Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chất thứ sinh từ một số loài thực vật Việt Nam (LV00394)

Đồng thời, các hợp chất tự nhiên của nhiều loài thực vật khác cũng đã được chứng minh là có hoạt tính kháng sinh chống lại vi khuẩn và vi nấm.. Để tìm hiểu thêm và tìm ra các chất thứ si

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, khi đời sống kinh tế xã hội của con người ngày càng được nâng cao và phát triển, vấn đề chăm sóc sức khoẻ con người ngày càng được quan tâm chú ý Các ứng dụng khoa học hiện đại trong y học đã giúp phát hiện, chế tạo nhiều loại thuốc đặc trị những căn bệnh trước kia được xem là bệnh nan y Không chỉ dừng lại ở chữa trị, người ta còn đi sâu tìm hiểu nguyên nhân, cơ chế của bệnh để đưa ra phương pháp điều trị tối ưu Một trong những nguyên nhân chính gây ra một số bệnh nguy hiểm ở người, động vật và thực vật đó là các vi sinh vật

Hiện nay, chúng ta đã sản xuất trên quy mô công nghiệp rất nhiều loại kháng sinh tổng hợp cho hiệu quả chữa trị cao đối với các bệnh do vi sinh vật gây ra Nhưng, sự lạm dụng kháng sinh tổng hợp lại làm gia tăng khả năng đề kháng kháng sinh của vi sinh vật Số kháng sinh mới mà chúng ta đưa vào để khắc phục vấn đề này còn hạn chế Do đó, việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn mới có nguồn gốc từ tự nhiên trở thành một hướng nghiên cứu rất đáng quan tâm Mặt khác, việc sử dụng các loại thuốc hoá học đang gây ra các vấn đề về môi trường, về đột biến, về bảo vệ nguồn gen tự nhiên Rất nhiều người quan ngại trong việc sử dụng các tác nhân vật lý, hoá học nhân tạo trong việc chăm sóc sức khoẻ Người ta bắt đầu hướng đến những sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là các chất chiết xuất từ thực vật

Từ lâu, nhiều hợp chất tự nhiên từ thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị bệnh rất có hiệu quả như tinh dầu gừng, bạc hà, quế… Ngày nay, với sự phát triển của Thực vật học, Hoá học, Dược học, việc xác định các hoạt chất trong cây cỏ dùng làm thuốc đã chứng minh sự hiệu nghiệm của những kinh nghiệm chữa bệnh dân gian, lấy ánh sáng khoa

học hiện đại làm sáng tỏ thực nghiệm khoa học lâu đời của nhân dân [7] Bằng khoa học thực nghiệm, người ta chỉ ra rằng một số hợp chất trong cây đặc biệt là các chất thứ sinh có giá trị chữa bệnh Trong chè xanh, măng cụt…chứa quercetin có tác dụng diệt khuẩn chữa sâu răng mà không độc với con người Silymarin trong cây kê sữa có tác dụng chống oxi hoá và ngăn ngừa ung thư [26] Catechin có trong nhiều loài thực vật ngăn chặn và làm chậm sự phát triển của tế bào khối u [30] Đồng thời, các hợp chất tự nhiên của nhiều loài thực vật khác cũng đã được chứng minh là có hoạt tính kháng sinh chống lại vi khuẩn và vi nấm Gần đây, nhiều hợp chất tự nhiên còn được quan tâm và ứng dụng trong các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm

Việc phát hiện, tách chiết và sử dụng các loại hợp chất tự nhiên thực vật bằng những phương pháp đơn giản (nghiền, sao khô và chiết lấy nước…)

đã được tiến hành từ rất lâu trong y học Nhưng những nghiên cứu để xác định và tách chiết các sản phẩm thứ sinh này bằng phương tiện và phương pháp hiện đại thì chỉ gần đây mới được quan tâm và thực hiện Để tìm hiểu thêm và tìm ra các chất thứ sinh trong một số loài thực vật phổ biến ở Việt Nam, ứng dụng trong việc kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh, chúng tôi

lựa chọn vấn đề “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chất thứ sinh

từ một số loài thực vật Việt Nam” làm đề tài nghiên cứu trong luận văn Thạc

sĩ

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chất thứ sinh chiết xuất từ một số loài thực vật; phân tích thành phần và ứng dụng chúng kháng lại một

số vi khuẩn gây bệnh ở thực vật, động vật và người

2.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết đến

sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi sinh vật

2.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học cơ bản trong dịch chiết từ các đối tượng thực vật

2.3 Phân lập các nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính trong các mẫu thí nghiệm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Đưa ra quy trình chiết, tách các phân đoạn các mẫu lá của 4 loài

thực vật: Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba đậu (Croton tiglium L.); Bạc thau (Argyreia acuta Lour.); Khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.)

3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu

3.3 Khảo sát thành phần hoá học của các phân đoạn dịch chiết các mẫu thực vật

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1.Đối tượng

4.1.1.Mẫu thực vật

Bốn loài thực vật: Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba đậu

(Croton tiglium L.); Bạc thau (Argyreia acuta Lour.); Khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.)

4.1.2.Mẫu vi sinh vật

Các vi sinh vật thuộc một số chủng vi sinh vật kiểm định do phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện vệ sinh dịch tễ TW Hà Nội cung cấp

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn dịch chiết (cao ethanol, phân đoạn n-hexan, phân đoạn chlorofom, phân đoạn

ethylacetate) từ 4 mẫu lá cây trên mô hình nuôi cấy vi sinh vật kiểm định trong phòng thí nghiệm

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thạch đĩa đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

5.2 Khảo sát thành phần hoá học của 4 mẫu lá cây

Định tính thành phần hoá học của 4 mẫu lá bằng các phản ứng hoá học đặc trưng

5.3 Định lượng một số hợp chất tự nhiên trong các mẫu lá thực vật

- Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau

- Phân lập các hợp chất bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng

6 Những đóng góp mới của đề tài

- Đưa ra quy trình chiết, tách các phân đoạn từ lá thực vật

- Phân lập một số hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn dịch chiết từ 4

loài thực vật: Ba chạc (Euodia lepta (Spreng) Merr.); Ba đậu (Croton tiglium L.); Bạc thau (Argyreia acuta Lour.); Khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.)

đối với một số chủng vi sinh vật

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY THUỐC

1.1.1 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc thế giới

Những năm gần đây, khoa học thế giới đã có những bước tiến dài trong nhiều lĩnh vực Trong đó, khoa học nghiên cứu về dược phẩm và chế phẩm dùng trong điều trị bệnh rất phát triển, đặc biệt ở các nước Mỹ, Anh, Nhật Bản, Trung Quốc…Họ đã đưa ra trên thị trường rất nhiều sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có tác dụng điều trị các bệnh nan y không chỉ đối với người bệnh mà còn tốt trong việc phòng chống bệnh cho cả người khoẻ mạnh

Bên cạnh đó, người ta còn đi sâu nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên

có trong nhiều loài thực vật để ngăn ngừa và điều trị các bệnh, đặc biệt là một

số bệnh hiểm nghèo như ung thư, đái tháo đường, nhiễm trùng máu …Các tạp chí khoa học thế giới, các phòng thí nghiệm y dược và ung thư quốc tế đã công bố rất nhiều các nghiên cứu về cây thuốc có tác dụng ngăn ngừa và điều trị ung thư Người ta đã nghiên cứu về các chất có hoạt tính chống ung thư trong nhiều loại cây như kê sữa (hợp chất sylimarin), chè xanh, trinh nữ hoàng cung…[44] Một số hoạt chất có tác dụng ngăn ngừa và điều trị đái tháo đường trong cây cỏ ngọt (hợp chất stevirosid), tam thất (gisenoid), nhân sâm (panaxan), hoàng sâm, lược vàng,… Nhiều loài thực vật chứa các hoạt chất kháng khuẩn: trinh nữ hoàng cung (chứa lycorin), chè xanh, bạc hà, hành, tỏi, mùi tây…[28]

1.1.2 Nguồn cây thuốc Việt Nam

Việc sử dụng cây thuốc ở Việt Nam đã có từ rất lâu đời Từ thực tiễn và những kinh nghiệm học hỏi từ đông y Trung Quốc đến nay chúng ta biết và

sử dụng rất nhiều các loại cây thuốc Chúng không chỉ chữa các bệnh thông thường như cảm mạo, sát khuẩn nhiễm trùng mà còn sử dụng trong điều trị những bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch,…

Nước ta - một quốc gia có hệ khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm là điều kiện rất tốt cho sự phát triển của hệ thực vật vô cùng đa dạng và phong phú Với khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm và trên 2.000 loài tảo tạo nên một nguồn nguyên liệu phong phú cho khoa học Đông y [27] Nguồn thực vật này đã được cha ông ta khai thác và chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian từ ngàn xưa

1.1.3 Tình hình sử dụng và nghiên cứu cây thuốc ở Việt Nam

Đến nay, các nghiên cứu về cây thuốc đã xác định ở Việt Nam có hơn 3.800 loài thực vật và nấm được dùng làm thuốc Cây thuốc nam có thể chữa

từ những bệnh đơn giản thường gặp đến các bệnh hiểm nghèo thậm chí như bệnh ung thư, đái tháo đường Trên thực tế, nhiều bệnh nhân đã được chữa khỏi những căn bệnh này nhờ sử dụng thuốc nam

Ở nước ta, khi khoa học về dược liệu và dược phẩm chưa phát triển mạnh, việc sử dụng thuốc đều dựa vào kinh nghiệm cha truyền con nối và kinh nghiệm dân gian Những năm gần đây, nhu cầu chăm sóc sức khoẻ của con người ngày càng cao thúc đẩy khoa học ứng dụng ngày càng phát triển đặc biệt là khoa học về thuốc Trên thế giới, người ta đã tiến hành những nghiên cứu rất sâu về các hợp chất tự nhiên có khả năng chữa bệnh hiểm nghèo Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cây thuốc bản xứ cũng đang được thực hiện và ngày càng phát triển Hiện nay, chúng ta đã và đang tiến hành chiết xuất các hợp chất tự nhiên từ nhiều loài thực vật, nghiên cứu tác dụng dược lý của chúng trên mô hình tế bào, vi khuẩn và trên chuột

Các nghiên cứu về cây thuốc được sưu tập và biên soạn thành nhiều tài liệu tham khảo [3, 7, 8, 9] Những nghiên cứu về tác dụng của các cây thuốc Đông y bao gồm bộ sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Đỗ Tất Lợi, Nxb Khoa học kỹ thuật, năm 1986; “999 bài thuốc dân gian gia truyền”,

Âu Anh Khâm, Nxb Y học Hà Nội, 1999; “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, Võ Văn Chi, Nxb Y học Hà Nội, năm 1999; “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, Viện dược liệu, Nxb Khoa học kỹ thuật, năm 2004; “Cây thuốc trị bệnh thông dụng”, Võ Văn Chi, Nxb Thanh Hoá, 2005; “Nghiên cứu thuốc từ thảo dược”, Bộ giáo dục và đào tạo, Bộ y tế, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, năm 2006…

Tại các trường Đại học, các phòng thí nghiệm, các viện nghiên cứu, các

đề tài nghiên cứu về thảo dược cũng đã và đang được tiến hành Một trong những nghiên cứu mới và nổi bật nhất hiện nay là nghiên cứu về cây Trinh nữ hoàng cung

1 2 KHÁI QUÁT VỀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THỰC VẬT

1.2.1 Các hợp chất thứ sinh và các chất có hoạt tính sinh học

Quá trình trao đổi chất của sinh vật bao gồm sự tạo thành các hợp chất

sơ cấp và hợp chất thứ cấp (còn gọi là hợp chất thứ sinh)

Hợp chất sơ cấp được tạo thành của quá trình đồng hoá và dị hoá, có vai trò quan trọng đối với cơ thể sống Nó bao gồm những chất thiết yếu cho

sự sống như các axit amin, các axit nuleic, cacbohidrat, lipit Chúng là trung tâm của quá trình trao đổi chất, sinh trưởng và phát triển của sinh vật

Các hợp chất thứ cấp (hợp chất thứ sinh) được tạo thành từ các hợp chất sơ cấp và các chất trao đổi trung gian của chu trình đường phân, chu trình pentose-phosphate, chu trình axit citric v.v Những nghiên cứu ban đầu

về hợp chất thứ sinh thấy rằng những hợp chất này chỉ đơn thuần là sản phẩm thừa trong quá trình trao đổi chất Nhưng sau nhiều công trình đi sâu nghiên cứu, người ta đã phát hiện và có những khẳng định mới về vai trò của hợp chất thứ sinh Khác với các chất trao đổi bậc nhất, hợp chất thực vật thứ sinh không phải là yếu tố đặc biệt cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển, quang hợp và sinh sản [50] Chúng được tạo ra trong những tế bào chuyên biệt với vai trò điều hoà mối quan hệ qua lại giữa các tế bào trong cơ thể Đồng thời chúng là các hợp chất phòng thủ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm thực vật từ môi trường xung quanh [41]

Cơ chế bảo vệ của hợp chất thứ sinh được thể hiện rất đa dạng Chúng tạo ra chất độc tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến hệ thần kinh, làm rối loạn

hệ thống trao đổi chất của các vi sinh vật gây bệnh (như các phytoalexin) Một số khác lại có mùi, vị khó chịu (đắng, chát, cay, hôi…) Các hợp chất thuộc nhóm terpen gây độc đối với bọ cánh cứng ăn vỏ, ngăn cản sự phát triển của sâu bướm Tannin, polyphenol, alkanoid, flavonoid được coi là chất đề kháng bệnh tật ở thực vật, gây độc cho các loại nấm gây bệnh, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều vi sinh vật Chất màu cũng có vai trò khá quan trọng Thực vật sử dụng chất này không chỉ để hấp dẫn động vật và côn trùng thụ phấn mà còn bảo vệ các mô khỏi bị tổn thương bởi tác dụng của tia tử ngoại, quá trình ion hoá hay quá trình đột biến Vì vậy, ở một khía cạnh nào

đó có thể coi hợp chất thứ sinh này là những chất có hoạt tính sinh học

Với sự phát triển của khoa học hiện đại, số lượng hợp chất thứ sinh được tìm ra ngày càng nhiều Người ta tiến hành phân loại chúng dựa trên nhiều tiêu chuẩn khác nhau Dựa vào bản chất hoá học chia hợp chất thứ sinh thành các hợp chất phenolic, flavonoid, alkanoid, coumanrin, glycosid, Dựa vào lịch sử phát hiện và sử dụng, các hợp chất thứ sinh được chia thành 4 nhóm chính [12]

- Terpen (gồm isoprenoid, terpenoid, carotenoid,)

- Glycosid (gồm glycosid trợ tim,…)

- Các phenylpropanoid (gồm flavonoid, tanin, lignin,…)

- Các hợp chất chứa nitơ (gồm alkaloid, hợp chất dị vòng thơm,…) Hiện nay nhiều hợp chất thứ sinh đã được tách chiết và sử dụng để phòng tránh và điều trị một số bệnh thông thường và cả bệnh hiểm nghèo ở người Trong số đó các hợp chất phenolic, flavonoid và alkaloid có nhiều ứng dụng rất phổ biến nhất Chúng được bào chế thành các dạng dược liệu hay được bổ sung vào thực phẩm nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng và tăng cường khả năng phòng ngừa bệnh tật

1.2.2 Một số loại hợp chất thứ sinh có hoạt tính sinh học

Chất thứ sinh được tổng hợp trong cơ thể nhiều loài thực vật Chúng có thể có ở cây này hoặc cây khác Vai trò của các chất này đến nay vẫn chưa được tìm hiểu cặn kẽ Song nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng chúng có thể tác động lên nhiều quá trình sinh học của cơ thể sinh vật, đặc biệt là cơ thể vi sinh vật và côn trùng Nói cách khác, chúng có hoạt tính sinh học Nhiều nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học đã được phát hiện và đi sâu nghiên cứu

1.2.2.1 Một số hợp chất thuộc nhóm carotenoid

Carotenoid là các hợp chất thiên nhiên có màu vàng đến đỏ vàng hoặc

da cam, thuộc nhóm tetraterpen (C40H56) Trong tự nhiên, có khoảng 70 sắc tố khác nhau: caroten (bao gồm nhiều đồng phân: , , ,  - caroten), lycopen, lutein, zeaxanthin, rhotonoxathin, crocetin, bixin, astaxin, fucoxanthin, pectonoxanthin, echinenon, pentaxathin,… Chúng chủ yếu có trong cây, củ, quả thực vật có màu như cà rốt, cà chua, gấc và nhiều loại lá… Hầu hết chúng đều có giá trị dinh dưỡng động vật Nhưng một số carotenoid lại có

hoạt tính sinh học Đó là -caroten, lycopen, lutein và zeaxanthin Đây là những chất có khả năng chống oxi hoá nên được sử dụng để điều trị và phòng chống lão hoá và ung thư

* - caroten

β-caroten được chiết suất từ củ cà rốt năm 1910 Đến nay, người ta còn phát hiện rất nhiều các đồng phân khác của  - caroten và tác dụng của chúng trong điều trị bệnh

 - caroten có tác dụng như tiền vitamin A cần thiết cho sự phát triển

cơ thể, tham gia sự tạo mô, da niêm mạc, võng mạc mắt, làm tăng sức đề kháng của cơ thể chống lại sự nhiễm khuẩn Nó còn giúp bảo vệ chống lại ung thư biểu mô,  - caroten có khả năng tạo máu nên thường được dùng kết hợp với sắt protoxalat [37]

*Lycopen

Lycopen là tên gọi bắt nguồn từ tên phân loại của cây cà chua Solanum

lycopersicum được dùng để tách ra nó năm 1910 bởi Willtatter và Escher

Đây là tên thường của , -caroten, một caroten điển hình thuộc phân lớp hydrocarotennoid

Công thức hoá học của lycopen là C40H56 được xác định năm 1928 Phân tử có cấu trúc mạch hở, đối xứng có 13 liên kết đôi liên hợp

Trong thực vật, lycopen tồn tại ở dạng cấu hình trans – trạng thái bền nhiệt Trong huyết tương người lycopen tồn tại trong hỗn hợp đồng phân chứa 50% dạng cis Lycopen có khả năng làm ngừng quá trình oxi hoá một cách đơn giản, bẫy peroxit một cách triệt để, ức chế quá trình oxi hoá ADN, peroxit hoá lipit và oxi hoá lipoprotein khối lượng nhỏ Do đó, lycopen chiết

suất từ cây cà chua có khả năng làm giảm ung thư tuyến tiền liệt và ung thư phổi

*Lutein

Lutein là một loại sắc tố tự nhiên tạo ra màu sắc cho rau quả Fremy và Stokes là người đầu tiên đề xuất về sự tồn tại của những chất màu trong lá cây xanh Nhưng 30 năm sau chúng mới được nghiên cứu nhiều và sâu hơn [44] Năm 1831, Kuhn và cộng sự đã tách thành công tinh thể lutein [49]

Hoạt tính sinh học chủ yếu của lutein là khả năng chống oxi hoá Chúng có thể phản ứng với các gốc tự do bảo vệ tế bào khỏi bị oxi hoá, chống ung thư da, lão hoá da, lão hoá thuỷ tinh thể, làm giảm xơ vữa động mạch [3] Lutein cũng được xác định là có tác dụng ngăn ngừa thoái hoá điểm vàng do

đó phòng được các bệnh thoái hoá ở mắt

Sự kết hợp lutein, zeaxanthin,  - caroten và lycopen sẽ tạo ra một sản phẩm chống oxi hoá đa trị vừa tốt cho máu vừa tốt cho mắt và nhiều cơ quan

tổ chức khác của cơ thể Tác dụng này sẽ tăng lên khi kết hợp thêm các vitamin C và vitamin E

1.2.2.2 Một số hợp chất phenol và polyphenol (hợp chất phenolic)

“Hợp chất phenolic” là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm các hợp chất

có ít nhất một vòng thơm và một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) tự do (gọi

là aglycol) hoặc kết hợp với các nhóm chức khác như ether, esther hay glucosid Phần lớn các phenolic tồn tại ở dạng kết hợp với đường (dạng glycosid) dễ tan trong nước Dựa vào đặc điểm cấu tạo, hợp chất phenolic được phân loại thành:

- Nhóm hợp chất phenol đơn giản: gồm các chất cấu tạo từ một vòng

benzen và một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH), được chia thành monophenol

(đại diện là phenol), diphenol (đại diện là pyrocatechin, rezoxin…), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquinon)

- Nhóm hợp chất phenol phức tạp: gồm các chất có thành phần cấu tạo

ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh Nhóm này được phân thành các nhóm sau:

+ Dẫn xuất của acid benzoic (C6 – C1): cấu trúc phân tử chứa vòng benzen có thêm nhóm carboxyl Chúng tồn tại phổ biến ở dạng tự do, cũng có

ở dạng kết hợp với esther (như acid salicylic) hay glycosid Một số dẫn xuất như acid procatechin, acid galic dạng tự do và dạng esther là thành phần cấu tạo nên catechin và tannin.Chúng thường gặp ở hạt nảy mầm

Gallic acid Procatechuic acid

Hình 1.1 Cấu trúc một số polyphenolic điển hình

+ Dẫn xuất của acid cinnamic (C6 – C3): gồm acid p–coumaric, acid caffeic, ferulic…rất phổ biến trong tự nhiên, một số acid khác như acid o – coumaric, o – ferulic ít gặp hơn Các acid phenolic được giải phóng khi thuỷ

phân dịch chiết của cây trong môi trường acid và được tách chiết bằng dung môi ether

+ Nhóm đa vòng – Flavonoid (C6 – C3 – C6): cấu trúc gồm hai vòng benzen và một vòng pyran Nhóm này đa dạng và phổ biến trong thực vật, có vai trò sinh lý quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây

- Nhóm hợp chất polyphenol (phenol polymer): tanin, lignin, melenin, acid

humic…

*Tác dụng:

Đối với thực vật, phenol và polyphenol có vai trò quan trọng trong hô hấp Chúng vận chuyển H+, hình thành liên kết hydro với các protein và enzyme tạo hiệu ứng dị lập thể (hiệu ứng không gian) làm thay đổi hoạt tính của các enzyme Nó làm tăng hoặc giảm nồng độ enzyme Trong sinh trưởng

và phát triển, phenol đóng vai trò chất hoạt hoá AIA–oxydase và tham gia quá trình tổng hợp enzyme này Nó như là chất điều khiển các chất điều hoà sinh trưởng Các phenol có tính phytonxit có đặc tính kháng khuẩn Nó được hình thành như một phản ứng tự vệ khi cây bị tổn thương do vi khuẩn gây bệnh (như cơ chế phản ứng kháng nguyên – kháng thể ở động vật và người) Các chất phenol có tác dụng kích thích quá trình tái sinh, bảo vệ chống bức xạ, gốc tự do, tác nhân gây đột biến và có tác dụng chống oxy hoá Vì vậy, nó làm tăng nhanh quá trình liền sẹo Khi được tiết ra môi trường nó có ý nghĩa

to lớn trong việc cảm nhiễm qua lại của cây

Đối với y học các hợp chất phenol có tác dụng chữa bệnh như là kháng sinh, chất chống viêm Chẳng hạn arbutin được dùng để sát trùng đường niệu, các hợp chất salycylate có tác dụng chống viêm, các esther của acid cinnamic trong actiso (như cynarin, các acid phenolic) có tác dụng bảo vệ gan [9] Các hợp chất phenol trong tế bào sống là một chất độc kìm hãm sự phát triển của nấm, vi nấm, virus gây bệnh Do đó, người ta có thể dùng chúng làm các chế phẩm tăng tính chống chịu cho cây như acid humic

Như vậy, phenol là một nhóm chất phức tạp có rất nhiều ứng dụng mà ngày nay chúng ta đang sử dụng và còn tiếp tục phải nghiên cứu Trong số hàng nghìn những hợp chất phenol trong cây đã được biết cấu trúc, flavonoid

là nhóm hợp chất quan trọng nhất có nhiều ứng dụng nổi trội về hoạt tính sinh học

1.2.2.3 Flavonoid (C 6 – C 3 – C 6 )

Flavonoid là một trong những nhóm chất phenol phức tạp thường gặp trong thực vật Flavonoid có cấu trúc đa dạng và nhiều tác dụng sinh học đã được nghiên cứu và kiểm nghiệm Chúng có ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt trong các tế bào thực vật quang hợp Đó là những sắc tố có màu vàng, tan trong nước nên gọi là “Flavonoid” (flavus: vàng) Một số sắc tố khác như xanh, tím, đỏ cũng thuộc nhóm này Chúng bao gồm nhiều loại trong đó hợp chất điển hình nhất là biflavon, ngoài ra còn có flavon, flavonol và flavanonol

Đến nay, hơn 4000 flavonoid đã được tìm thấy từ các loài thực vật Ban đầu chúng được phát hiện với vai trò chỉ là sắc tố của thực vật vào mùa thu khi các loại hoa, lá, cây chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ Sau này, các flavonoid được phát hiện thấy trong quả, hạt, thân cây, chè, rượu vang đỏ…Chúng là các thành phần nổi bật nhất trong các giống quả cam, quýt và phổ biến trong thức ăn của con người [5]

Phân tử flavonoid có cấu trúc monomer, dimer, hay oligomer cao hơn

9

10 8

4

1'

5' 6'

4'

3' 2'

B

Hình 1.2 Cấu trúc khung Flavonoid

Flavonoid có cấu trúc C6 – C3 – C6, trong đó phần C6 là vòng benzen

(A,B) và một vòng pyran C3 (C) Trong đó vòng A kết hợp với vòng C tạo

thành khung chroman

Trong cây, flavonoid tồn tại dưới hai dạng: dạng tự do (aglycon) và

dạng liên kết với đường (glycosid) Các glycosid khi thuỷ phân trong môi

trường acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon Trong tự nhiên

trừ catechin và leucoantocyanidin (flavan – 3,4 diol), phần lớn các flavonoid

đều tồn tại ở hai dạng glycosid: O – glycosid và C – glycosid

Một số flavonoid có tác dụng hỗ trợ đối với vitamin C Chúng thường

được sử dụng phối hợp với vitamin C trong dự phòng điều trị chảy máu cấp

xung huyết, tăng sự thẩm thấu của mao mạch, phù nề…Một số flavonoid khác

lại có hoạt tính vitamin P Chúng tác dụng lên tính chống chịu của mạch máu

và gây ra các biểu hiện lâm sàng khi cơ thể bị nhiễm độc, sốt, rối loạn hoạt động của hệ tim mạch

- Tác dụng chống oxy hoá

Đây là cơ sở quan trọng nhất thể hiện hoạt tính sinh học của các flavonoid Các flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do Vì vậy, flavonoid thể hiện tính năng bảo vệ gan một cách tích cực Trong gan thường diễn ra sự chuyển hoá lipid của màng tế bào gan Các gốc acid béo tự do bị oxy hoá thành peroxit Nhờ khả năng ngăn cản sự peroxit hoá, các flavonoid có khả năng ngăn cản sự hình thành acid béo và cholesterol Vì vậy, chức năng gan được tái sinh nhanh và phục hồi

Không những thế, flavonoid còn có khả năng ngăn cản các chất độc hướng gan, ngăn chặn sự nhiễm mỡ trong gan Khi vào trong cơ thể, các flavonoid sẽ giải toả các điện tích trên mạch vòng của nhân thơm và hệ nối đôi liên hợp của chúng sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do hình thành do bệnh lý Vì vậy, nó làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự

do mà flavonoid tạo ra bền vững hơn nên không tham gia các phản ứng dây chuyền, phản ứng oxy hoá Kết quả là hạn chế được quá trình bệnh lý do cắt đứt dây chuyền phản ứng Tuy nhiên mức độ tác dụng của các flavonoid phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng flavonoide cụ thể [33]

- Tác dụng đối với ung thư

Một số flavonoid khi tiếp xúc với tế bào khối u thấy có tác dụng trị liệu dựa trên các cơ chế thường thấy:

+ Kìm hãm hoạt tính enzyme oxy hoá – khử

+ Kìm hãm quá trình hô hấp của tế bào ung thư

+ Kìm hãm hoạt động giảm phân

+ Kìm hãm trao đổi chất trong tế bào

Các cơ chế này cũng diễn ra khi các flavonoid tiếp xúc với các tế bào vi sinh vật gây bệnh

- Tác dụng với enzyme

Nhóm OH của flavonoid phản ứng với nhóm cacboxyl (COOH) của các peptide tạo thành liên kết hydro Nhờ đó, flavonoid tương tác với các enzyme

và làm thay đổi hoạt tính của nhiều enzyme trong hệ thống sinh học, đặc biệt

là hệ enzyme màng tế bào Do đó, các flavonoid có khả năng gây bất hoạt hệ thống enzyme màng tế bào vi khuẩn Kết quả là ức chế quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn

- Tác dụng đối với chuyển hoá và trên lâm sàng [4]

Các flavonoid có tác dụng sâu sắc lên chức năng của tế bào miễn dịch

và tế bào viêm Gay (1998) đã chỉ ra rằng quercetin có thể sử dụng để điều trị

hen suyễn và tốt cho bệnh nhân tiểu đường và nhiễm HIV Flavonoid baicalin trong các nghiên cứu gần đây cho thấy hoạt tính chống viêm và chống HIV theo cơ chế gây cản trở sự tương tác giữa protein vỏ của HIV với các recepter

và ngăn chặn HIV tấn công vào tế bào đích

1.2.2.4 Tannin

Tannin (chất chát) là các polyphenol được cấu tạo dựa trên cấu tạo của acid tannic và acid gallic, tan tốt trong nước và phản ứng được với protein (nguyên nhân gây ra tính làm se của một số loại cây sử dụng làm thuộc da) Chúng phổ biến trong giới thực vật

*Tác dụng

Tannin có khả năng tạo kết tủa với protein nên có tác dụng chữa bệnh tiêu chảy hay chống chảy máu Nó có khả năng kết tủa với kim loại nặng và alkanoid nên thường dùng để chữa ngộ độc kim loại và alkaloid Các hợp chất tanin còn có tác dụng ức chế và diệt vi khuẩn [9]

1.2.2.5 Coumanrin (C 6 – C 3 )

Là một nhóm các hợp chất hữu cơ có trong nhiều loại cây Cấu trúc dị vòng chứa oxy tạo nên mùi thơm giống mùi thơm của vanilin hay cỏ mới khô Coumanrin được phát hiện từ những năm 1820

Coumanrin là những -pyron có cấu trúc C6 – C3 Trong các phân tử coumanrin đều có nguyên tử oxy liên kết tại vị trí C7 nên có thể coi nó là dẫn xuất của umbelliferon Coumanrin thuộc nhóm các hợp chất phenol có nhóm

OH bị ether hoá bởi nhóm CH3 hay một terpennoid chứa từ một đến ba đơn vị isoprenoid

Về mặt hoá học, các coumanrin tồn tại ở dạng tự do hay kết hợp với glucose tạo thành dạng coumanrin glycosid Mạch đường thường là glucose, đôi khi là glucose – glucose hoặc glucose – xylose Phân tử chứa vòng lacton

dễ mở vòng tạo muối tan trong nước khi tác dụng với dung dịch kiềm

OH

CH3O

Wafarin

Bishydroxycoumarin

Hình 1.4 Khung cấu trúc của Coumarin và các dẫn xuất của nó

*Tác dụng

Tác dụng dược lý chủ yếu là chống viêm, kháng khuẩn và nấm Ngoài

ra một số khác có tác dụng chống sốt rét (daphnetin, dentatin và clausarin), chống đông máu (dicoumanron), gây giãn mạch (othrol, seopron) [9]

1.2.2.6 Glycosid

Glycosid là các carbohydrat có nhiều trong lá, hạt, và vỏ cây dạng kết tinh có vị đắng Dưới tác dụng của enzyme hoặc acid các glycosid bị thuỷ phân tạo ra đường và phần không đường là aglycon Các aglycon có cấu trúc kiểu cardenolid và bufadienolid Cardenolid thuộc loại steroid C23 có chuỗi bên là vòng ,  lacton 5 cạnh không no và một nhóm C14 hydroxyl như strophanthidin, oleandrigenin Bufadienolid là steroid C24, chuỗi bên là vòng lacton 6 cạnh, hai lần không no và một nhóm hydroxyl 14, hướng  hoặc nhóm tương tự như bufalin, marinobufagin…

Các glycosid tìm thấy phổ biến trong thực vật dưới nhiều dạng như: glycosidephenolic (arbutin, salixin, phloridin…), các sắc tố, các tinh dầu (sinigrin), glycosidesaponin…

Hình 1.5 Cấu trúc một glycosid điển hình

*Tác dụng:

Nhiều nghiên cứu cho thấy một số glycosid có tác dụng ức chế sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Ngoài ra một số glycosid còn được sử dụng làm thuốc trợ tim [9, 14]

1.2.2.7 Alkaloid

Alkaloid là thuật ngữ dùng để chỉ nhóm các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc dị vòng chứa nitơ, có tính bazơ có trong một số loài thực vật nhất định, đôi khi có cả trong động vật Alkaloid có nghĩa là giống như (oid) chất kiềm (alcali)

Nguyên tử nitơ trong alkaloid có thể là một phần, hoặc không phải là một phần của hệ thống dị vòng Chúng có cấu trúc phân tử phức tạp, có hoạt tính Sinh-dược rõ rệt và phân bố hạn chế trong giới thực vật 42 Hiện nay đã

có hơn 12000 loại alkaloid khác nhau được phân lập Trong cây, alkaloid tồn tại dưới 3 dạng: dạng tự do, dạng muối của các axit phổ biến như citric, lactic, oxalic, axetic, malic…và dạng oxit nitơ Alkaloid không phổ biến ở tất cả các loài thực vật mà chỉ tập trung ở một số ít loài Chúng chủ yếu được tìm thấy trong các loài thực vật có hoa, nhưng chỉ có khoảng 20% số loài thực vật có hoa là có thể sản sinh ra alkaloid Đa số alkaloid không có mùi, vị đắng, một

số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin) Về vai trò sinh học, các alkaloid được coi là một trong những “hàng rào phòng thủ hoá học hữu hiệu” bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh và các loại côn trùng, sâu bệnh ăn lá 43 Về y học, alkaloid được sử dụng rất đa dạng: làm thuốc gây ức chế, hoặc kích thích hệ thần kinh trung ương, dùng làm thuốc điều hoà huyết áp, chữa loạn nhịp tim, thuốc diệt ký sinh trùng, kháng khuẩn, thuốc chống ung thư và nhiều tác dụng quan trọng khác Dưới đây là 3 dạng alkaloid điển hình:

N

N N

CH3

CH3O

O C

H3

O

N H

O H

N

CH3

Hình 1.6 Cấu trúc một số Alkaloid điển hình

1 3 CHẤT KHÁNG SINH CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT

1.3.1 Chất kháng sinh

Chất kháng sinh là chất hoá học do một số vi sinh vật tạo ra có hoạt tính chống lại các vi sinh vật khác Đó là các nhân tố hoá trị liệu đặc biệt Chúng là những sản phẩm tự nhiên mà không phải là những hoá chất tổng hợp Kháng sinh là các sản phẩm của trao đổi chất bậc hai Chúng là một trong những nhóm chất quan trọng nhất được sản xuất nhờ các quá trình vi sinh vật ở quy mô lớn Các chất kháng sinh như: penicillin, streptomycin, các chất kháng sinh thế hệ 2 và thế hệ 3…đã được sản xuất từ thế kỷ trước Hiện nay, khoảng hơn 8.000 chất kháng sinh đã được biết đến và mỗi năm có khoảng vài trăm kháng sinh mới được phát hiện [1]

Việc sử dụng kháng sinh để điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra có ý nghĩa to lớn đối với y học Nhưng không phải chất kháng sinh nào cũng có khả năng chống lại mọi vi sinh vật Mỗi kháng sinh có thành phần, cấu tạo hoá học, tính chất, đặc tính và cơ chế tác dụng riêng biệt tác động đặc hiệu lên một vài vi sinh vật Do đó, mỗi một loại kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định Đó là tính chọn lọc của kháng sinh [1] Chính vì vậy một số vi sinh vật gây bệnh sau quá trình tiếp xúc lâu dài với kháng sinh

đặc hiệu đã hình thành tính đề kháng kháng sinh Và những vấn đề mới về kháng sinh lại được đưa ra Người ta hướng đến những chất kháng sinh có nguồn gốc thực vật

1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc thực vật

Khái niệm chất kháng sinh thực vật chỉ mới xuất hiện gần đây Năm

1973, Ingham là người đầu tiên đưa ra định nghĩa kháng sinh thực vật

“phytoalexin” Phytoalexin là các chất kháng khuẩn hình thành trong cơ thể thực vật thông qua một chuỗi liên tiếp các quá trình chuyển hoá trước những biến đổi sinh lý học để phản ứng lại với điều kiện môi trường nhằm thích nghi với điều kiện sống tốt hơn hoặc chống lại sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh

Phytoalexin được tìm thấy dưới nhiều dạng có bản chất hoá học khác nhau như: alkaloid, flavonoid, glycosid, terpenoid…[19] Chúng được sản xuất bởi cơ thể thực vật như là các chất độc với các sinh vật tấn công chúng

Cơ chế tác động của các phytoalexin tương tự như cơ chế tác động của các chất kháng sinh Chúng có khả năng phá vỡ thành tế bào, làm trì hoãn quá trình sinh trưởng, phá vỡ quá trình trao đổi chất của các sinh vật có hại Kết quả là các phytoalexin ức chế sự sinh

trưởng, phát triển hoặc gây độc cho tế bào

vi sinh vật gây bệnh

Những năm gần đây, người ta đã

phân lập được nhiều phytoalexin có khả

năng chống lại các tổn thương tới thực vật

Một ví dụ tiêu biểu là Allixin

(3-hydroxy-

5-methoxy-6-methyl-2-penthyl-4H-pyran-4-one), một hợp chất có cấu trúc khung

4-O+O

O

O

O+O O

O C

pyrone đã được phân lập đầu tiên từ tỏi Alixin là một sản phẩm được sản xuất bởi thực vật khi phản ứng với các stress liên tiếp Hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học như chống oxi hoá, chống vi khuẩn, chống sự tăng sinh của khối u, ức chế quá trình hình thành ung thư da, ức chế quá trình liên kết của aflatoxin B2 với ADN Chính vì vậy, allixin hoặc các dẫn xuất của nó có thể

là một tác nhân tiềm tàng trong việc chữa trị bệnh ung thư và các bệnh khác [34]

Trong lịch sử y học dân gian, nhiều phytoalexin được sử dụng để chống lại các tác nhân bệnh lý vi sinh vật một cách hiệu quả như: emetine, quinin, berberine…Ngày nay, việc tìm ra bản chất của các hợp chất tự nhiên (là các alkaliod, flavonoid, glycosid, indole alkaloid, biflavonoid ) hứa hẹn những phương thuốc đặc trị cho những bệnh do vi sinh vật gây nên, thậm chí cả AIDS [38]

Các phenolic trong thực vật trong đó có flavonoid là các chất thứ sinh được nghiên cứu sâu rộng và phổ biến nhất Trong dịch chiết từ hầu hết các

bộ phận của cây đều chứa loại hợp chất này Chúng có tiềm năng kháng khuẩn rất lớn Một đại diện điển hình trong số đó là quinon Khả năng kháng

vi sinh vật của hợp chất tự nhiên này đã được nghiên cứu và chứng minh Nó tác dụng lên vi sinh vật dựa trên cơ chế tác động lên bề mặt tế bào, phá hủy lớp vỏ peptidoglycol hoặc phá huỷ hệ thống enzyme màng và làm vi sinh vật chết Các hydrophenolic và các phenolic loại hydroxylcianic như caffeic acid, ferulic acid, coumaric acid…có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các chủng

vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonela typhi, Bacillus subtilis,

E.coli…Các polyphenolic như Tannin có thể ức chế cả một số liên cầu khuẩn Streptococcus, Listeria monocytogenens,…Các hydroxylatephenol như

catechol và pyrogallon không ức chế mà gây độc cho vi sinh vật Thực vật thuộc họ Lamiaceae chứa rosmaric acid kháng khuẩn rất tốt theo cơ chế tác

dụng lên hệ thống enzyme màng của vi sinh vật [36]…Ở nhiều họ thực vật khác cũng đã nghiên cứu và chiết suất được các chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn có trong tinh dầu hoặc các chất thơm trong cây

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng thực vật

Mẫu lá của 4 loài thực vật bao gồm: Cây ba chạc (Euodia lepta

(Spreng) Merr.); Cây ba đậu (Croton tiglium L.); Cây bạc thau (Argyreia

acuta Lour.); Cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gragnep.) Mẫu được thu hái

ở Tam Đảo – Vĩnh Phúc và Trạm đa dạng Sinh học – Ngọc Thanh – Vĩnh

Phúc Người thẩm định phân loại các mẫu thực vật nghiên cứu cho đề tài này

là TS Võ Văn Chi, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây Ba chạc (Euodia

lepta (Spreng) Merr)

Ba chạc hay còn gọi là Chè đắng, Chè cỏ, Cây

dầu dầu; có tên khoa học là Euodia lepta (Spreng)

Merr, thuộc họ Cam Ba chạc thuộc loại cây nhỡ cao 2

– 8m Lá có 3 lá chét, với lá chét nguyên Cụm hoa ở

nách các lá và ngắn hơn lá Quả nang, thành cụm thưa,

có 1 – 4 hạch nhẵn, nhăn nheo ở cạnh ngoài, chứa mỗi

cái một hạt hình cầu đường kính 2mm, đen lam, bóng

Hoa nở tháng 4 - 5 Quả tháng 6 – 7

Ba chạc mọc phổ biến khắp nước ta trên những đồi cây bụi, ở bìa rừng

và trong rừng thưa, cả ở vùng núi và đồng bằng

Hình 2.1 Cây Ba chạc

(Euodia lepta Spreng Merr)

2.1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây Ba đậu (Croton tiglium L.)

Ba đậu hay còn gọi là cây Mẩn để, có tên khoa học là Croton tiglium L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbtuceae)

Cây gỗ nhỏ cao 3 – 6m Lá mọc so le, mép

khía răng Lá non màu hồng đỏ Hoa mọc thành

chùm ở đầu cành, hoa đực ở phía ngọn, hoa cái ở

phía gốc Quả nang nhẵn màu vàng nhạt Hạt có vỏ

cứng màu vàng nâu xám Cây ra hoa tháng 5 – 7, có

quả tháng 8 – 10

Cây của vùng Ấn Độ - Malaysia, mọc hoang ở

ven đồi, nương, rẫy cũ và rừng ẩm Hạt thu hái ở

những quả chín chưa nứt vỏ Để nguyên quả, khi dùng mới gỡ hạt hoặc dập lấy hạt phơi khô Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch, thái phiến, phơi khô dùng

Lá dùng tươi

2.1.1.3 Đặc điểm sinh học của cây Bạc thau (Argyreia acuta Lour.)

Bạc thau hay còn có tên khác là Bạc

sau, Lú lớn hay Thảo bạc, có tên khoa học là

Argyreia acuta Lour., thuộc họ Khoai lang

(Concovulaceae) Thân dạng dây leo bò hoặc

quấn Thân có nhiều lông màu trắng bạc Lá

nguyên mọc so le, hình bầu dục hay trái xoan,

mặt trên nhẵn, xanh thẫm, mặt dưới (mặt sau)

có nhiều lông mịn màu trắng bạc Cụm hoa ở

nách lá hay ngọn thân, hình đầu hoặc hình tán,

cuống hoa có lông tơ trắng bạc Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, màu trắng hoặc tím, mặt ngoài có lông tơ Mặt ngoài của lá đài cũng có ánh bạc Quả mọng

hình cầu, khi chín màu đỏ, bao bởi đài hoa phát triển, có mặt trong màu đỏ Hạt hình trứng, màu nâu Mùa hoa, quả tháng 6 – 7 đến tháng 11

Cây mọc hoang ở nhiều nơi, ven bờ bụi Có thể thu lá và thân quanh năm Lá thường dùng tươi Cành, lá, rễ đem về rửa sạch, thái nhỏ phơi khô

Có thể tẩm rượu sao qua rồi mới sử dụng

2.1.1.4 Đặc điểm sinh học của cây Khổ sâm (ba đậu Bắc kỳ) (Croton tonkinesis Gagnep.)

Khổ sâm hay Khổ sâm Bắc bộ, có tên khoa học là Croton tonkinesis Gagnep thuộc họ Thầu dầu (Euphobiaceae) Cây có kích thước nhỏ, cao

khoảng 1 – 1,5m, cành non mảnh Lá mọc so le, có khi tụ họp 3 – 4 lá như kiểu mọc vòng, hai mặt có lông óng ánh như lá nhót, phủ dày hơn ở mặt dưới; phiến lá hình ngọn giáo, dài 5 – 9cm, rộng 1 – 3cm, chóp nhọn dài thành mũi nhọn, mép nguyên, ba gân toả từ gốc, cùng với hai tuyến dạng răng cưa Hoa nhỏ trắng, mọc thành chùm ở nách lá hoặc đầu cành,

đơn tính, cùng gốc Quả có 3 mảnh vỏ Hạt hình trứng

màu nâu

Cây mọc hoang và được trồng ở khắp nơi, trong

các vườn gia đình hoặc vườn thuốc, chủ yếu ở các tỉnh

phía Bắc Việt Nam Thường trồng bằng gieo hạt hoặc

trồng bằng cành vào mùa xuân Thu hái khi cây đang

có hoa, đem phơi hoặc sấy khô Khi dùng sao vàng

Xử lý mẫu: Các mẫu thực vật sau khi được thu

hái về, rửa sạch, để khô trong bóng râm Mẫu sau khi khô được sấy trong tủ sấy có quạt gió ở 450C trong vòng 48h và nghiền thành bột mịn Để tiến hành chiết rút các hợp chất tự nhiên có trong các mẫu thực vật chúng tôi tiến hành

Hình 2.4 Cây khổ sâm

(Croton tonkinesis Gagnep)

ngâm trong ethanol 90% Khối lượng khô tuyệt đối của các mẫu lá cũng được xác định

2.1.2 Đối tượng vi sinh vật

Để nghiên cứu hoạt tính kháng một số vi sinh vật kiểm đinh, chúng tôi

sử dụng các chủng vi sinh vật: Bacillus subtilis, Cadida abbicans, E.coli,

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Staphyylococcus aureus, Vibrio cholera

Các chủng vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh vật trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện vệ sinh dịch tễ TW Hà Nội cung cấp

2.1.2.1 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis: là vi khuẩn kiểm định đại diện của nhóm trực khuẩn

Gram dương Chúng sinh sản bằng bào tử, sống hiếu khí B subtilis là tác nhân gây một số bệnh cho cây trồng, không gây bệnh cho người.[1]

2.1.2.2 Cadida abbicans

Cadida abbicans là một loại nấm men đơn bào có hình tròn hoặc bầu

dục, kích thước nhỏ khoảng 2-5 µm, sinh sản thành chuỗi và sinh nội độc tố Nhiệt độ thích hợp 20-37oC Candida abbicans thường sống hoại sinh trong

đường tiêu hóa của người, động vật

2.1.2.3 E.coli

Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, hình que có kích thước (1,1 –

1.5)m x (2 – 6)m Là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phát triển tốt ở 15 – 20oC,

có thể tồn tại tốt trong môi trường acid và nhiệt độ thấp E coli truyền nhiễm

vào cơ thể người và động vật chủ yếu qua đường tiêu hóa gây viêm ruột và gây viêm nhiễm tạo mủ ở nhiều nơi

2.1.2.4 Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae còn gọi là phế trực khuẩn Friedlander là trực

khuẩn ngắn, Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực Vi khuẩn này có nhiều hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không

sinh nha bào Klebsiella pneumoniae là loại vi khuẩn rất phổ biến trong

thiên nhiên (nước, đất) Nó ký sinh ở đường hô hấp trên của người, là tác

nhân “gây bệnh cơ hội”

2.1.2.5 Pseudomonas aeruginosa

Vi khuẩn P.aeruginosa còn gọi là trực khuẩn mủ xanh Vi khuẩn P

aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thước 0,6 x 2 μm có khả

năng di động nhờ một tiêm mao đơn cực, không bào tử, đứng một mình hay

thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn P aeruginosa là điển hình của loại

vi khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội (opportunistic pathogen): gây nhiễm trùng đường niệu, đường hô hấp, viêm da, nhiễm trùng mô mềm, viêm màng não…

2.1.2.6 Salmonella typhi

Salmonella typhi là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 3,0 x

0,5 µm, có nhiều lông ở xung quanh thân Sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện,

phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Salmonella typhi

có trên cơ thể người, tập trung chủ yếu ở ống tiêu hóa và gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như thương hàn

2.1.2.7 Shigella flexneri

Shigella flexneri là trực khuẩn Gram âm có dạng hình que thẳng dài

1-3m, không có lông, không di động, không có vỏ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm Vi khuẩn này có thể nuôi cấy được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí Chúng khu trú ở niêm mạc đại tràng, gây ra bệnh lỵ trực khuẩn ở

người, rất dễ tái phát và có thể trở thành bệnh mãn tính Một số loài có khả năng sinh ngoại độc tố tác động lên hệ thần kinh, gây các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu

2.1.2.8 Staphyylococcus aureus (tụ cầu vàng)

Staphyylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình cầu, kỵ

khí tuỳ tiện, phá triển tốt trong điều kiện hiếu khí, không sinh bào tử, không

di động Staphyylococcus aureus thường sống trong các hốc tự nhiên của cơ

thể, khoảng 30% cư trú trên da hay mũi người khoẻ mạnh, gây các bệnh từ nhẹ (mụn nốt đỏ, apxe) đến nặng (viêm phổi, viêm màng não, viêm màng tim,

nhiễm trùng máu) Staphyylococcus aureus là nguyên nhân gây ngộ độc thức

ăn, gây sốc phản vệ và gây nhiễm trùng bệnh viện (do khử trùng dụng cụ y tế không sạch)

2.1.2.9 Vibrio cholerae

Vibrio cholerae (còn gọi là Kommabacillus) là vi khuẩn Gram âm, hình

que, hai đầu không bằng nhau, di động rất nhanh trong nước Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sản sinh choleratoxin là độc tố có cường độ gây bệnh mạnh

và các độc tố khác như hemolysine gây bệnh tả ở người

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

2.2.1 Hóa chất thí nghiệm

Hóa chất tinh khiết dùng để chiết xuất, định tính, định lượng như: EtOH ≥ 90%, n–hexan ≥ 95%, Chlorofom ≥ 99,0%, Ethylacetate ≥ 99,5%, Nước cất, Aceton ≥ 99,5%, Toluen ≥ 99,5%, Acid fomic ≥ 88,0%, Methanol

≥ 99,5%, H2SO4 ≥ 98%, NaOH, HCl, Pb(CH3COO)2 10%,…của các hãng Sigma, Merck…

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Một số máy móc thiết bị tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu Khoa học và chuyển giao Công nghệ - ĐHSP Hà Nội 2; Phòng thí nghiệm Hóa sinh miễn dịch và Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật – ĐHKHTN, Đại học Quốc gia

Hà Nội

+ Máy móc: Máy cô quay chân không, máy cất nước, máy xác định

OD, bình ổn nhiệt, nồi hấp khử trùng, buồng cấy vô trùng, tủ ấm…

+ Thiết bị thí nghiệm: Tủ sấy, cân điện tử, ống nghiệm, ống đong, bình

tam giác, đĩa petri, pipet, que cấy: …

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Quy trình nghiên cứu

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình nghiên cứu thành phần hóa học và đặc tính kháng vi

sinh vật kiểm định từ các mẫu thực vật

Mẫu lá thực vật khô

Tiến hành chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên

Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm đinh Khảo sát thành phần hóa học

Thăm dò thành phần hoá học có hoạt tính kháng khuẩn

Kết luận

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Mục đích: Xác định khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao chiết và

chế phẩm phân đoạn đối với một số chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh theo phương pháp nhỏ dịch, xác định vòng kháng khuẩn

Tiến hành: - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, hấp khử trùng 3 lần trong 3

ngày liên tiếp

- Nuôi cấy lắc khởi động vi sinh vật trong môi trường dịch thể trong 24 giờ, nấm men trong 48 giờ

- Cấy vi sinh vật đã khởi động trên môi trường đặc trong đĩa petri, sau

đó đục giếng

- Mẫu dịch chiết được pha theo tỷ lệ thích hợp (thường là 1 mẫu: 19 nước cất) sẽ được tra vào các giếng Để đĩa petri trong 4oC cho mẫu khuyếch tán đều vào thạch rồi đưa vào tủ ấm 37oC Đọc kết quả vòng kháng khuẩn sau

24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với nấm

2.3.3 Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng của từng nhóm chất với các thuốc thử đặc trưng và cho màu hoặc dấu hiệu nhận biết khác nhau Với một liều lượng xác định, việc so sánh cường độ màu cũng có thể bước đầu đánh giá được hàm lượng của chúng trong các mẫu nghiên cứu

2.3.3.1 Định tính flavonoid

Mẫu thử được pha trong Ethanol với một lượng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc

- Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống

đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay

da cam

- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm:

một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy

lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc Kết quả cho màu

đỏ son là phản ứng dương tính

2.3.3.2 Định tính tannin

Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:

- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một

ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4 Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm

- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch

mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục

- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào

dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

2.3.3.3 Định tính các polyphenol khác

- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha như trên

Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam

- Phản ứng với FeCl 3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96% Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen

+ Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc Phương pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol với thuốc

thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 765nm Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo mg acid gallic chuẩn

Chuẩn bị mẫu định lượng:

- Cân chính xác 5 gam bột mẫu dược liệu và tiến hành chiết rút 3 lần bằng Methanol (mỗi lần 50ml), lọc gom dịch lọc và thêm MeOH tới 150ml

- Cân chính xác 0,05 mg cao các phân đoạn hoà tan trong 10ml MeOH

Phương pháp tiến hành:

Lấy 1,58ml nước cất 2 lần vào cuvet loại 3ml sau đó thêm 20l mẫu và 100l thuốc thử Folin, lắc đều và để trong tối trong 5 phút Tiếp theo thêm

300ml dung dịch Na2CO3 bão hoà, lắc đều và để trong tối trong 2h sau đó tiến hành đo ở bước sóng 765nm

2.3.5 Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia hai pha: một pha

đứng im gọi là chất hấp phụ là lớp mỏng Silicagen rải trên một tấm thủy tinh, một pha di động là một dung môi đựng trong một bình có nắp kín Lớp hấp phụ nhúng vào dung môi Dung môi di chuyển lên làm chuyển dịch mẫu để phân tách từ vị trí chấm của nó trên lớp mỏng Nếu mẫu là một hỗn hợp, mỗi chất trong đó có hệ số hấp phụ và có ái lực xác định đối với dung môi sẽ di chuyển với tốc độ riêng

Vị trí các vết chuyển dịch có thể soi dưới ánh sáng tử ngoại, hoặc hiện màu bằng những thuốc thử thích hợp Ta có thể cạo các vết, rửa được các chất, tinh chế, đem phân tích bằng quang phổ kế để xác định thành phần riêng biệt

Cách tiến hành:

Sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel DC - Alufolien 60 F254 (Merck

5554) Hệ dung môi chạy sắc ký là hệ dung môi TEF theo tỷ lệ 5:4:1 (Toluen

– Etthylacetat – acid formic) Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%

- Chuẩn bị dung môi chạy sắc ký hệ dung môi TEF theo tỷ lệ 5:4:1

- Hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp và tiến hành lọc qua màng lọc kích thước lỗ 0,45m

Tiến hành chấm mẫu lên bản mỏng và chạy sắc kí (đặt trong dung môi)

- Hiện kết quả bằng thuốc thử

Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b

Trong đó: - a: khoảng di chuyển của chất nghiên cứu

- b: khoảng di chuyển của dung môi

- Rf: hệ số di chuyển của chất phân tách có giá trị từ 0 đến 1