Nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica forsk.) (LV00714)

Đái tháo đường Diabetes mellitus là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị, ngày càng trở thành

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay tốc độ phát triển kinh tế ngày càng mạnh, đời sống vật chất và tinh thần ngày càng tăng cao, kéo theo đó là sự phát triển nhanh của một số loại bệnh có tác động xấu đến chất lượng cuộc sống của con người Trong số

đó có tình trạng thừa cân, BP và ĐTĐ

Béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng đến sức khỏe như: bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tiểu đường, đột quỵ, giảm khả năng sinh sản, giảm chức năng hô hấp, tăng viêm xương, khớp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa, ….[16]

Đái tháo đường (Diabetes mellitus) là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị, ngày càng trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới

Đái tháo đường với biểu hiện chung nhất là tăng glucose huyết do tế bào β của đảo tụy Langerhan bị phá hủy mất khả năng sản xuất insulin (ĐTĐ typ I) hoặc do rối loạn trao đổi lipid-glucid dẫn đến đối kháng insulin (ĐTĐ typ II) [1]

Bệnh đái tháo đường và BP có quan hệ chặt chẽ, trong đó ĐTĐ là hậu quả của BP (Obesity) và thừa cân quá mức [24]

Y học hiện đại đã cho ra đời nhiều loại thuốc chữa ĐTĐ hiệu quả như insulin, biguanid… Tuy nhiên các loại thuốc này có nhiều tác dụng phụ và chi phí điều trị đắt đỏ

Chính vì thế, WHO khuyến cáo nghiên cứu phát triển các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược, với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng,

giá thành rẻ, ít tác dụng phụ, dễ được cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nước kém phát triển và đang phát triển

Thực tế có nhiều loại thảo dược có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh BP và ĐTĐ Trong đó cây rau muống, một thực phẩm quen thuộc ở nhiều quốc gia trên thế giới đã được nghiên cứu chứng tỏ về khả năng điều trị ĐTĐ rất tốt Điển hình là các nghiên cứu ở Trung Hoa, Vienna (Áo), Viện Đại Học North Carolina State University [6]…

Ở nước ta, những nghiên cứu về các dược liệu điều trị bệnh ĐTĐ và BP được bắt đầu từ khoảng 5 năm trở lại đây [15], [16], [18], đáng chú ý là ở 4 trung tâm lớn: Đại học Y Hà Nội, Đại học Dược Hà Nội, Đại học Quốc Gia

Hà Nội và Viện Dược Liệu Trung Ương

Các nhà nghiên cứu Việt Nam đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của nhiều dược liệu, trong đó có những vị thuốc cổ truyền lâu đời như Mướp đắng, Thổ phục linh, và những cây thuốc hoàn toàn mới phân bố rất nhiều tại Việt Nam Không chỉ dừng ở những nghiên cứu sàng lọc tác dụng của chất hoạt tính từ thực vật trên động vật thí nghiệm, nhiều nghiên cứu đã bước đầu đi vào tách, tinh chế các thành phần hoạt chất từ những dược liệu có tác dụng chữa bệnh ĐTĐ

Gần đây, các nghiên cứu bước đầu đã cho thấy một số hoạt chất trong các phân đoạn dịch chiết của vài loài thực vật thuộc họ chua me (Oxali daceae),

Tử vi (Lythra ceae), họ Cam chanh (Rutaceae) có chất lượng cao trong điều trị bệnh BP và ĐTĐ

Ở Việt Nam cây rau muống cũng được biết đến trong việc chữa một số bệnh giải nhiệt, giải độc, thông máu bổ máu, lợi tiểu, nhuận trường …trị các chứng đau dạ dày, xuất huyết, máu cam… [7]

Tuy nhiên việc nghiên cứu đặc tính hóa sinh, y dược của các hoạt chất thiên nhiên từ đối tượng này chưa được nghiên cứu một cách thỏa đáng Chính

vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu tách chiết một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ

cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo mô hình chuột BP và gây ĐTĐ

- Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết

từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) trên mô hình chuột gây ĐTĐ

bằng STZ

- Đánh giá khả năng ổn định rối loạn trao đổi glucid-lipid của một số

phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) trên chuột

ĐTĐ thực nghiệm

4 Đóng góp mới của đề tài

Cung cấp một số dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học, hàm lượng các nhóm hợp chất hữu cơ, khả năng chống BP của phân đoạn dịch chiết từ

cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Hợp chất phenolic

Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [25]

Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng

benzene và một vài nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…)

Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử

của chúng ngoài vòng thơm benzene (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic

Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các hợp

chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin

1.1.1.1 Flavonoid thực vật

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng

Flavonoids là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và hai vòng benzen liên kết bởi một đường thẳng có 3 cacbon

Flavonoid gồm 2 vòng thơm và một vòng pyran

*Hoạt tính sinh học của flavonoid

Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant): flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây truyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Những flavonoid có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của các enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo thành dạng semiquinon hoặc quinon

O2 + Flavonoid (dạng khử) polyphenoloxydase Flavonoid (dạng oxy hóa) (dạng Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon)

H2O2 + Flavonoid (dạng khử) Peroxydaxe Flavonoid (dạng oxy hóa) (dạng Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon) +H2O

- Flavonoid có khả năng điều hòa hoạt động enzyme do khả năng liên kết với nhóm amin trong phân tử protein, làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme do đó tạo hiệu ứng điều hòa dị lập thể

- Flavonoid có tính kháng khuẩn, kháng virut, tăng khả năng đề kháng của cơ thể do kích thích lympho bào, tăng sản xuất interferon, ức chế hiện tựơng thoát bọng (digramilation)

- Flavonoid có hoạt tính của vitamin pp, làm tăng tính bền và đàn hồi của thành mạch, giảm sức sống của mao mạch

- Flavonoid có tác dụng chống ung thư do kìm hãm các enzyme oxy hóa khử, quá trình đường phân và hô hấp, kìm hãm phân bào, phá vỡ cân bằng trong quá trình trao đổi chất của tế bào ung thư

- Tác dụng giảm BP và lipid máu

- Tác dụng hạ glucose huyết

1.1.1.2 Tannin thực vật

Tannin (tannin , tannoid) là một chất làm se, có mặt trong cấu trúc tế

bào thực vật chúng có thể là một dạng polyphenolic đóng vai trò là hợp chất liên kết và kết tủa protein cũng như các hợp chất hữu cơ khác nhau bao gồm

cả axit amin và alkaloids

Các hợp chất tannin được phân phối rộng rãi ở nhiều loài thực vật Chúng đóng một vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật chống lại sự ăn thịt Đồng thời góp phần quy định tăng trưởng thực vật Tương tự như vậy, sự phá hủy hoặc sửa đổi của các tannin với thời gian đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chín của trái cây

Tannin được tìm thấy ở các loài trong thế giới thực vật Tannin được tìm thấy trong lá, chồi, hạt, rễ, và các mô gốc Trong tế bào gốc tannin thường được tìm thấy trong các giai đoạn tăng trưởng của cây, chẳng hạn như phloem và xylem thứ cấp và lớp giữa vỏ và lớp biểu bì Tannin có thể giúp điều chỉnh sự phát triển của các mô

Các polyphenol có nhiều nhất là tannin cô đặc , được tìm thấy trong hầu như tất cả các cơ quan thực vật, chiếm 50% trọng lượng khô của lá.Tannin có trọng lượng phân tử khác nhau, từ 500 đến hơn 3.000 ( axit galic este ) và lên đến 20.000 (proanthocyanidins) Tannin là không tương thích với chất kiềm , gelatin , kim loại nặng, sắt , nước chanh , muối kim loại, chất oxy hóa mạnh và sulfat kẽm

Cơ sở Đơn

vị:

Gallic axit

Flavone

Phloroglucinol

Các đơn vị cấu thành chính của tanin

1.1.1.3 Hợp chất coumarin

Coumarin là chất của α-purone có cấu trúc C6 - C3 dị vòng chứa oxy Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm [30] Tính chất hóa học đặc trưng là dễ dàng kết hợp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước

Coumarin Coumarin sử dụng trong đời sống hằng ngày như làm nước hoa, hương liệu, làm chất chống đông máu và chất diệt loài nhặm nhấm Trong y học dẫn xuất của coumarin có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, ngăn cản đột quỵ Một số coumarin khác có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán và giảm đau

1.1.2 Alkaloid

Alkaloid là hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật Đa số các alkaloid thành phần chứa oxy ở thể rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin) Alkaloid thường không có màu, không mùi và vị đắng Một số alkaloid có màu vàng như berberin, palmitin Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước [40]

O H

O H

Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết định Chúng phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng vàng) hay Dragendroff (cam) Có khoảng 20% loài thực vật có hoa có khả năng sinh alkaloid Trong y học nhiều thuốc chữa bệnh có thành phần alkaloid như thuốc gây kích thích hoặc ức chế hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hòa huyết áp, chữa rối loạn nhịp tim… Một

số nghiên cứu gần đây cho thấy các alkaloid chiết từ thực vật cũng có tác

dụng hạ glucose huyết như: Berberin (Tinosporacordifolia, Coptis sinensis), Casuarine 6-O-α- glucoside (Syzygium malaccense)

1.1.3 Steroid

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau Ví dụ về các steroid bao gồm các chất béo ăn cholesterol, hormon sinh dục estradiol, testosterone, và thuốc chống viêm dexamethasone

Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử cacbon liên kết với nhau mang hình thức của bốn vòng hợp nhất: ba vòng cyclohexane (được xem như là vòng A, B, và C) và một vòng cyclopentane (vòng D) Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với cốt lõi bốn vòng và oxi hóa của các vòng

Steroid là các hợp chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và bao gồm cả các sterol và axit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính Một số steroid có nguồn gốc thiên nhiên như: hợp chất digitalis và các tiền chất của một số loại vitamin nhất định Steroid rất đa dạng và phong phú, bao gồm các hình thức của một số loại vitamin D, digitalis, sterol (ví dụ: cholesterol) và các axit mật Các sterol là các dạng đặc biệt của các steroid, với một nhóm hydroxyl tại vị trí 3 và một khung lấy từ cholestane Hàng trăm steroid

riêng biệt được tìm thấy ở thực vật, động vật và nấm Tất cả các steroid được sản xuất ở các tế bào từ các sterol lanosterol (động vật và nấm) hoặc

từ cycloartenol (thực vật) Cả lanosterol và cycloartenol lấy từ cyclization của triterpene squalene

1.1.4 Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất ,được hình thành từ quá trình polymer hóa các tiểu đơn vị isopren 5C (C5H8) ,có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n .Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate)/mevalonate hoặc con đường glyceraldehydes 3-phosphate/pyruvate Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd

1.2 Bệnh béo phì (Obesity)

Bệnh BP (obesity) được tổ chức y tế thế giới WHO định nghĩa là: tình trạng tích lỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân tới mức ảnh hưởng tới sức khỏe Tổ chức này dùng chỉ số khối cơ thể BMI (Body Mass Index) để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt mỡ của mỗi người

Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức sau:

2

W

BMI H

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện nay số người BP đã lên tới 1.7

tỉ người [3], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn gặp ở các quốc gia đang phát triển Mỹ là nước có số dân mắc bệnh cao nhất thế giới, khoảng 60 triệu người (chiếm 30% dân số ), tăng gấp 3 lần so với điều tra năm 1991 Ở châu Âu, Anh là quốc gia đứng đầu bảng với 23% dân số Theo

số liệu 2010, khoảng 171 triệu trẻ em trên thế giới bị còi do thiếu ăn, chế độ thiếu vitamin và khoáng chất, chăm sóc trẻ không đầy đủ và bệnh tật Tại châu Á tỉ lệ thừa cân BP ở một số nước như: Thái Lan 3.5%, Philipin 4.27%, Malaysia 3.01%, Nhật 3%, Trung Quốc 2%, Hồng kông 3%

* Ở Việt Nam:

Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn cho người châu Á, số người thừa cân BP cũng tăng theo thời gian Năm 1991 theo điều tra của Lê Huy Liệu [17] và

cộng sự thì tỉ lệ thừa cân mắc bệnh BP nói chung tại Hà Nội là 1.1% Đến năm 2000 con số này đã là 2.62% tăng gần 2.5 lần trong vòng 10 năm [điều tra của Lê Văn Hải) [17]

Năm 2007, Viện dinh dưỡng Quốc gia điều tra trên đối tượng người trưởng thành 25-64 tuổi cho thấy tỉ lệ thừa cân BP là 16.8% và còn có xu hướng tăng lên Theo Viện trưởng TS Nguyễn Công Khẩn thì tỉ lệ này ở thành thị lớn hơn nông thôn, ở nữ giới cao hơn nam giới Trẻ em Việt Nam cũng có 16.3% mắc thừa cân BP [24] Hà Nội có 4.9% trẻ 4-6 tuổi mắc bệnh, Thành Phố Hồ Chí Minh 6% trẻ dưới 5 tuổi và 22.7% học sinh tiểu học cũng mắc vào tình trạng này Với những hiểu biết hiện nay, thừa cân, BP được coi

là những đối tượng “nghiễm nhiên” tiến tới ĐTĐ type 2, đặc biệt với những người có chỉ số BMI cao lại có vòng eo lớn - béo trung tâm [13] Trước tình hình đó bộ y tế đã ký quyết định thành lập “ Trung tâm phục hồi dinh dưỡng

và kiểm soát BP” trực thuộc viện dinh dưỡng, chính thức tuyên chiến với bệnh BP

1.2.2 Tác hại của bệnh béo phì

Tình trạng thừa cân và BP đã và đang trở thành một nguy cơ của sức khỏe Tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, tình trạng này đang tăng lên nhanh chóng trong những năm gần đây nhất là ở trẻ em bên cạnh một

số lượng không nhỏ các bệnh nhân bị suy dinh dưỡng

Thừa cân BP là nguyên nhân làm gia tăng bệnh lý mạn tính nguy hiểm như tim mạch, tăng huyết áp, ĐTĐ trong đó hệ xương khớp là một trong những căn bệnh chịu tác hại nghiêm trọng của tình trạng này [14], [18], [23], [41] 1.2.3 Nguyên nhân gây béo phì

Béo phì do nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể kể đến những nguyên nhân chủ yếu sau:

- Thói quen ăn uống

- Thói quen vận động

- Yếu tố “di truyền”

1.2.4 Giải pháp và điều trị bệnh béo phì

Để phòng bệnh BP có hiệu quả, mỗi cá nhân cần nâng cao nhận thức

về dinh dưỡng và hoạt động thể lực Trên phạm vi xã hội, việc phòng bệnh cần tập trung vào nhóm có nguy cơ mắc bệnh này [9], [23], [25]

Điều trị thừa cân BP dựa trên nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn uống, luyện tập và dùng thuốc Trong đó thuốc và phẫu thuận chỉ dùng trong trường hợp bắt buộc

1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid

1.2.5.1 Khái niệm

Rối loạn lipid máu là tình trạng tăng cholesterol, triglycerides (TGs) huyết tương hoặc cả hai, hoặc giảm nồng độ lipoprotein phân tử lượng cao, tăng nồng độ lipoprotein phân tử lượng thấp làm gia tăng quá trình xơ vỡ động mạch Nguyên nhân có thể tiên phát (do di truyền) hoặc thứ phát Chẩn đoán bằng xét nghiệm cholesterol, triglycerides và các thành phần lipoprotein máu Điều trị bằng thay đổi chế độ ăn uống, hoạt động thể lực và dùng thuốc

hạ lipid máu

1.2.5.2 Phân loại

Rối loạn lipid máu phân loại kinh điển dựa trên đặc điểm tăng nồng độ lipid và lipoprotein máu Trên thực hành lâm sàng, phân loại rối loạn lipid máu dựa trên những rối loạn tiên phát hoặc thứ phát và tính chất tăng lipid máu, ví dụ tăng cholesterol đơn thuần, tăng TGs đơn độc hay tăng cả cholesterol và TGs (tăng lipid máu hỗn hợp) Phân loại này có bất cập là không tính đến các bất thường của lipoprotein (ví dụ giảm HDL hoặc tăng LDL) mà đây là những rối loạn có thể gây ra các biến cố tim mạch mặc dù cholesterol và TGs máu bình thường [19], [26], [27], [36]

1.2.5.3 Nguyên nhân và triệu trứng rối loạn lipid

- Nguyên nhân gây rối loạn lipid máu có thể là nguyên phát (do các bệnh

về gen) hoặc thứ phát (do thói quen ăn uống, sinh hoạt hoặc một số bệnh lý)

- Rối loạn lipid máu thường không có triệu chứng đặc trưng Hầu hết là những triệu chứng “mượn” của các cơ quan khác vì xơ vỡ động mạch là một bệnh toàn thân Bệnh nhân có thể biểu hiện bằng các triệu chứng của bệnh tim mạch như bệnh mạch vành (BMV), bệnh mạch máu ngoại biên, bệnh động mạch cảnh Nồng độ TGs cao (> 1000 mg/dL [> 11.3 mmol/L]) có thể gây viêm tụy cấp LDL-c có thể gây ra u mỡ vàng bám ở mi mắt; giác mạc, gân Achilles, khuỷu tay, khớp gối Rối loạn betalipoprotein có thể có u mỡ vàng ở lòng bàn tay hoặc thân người Triglycerides máu tăng quá cao (> 2000 mg/dL [> 22.6 mmol/L]) còn có thể gây ra những mảng trắng như kem ở động, tĩnh mạch võng mạc Ở mức độ cực kỳ cao, TGs có thể làm huyết tương trắng như sữa Triệu chứng có thể gặp là bệnh nhân khó thở, lẫn lộn, dị cảm…[19], [26], [27], [36]

1.2.5.4 Chẩn đoán và điều trị

- Rối loạn lipid máu được đặt ra ở những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng hoặc biến chứng của rối loạn lipid máu (ví dụ bệnh xơ vỡ động mạch) Rối loạn lipid tiên phát được nghi ngờ ở những bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng của rối loạn lipid máu, bệnh xơ vỡ động mạch xuất hiện sớm (trước 60tuổi), tiền sử gia đình có người mắc bệnh động mạch hoặc cholesterol máu

> 240 mg/dL (> 6.2mmol/L) Chẩn đoán xác định bằng xét nghiệm các thành phần lipid máu: cholesterol toàn phần (TC), HDL-cholesterol (HDL-c) và LDL-cholesterol (LDL-c)

1.3 Bệnh đái tháo đường

1.3.1 Khái niệm và phân loại

1.3.1.1 Khái niệm

Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng rối loạn chuyển hóa cacbohydrat có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất

hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin

ĐTĐ là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose trong máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin hoặc cả hai Tăng glucose máu mạn tính thường kết hợp với

sự hủy hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu [11,26]

ĐTĐ trong giai đoạn mới phát thường làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, cắt cụt chi[24,25]

WHO đã nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết

và rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh ĐTĐ Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã hoành hành 20 năm cuối thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI”

1.3.1.2 Phân loại

Dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân phát sinh bệnh, ủy ban chuyên gia về chuẩn đoán và phân loại ĐTĐ của WHO chia ĐTĐ thành các loại như sau:

ĐTĐ type 1: Thường xảy ra ở trẻ em và thanh thiếu niên, khởi phát ở các cá thể có tính mẫn cảm về di truyền với bệnh Nguyên nhân chính của bệnh là tế bào β đảo tụy Langerhans bị phân hủy dẫn đến mất khả năng sản xuất insulin, một hormone điều hòa lượng đường trong máu Quá trình hủy hoại tế bào β do cơ chế tự miễn Người ta đã biết đến 18 vùng gen liên quan đến type này và được ký hiệu từ IDDM1 đến IDDM18 Các gen này chủ yếu

liên quan đến những yếu tố kháng nguyên bạch cầu người HLA hoặc là gen

mã hóa insulin

ĐTĐ type 2: Chiếm 80% - 90% bệnh nhân, có tính quy tụ gia đình và hay gặp ở những người trên 30 tuổi Hai yếu tố chính đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ĐTĐ type 2 là khiếm khiết chức năng tế bào β tuyến tụy và tình trạng kháng insulin, bất thường về số lượng receptor insulin hoặc ái lực gắn hormone của insulin và cũng có thể do acid béo tự do tăng cao gián tiếp làm ảnh hưởng quá trình truyền tin nội bào của insulin ở tế bào đích Bởi vậy, bệnh BP là một trong những nguyên nhân môi trường được đề cập đến nhiều nhất vì chính BP làm gia tăng tình trạng kháng insulin

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam

* Trên thế giới:

Theo Tổ chức Y tế thế giới: Năm 1995 cả thế giới có 135 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 4% dân số thế giới, đến năm 2010 có 221 triệu người

và dự báo đến năm 2025 là 330 triệu người mắc căn bệnh này, chiếm 6.0%

Tỷ lệ bệnh tăng lên ở các nước phát triển là 42%, nhưng ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) sẽ là 170%

Như vậy, ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế giới chủ yếu là các nước đang phát triển Nó đang là gánh nặng thực sự cho sự phát triển kinh tế, xã hội và sức khỏe của con người toàn thế giới trong thế kỷ 21[25]

* Ở Việt Nam:

Tại Việt Nam, cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trong 10 năm qua có xu hướng gia tăng[4] Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường năm 2002 chiếm 2.7%, đến 2008 đã tăng lên 5.7% dân số Nghiên cứu của bệnh viện Nội tiết TW trên phạm vi toàn quốc năm

2001 thì tỷ lệ ĐTĐ tại 4 tỉnh TP lớn của Việt Nam (Hà Nội, Hải Phòng, Đà

Nẵng, TP Hồ Chí Minh) trong lứa tuổi 30-64 là 4.0%, tỷ lệ rối loạn dung nạp Glucose là 5.1%, riêng quận Hoàn Kiếm (Hà Nội) lên tới 7% Tỷ lệ đối tượng điều tra có các yếu tố nguy cơ của bệnh ĐTĐ là 38.5% Cũng qua số liệu điều tra, số bệnh nhân ĐTĐ không được chẩn đoán là 44% Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn Vì vậy, mỗi năm có trên 70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời

Ở nước ta, đối tượng mắc bệnh ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30-65, tuy nhiên hiện nay có những bệnh nhân ĐTĐ mới chỉ 9-10 tuổi, điều này phản ánh sự trẻ hóa về bệnh này Bên cạnh đó, biến chứng tim mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến và là nguyên nhân gây đột quỵ và tử vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ Vì thế, ĐTĐ không chỉ là mối quan tâm của ngành y

tế mà còn thu hút cả sự chú ý của các nhà quản lý xã hội

1.3.3 Phân loại và cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ

Năm 1997, WHO đã đề nghị phân loại ĐTĐ mới dựa trên những tiến

bộ khoa học trong những năm gần đây Phân loại này dựa vào hiểu biết về nguyên nhân sinh bệnh:

a) Đái tháo đường type 1 (ĐTĐ phụ thuộc insulin)

Đái tháo đường type 1 là tình trạng tăng đường huyết mãn tính do hậu quả của tình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối hoặc tương đối kèm theo các rối loạn chuyển hóa protein, lipid Các rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính và mãn tính

+ Cơ chế bệnh sinh:

Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc vào điều kiện môi trường Bệnh gặp ở 0.2-0.5 % số người trong quần thể và chiếm 5-10% số người mắc bệnh tiểu đường

Các giai đoạn trong ĐTĐ type 1[11]:

- Giai đoạn 1: Bản chất di truyền–nhạy cảm gene

- Giai đoạn 2: Khởi phát quá trình tự miễn

- Giai đoạn 3: Phát triển một loạt các kháng thể

- Giai đoạn 4: Tổn thương chức năng tế bào β đảo tụy

- Giai đoạn 5: Đái tháo đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào β đảo tụy Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin

có kèm biến chứng

+ Đặc điểm lâm sàng:

Bệnh nhân ĐTĐ type 1 có đặc điểm lâm sàng phức tạp Thiếu hụt insulin tuyệt đối làm tăng đường huyết và axit béo quá mức dẫn tới tăng áp lực thẩm thấu Bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, khát nhiều, sụt cân, mờ mắt, mệt mỏi…Bệnh nhân ĐTĐ type1 bắt buộc phải điều trị bằng insulin

b) Đái tháo đường type 2 (ĐTĐ không phụ thuộc insulin)

Đái tháo đường type 2 là tình trạng tăng đường huyết do hậu quả của kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo suy giảm chức năng tế bào β hoặc do suy giảm chức năng tế bào β kèm theo kháng insulin của cơ quan đích Đây là đạng ĐTĐ thường gặp nhất Thường gặp ở bệnh nhân lớn tuổi

+ Cơ chế bệnh sinh:

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Nồng độ glucose trong máu vẫn ở mức bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần và xuất hiện tăng glucose huyết sau bữa ăn

- Giai đoạn 3: Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm và gây tăng glucose huyết lúc đói Bệnh ĐTĐ biểu hiện qua bên ngoài [11]

Một số dạng DTĐ khác:

+ Đái tháo đường thai kỳ:

Đây là dạng đái tháo đường xảy ra ở một số phụ nữ mang thai và sẽ biến mất sau khi sinh Có thể gây ra các biến chứng cho mẹ và con trong quá trình mang thai Phụ nữ bị ĐTĐ thai kỳ có nhiều khả năng phát triển thành bệnh đái tháo đường type 2 sau này

1.3.4 Tác hại và biến chứng ĐTĐ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và khả năng làm việc của người lao động, nhưng hơn cả là nguy cơ biến chứng của bệnh nhân thường rất cao [4]

Biến chứng mắt như: bệnh lý võng mạc (27.8%), đục thủy tinh thể (6.1%) tăng sinh gây mù lòa (1.1%) Bệnh về võng mạc tăng dần theo thời gian phát hiện bệnh

Biến chứng thận như: microalbumin niệu (11.6%), macroalbumin (3%), suy thận từ độ 1 đến độ 4 (3.5%) …

Biến chứng thần kinh ngoại vi: giảm hoặc mất phản xạ gân xương hoặc cảm giác rung …

Tổn thương bàn chân: tùy từng mức độ như phỏng rộp, biến dạng, loét, hoại thư, cắt cụt, …

Biến chứng mạch máu lớn: mạch vành có tới (38%), đột quỵ (1.2%), tăng huyết áp (27.6%) …

1.3.5 Một số thuốc tổng hợp điều trị bệnh ĐTĐ Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ được chia thành các nhóm chính:

- Các thuốc giảm đường huyết

- Insulin

- Glucosidase Inhibitors

- Thiazolidinediones

- Tainsulin

1.3.6 Đái tháo đường với y học cổ truyền (YHCT)

Theo Đông Y, bệnh ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát, với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều Do ăn nhiều các chất cay, béo ngọt làm mất cân bằng âm dương trong cơ thể, tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt, làm phần âm của phủ tạng như âm, vị thận bị hao tổn Hỏa nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị âm gây chứng gầy đói, thận âm hư gây tiểu nhiều và tiểu ra đường Xuất phát từ quan niệm trên, nên phương pháp điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ sở để lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể [2], [3], [4], [5]

Việt Nam là nước có nguồn dược liệu rất phong phú Bên cạnh chế độ ăn uống và tập luyện hợp lý thì việc sử dụng thảo mộc trong điều trị bệnh ĐTĐ từ lâu đã được biết đến với nhiều tác dụng tích cực Các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ của Đông Y chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Một số thảo mộc rất sẵn trong nước có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ [4], [5] như: Bầu đắng, tỏi, nghệ, quế, hành tây, bí đao, mướp đắng, khế, rau muống…

1.4 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

BP và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỉ

21 Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người BP luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát của Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP BP liên quan tới ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin [20]

Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người BP có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa BP và bệnh ĐTĐ type 2 bao gồm: chỉ số khối cơ thể, thời gian BP, chế độ dinh dưỡng, sự vận

động thân thể Một thống kê đã chỉ rằng những người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị BP dưới 5 năm và nếu trọng lượng cơ thể tăng một kilogram thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4.5% [37] Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người BP

có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hóa glucose ở cơ

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thấy rằng thừa cân và BP có một mối liên quan chặt chẽ đến tính kháng insulin và bệnh ĐTĐ type 2 và điều đó cũng không loại trừ ở các bệnh nhân ĐTĐ Việt Nam ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyển hóa glucid, sự rối loạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do đó kéo theo hoặc làm quá trình rối loạn chuyển hóa lipit ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc trưng chung của rối loạn chuyển hóa lipit trong ĐTĐ là sự tăng triglyceride, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ type1 rối loạn tăng triglyceride sẽ mất đi khiểm soát được glucose máu khác với type2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-c của type2 cũng có thể tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-c với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vỡ động mạch [18]

1.5 Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm STZ

Streptozotocin (STZ: 2-deoxy -2 (3-mety-3 nitrosoureido)-D-glucopyranose)

là chất có hoạt tính ung thư được chiết xuất từ nấm Stretomycer achromogens Khả năng gây ĐTĐ của STZ đã được phát hiện vào năm 1963 Kể từ đó STZ được sử dụng rộng rãi trong mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong các nghiên cứu về thuốc [10]

Streptozotocin Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành người ta có thể gây ĐTĐ type 1 hay type2

ĐTĐ type1: với chuột cống trưởng thành, tiêm liều duy nhất từ 60mg/kg thể trọng

40-ĐTĐ type 2: với chuột cống, tiêm STZ liều 100mg/kg thể trọng vào ngày đầu tiên sau khi sinh Với chuột nhắt có thể nuôi với chế độ dinh dưỡng giàu lượng mỡ sau đó tiêm STZ với liều 50-110mg/kg thể trọng cơ thể

STZ được nhận biết và xâm nhập vào tế bào β qua kênh vận chuyển glucose GLUT2 Hoạt động của nó trong tế bào làm tổn thương và alkyl hóa ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tư tế bào Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí 06 cuả guanine

1.6 Vài nét về cây rau muống (Ipomea aquatica Forssk.)

"nghiện"

Cây mọc bò, ở mặt nước hoặc trên cạn Thân rỗng, dày, có rễ mắt, không lông Lá hình ba cạnh, đầu nhọn, đôi khi hẹp và dài Hoa to, có màu trắng hay hồng tím, ống hoa tím nhạt, mọc từng 1-2 hoa trên một cuống Quả nang tròn, đường kính 7–9 mm, chứa 4 hạt có lông màu hung, đường kính mỗi hạt khoảng 4 mm [6], [7], [8], [11], [12]

1.6.2 Phân loại và mô tả

* Tùy theo điều kiện trồng trọt, có thể phân ra các giống:

+ Rau muống ruộng có hai giống trắng và đỏ: rau muống trắng thường được trồng cạn, trên luống đất, cần không nhiều nước, thân thường trắng xanh, nhỏ, kém chịu ngập; rau muống đỏ trồng được cả ở trên cạn và ở nước ngập, ưa nhiệt độ 20-30 °C, giống này thân to, cuống thường có màu đỏ, mọng

+ Rau muống phao: Cấy xuống bùn, cho rau nổi trên mặt nước, cắt ăn quanh năm

+ Rau muống bè: Kết thành bè thả trên mặt nước ao, hồ, kênh, mương quanh năm, những tháng rét năng suất kém

+Rau muống thúng: Trồng vào thúng có đất và phân, đặt lên giá cắm

ở ao sâu để thúng nổi lên khoảng 1/4 chiều cao, cho rau bò kín mặt ao

Các giống rau muống nước thường luộc ngon hơn xào hay ăn sống, giống trồng cạn thường thích hợp với xào hoặc có thể ăn sống

+ Mô tả thực vật:

Thân Cỏ bò trên đất ẩm hay mặt nước, có thân dài ở trường hợp rau muống nước có thể đạt đến 2 - 3 m hay hơn, có rễ bất định ở mắt, lóng bộng, nên có thể nổi trên mặt nước, không lông, mủ trắng [6]

Lá hình tam giác hay đầu tên, không lông, dài từ 5-15cm; rộng từ 2-8

cm, có cuống dài Phát hoa ở nách lá, mang ít hoa thường trắng với trung tâm

hơi tím tím, hoa có dạng cái kèn loa,đường kính từ 3-5 cm, lá đài bằng nhau, tiểu nhụy 5 không bằng nhau gắn trên ống vành

Nang tròn to khoảng 8 - 9 mm, hột 4 có lông hoe

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

+ Cây rau muống ( Ipomoea aquatica Forsk.)

+ Bộ phận sử dụng: thân, lá, ngọn của cây rau muống

+ Địa điểm thu mẫu : Phương Khoan - Sông Lô - Vĩnh Phúc Sấy khô ở 60ºC sau đó được ngâm kiệt trong Ethanol 90º thu dịch cao phục vụ cho các bước nghiên cứu

Hình 2.1 cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)

2.1.2 Mẫu động vật

Chuột bạch chủng Swiss nặng từ 18 - 20g được nuôi BP và gây ĐTĐ typ

II do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp Chuột được nuôi trong phòng

ở nhiệt độ khoảng 22±20C với chu kỳ ngày 12h và đêm 12h; được ăn bằng thức

ăn cho bộ gậm nhấm do Viện Vệ sinh dịch tễ TW cung cấp

Hình 2-2 Chuột nhắt trắng chủng Swiss

2.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

* STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse

* Ethanol 900, Hóa chất dùng cho quá trình tách chiết, định tính, định lượng như n-hexan, chloroform, ethylacetate…

* Máy đo đường huyết tự động One Touch Ultra

* Bộ kít thử Medisense optium blood glucose electrodes

* Cân phân tích, máy ly tâm, lò vi sóng, máy lắc vontex, pipetman… Các thiết bị đều đảm bảo tiêu chuẩn về độ chính xác và an toàn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu

Từ 3000g rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) Sấy khô được ngâm

chiết với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng 220c trong vòng 45 ngày (quá trình được lập lại 3 lần) Gộp các dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất lại dung môi bằng cách chiếu đèn điện thu được cao tổng số ethanol được hòa tan

trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, chloroform,ethylacetate cất dung môi dưới áp xuất giảm thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây rau

muống (Ipomoea aquatica Forsk.)

2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên

Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính [21] Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:

Diazo hóa Diazo Phản ứng cho màu da cam là

dương tính Dung dịch

Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam

Acid sulfuric H2SO4 10%

Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

Vanilin/HCL Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ

Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết

tủa màu da cam

Glycoside Keller-Killian

Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

Polyphenol

khác

Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất

hiện màu vàng

FeCL3/HCL Phản ứng dương tính nếu xuất

hiện màu lục, xanh, đen

2.2.2.2 Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau

Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong

mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu

trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn

là acid gallic [17]

Các bước tiến hành như sau:

* Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất

Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic có nồng độ 5mg/ml

Dung dịch Na2CO3; 200g Na2CO3+800ml H2O đun sôi Thêm một vài giọt tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml

Dung dịch mẫu cần định lượng

* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic

Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2,

3, 5 và 10ml sau đó dẫn nước cất tới 100ml ta thu được các nồng độ 0, 50,

100, 150, 250, và 500mg/l acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng

độ hoặc dịch chiết các phân đoạn ) + 1.58 ml H2O + 100 µlthuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho them 300 µl Na2CO3 Để hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 200c rồi xác định ở bước sóng 765 nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 µl để định

lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn aicd gallic

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây rau

muống (Ipomoea aquatica Forsk.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa

sinh máu của chuột BP thực nghiệm

2.2.3.1 Thử độc tính cấp ,xác định LD50

Xác định LD50 của dịch chiết cây rau muống theo phương pháp Lorke.[17] Chuột nhịn đói trước 16 giời thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N=10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (thể tích và khối lượng

tối đa cho phép ) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh

giá mức độ độc của dịch chiết cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)

2.2.3.2 Xây dựng mô hình chuột BP thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau[22]:

Nhóm 1 - Nhóm đối chứng: Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng

thức ăn bình thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp)

Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: Các con chuột được chăm sóc bằng chế độ

thức ăn giàu lipid và cholesterol

Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê

2.2.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây rau

muống chuột nhắt gây ĐTĐ bằng STZ

Để tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây rau muống, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [16, 19, 22] 2.2.4.1 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2

Chuột nuôi BP được gây ĐTĐ type 2 bằng tiêm STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0.01M, pH = 4.3) dưới màng bụng, gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột BP thực nghiệm nhằm tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 phát triển từ BP Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h Sau đó chúng được uống nước và ăn bình thường Sau từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định ≥ 18mmol/l [6], [9], [11] Tiến

hành phân các lô chuột (mỗi lô gồm 5 con) đã bị bệnh để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi sử dụng các phân đoạn dịch chiết từ rau muống

Lô 1: Lô STZ nhóm đối chứng không điều trị

Lô 2: Lô STZ điều trị bằng Metformin

Lô 3: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOH

Lô 4: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn n-hexan

Lô 5: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn ChL

Lô 6: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn EtOAc

Lô 7: Lô STZ điều trị bằng phân đoạn nước

Chuột bị bệnh uống điều trị các phân đoạn dịch chiết từ rau muống và metformin, được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở các thời điểm khác nhau (2h, 4h, 8h, 10h) và tiến hành các xét nghiệm tiếp theo Sau

đó tiếp tục điều trị cho chuột trong vòng 21 ngày (3 tuần)

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống trên mô hình chuột ĐTĐ type 2

Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống với liều 2000mg/kg Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị

Bảng 2.3 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose của các phân đoạn

dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)

1 Thức ăn chuẩn Uống nước cất, không điều trị

2 Thức ăn béo STZ Uống nước cất, không điều trị

3 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethanol (2000mg/kg)

4 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn n-hexan(2000mg/kg

5 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn CHCL3 (2000mg/kg)

6 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (2000mg/kg)

7 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn nước (2000mg/kg)

8 Thức ăn béo STZ Điều trị metformin (500 mg/kg) thể trọng

2.2.5 Sử dụng phương pháp hóa sinh - y dược

Để định lượng đường huyết [38], [39] và một số chỉ số hóa sinh liên

quan đến rối loạn trao đổi lipid [35] ở chuột trước và sau khi điều trị bằng các

phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống

2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết

* Nguyên tắc:

Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo

màu và được đo bằng phương pháp quang học để định lượng glucose huyết

+ Phản ứng 1: Khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử,

dưới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose

trong máu phản ứng với oxy (không khí) tạo thành axit gluconic và hydro

peroxide (H2O2)

+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong máy One Touch Ultra chuyển hóa định lượng biểu thị bằng số mmol/L hoặc mg/dl glucose

* Tiến hành:Ấn nút điều khiển để khởi động máy Gắn que thử vào máy Dùng

kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, lấy giọt máu thứ 2 Mẫu máu dùng cho việc đo là 1µL, phải là giọt máu tròn đầy, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử Sau 5 giây, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trên màn hình

Hình 2-3 Phương pháp lấy máu đo glucose huyết

2.2.5.2 Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô) Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:

a) Định lượng triglycerid

Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ