Nghiên cứu đặc tính hoá sinh của một số hợp chất tự nhiên từ cây cốt khí (Tephrosia Candida.l. ) mọc phổ biến ở Việt Nam

Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí tới một số chỉ số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid và gluxit 46 3.6.3.1.. Tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch c

Bộ giáo dục và đào tạo

Trường Đại học sư phạm Hà nội 2

Bộ giáo dục và đào tạo

Trường Đại học sư phạm Hà nội 2

Trần Văn Quang

Nghiên cứu đặc tính Hoá sinh của một số hợp chất

tự nhiên từ cây cốt khí

(Tephrosia candida.l.) mọc phổ biến ở việt nam

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

Luận văn thạc sĩ khoa học

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quang Vinh

Hà nội 2009

Lời cảm ơn

Luận văn này được thực hiện tại Phòng Miễn dịch học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quang Vinh và GS.TS Đỗ Ngọc Liên khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đã giao đề tài, tận tính giúp đỡ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập, cũng như chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ Trung tâm Nghiên cứu Khoa học và Sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia

Hà Nội và các thầy cô trong Phòng sau đại học Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Cha, Mẹ, Vợ, Con những người luôn chăm sóc động viên tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 200

Học viên

Trần Văn Quang

Môc lôc

1.1 Giíi thiÖu vÒ mét sè hîp chÊt tù nhiªn ë thùc vËt 4

1.3.3 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh 16

1.4.6 Một số nghiên cứu về cây cốt khí (Tephrosia candida.L.) có tác

dụng hạ đường huyết ở Việt Nam và trên thế giới

2.2.5 Đọc kết quả 27 2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá cốt khí 27

2.3.2 Phương pháp định lượng glucose huyết [42,49] 28 2.3.3 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo typea [16] 29

2.5.3 Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nulear Magnetic

3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ lâ cốt khí 35 3.2 Định tính một số hợp chất tự nhiên trong các dịch chiết của thịt

3.3 Định lượng hợp chất phenolics trong các phân đoạn dịch chiết [44] 38 3.4 Phân tích các thành phần hợp chất tự nhiên từ lá cây cốt khí bằng

3.6 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí lên chuột béo phì 41

thực nghiệm

3.6.1 Kết quả gây mô hình chuột béo phì thực nghiệm bằng thức ăn có

3.6.2 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lên trọng lượng của chuột

3.6.3 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí tới một số chỉ

số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid và gluxit 46 3.6.3.1 Chỉ số Cholesterol toàn phần của chuột béo phì sau 14 ngày

3.6.3.2 Chỉ số Triglycerid của chuột béo phì 14 ngày điều trị 48 3.6.3.3 Chỉ số HDL của chuột béo phì sau 14 ngày điều trị 50 3.6.3.4.Chỉ số glucoset của chuột béo phì sau 14 ngày điều trị 51 3.7 Tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ lá cốt

3.7.1 Tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí

đối với chuột béo phì có tiêm STZ sau 10 giờ điều trị 54 3.7.2 Tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí

lên chuột béo phì có tiêm STZ sau 12 ngày điều trị 56 3.8 Quy trình phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất

có hoạt tính sinh học trong phân đoạn ethylacetat 58

2 KiÕn nghÞ 63

Danh mục các bảng, hình, sơ đồ Bảng 3.1: Hiệu suất điều chế các phân đoạn từ lá cốt khí 36 Bảng 3.2: Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết từ lá cốt khí 37 Bảng 3.3: Kết quả định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ethanol 38 Bảng 3.4 Đặc điểm các băng sắc kí đồ của các phân đoạn dịch

Bảng 3.6: Trọng lượng của các lô chuột sau 3 tuần nuôi và hai chế độc ăn

Bảng 3.7: Một số chỉ số hoá sinh của chuột bình thường và chuột béo phì

sau 4 tuần nuôi theo hai chế độ ăn khác nhau 43 Bảng 3.8: Trọng lượng (gam) của các lô chuột sau 14 ngày điều trị

Bảng 3.13 Nồng độ glucose máu của chuột béo phì trước và sau khi tiêm 53 Bảng 3.14: ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ glucose máu của chuột béo phì được tiêm STZ

Hình 7: Hàm lượng Cholesterol của chuột trước và sau 14 ngày điều trị 47 Hình 8 Hàm lượng Triglycerid của chuột trước và sau 49 Hình 9: Hàm lượng HDL của chuột trước và sau 14 ngày điều trị 50 Hình 10 Hàm lượng glucose máu của chuột trước và sau 52 Hình 11 Sự thay đổi nồng độ glucose máu ở chuột béo phì + STZ sau khi uống các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí 55 Hình 12: Sự thay đổi nồng độ glucose máu của chuột béo phì + STZ

sau 14 ngày điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết 57

Chữ viết tắt CAH Phân đoạn dịch chết n – Hexan

CaC Phân đoạn dịch chiết Chlorofom

CaE Phân đoạn dịch chiết Ethylacetat

HMBC Hetaronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Heteronuclear Multuple Quantum Coherence

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

LD50 Liều gây chết 50% động vật thực nghiệm (Lethal dose)

Me Nhóm metyl

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Mở đầu

1 Lý do chọn đề tài

Khoảng 1550 năm trước công nguyên, thầy thuốc người Hy Lạp đã mô tả bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay còn gọi là bệnh tiểu đường với các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và gầy sút nhanh [15,21] Bệnh có chiều hướng tăng dần theo thời gian và tốc độ phát triển của xã hội Đặc biệt trong vài thập niên gần đây, số người mắc bệnh này trên thế giới tăng với tốc độ rất nhanh, do vậy hiện nay bệnh ĐTĐ được xem như là một đại dịch của toàn cầu Theo điều tra của WHO năm 2000 số người mắc bệnh ĐTĐ trên thế giới là 177 triệu người, dự tính đến năm 2025 con số sẽ lên tới 300 330 triệu [4, 15]

Hiện nay bệnh ĐTĐ đã thực sự trở thành gánh nặng về kinh tế cho nhiều quốc gia trên thế giới Do tốc độ phát triển nhanh của bệnh, nên nhu cầu thuốc điều trị ĐTĐ cũng tăng nhanh Kể từ khi Best và Banting (1921) phát hiện ra insulin [21, 28] đến nay, hàng loạt thuốc điều trị bệnh ĐTĐ đã ra đời (các sulfonyluream các biguanid, nhóm thiazolidinedion) và đang được sử dụng nhằm hạn chế sự tiến triển của bệnh và cải thiện cuộc sống cho người bệnh [28, 33, 36] Bên cạnh các thuốc có nguồn gốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc thảo dược cũng đang được cũng đang được quan tâm và phát triển

Uỷ ban chuyên gia của WHO về ĐTĐ đã khuyến nghị nên phát triển và sản xuất các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ có nguồn gốc thảo dược, bởi vì vậy là nguồn dược liệu sắc có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít độc tính và ít tác dụng phụ đồng thời dễ chấp nhận cho cộng đồng đặc biệt là các nước nghèo kém phát triển

- Nước ta nằm ở vùng nhiệt đới, Châu á có nền y học cổ truyền sử dụng các bài thuốc đông y có nguồn gốc từ tài nguyên thiên nhiên thực vật phong phú để chữa các bệnh nhiễm khuẩn và nhiều bệnh nan y khác Tuy nhiên, việc nghiên cứu sâu sắc các đặc tính hoá học, cơ chế tác dụng dược lý của các bài

kết hợp với nghiên cứu cơ sở dược lý và cơ chế tác dụng của chúng giúp điều trị các bệnh đang lan tràn trong cộng đồng dân cư như ung thư, béo phì, đái tháo đường, tim mạch là rất cấp bách hiện nay Vì vậy, chúng tôi chọn đề

tài: Nghiên cứu đặc tính Hoá sinh của một số hợp chất tự nhiên từ cây cốt khí (Tephrosia candida.L.) mọc phổ biến ở Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần hoá học của cây cốt khí

(Tephrosia candida), và tác động hạ glucose huyết, nhằm tạo cơ sở cho những

nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Chúng tôi nghiên cứu đề tài này với mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết và hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí trên chuột gây ĐTĐ bằng STZ

2 Xác định độc cấp LD50

3 Phân lập một số hợp chất từ lá cây cốt khí

4 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất đã phân lập được từ dịch chiết lá cốt khí

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập một số hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học trong lá cây cốt khí mọc phổ biến ở Việt Nam và ứng dụng trong y dược

3.2 Đánh giá tác dụng chống rối loạn trao đổi glucose và lipid trên mô hình chuột gây bệnh béo phì thực nghiệm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lá cây và dịch chiết từ lá cốt khí (Tephrosia candida.L)

- Chuột nhắt chủng Swiss được nuôi theo 2 chế độ thức ăn khác nhau

4.2 Phạm vi nghiờn cứu : Tập trung nghiên cứu thành phần hoá học của lá

cốt khí và tác dụng hạ glucose và lipid máu, tạo cơ sở cho những phương pháp

nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền

4.3 Thời gian triển khai nghiờn cứu:

Dự kiến sẽ nghiờn cứu trong 08 thỏng từ thỏng 10/2008 đến hết tháng 06/2009

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Thu mẫu, tách, chiết rút bằng nước và dung môi hữu cơ

5.2 Tạo mô hình chuột béo phì và rối loạn trao đổi chất glucid

5.3 Sử dụng một số phân đoạn dịch chiết đánh giá tác dụng hạ glucose huyết và chống rối loạn trao đổi chất lipid

5.4 Thử nghiệm khả năng ngưng kết hồng cầu, khả năng kháng khuẩn gây bệnh do nhiễm độc thực phẩm

5.6 Phân tích cấu trúc 02 hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học bằng phổ hấp phụ và cộng hưởng từ hạt nhân

6 Giả thuyết khoa học

- Nghiên cứu thành phần hoá học của cây cốt khí (Tephrosia candida.L.) khí và tác dụng hạ glucose, lipid máu, tạo cơ sở cho những

phương pháp nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới

- Giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền

Nội dung

Chương I: Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật

1.1.1 Lớp chất flavonoid [14, 30, 46]

a Giới thiệu chung

Các flavonoid là lớp chất phổ biến trong thực vật Chúng là hợp chất

được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B được kết nối bởi 1 dị vòng C với khung cacbon C6 - C3 - C6

Các flavonoid là dẫn xuất của 2 – phenyl chroman (flavan)

3 4

5 6

Các flavonoid có ở trong tất cả các cán bộ phận của cây, bao gồm quả, phấn, hoa, rễ Một số flavonoid có hoạt tính sinh học thể hiện ở khả năng chống oxi hoa

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

1

1'2' 3'4' 5' 6'

Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các nhóm hydroxy liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất khác nhau

Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng

tự do mà thường dưới dạng glycoside

Flavonol

O

O

Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcol do vòng dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcol

+ Flavanonol 3

Các flavanonol – 3 còn gọi là flavanon – 3 – ol hay dihydroflavonol, flavanomol có cấu trúc giống như flavanon chỉ khác nhóm thế hydroxy ở vị trí cacbon (C – 3)

Người ta đã biết đến khoảng 30 hợp chất thuộc nhóm này, phần lớn chúng ta ở dạng aglycon chỉ có vài chất ở dạng glycoside Flavanonol có hai nguyên tử cacbon bất đối là C–2 và C–3 nên chúng có tính quang hoạt Các hợp chất flavanonol–3 thường gặp là aromadenndrin, fustin và taxifolin

+ Chalcol

Chalcol khác với các loại flavonoid là nhóm Chalcol có phân tử gồm hai vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch chở có 3 nguyên tử cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu đánh từ vòng B

Hiện nay người ta biết đến khoảng 20 hợp chất Chalcol, ngoài ra còn thấy hợp chất dihydrochalcol Tuy vậy, giữa chalcol và dihydrochalcol hầu như không có mối quan hệ khăng khít nào Chalcol có thể bị đồng phân hoá thành flavanon khi đun nóng với axit chlohydric (HNl)

O

Auron

Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng Shinoda (phản ứng định tính flavonoid) Trong tự nhiên, các chalcol – glycoside dễ bị oxi hoá thành auron – glycoside nên hai nhóm chất này tồn tại cạnh nhau Các auron – glycoside hay xuất hiện trong họ Cúc Ví dụ như hai hợp chất auron có trong cây Cúc chuồn chuồn là coreopsin và sunphurein, công thức như sau:

Màu sắc của antoxianidin thay đổi theo pH Trong dung dịch axit vô cơ, Antoxianidin cho muối oxoni có màu đỏ, còn trong môi trường kiềm chúng tạo thành các anhydrobazo với một nhóm quinoid màu xanh:

+ Catechin

Catechin là các dẫn xuất flavan – 3 – ol Do đó hai trung tâm cacbon bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang Ví dụ như các cặp Catechin và epicatechin Trong đó chỉ có (+) – Catechin và (–) – epicatechin xuất hiện trong thiên nhiên

O

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

1

1'2' 3'4' 5' 6'

Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc cũng

như sinh tổng hợp Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử cacbon

nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai Công thức như sau:

1.1.2 Vài nét về các hợp chất tecpen [57]

Tecpen là một lớp hợp chất tự nhiên phổ biến nhất, cấu trúc có thể phân

chia thành các đơn vị isopren Đó là thành phần chính của các loại tinh dầu

mà ta thường dùng trong công nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược

phẩm Những tecpen bậc cao thường là những chất có hoạt tính sinh học quan

trọng Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành mà người ra phân biệt thành các

monotecpen C10, sesquitecpen C15, ditecpen C20, sestertecpen C25, tritecpen C30,

tetratecpen C40, và polytecpen

CH

CH C O

Dựa vào số vòng của cấu trúc, người ta chi Monotecpen thành 3 nhóm:

Monotecpen không vòng, Monotecpen 1 vòng, Monotecpen 2 vòng Trong

mỗi nhóm, các Monotecpen có thể là các hyđrocacbon không no hoặc có thêm

nhóm chức ancol, andenhyt, xeton Hầu hết các Monotecpen mạch thẳng có

trong thiên nhiên có bộ khung cơ bản 2,6 – dimetyloctan hay geranilan Còn

có một số rất ít gọi là các tecpen bất thường thì được tạo nên theo một con

đường sinh tổng hợp khác

+ Sesquitecpen

Có khoảng 1000 Sesquitecpen thuộc khoảng 100 khung Với số lượng chiếm khoảng một phần tư tổng số các chất tecpen tự nhiên mà ta biết ngày nay, các Sesquitecpen là nhóm chất tecpen lớn nhất Với các khung chính là: Sesquitecpen mạch thẳng, mạch vòng đơn, mạch vòng kép, Sesquitecpenlacton

+ Ditecpen

Ditecpen bào gồm các axit nhựa, các Ditecpen độc tố và các chất kích thích sinh trưởng gibberellin Phần lớn là những hợp chất vòng, kiểu đóng vòng phổ biến là sự tạo thành các dẫn xuất perhydronaphtalen và perhydrophenanthren

Các hợp chất mạch thẳng rất ít, trừ một chất khá phổ biến trong thiên nhiên là phytol, là một ancol có trong chất diệp lục (chlorophyll) dưới dạng este và tạo thành mạch bên của vitamin E và vitamin K1 Có một nối đôi giữa

C2 và C3

CH2OH

+ Tritecpen

Các Tritecpen phân bố rộng rãi trong giới thực vật, cho đến những năm

70 có khoảng 500 hợp chất Tritecpen được xác định cấu trúc Một số Tritecpen có tác dụng sinh lý, dược lý như: Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và kháng một số dạng ung thư, ngoài ra còn có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, điều hoà nội tiết, hạ cholesterol trong máu và chống xơ vữa động

mạch Hợp chất spualen với cấu hình trans là chất tiền thân sinh học của tất cả

OH

23 19 24

17

16 15 14

21

H

18 13 12 11

10

9 8 7 21

6

2 1 20

4 35

1.2 Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)

Danh từ bệnh (ĐTĐ) (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (diabetes: nước chảy trong ống syphon), La Tinh (mellitus – ngọt) ĐTĐ là bệnh mãn tính phổ biến nhất và đang ngày càng phát triển trên toàn cầu Biểu hiện của bệnh là sự tăng đường huyết, không dung nạp glucose dẫn đến ĐTĐ

ĐTĐ cũng là nguyên nhân gây các biến chứng mù mắt, suy gan, thần kinh, tim mạch, Nguyên nhân ĐTĐ là do tế bào  của đảo tuỵLangerhan bị phá huỷ mất khả năng sản xuất insulin, một hormon điều hoà nồng độ glucose

máu (ĐTĐ type 1) hoặc do rối loạn trao đổi chất lipid – glucid dẫn đến đối kháng sinh insulin (ĐTĐ type 2) [12]

1.2.1 Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ

Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ thay đổi theo lứa tuổi, dân tộc và các vùng địa lý khác nhau và theo sự phát triển kinh tế của mỗi quốc gia Những số liệu mới nhất đưa ra tại Hội nghị thượng đỉnh về ĐTĐ thế giới năm 2006 cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Châu á hiện nay đã vượt xa Châu Âu, nơi vốn được xem là

ổ bệnh Trong khi có khoảng 5% số người trưởng thành ở Châu Âu mắc bệnh thì ở Châu á số người mắc là từ 10 – 12% và ở những quốc gia đảo thuộc Thái Bình Dương là 30 – 40% Điều nguy hiểm là Châu á đang có chiều hướng gia tăng ĐTĐ ở tuổi thanh thiếu niên và trẻ nhỏ Cũng theo tổ chức này thì nếu năm 2000 có 146 triệu người mắc bệnh ĐTĐ thì năm nay 2010 sẽ là

220 triệu người và năm 2025 sẽ có thể lên tới 300 triệu người chiếm 5% dân

số thế giới

ở Việt Nam, chỉ tính riêng năm 1991 tỷ lệ người mắc bệnh ở Hà Nội là 1,1%; ở Huế 0,96%; ở TP HCM 2,3% Năm 2002, tỷ lệ bệnh ĐTĐ trên toàn quốc là 2,7%; riêng tại các thành phố tỷ lệ mắc là 4,4% trong khi ở các khu vực khác đang dao động từ 2,1 – 2,7% Và hiện nay có khoảng 2 triệu người mắc ĐTĐ, nhưng có tới 65% người bệnh không biết mình đã mắc bệnh này Trong 10 năm qua, số bệnh nhân ĐTĐ đã tăng 3 – 4 ở khu vực thành thị Khu vực nông thôn trước đây thường rất ít nay bệnh đã trở nên phổ biến [4]

Rõ ràng ĐTĐ đang có nhiều hướng phát triển nhanh chóng nhất là khu vực Châu á Mối liên quan chặt chẽ giữa dinh dưỡng – lối sống và bệnh

ĐTĐ từ lâu đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới công nhận Dinh dưỡng không hợp lý dẫn đến thừa cân, béo phì và rối loạn chuyển hoá là một trong những cơ chế quan trọng trong sinh bệnh học của rối loạn dung nạp glucose

và bệnh ĐTĐ Hơn nữa bệnh ĐTĐ lại có nhiều biến chứng về tim mạch, thần

kinh, gât đột quỵ, mù loà, tổn thương thân, tuổi thọ Vì thế, ĐTĐ không chỉ

là mối quan tâm của ngày y tế mà còn thu hút cả sự chú ý của các nhà quản lý xã hội

1.2.2 Phân loại bệnh ĐTĐ

Năm 1997, Uỷ ban chuyên gia về chuẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ của WHO đưa ra đề nghị phân loại bệnh ĐTĐ mới dựa trên những tiến bộ khoa học trong những năm gần đây [21, 24, 27]

+ ĐTĐ type 1: là kết quả của sự phá huỷ tự nhiên tế bào  tuyến tuỵ Vào lúc ĐTĐ xuất hiện, thì hầu hết các tế bào  của tuyến tuỵ đã bị phá huỷ, quá trình phá huỷ này là do cơ chế tự miễn [12, 16, 22, 25, 27] Bản thân cơ thể sản sinh ra các kháng thể chống lại tổ chức tuyến tuỵ, chống lại glutamic acid decarboxylase (GSD), chống lại insulin (IAAS) Loại tiểu đường này xảy

ra ở bất kỳ lứa tuổi nào, nhưng thường xảy ra ở trẻ em và thanh niên

+ ĐTĐ type 1 [18]; hai yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh

bệnh của tiểu đường type 1 là khiếm khuyết chức năng tế bào  tuyến tuỵ và hiện tượng kháng insulin Tuy nhiên hai yếu tố này lại tác động qua lại với nhau Khiếm khuyết chức năng bài tiết insulin có thể làm xuất hiện hiện tượng kháng insulin hoặc ngược lại:

+ Tiểu đường thời kỳ thai nghén: cơ thể của ngườu phụ nữ thay đổi

nhiều trong kỳ mang thái, thai phụ có thể mắc dạng tiểu đường này

+ Các type ĐTĐ đặc hiệu:

- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào 

- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin

- Bệnh tuyến tuỵ ngoại tiết

- Các bệnh nội tiết

- Thuốc hoặc hoá chất

- Nhiễm khuẩn

- Một số hội trứng di truyền kết hợp với ĐTĐ

1.2.3 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ

1.2.3.1 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ type 1

Nguyên nhân chính của ĐTĐ type 1 là do tế bào  của đảo tuỵ Langerhan bị phân huỷ mất khả năng sản xuất insulin, một hormon điều hoà nồng độ glucose máu Quá trình huỷ hoại các tế bào  này là do cơ chế bệnh

tự miễn dịch Khoảng 18 vùng gene có liên quan đến nguy cơ tiểu đường type

1 Mỗi vùng ở những vùng này có thể chứa vài gene được gắn nhãn hiệu IDDM1 đến IDDM18 Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng đóng vai trò khởi

động quá trình bệnh lý [16, 22, 35] như virut (Coxsackie B, Cytomegalovirut, Echo, Epstein – Bar ), thức ăn (sữa bò, cafein ) điều kiện sống (stress, thường xuyên tiếp xúc với các độc chất với tế bào  như vascor )

Khi tác nhân môi trường tác động, lúc này hệ thống miễn dịch được hoạt động hoá, tấn công vào các tiểu đoạn tuỵ [14, 16, 35] Mặc dù diễn biến lâm sàng yên lặng, nhưng bên trong cơ thể, các tiểu đạo đã bị thâm nhiễm các bạch cầu đơn nhân, các đại thực bào và các tế bào lympho T độc hoạ hoá [14, 35] Quá trình thâm nhiễm này gọi là viêm đảo tuỵ (insulintis), diễn tiến kéo dài [14, 27] Khi tế bào  tuyến tuỵ chưa bị phá huỷ nhiều, lượng insulin máu vẫn đủ cho nhu cầu hoạt động cơ thể, thì lâm sàng chưa biểu hiện gì, đây gọi

là giai đoạn ĐTĐ Giai đoạn này có thể ngắn hoặc dài tuỳ từng cá thể [27] Khi tế bào  bị phá huỷ càng nhiều, lượng insulin sản xuất ra không đáp ứng

đủ nhu cầu hoạt động cơ thể, glucose huyết sẽ tăng lên, và lúc này biểu hiện bệnh rõ ràng

1.2.3.2 Cơ chế sinh bệnh của ĐTĐ type 2

Mặt dù ĐTĐ type 2 thường gặp hơn (chiếm 80 – 90% tổng số bệnh nhân ĐTĐ) cà có tính quy tụ gia đình [18, 52] Hai yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào  tuyến tuỵ và hiện tượng kháng insulin [15, 20, 27, 50, 58] Kháng

insulin và khiếm khuyết chức năng tế bào  tuyến tuỵ là hai yếu tố tác động qua lại lẫn nhau [26] Khiếm khuyết chức năng bài tiết insilin có thể làm xuất hiện hiện tượng kháng insulin, hoặc ngược lại [15, 27] Giữa hai yếu tố này, yếu tố nào chiếm ưu thế và yếu tố nào xuất hiện trước cho đến nay vẫn chưa xác định được Cùng với yếu tố môi trường như chế độ ăn uống, sinh hoạt, béo bệu thúc đẩy làm phát sinh và phát triển bệnh [25, 32]

Sinh bệnh học của ĐTĐ type 2 diễn tiến qua 3 giai đoạn [17]

+ Giai đoạn 1: Mặt dù nồng độ glucose trong máu vẫn có mức bình

hường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

+ Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần và xuất

hiện tăng gluocse sau bữa ăn

+ Giai đoạn 3: Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin

suy giảm và gây tăng glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài

Béo bệu là một trong những yếu tố môi trường đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh được đề cập nhều nhất, chính béo bệu làm gia tăng tình trạng kháng insulin [20, 25, 26, 32] Nhiều bằng chứng cho thấy các biện pháp giảm béo bệu cũng làm giảm đáng kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát tốt glucose huyết

1.2.5 ĐTĐ với Y học cổ truyền

Quan niệm của đông y, bệnh ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát, với

ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều, Do ăn nhiều các chất cay, béo ngọt làm mất cân bằng âm dương trong cơ thể, tạo thành hoả nhiệt, uất nhiệt, làm phần âm của phủ tạng như âm vị, thận bị hao tồn Hoả nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vì âm gây chứng gây đói, thân ấm hư gây tiểu nhiều và tiểu ra đường Xuất phát từ quan niệm trên, nên phương pháp

điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tâm làm cơ sở để lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể [2, 3, 4, 5]

Các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ của Đông y chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu như Sinh địa, Cỏ ngọt, Mướp đắng, Hoàng Kỳ, Huyền sâm [ 10]

1.3 Các chất kháng khuẩn và kháng sinh có nguồn gốc thực vật và vi sinh vật

1.3.1 Chất kháng khuẩn

Chất kháng sinh là những chất được sinh ra bởi các vi sinh vật trong hoạt động sống của chúng, nhằm ức chế hoặc tiêu diệt sự sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật khác một cách có chọn lọc Ví dụ, hàng loạt chất kháng sinh đã được biết từ thế kỷ trước như: penicillin, streptomycin, và các chất kháng sinh thế hệ 2 và thế hệ 3

Một số chất mặc dù có khả năng ức chế vi sinh vật ngay ở nhiệt độ thường những không được coi là chất kháng sinh như: thuốc đỏ, thuốc tím, Mặt khác, chất có nguồn gốc vi sinh vật nhưng được bán tổng hợp bằng con

đường hoá học nhưng vẫn được coi là chất kháng sinh – chất kháng sinh bán tổng hợp Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng đối với một hoặc một số nhóm

vi sinh vật nhất dịnh do thành phần, cấu tạo, tính chất, đặc tính và cơ chế tác dụng đặc trưng lên các vi sinh vật đó [1]

1.3.2 Chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật

Năm 1973, Ingham đã đưa ra định nghĩa "phytoalexin" để chỉ các chất kháng khuẩn hình thành trong cơ thể thực vật thông qua một chuỗi liên tiếp các quá trình chuyển hoá trước các biến đổi sinh học hoặc để phản ứng lại với

điều kiện môi trường nhằm thích nghi với điều kiện sống tốt hơn hoặc chống lại sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh Phytoalexin được tìm thấy dưới nhiều dạng khác nhau như: alkaloid, flavonoid, glycoside, ''[11,58]

1.3.3 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

đoạn kéo dài tổng hợp protein

- ức chế sinh tổng hợp acid nucleic [58]

1.4 Vài nét chung về cây cốt khí (Tephrosia candida.L.) [7]

Cốt khí còn có tên khác: Đoón kiếm trắng

1.4.1 Phõn bố:

Nguyờn sản ở vựng xớch đạo - nhiệt đới Malaixia Được đưa trồng ở

VN gần 1 thế kỷ nay, chủ yếu là cỏc tỉnh Bắc Bộ Đặc biệt trong vài chục năm gần đõy cõy cốt khớ đó được trồng kết hợp với diện tớch lớn trờn nhiều vựng cả

ở ven biển miền trung, Tõy Nguyờn và Nam Bộ đều sinh trưởng và phỏt triển tốt Do vậy, cốt khớ đó trở thành cõy chủ lực được sử dụng làm cõy che phủ đất, chống xúi mũn, trồng xen phụ trợ cho nhiều loại cõy trồng khỏc trong nụng lõm nghiệp rất cú hiệu quả được nhiều dự ỏn trong và ngoài nước quan tõm hỗ trợ phỏt triển

Ở VN được biết cú 9 loài cốt khớ nhưng chỉ cú loài này được trồng phổ biến

1.4.2 Một số đặc tính sinh học của cây cốt khí

Cõy bụi nhỏ thõn gỗ cao 2-3m, đường kớnh cổ rễ 4-5cm, tuổi thọ trung bỡnh 3-5 năm, thõn trũn, cú nhiều lụng màu trắng vàng, nhiều cành, nhỏnh, tỏn khỏ dày Cõy ưa sỏng, mọc nhanh và thường xanh Hệ rễ phỏt triển và cú nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm cộng sinh

Lỏ kộp lụng chim 1 lần lẻ, cú 15-27 đụi lỏ chột hỡnh thuỗn 2 đầu nhọn dài 7cm, mặt trờn màu xanh thẫm, mặt dưới cú nhiều lụng bạc

3-Hoa tự chựm mọc đứng, hoa to màu trắng, quả đậu dẹt, dài 8-10cm, rộng 8-9cm, khi non phủ 1 lớp lụng bạc, khi chớn vỏ quả màu nõu vàng, cú 1-

13 hạt, hạt màu nõu đen, vỏ cứng, tỷ lệ nảy mầm cao, dễ bảo quản Cõy 1 tuổi

đó ra hoa và cho quả, hàng năm cú 2 lứa: lứa đầu ra hoa thỏng 8-9 quả chớn vào thỏng 11-12; lứa sau ra hoa thỏng 12-1, quả chớn vào thỏng 2-3 năm sau

1.4.3 Mụi trường sống:

Thớch hợp điều kiện khớ hậu núng ẩm ở vựng thấp cú độ cao dưới 300m

so với mặt biển Lượng mưa hàng năm từ 1000-1500mm, mựa khụ 3-4 thỏng, nhiệt độ trung bỡnh năm từ 15-250C

Cũng cú thể mọc được ở độ cao lờn tới 500-600m hoặc 900-1000m như

ở Tủa Chựa (Lai Chõu) vẫn sinh trưởng và phỏt triển bỡnh thường

Yờu cầu đất sõu, ẩm xốp, thành phần cơ giới trung bỡnh, độ pH từ ớt chua đến chua, thoỏt nước, đất phỏt triển trờn nhiều nhúm đỏ mẹ khỏc nhau Nhưng cũng chịu được đất nghốo xấu, tầng mỏng, tỷ lệ đỏ lẫn và kết vún nhiều, đất nương rẫy thoỏi hoỏ Khụng trồng được trờn đất bị ngập ỳng, đất bị nhiễm mặn

1.4.4 Cụng dụng:

Che phủ và cải tạo đất, chống xúi mũn: mọc nhanh đõm chồi khoẻ, tỏn

lỏ dày, chất xanh dễ phõn giải, vỡ cú vi khuẩn cố định đạm cho nờn được trồng

để phủ xanh phục hồi bảo vệ đất và làm phân xanh rất tốt Ở điều kiện thích hợp sau khi trồng 5 tháng có thể cho 30 tấn sinh khối tươi/ha, là nguồn hữu cơ đáng kể

Trồng xen che bóng phụ trợ hạn chế cỏ dại xâm lấn cho cây rừng như

mỡ, bạch đàn, cây đặc sản như trẩu, sở quế, cây công nghiệp như chè, cà phê, dứa, cây ăn quả như cam, chanh trong các năm đầu

1.4.5 Hạn chế:

Chưa được nghiên cứu đầy đủ, có hÖ thống nhất là về cải thiện cũng như năng suất, sinh khối và tác dụng cố định đạm sinh học Chưa có những nghiên cứu nào trên thế giới về khả năng hạ glucose và lipid máu của dịch chiết lá cây cốt khí

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Lá cây cốt khí được thu hái vào tháng 06 năm 2008 tại Vĩnh Phúc, do

TS Trần Văn Ơn, Trường Đại học Dược Hà Nội giám định

Lá cốt khí được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột mịn Tiến hành chiết ngâm lá với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng (quá trình chiết được lặp lại 3 lần) Hỗn hợp này được lọc qua giấy lọc Whatman Nol (Whatman International Ltd., England) Phần nước lọc được ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút để loại bỏ cặn Dịch chiết EtOH được cất loại dung môi dưới áp xuất giảm thu được cao ethanol, sau đó được sử lý tiếp tục với các dung môi hữu cơ khác nhau

2.1.2 Mẫu động vật

- Chuột nhắt trắng là chủng Swiss 3 tuần tuổi (12 – 14g), Do Viện vệ sinh Dịch Tễ Trung ương cung cấp

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

2.1.3.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế các hợp chất

+ Cột sắc ký pha thường các loại đường kính

+ Cột sắc ký pha đảo trung áp

+ Máy phun dung dịch thuốc thử

+ Bếp điện

2.1.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc

+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhận NMR AM500 Ft – NMR spectrometer

+ Máy sắc ký lỏng cao cấo ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC – MSD Trap spectrometer

+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro – hotstage

+ Thiết bị đo độ quay cực JASCO DIP – 1000 KUY polarieter

2.1.3.3 Hoá chất

+ STZ (streptozotocin) Sigma, ST Louse

+ Silica gel 60 (0,04 – 0,063mm) Merck

+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 – 50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.)

+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC – Alufplien 60 F254 (Merck 1.05715)

+ Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP 18 F254s (Merck)

+ Bản mỏng điều chế pha thường DC – Alufolien 60 F254 (Merck) + Các loại dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ethylacetat, chloroform, n – hexan, aceton, v.v là loại hoá chất tinh khiết của Merck 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của cây cốt khí [19, 31, 54]

Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam

+ Phản ứng diazo hoá

Dung dịch thử được pha như trên Chia dung dịch nhận được vào 2 ống ống 1: Dùng làm ống đối chứng

ống 2: Nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo

Phản ứng cho màu da cam là dương tính

+ Phản ứng với dung dịch kiềm

Dung dịch thử được pha như trên Chia dung dịch nhận được vào 2 ống ống 1: Dùng làm ống đối chứng

ống 2: Nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%

Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam + Phản ứng với acid sunfuric

Dung dịch thử được pha như trên Chia dung dịch nhận được vào 2 ống ống 1: Dùng làm ống đối chứng

ống 2: Nhỏ thêm vài giọt dung dịch acid sunfuric

Phản ứng có màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của các flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

b Thử định tính tannin

+ Phản ứng với vanillin

Dung dịch được pha như trên Chia dung dịch nhận được 2 ống

ống 1: Dùng làm ống đối chứng

ống 2: Nhỏ thêm vài giọt nước thử vanillin/H2SO4 Phản ứng dương tính

là dung dịch thu được có màu đỏ đậm

+ Phản ứng với FeCl3 n

Nhỏ dung dịch FeCl3 1% trộn nước vào ống nghiệm có đựng thuốc đã

được pha loãng bằng ethanol 96% Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen

c Thử định tính steroid

+ Phản ứng liebermann – Burchard

Lấy 1 ml dung dịch anhydrid acetic và 1ml dung dịch chloroform đã để lạnh 0oC, sau đó cho thêm 1 giọt acid sunfuric Chất thử được hoà tan trong chloroform và cho vào hỗn hợp trên Nếu xuất hiện các màu xanh, lục hồng, cam, đỏ và bền vững trong một thời gian thì phản ứng là dương tính

Đây là phản ứng đặc trưng cho nhân sterol Trong nhân srerol có nối kép trong vòng B hoặc nhóm metylen tự do ở C7 có thể chịu sự oxy hoá và sự khử nước – là nguyên nhân chính của sự hiện màu

d Thử định tính saponin

+ Phản ứng tạo bọt

Mẫu thử được pha như ở trên: ống 1 cho 5ml dd NaOH 0.5N (pH = 13), ống 2 cho 5ml dd HCl 0.1N (pH = 1) Sau đó cho vào mỗi ống 5ml dịch chiết mẫu thử Lắc mạnh hai ống, nếu thấy có nhiều bọt và bền vững ở môi trường kiềm (ống 1) thì cho thấy sự có mặt của saponin steroid, môi trường acid (ống 2) là saponin

f Thử định tính alkaloid

Hoà tan 0,01g cặn dịch chiết vào 1ml H2SO4 loãng, lọc qua giấy lọc thu

được dịch lọc Lấy 100l mẫu cho mỗi ống nghiệm để làm phản ứng với các

- Cân 10mg mỗi loại cao và hoà loãng trong 1ml ethanol 90%

- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dầm nước cất tới 1000ml

2.1:Bảng kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)

P seudomonas aeruginosa (ATCC 25923)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subyillis (ATCC 27212)

Staphylococcus aureus (ATCC 12222)

- Nấm sợi: Aspergillus niger (493), Fusarium oxysporum (M42)

- Nấm men: Candida albicans (ATCC7754), Saccharomyces cerevisiae (SH 20)

- Kháng sinh kiểm định:

+ Ampicilin đối với vi khuẩn Gr (+)

+ Tetracylin đối với ci khuẩn Gr (-)

+ Nystatin đối với nấm sợi và nấm men

- Cách pha kháng sinh: Kháng sinh được pha trong dung môi DMSO 100% với nồng độ: Ampixilin: 50nM; Tetracylin: 10mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0,04 mM

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

* Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrise Broth (SBD) cho nấm mem và nấm mốc Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)

* Môi trường thí nghiệm: Eugon broth cho vi khuẩn, Myco phil cho nấm

2.2.4 Phương pháp tiến hành

- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96 – well plates) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) [70] hiện đang được áp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Với các bước tiến hành như sau:

Bước 1: Chuẩn bị vi sinh vật

Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng đã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24h đối với vi khuẩn, 48h đối với nấm) Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm

- Từ dung dịch gốc nhỏ l mẫu vào mỗi giếng (96 giếng)

- Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn 190 l vi sinh vật đã hoạt hoá

- Đối chứng dương:

Dãy 2: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định

- Đối chứng âm: Chỉ có vi sinh vật kiểm định

- Để trong tủ ấm 370C/24h với vi khuẩn và 300C/48h với nấm

Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC (Minimmun Inhibitory Concentration)

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tổi thiểu (Minimmun Inhibitory Concentration) của mẫu có hoạt tính:

Các bước tiến hành như bước 1: Riêng các mẫu có biểu hiện dương tính

ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, (5 – 10) thang nồng độ để tính giá trị ức chế tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn

2.2.5 Đọc kết quả

Nồng độ dương tính là ở đó không có vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU (Colony Forming Unit) < 5

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimmun Inhibitory Concentration) của chất có hoạt tính:

Các mẫu đã có hoạt tính sàng lọc ban đầu pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà

ở đó có vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn

2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá cốt khí

2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD 50 [43]

Xác định LD50 của lá cốt khí trên chuột bằng đường uống và đường tiêm màng bụng theo phương pháp Lorke [43] Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối đa có thể cho phép) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết lá cốt khí

Tiêm màng bụng dịch chiết lá cốt khí lần lượt cho từng lô với liều tăng dần để xác định liều cao nhất không gây chết chuột nào đến liều thấp nhất gây chết toàn bộ chuột

2.3.2 Phương pháp định lượng glucose huyết [42,49]

Định lượng glucose huyết bằng kỹ thuật enzyme Glucoseoxidaxe bị oxy hoá nhờ sự xúc tác của các enzyme có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy One Touch Ultra do hãng Johnson & Jihnson sản xuất

Nguyên lý hoạt động

Khi tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng qua thẻ, glucose (trong máu) sẽ phản ứng với oxy (trong không khí) nhờ xác tác của enzyme glucooxydase (có ở trên bề mặt vùng phản ứng của giấy thử) tạo acid gluconic

và hydrogen peroxide [42] Hydrogen peroxide vừa tạo ra sẽ oxy hoá thuốc nhuộm trên bề mặt vùng phản ứng làm biến đổi màu của giấy thử vùng phản ứng (từ màu kem chuyển dần sang màu xanh) [42, 49] Độ đậm màu xanh tuỳ thuộc vào nồng độ glucose chứa trong máu

Mỗi 1cm2 của vùng phản ứng trên giấy thử gồm các chất sau: glucose oxidase (14IU), peroxidase (11IU), 3 – Methyl – 2 – benzothiazolinonehydrazone hydrochloride (0,06mg), và acid 3 – Dimethyllaminnobenzoic (0,12mg) [42] Các thành phần này đóng vai trò là các chất xúc tác phản ứng oxy hoá glucose và chất chỉ thị màu giúp nhận biết nồng độ glucose có trong mãu máu nhờ hệ thống quang học của máy One touch Uitra

Phương pháp tiến hành

Máy One Touch Uitra đo lường được glucose trong máu toàn phần Máu được thấm vào đầu trên của que thử One Touch Uitra và tự động được hút vào vùng đo nơi phản ứng xảy ra

- Gắn một que thử để bật máy Nhấn nút C để chọn mã spps chính xác với mã ghi trên lo que thử

- Cắt đuôi chuột bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2 Mẫu máu dùng cho vệt đo là 1 L, phải có máu tròn đẩy Thấm nhẹ giọt máu vào điểm nhận

máu trên que thử Sau 5 giây kết quả sẽ hiển thị trên màn hình

2.3.3 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo type 1 [16]

Chuột nhắt trắng là chủng Swiss (19 – 20g) Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h, tiêm màng bụng streptozotocin gây bệnh ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo type 1 Sau đó chúng được tiếp nhận nước và thức ăn bình thường Sau từ 3 – 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định  18mmol/l Tiến hành phần các lô chuột đã bị bệnh để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi sử lí với các phân đoạn dịch chiết lá cốt khí khác nhau [19, 34, 37, 40, 47, 51, 52, 55, 56]

1 Lô STZ nhóm chứng uống nước cất

2 Lô STZ điều trị bằng phân đoạn dịch chiết n – hexan

3 Lô STZ điều trị bằng phân đoạn dịch chiết chloroform

4 Lô STZ điều trị bằng phân đoạn dịch chiết ethylacetat

5 Lô STZ điều trị bằng phân đoạn nước

6 Lô STZ điều trị bằng insulin (liều 0.1 UI/kg)

Sau khi cho chuột bị bệnh uống điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform, ethylacetat, phân đoạn nước và insulin tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột tại các thời điểm 2h, 4h, 8h, 10h

2.4 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.4.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60 F254 (Merek 1,05715), RP18, F254s (Merek) Phát hiện chất bằng

đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254mm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H SO 10 % được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp