảm hiệu suất lao động: Người béo phì làm việc chóng mệt mỏi, nhất

là trong môi trường nóng Mặt khác do khối lượng cơ thể quá nặng nề nên để hoàn thành công việc, người béo phì mất nhiều thì giờ và công sức hơn người bình thường Hậu quả là hiệu suất lao động của người béo phì giảm rõ rệt

Kém lanh lợi: Người béo phì thường phản ứng chậm chạp hơn so với

người bình thường trong sinh hoạt cũng như lao động Do đó họ rất dễ bị tai nạn giao thông và tai nạn lao động

Hai nguy cơ rõ rệt ở người béo phì đó là:

- Nguy cơ thứ nhất là tỉ lệ bệnh tật cao: Béo phì là một trong các yếu tố nguy cơ chính của các bệnh mãn tính không lây như: rối loạn lipid máu, bệnh mạch vành, bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin, sỏi mật… Ở phụ

nữ mãn kinh, các nguy cơ ung thư túi mật, ung thư vú và ung thư tử cung tăng lên ở những người béo phì, còn ở nam thì bệnh ung thư thận và ung thư tuyến tiền liệt hay gặp hơn

Béo phì là yếu tố nguy cơ cho bệnh tim mạch: Các yếu tố nguy

cơ luôn đi kèm theo bệnh béo phì đối với tim mạch là tăng huyết áp và rối loạn lipid máu Nhưng cũng có những bằng chứng cho thấy béo phì còn là yếu tố nguy cơ độc lập đối với bệnh mạch vành Kannel - 1999 chứng minh mức độ béo phì có liên quan chặt chẽ đến tỉ lệ phát triển bệnh mạch vành Willet - 1995 lại thấy bệnh mạch vành đã bắt đầu phát triển ngay từ khi có tăng cân Nhiều nghiên cứu ở cả châu Âu và châu Á đều cho thấy khi tỉ lệ BMI tăng cao từ 25 - 29,9 kg/m2thì các bệnh như đái tháo đường, tăng huyết

áp và tăng lipid máu xuất hiện, còn khi BMI ≥ 30 kg/m2 thì bệnh mạch vành tăng lên rõ rệt

Béo phì và đái tháo đường type 2: Đái tháo đường type 2 có rất

nhiều yếu tố nguy cơ Về khía cạnh nào đó, bệnh là sự tổng hợp của nhiều yếu

tố nguy cơ Ở các nước Phương Tây tỷ lệ béo phì chiếm từ 5% đến 10% (lứa tuổi trên 40 tuổi) mắc bệnh đái tháo đường type 2, cá biệt có quốc gia tỷ lệ này còn cao hơn nữa Ở các quốc gia đang phát triển tỷ lệ thừa cân và béo phì cũng đang tăng nhanh Điểm đặc biệt ở khu vực này là béo phì xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi thiếu niên Béo phì được xem như là hậu quả của sự mất thăng bằng năng lượng, cung vượt cầu và hậu quả là rối loạn chuyển hóa lipid máu Đây cũng là yếu tố góp phần vào quá trình tăng đề kháng isulin, làm đái tháo đường type 2 phát triển Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các rối loạn chuyển hóa lipid có trước khi đái tháo đường lâm sàng xuất hiện nhiều năm

Đột quỵ Sức khỏe phụ nữ: Người ta thấy béo phì có thể làm cho tình trạng

của những rối loạn ở tuổi sau mãn kinh xấu hơn

Suy giảm chức năng hô hấp: Ở phụ nữ béo phì thường xảy ra

những cơn ngừng thở ngắn Người ta cũng thấy người béo phì có kèm theo tăng áp động mạch phổi và nguy cơ sau mổ

Rối loạn hoạt động cơ xương: Người béo phì thường bị đau lưng

nhất là ở phụ nữ

Ung thư: Theo Hiệp hội ung thư Mỹ, ở những người béo phì thì

yếu tố ung thư tăng 1,33 lần ở nam và 1,55 lần ở nữ Các nghiên cứu gần nhất cũng cho thấy tỷ lệ ung thư trực tràng ở người béo phì tăng cao so với người bình thường ở các nước châu Âu, mối liên quan này yếu hơn ở khu vực châu

Á - Thái Bình Dương

Bệnh túi mật: Người ta thấy nồng độ cholesterol tăng cao trong

muối mật ở người béo phì liên quan chặt chẽ đến sỏi mật Những bất thường

về gan, đặc biệt là thận nhiễm mỡ thường xảy ra ở người béo phì, tình trạng bất thường về men gan cũng được cải thiện nếu cân nặng giảm

Các vấn đề về bệnh lý tâm thần: Ở lứa tuổi vị thành niên quá

trình hình thành nhân cách của trẻ đang dần hoàn thiện vì thế các rối loạn tâm thần đặc biệt có hại đến sự phát triển của trẻ Ở các nước phương Tây, phụ nữ

và trẻ em béo phì có tỷ lệ phạm tội và liên quan đến hành vi gây rối xã hội cao hơn các đối tượng khác

Hậu quả của béo phì ở trẻ và vị thành niên: Đó là tăng tỷ lệ các

bệnh mãn tính như: rối loạn dung nạp glucose, tăng huyết áp, rối loạn chuyển hóa lipid máu, bệnh thoái hóa mỡ, các rối loạn tiêu hóa, ngừng thở ngắn khi ngủ Người ta cũng thấy có mối liên quan chặt chẽ giữa bệnh đái tháo đường type 2 với tỷ lệ thừa cân, béo phì ở trẻ trong khu vực châu Á - Thái Bình Dương, ngoài ra tỷ lệ bệnh mạch vành cũng khá cao ở đối tượng này

- Nguy cơ thứ hai là tỉ lệ tử vong cao, nhất là ở những bệnh kể trên

1.2.5 Giải pháp phòng và điều trị [2]

Phòng chống: Để phòng bệnh thừa cân, béo phì có hiệu quả buộc phải

có những chương trình quốc gia để quản lý, giám sát Phòng chống béo phì có

ba mục tiêu tiếp cận với ba mục đích khác nhau đó là:

Phòng bệnh ở cộng đồng: Chủ yếu là bằng tuyên truyền, giáo

dục để làm giảm cân nặng bằng cách: thay đổi lối sống, tăng hoạt động thể lực, giảm và bỏ hẳn thuốc lá, hạn chế rượu, bia và các thói quen có hại khác trong sinh hoạt

Phòng bệnh có chọn lọc: Tập trung vào nhóm người có yếu tố

nguy cơ dễ mắc bệnh béo phì Đối tượng này là những người có yếu tố gia đình, người lao đông tĩnh tại, làm việc nhiều với máy vi tính, người quá cân…

Phòng bệnh có mục đích cụ thể: Tập trung vào một mục đích là

chống tăng cân và những vấn đề có liên quan do tăng cân gây ra Thường những đối tượng này lại rất dễ mắc những bệnh như bệnh mạch vành, đái tháo đường type 2 nhưng họ lại chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán béo phì theo các tiêu chuẩn của WHO

Điều trị: Cho đến nay điều trị béo phì chủ yếu vẫn là thực hiện chế độ

ăn uống hợp lý và tăng hoạt động thể lực, những can thiệp y tế chỉ được đặt ra khi các biện pháp trên không có hiệu quả

Thay đổi về lối sống: Nhiều công trình khoa học đã chứng minh thay đổi lối sống bao gồm thực hiện hành vi ăn uống hợp lý, tăng hoạt động thể lực sẽ cải thiện được tình trạng thừa cân, béo phì

Chế độ ăn: Nguyên tắc:

- Chọn những thực phẩm phổ biến, tiện lợi vốn rất nhiều ở nước ta

- Phân bố bữa ăn hợp lý

- Số lượng thực phẩm cho một bữa ăn phù hợp, cố gắng không cần đến các bữa phụ

- Tỷ lệ dầu và mỡ chứa dưới 20 - 30%

- Tỷ lệ carbohydrate 55 - 65%

- Tỷ lệ Protein ≤ 15%

- Hoa quả tươi, rau tươi và các thức ăn tự nhiên phải được tăng cường

- Hạn chế uống rượu, bia

Tăng hoạt động thể lực: Là yếu tố quan trọng đảm bảo sự thành công Tăng hoạt động thể lực nhưng phải phối hợp với thực hiện chế độ ăn hợp lý Kế hoạch tăng cường hoạt động thể lực còn phải dựa vào tuổi, vào những ham muốn và sở thích cá nhân

Sử dụng thuốc: Thuốc chỉ nên dùng trong những trường hợp bắt buộc, phải xem thuốc là phương tiện trợ giúp cho chế độ ăn uống và luyện tập Thuốc giảm cân không được sử dụng vì mục đích thẩm mỹ mà chỉ được

sử dụng cho những bệnh nhân có BMI > 27 và khi ăn nhiều hoặc luôn có cảm giác đói là nguyên nhân chính gây tăng cân, nhiều yếu tố nguy cơ cùng xuất hiện như: rối loạn dung nạp glucose, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, nhiều biến chứng do béo phì đã xuất hiện như: viêm xương khớp, bệnh lý thực quản… Các loại thuốc thường được sử dụng hiện nay là:

- Metformin: có tác dụng giảm mỡ máu dẫn đến giảm trọng lượng nhưng cũng gây tác dụng phụ đường tiêu hóa, gây nhiễm toan lactic

- Orlistat: Ức chế lipase của tụy nhưng thuốc cũng gây suy giảm khả năng hấp thụ các vitamin tan trong mỡ vì thế khi dùng thuốc phải tăng chế độ ăn nhiều vitamin như rau tươi, hoa quả

- Các thuốc ức chế sự thèm ăn: ephedrine, caffeine

Phẫu thuật: Phương pháp này chỉ áp dụng đối với những bệnh nhân có BMI trên 35, kèm theo các bệnh lý và rối loạn liên quan Phẫu thuật mang lại thành công rất lớn, nhiều người giảm được 50% cân nặng trong vòng

1 - 2 năm đầu sau phẫu thuật, tuy nhiên nó cũng gây ra nhiều tác dụng phụ như suy nhược, khô da, rụng tóc tạm thời…

1.2.6 Rối loạn trao đổi Lipid máu [8], [9], [10], [17]

Theo các nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ những người mắc bệnh béo phì có nguy cơ mắc các bệnh về rối loạn lipid máu và xơ vữa động mạch cao Để xác định sự rối loạn lipid máu và xơ vữa động mạch, người ta dựa vào một số chỉ

số như: cholesterol máu, triglycerid, LDL (Low density lipoprotein - lipoprotein có tỷ trọng thấp), HDL (High density lipoprotein - lipoprotein tỷ trọng cao)

Cholesterol máu có vai trò rất quan trọng, giúp cho sự hoạt động của màng tế bào thần kinh, là tiền chất tổng hợp nên các hormon steroid (các hormon thượng thận, hormon sinh dục…) Cholesterol được tạo ra từ hai nguồn là: do cơ thể tự sản xuất (gan sản xuất 80%) và do thức ăn cung cấp Ở người bình thường, hàm lượng cholesterol máu luôn hằng định, khi nó tăng quá cao vì một lý do nào đó thì gây hiện tượng “tăng mỡ máu”

Cholesterol thực chất không hòa tan trong máu nên khi lưu thông chúng được bao bọc bởi một lớp áo protein (hay còn được gọi là lipoprotein) Có hai loại lipoprotein quan trọng là lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) và lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) LDL có vai trò vận chuyển và phân bố cholesterol cho các

tế bào Khi lượng LDL trong máu cao thì thành động mạch sẽ bị đóng mỡ gây

xơ vữa thành mạch, do đó chúng được gọi là cholesterol “xấu” Ngược lại, HDL có vai trò lấy cholesterol ra khỏi máu và ngăn không cho chúng xâm nhập vào thành động mạch nên được gọi là cholesterol “tốt”

Ngoài ra cũng cần chú ý tới một loại lipid khác đó là các triglycerid, chúng được cung cấp từ thức ăn Sự sinh tổng hợp triglycerid nội sinh diễn ra

ở gan và mô mỡ Trong mô mỡ chúng là nguồn dự trữ năng lượng chính của

cơ thể Ở những người béo phì, nồng độ acid béo tự do và triglycerid thường tăng cao trong máu gây hiện tượng “nhiễm độc mỡ”

1.3 Enzim lipase [14], [15]

Lipase, do tuyến tuỵ tiết ra, được hoạt hoá bởi acid mật, có tác dụng thuỷ phân liên kết este của acid béo và glycerol trong triglycerid (TG) (hình 1.1)

Lipase tách các acid béo (AB) khỏi triglycerid với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vị trí của acid béo trong phân tử triglycerid Do Lipase chỉ đặc hiệu với liên kết 1 và 3 của TG nên sự thuỷ phân 2-monoglycerid (MG) đòi hỏi sự vận chuyển AB sang vị trí C1 của glycerol trước khi được thuỷ phân Các AB ở vị trí 1 và 3 được tách ra đầu tiên, acid béo ngắn (butyrat) được tách ra trước những AB dài (palmitat)

Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn Gram âm, hình que, có kích thước

(1,1 - 1,5)µm × (2 - 6)µm, là loại yếm khí tùy tiện Đa số các vi khuẩn này phát triển trong khoảng nhiệt độ 15 - 200C, có thể tồn tại rất lâu trong môi trường acid và nhiệt độ thấp tốt hơn các vi khuẩn khác Chúng nhiễm vào trong hoặc ngoài ruột chủ yếu từ thực phẩm và là nguyên nhân gây một số bệnh cho người như: tiêu chảy, viêm ruột, viêm đại tràng, viêm đường tiết liệu, đường hô hấp, viêm não, viêm nhiễm tạo mủ nhiều nơi

Lipase

(Rất nhanh)

Lipase (Nhanh) Isomerase

Lipase (Rất nhanh)

OH

OH

OH Glycerol

E.coli có khả năng kháng lại các loại kháng sinh cổ Khả năng này của

chúng có thể được hình thành do đột biến gen, di truyền qua các thế hệ, tiếp hợp hoặc do biến đổi thành và màng tế bào

1.4.2 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là đại diện cho nhóm cầu khuẩn Gram dương

không sinh bào tử Nếu một loại kháng khuẩn nào có tác dụng với

Staphylococcus aureus thì cũng có thể có tác dụng với các loại cầu khuẩn

khác (Streptococcus, Diphlococcus) Staphylococcus aureus thường gây nhiều

loại bệnh như: mụn nhọt, đầu đinh, chín mé, viêm họng, viêm phổi, viêm xương, có thể gây nhiễm trùng huyết rất nguy hiểm và gây nhiễm độc thực phẩm Loại vi khuẩn này sống tương đối lâu và có thể kháng nhiều loại kháng

sinh

1.4.3 Salmonella typhi

Salmonella typhi là vi khuẩn Gram âm, hình que, có nhiều lông, sống kị

khí tùy tiện, có thể di động Vi khuẩn này xâm nhập vào cơ thể người, tập trung chủ yếu ở ống tiêu hóa và gây bệnh thương hàn

1.4.4 Bacillus subtilis

Bicillus subtilis đại diện cho nhóm trực khuẩn Gram dương, là tác nhân

gây một số bệnh cho cây trồng Chúng sinh bào tử, sống hiếu khí và không gây bệnh cho người

1.5 Vài nét về cây táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne) [5]

1.5.1 Đặc điểm hình thái, phân bố

Cây táo mèo hay còn gọi là chua chát, có tên khoa học là Docynia

indica (Wall.)Decne, thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) Cây nhỡ cao khoảng

5m, nhánh và thân non có gai, lá có phiến, có thùy Lá ở nhánh già không có thùy, thon, dài 7 - 10cm, lá non có lông dày, mép lá có răng nhỏ, gân phụ có 6

- 10 cặp, lá kèm mau rụng

Tán 1 - 3 hoa, cuống ngắn, đài dày lông trắng, mịn, phiến nhọn, cánh hoa mỏng, không có lông, nhị ngắn, vòi nhụy 5, dính nhau, bầu nhiều noãn Quả thịt, tròn hay hình trứng, màu vàng vàng, vỏ quả trong cứng

Mùa ra hoa tháng 2 - 4, quả tháng 7 trở đi Tái sinh bằng hạt, chồi hoặc chiết cành

Loài phân bố ở Xích Kim, Mianma, Thái Lan, Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc Ở nước ta, cây mọc hoang trong rừng núi cao giữa 1500 và 2000m ở Lai Châu, Lào Cai, Nghĩa Lộ, Sơn La Cây được trồng nhiều lấy quả Thu hái vào mùa thu, thái mỏng, phơi khô Hiện nay, táo mèo không chỉ được dùng để ăn mà còn có tác dụng chữa bệnh nên người ta đã đem về trồng

và trở thành một mặt hàng có giá trị lớn mang lại lợi ích kinh tế, cải thiện đời sống cho người dân địa phương

Hình 1.2 Quả táo mèo

1.5.2 Tác dụng dược lý [1], [5], [6]

Quả táo mèo có vị chua chát, tính ấm, ăn được Trong Đông y, quả được dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa (giúp ăn ngon hơn, dễ tiêu), chữa bệnh cao huyết áp, tăng cường sức miễn dịch cho cơ thể, chữa ho, trấn tĩnh,

an thần… Khi làm thuốc, táo mèo có tính năng giống như vị thuốc sơn tra Trong những bài thuốc chứa sơn tra có thể dùng táo mèo thay thế mà vẫn đạt kết quả tốt Tuy nhiên, chi tiết về các hợp chất tự nhiên trong quả táo mèo có tác động đến quá trình chuyển hóa lipid, béo phì và rối loạn trao đổi gluxit chưa có tài liệu nào nghiên cứu đầy đủ Vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là nghiên cứu hiệu quả giảm mỡ máu, giảm đường huyết và tác động đến enzyme chuyển hóa lipid (enzyme lipase) của dịch chiết các hợp chất tự nhiên

từ quả táo mèo trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Quả, lá táo mèo (Docynia indica (Wall.)Decne): được thu hái vào tháng

9 năm 2008, tại huyện Văn Chấn - tỉnh Yên Bái Sau đó được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột mịn Mẫu khô được ngâm với ethanol 90% ở nhiệt

độ phòng (quá trình chiết được lặp lại 3 lần) Hỗn hợp này được lọc bằng giấy lọc Phần nước lọc được ly tâm ở 10.000 vòng trong 10 phút để loại bỏ cặn Dịch chiết EtOH được cất loại dung môi dưới áp xuất giảm thu được cao ethanol, sau đó được xử lý tiếp tục với các dung môi khác nhau: n-hexan, chloroform, ethylacetate

2.1.2 Nguyên liệu động vật và vi sinh vật

Chuột nhắt trắng: chủng Swiss (14g/con) 4 tuần tuổi được mua tại Viện

vệ sinh Dịch tễ TW sau đó tiếp tục nuôi theo 2 chế độ thức ăn là thức ăn chuẩn và thức ăn chứa lipid, cholesterol cao (thức ăn được phối chế từ sữa Hà Lan nguyên kem, đậu tương, mỡ lợn, lòng đỏ trứng , theo tỷ lệ dinh dưỡng

và tính toán dựa vào tài liệu của Viện Dinh dưỡng Quốc gia)

Các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Salmonella typhi, Bacillus subtilis do Bộ môn Vi sinh vật, trường Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại Học Quốc gia Hà Nội cung cấp

2.1.3 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Dụng cụ thí nghiệm: tủ sấy, máy cô thu hồi dung môi, máy quang phổ

UV - VIS 1000, máy xác định các chỉ số lipid và glucose máu OLYMPUS (Nhật Bản) cùng các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm như: bình nón, ống đong, cân điện tử…

Hóa chất thí nghiệm: Hóa chất tinh khiết dùng để phân tích được mua của các hãng có uy tín (Prolabo, Sigma, Merck…) như: n-hexan, chloroform, ethylacetate, ethanol…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của quả và lá táo mèo

2.2.1.1 Thử định tính Flavonnoid [15], [16]

Phản ứng Shinoda: Pha mẫu thử trong ethanol với một lượng thích hợp,

cho thêm vài giọt acid chlohidric đặc rồi chia dung dịch thành 2 ống nghiệm:

Ống 1: dùng làm đối chứng

Ống 2: thêm vài mảnh Mg, đun trên nồi cách thủy trong vài phút

Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam

Phản ứng diazo hóa: Dung dịch thử được pha tương tự như trên Chia

dung dịch vừa nhận được vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: dùng làm đối chứng

Ống 2: nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo

Kết quả cho màu da cam là phản ứng dương tính

Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch thử được pha tương tự như

trên Chia dung dịch nhận được vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: dùng làm đối chứng

Ống 2: nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%

Phản ứng cho kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam

Phản ứng với acid sunfuric: Dung dịch thử cũng được pha tương tự

như trên Chia dung dịch nhận được vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: dùng làm đối chứng

Ống 2: nhỏ thêm vài giọt acid sufuric

Phản ứng có màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

2.2.1.2 Thử định tính tannin

Phản ứng vanillin: Dung dịch thử được pha như trên, sau đó chia dung

dịch nhận được vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: dùng làm đối chứng

Ống 2: nhỏ thêm vài giọt thuốc thử vanillin/H2SO4 Phản ứng dương tính khi dung dịch thu được có màu đỏ đậm

Phản ứng gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu,

phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục

thuốc thử đã được pha loãng bằng EtOH 96% Phản ứng dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen

Phản ứng với acetate chì: Cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào

dung dịch mẫu Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

2.2.1.3 Thử định tính alkaloid

Hòa tan 0.01g cao dịch chiết vào trong 1ml H2SO4 loãng, lọc qua giấy lọc thu được dịch lọc Lấy 1ml mẫu cho vào mỗi ống nghiệm để làm phản ứng với các thuốc thử:

Thuốc thử Dragendorff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): nhỏ từ từ thuốc thử vào ống nghiệm Trong môi trường acid thì alkaloid cho kết tủa màu đỏ da cam hay đỏ gạch

Thuốc thử Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nước): Với hỗn hợp HgCl2 và KI trong thuốc thử Mayer sẽ phản ứng với alkaloid trong nước cho kết tủa ánh vàng vô định hình

Thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm

ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh Nếu một chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì nó di chuyển chậm hơn trong pha tĩnh, ngược lại một chất có ái

lực thấp với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn trong pha tĩnh Khả năng hòa tan của chất trong pha động càng lớn thì chất càng di chuyển nhanh hơn do chuyển động của pha động Như vậy, các chất khác nhau được phân tích tách rời là do chúng có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh

Chúng tôi tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sillicagel Merck Alufolien 60 F254, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% Hệ dung môi chạy sắc ký: TEAF: 5:3:1:1 (Toluen - Ethylacetate - Acetone - Acid Fomic)

Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b

Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất polyphenol trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp phụ trên máy ERME ở bước sóng λ = 765nm, dùng acid gallic làm chất chuẩn để tính lượng polyphenol tổng số

- Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh Thể tích tổng số dung dịch gốc là 100ml (cồn 90%) Như vậy, 1ml dung dịch gốc acid gallic chứa 5mg (5mg acid gallic/ml)

- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml

Tiến hành xây dựng đường đồ thị chuẩn acid gallic như sau:

- Chuẩn bị cóng định lượng theo tỷ lệ 0, 1, 2, 3, 5 và 10ml, sau đó dẫn nước cất tới 100ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500mg/l acid gallic

- Cho vào mỗi cóng định lượng 20µl mẫu thử + 1,58ml H2O + 100µl thuốc thử Folin - Ciocalteau, sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300µl Na2CO3

Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2h ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

Bảng 2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

y = 0,001x + 0,0128

2.2.4.1 Dụng cụ

- Đĩa petri: đường kính 9cm, đáy phẳng, lượng thạch 25ml/đĩa

- Dung dịch nghiên cứu: dịch chiết của các phân đoạn cao cồn, n-hexan, chloroform, ethylacetate được pha trong đệm PB 0,02M (pH = 7,4)

theo nồng độ 0,03mg/ml đệm và được khử trùng ướt trước khi cấy trên thạch

2.2.4.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Agar: 20g

- Pepton: 5g

- Nước mắm: 20ml

- Nước cất

Lấy 20g agar hòa tan trong 800ml nước cất, thêm 5g pepton, 20ml

nước mắm, sau đó đổ thêm nước cất cho đủ 1000ml Đun hỗn hợp trên sôi

trong 1 giờ rồi chia vào các bình tam giác đem khử trùng ở 1 atm trong 2 giờ

Sau khi khử trùng, môi trường được đổ vào các đĩa petri đã được khử trùng

2.2.4.3 Tiến hành

Vi sinh vật được nuôi cấy lắc trong môi trường thạch thường dịch thể

trong 24 giờ để khởi động giống Giống khởi động được cấy gạt vào mỗi

trường rắn trên các đĩa petri đã chuẩn bị trước Sau đó đục giếng trên đĩa

petri

Các phân đoạn dịch chiết được pha trong đệm PB 0,02M (pH = 7,4) rồi

được tra vào các giếng Để các đĩa petri trong 40C cho dịch chiết khuếch tán

đều trong thạch rồi cho vào tủ ấm 370C Đọc kết quả đường kính vòng kháng

khuẩn sau 24 - 36 giờ

2.2.5 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và chống béo phì của các phân

đoạn dịch chiết từ quả táo mèo

2.2.5.1 Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết

Mô hình chuột béo phì thực nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss 4 tuần tuổi với khối lượng ban đầu là 14g/con, được chia thành nhiều lô và nuôi tiếp theo chế độ thức ăn tiêu chuẩn và thức ăn có hàm lượng chất béo, cholesterol cao

- Lô nuôi thường: cho ăn thức ăn thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) được gọi là lô đối chứng âm

- Các lô còn lại: cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột Hà Lan nguyên kem, đậu tương, lòng đỏ trứng, mỡ nước… và được tính theo chuẩn của Viện Dinh dưỡng Quốc gia

- Thời gian nuôi chuột là 4 tuần

Bảng 2.2 Thành phần thức ăn giàu lipid

Thành phần thức ăn được tính toán dựa trên thành phần dưỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện dinh dưỡng Quốc gia Việt Nam và một số tài liệu khác

Sau 4 tuần nuôi, tiến hành cân trọng lượng và lấy máu xét nghiệm một

số chỉ số hóa sinh như: glucose máu, lipid máu gồm cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL

Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số hóa sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm: Chuột sau khi nuôi bằng mô hình

béo phì thực nghiệm, tiến hành làm thí nghiệm tiếp Chuột béo phì được chia làm 5 lô, mỗi lô gồm 6 con, cao của các phân đoạn dịch chiết quả táo mèo được hòa vào nước cất rồi cho chuột uống hàng ngày vào buổi sáng Các lô được bố trí như sau:

Lô 1: chuột béo phì không điều trị, chỉ cho uống nước muối sinh lý (0,9% NaCl) được gọi là lô đối chứng dương

Lô 2: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethanol (650mg/kg)

Lô 3: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn chloroform (650mg/kg)

Lô 4: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethylacetate (650mg/kg)

Lô 5: chuột béo phì cho uống Metformin - một loại thuốc chữa béo phì

và tiểu đường type 2 với liều 500mg/kg thể trọng

Sau 16 ngày điều trị, tôi tiến hành xác định trọng lượng và lấy máu chuột để phân tích một số chỉ số hóa sinh: glucose, cholesterol, triglycerid HDL, LDL, lipase

2.2.5.2 Phương pháp định lượng glucose [10], [15], [17]

Định lượng glucose huyết bằng kỹ thuật enzyme Glucose bị oxy hóa nhờ xúc tác của enzyme có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy One touch Ultra do hãng Johnson & Johnson sản xuất

Nguyên lý: Khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, glucose (trong máu) sẽ phản ứng với oxy (trong không khí), nhờ xúc tác của enzyme glucose oxidase (có trên bề mặt vùng phản ứng của giấy thử) tạo acid gluconic và peroxide hydrogen (H2O2) H2O2 vừa tạo thành sẽ oxy hóa thuốc nhuộm trên bề mặt vùng phản ứng làm biến đổi màu của giấy thử ở đó (từ màu kem chuyển dần sang màu xanh) Mức độ đậm của màu xanh tùy thuộc

vào nồng độ glucose chứa trong mẫu máu

2.2.5.3 Định lượng triglycerid huyết thanh [3], [15]