Nghiên cứu một số đặc tính của KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò.

Vì vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu, bò bằng nhiều phương pháp để chẩn đoán nhanh, chính xác thực trạng nhiễm bệnh và thử nghiệm các hóa dược đặc h

BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở TRÂU, BÒ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Thú y Khoa : Chăn nuôi - Thú y Khóa học : 2010 - 2014

Thái Nguyên – 2014

BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở TRÂU, BÒ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Thú y Khoa : Chăn nuôi - Thú y Khóa học : 2010 - 2014

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Quang

Thái Nguyên – 2014

Qua đây em xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y – trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Quang thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Em cũng xin gửi lời biết ơn tới cô giáo GS Nguyễn Thị Kim Lan, Ths Phạm Thị Trang, đã chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ cho em trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô giáo trong trường cũng như các thầy cô giáo trong khoa Chăn nuôi thú y luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày 05 tháng 12 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1: Kết quả xác định độ nhạy độ đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán

bệnh tiên mao trùng 39 Bảng 4.2: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT

CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 40 Bảng 4.3: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT khi bảo

quản ở 00C 42 Bảng 4.4: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT khi bảo

quản ở nhiệt độ phòng (28 – 340C) 42 Bảng 4.5: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT

CATT khi bảo quản ở 00C 43 Bảng 4.6: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT

CATT khi bảo quản ở nhiệt độ phòng (28 – 340C) 44 Bảng 4.7: Tổng hợp kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến

độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT 45 Bảng 4.8: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT sau 1 tháng

bảo quản (ở 00C) 46 Bảng 4.9: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT sau 3 tháng

bảo quản (ở 00C) 47 Bảng 4.10: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT sau 6 tháng

bảo quản (ở 00C) 48 Bảng 4.11: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT

CATT sau 1 tháng bảo quản 48 Bảng 4.12: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT

CATT sau 3 tháng bảo quản 49 Bảng 4.13: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT

CATT sau 6 tháng bảo quản 50 Bảng 4.14: Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy,

độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT 50

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1: Đánh giá kết quả sử dụng KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao

trùng 36

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

ADN : Acid deoxyribonucleic

CATT : Card Agglutination Test for Trypanosomiasis

cs : cộng sự

EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic

IFAT : Indirect Fluorescent Antibody Test

IPTG : Isopropyl β – D – thiogalactoside

KHKT : Khoa học kỹ thuật

MSC : Màng sinh chất

PBS : Phosphat Buffered Saline

RNA : Ribonucleic acid

SDS : Sodium Dodecyl Sulfat

VAT : Variant Antigen Tupe

VSG : Variant Surface Glucoprotein

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iv

MỤC LỤC v

Phần 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 2

Phần 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

2.1.1 Bệnh tiên mao trùng ở gia súc 3

2.1.2 Những hiểu biết về KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 26

2.2 Tình hình nghiên cứu về tiên mao trùng 30

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 30

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 31

Phần 3 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 34

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 34

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 34

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 34

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 34

3.3 Nội dung nghiên cứu 34

3.3.1 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 34

3.3.2 Xác định điều kiện bảo quản của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 34

3.4 Phương pháp nghiên cứu 35

3.4.1 Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 35

3.4.2 Phương pháp xác định điều kiện bảo quản KIT theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 37

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 37

Phần 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

4.1 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT trước khi bảo quản 39

4.1.1 Kết quả xác định độ nhạy độ đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 39

4.1.2 Kết quả xác định độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 40

4.2 Kết quả nghiên cứu điều kiện bảo quản KIT 41

4.2.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT (sau 1 tháng bảo quản) 41

4.2.2 Xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT khi bảo quản ở 00C 46

Phần 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

đây, trâu, bò ở nước ta thường mắc bệnh tiên mao trùng (Trypanosomosis),

đặc biệt ở các tỉnh miền núi có số lượng trâu bò lớn gây ảnh hưởng không nhỏ đến đàn vật nuôi

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomosis) là một bệnh ký sinh trùng truyền lây giữa người và gia súc do ký sinh trùng đơn bào (protozoa) lớp trùng roi (flagellata) gây ra Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma

brucei, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vavax, Trypanasoma siminae…

Bệnh tiên mao trùng hay còn gọi là bệnh ngã nước Trâu, bò mắc bệnh thể cấp tính thường: sốt cao 41- 41,7oC cùng với các triệu chứng thần kinh như: ngã quỵ, kêu rống, đi vòng tròn… trâu, bò bệnh sẽ chết sau 7 - 15 ngày Ở thể mãn tính triệu chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, da khô mốc, thiếu máu kéo dài, viêm phúc mạc, phù thũng 4 chân… Trường hợp bệnh nặng, con vật đột ngột sốt cao, bụng chướng to rồi lăn ra chết Vì vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu, bò bằng nhiều phương pháp để chẩn đoán nhanh, chính xác thực trạng nhiễm bệnh và thử nghiệm các hóa dược đặc hiệu nhằm xây dựng phác đồ điều trị thích hợp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học nước ta hiện nay dựa trên nền tảng của sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp có ý nghĩa lớn trong y học phòng ngừa chẩn đoán và điều trị Trong đó có phương pháp ứng dụng KIT được chế tạo theo nguyên lý CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu, bò.

Xuất phát từ thực tế trên, được sự hướng dẫn của TS Nguyễn Văn Quang, sự phân công của khoa chăn nuôi - thúy y, trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính

của KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò”.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò

- Xác định được điều kiện phù hợp nhất để bảo quản KIT CATT chế

từ kháng nguyên tái tổ hợp

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học

Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về các điều kiện thích hợp để chế tạo và bảo quản KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

(Trypanosomiasis) hiệu quả

Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán là hướng nghiên cứu công nghệ cao, khẳng định việc làm chủ công nghệ, đã và đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại Việt Nam

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình sản

xuất KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) từ kháng

nguyên tái tổ hợp

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học của đề tài

Bệnh tiên mao trùng do loài Trypanosoma evansi gây ra Được

Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam Sau đó, bệnh được xác định

là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước Bệnh do loài tiên mao

trùng Trypanosoma evansi gây ra Trâu, bò, ngựa… mắc bệnh gây nên tình

trạng thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản xuất, nếu không có biện pháp trị bệnh kịp thời dễ dẫn đến chết

2.1.1 Bệnh tiên mao trùng ở gia súc

2.1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng

Lương Văn Huấn và cs (1997) [7], vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống

phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:

Ngành Sarcomastigophora

Phân ngành Mastigophora

Lớp Zoomastigophorasida

Bộ Kinetoplastorida Phân bộ Trypanosomatorida

Họ Trypanosomatidae Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901 Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909 Loài Trypanosoma (S) cruzi

Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918 Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trypanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (N) congolense Loài Trypanosoma (N) siminae Loài Trypanosoma (N) vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906 Loài Trypanosoma (T) brucei Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843 Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)

Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế

(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T

brucei, T congolense, T cruzi, T evansi, T gambiense, T siminae, T vivax

* Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi)

Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (1999) [9] tiên mao trùng T evansi

được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm), chiều rộng 1,5 - 2 µm Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn, giữa có một nhân, có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành màng rung động, nhờ roi và màng rung động nên tiên mao trùng di chuyển đươc trong máu

Theo tài liệu của Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [13] tiên mao trùng do nguyên sinh động vật gây ra, là loài đơn bào hình lông mao hoặc mũi khoan,

di động trong máu nhờ roi tự do, có kích thước 18 – 34 × 2,5µm, sống ký sinh ở huyết tương trâu, bò, dê, ngựa…

Có thể nói, cấu trúc cơ bản của Trypanosoma evansi cũng giống như hầu hết các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae Cấu trúc gồm 3

phần chính theo thứ tự từ ngoài vào trong như sau:

- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa) Lớp

vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Variant Glycoprotein Surface - VGS) Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare C A., 1972 [34]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [12]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [5])

- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài, trong nguyên sinh chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi

- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng

2.1.1.2 Đặc điểm dịch tễ học tiên mao trùng

* Sự phân bố bệnh

Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi cho tới Philippine Bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ

Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [11], bệnh tiên mao trùng thường phân bố ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Các nước châu Á, châu Phi, châu Âu, châu Úc đều có bệnh TMT

Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạc Sahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa Trung Hải

Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả Rập Saudi,

Yêmen, Sultanate, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan, Pakistan

Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ, Malaysia, bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine

Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiện chỉ còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ)

Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ở Brazil, Mexico, Venezuela, Colombia

Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng (Reid S A.,

2002 [38]; Losos G T., 1972 [35]) cho rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi, từ Ấn Độ đến Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia, Iran, Philippine

Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển Theo Phạm Sỹ Lăng (1982) [12], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây) Trâu, bò nhiễm bệnh với tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng nhiễm tiên mao trùng cao hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò

có nguồn gốc từ miền núi chuyển xuống vùng đồng bằng)

Chi cục thú y Hà Nội (2006) [2] cho biết, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau

Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [21], đã sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng tự nhiên, đã kết luận trâu, bò ở Việt Nam vẫn nhiễm với tỷ lệ tương đối cao 21,27% Trong

đó, trâu ở các tỉnh miền núi phía Bắc và trung du nhiễm Trypanosoma evansi

nhiều hơn đồng bằng

Lê Văn Quyết và cs (1995) [25], điều tra ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên thấy trâu nhiễm với tỉ lệ 22,12% và bò nhiễm với tỷ lệ 6,6 – 10,3% Phan Lục và cs (1996) [19] cho biêt, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở một

số địa phương miền Bắc là 5,9%

Hà Viết Lượng (1998) [20], tỷ lệ bò nhiễm tiên mao trùng ở các tỉnh miền Trung là 8,99%

Theo Trần Văn Bình (2008) [1], cho thấy ở miền Bắc bệnh tiên mao trùng xảy ra nhiều hơn ở khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, bò sữa và

bò Lai Sind nhiễm bệnh cao hơn bò nội

Có thể nói bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi xuất hiện ở

hầu hết các khu vực trên thế giới, tăng dần về số lượng và mức độ nghiêm trọng trong những năm gần đây tác động đáng kể tới tỷ lệ tử vong của vật nuôi trên thế giới

* Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh TMT

Trong tự nhiên TMT ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, hổ, nai, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống…, nhưng không ký sinh ở người Trong phòng thí nghiệm: thỏ, chuột bạch, chuột lang, mèo đều mẫn cảm với TMT (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2009) [16]

Sự lây truyền tiên mao trùng rộng rãi là nhờ các vật chủ môi giới truyền

bệnh như ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae)… chúng hút máu con bệnh và truyền sang cho con

khỏe nhờ vòi hút Sự lây truyền này mang tính chất cơ học

Theo Phan Sỹ Lăng (1982) [12] Ở Nam Mỹ Ligniere, Elmasson, đã

truyền bệnh tiên mao trùng thành công cho trâu, bò bằng ruồi Stomoxys

calcitrans

Phan Địch Lân (2004) [17] cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm thấy hai

loài mòng T rubidus và T striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và 14,0%; ruồi hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ lệ 12,5%

Ở những vùng đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mòng hút máu dễ dàng tìm thấy tiên mao trùng Sau khi theo máu vào vòi hút ruồi và mòng, tiên mao trùng vẫn sống đến giờ thứ 53, thời gian hoạt động mạnh nhất là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34 trung bình là 24 giờ Sự hoạt động của tiên mao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42 Từ 46 - 53 giờ thì tiên mao trùng ngừng hoạt động Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [11] căn bệnh có thể duy trì sức sống

ở vật môi giới trong vòng 24 – 44 giờ Nếu trong thời gian này ruồi trâu và mòng chưa kịp truyền căn bệnh cho con vật khác thì căn bệnh sẽ chết ở vòi hút của mòng và ruồi trâu

Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian: từ 1 - 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ tiên mao trùng có hình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ tiên mao trùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động

Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao

trùng sau khi xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian

từ giờ thứ 1 đến thứ 5, tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự như khi truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7 chỉ còn 30% số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và thời gian chết của chuột cũng dài Điều này có thể giải thích là do độc lực của tiên mao trùng giảm dần và

số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh cũng giảm dần sau khi

chúng xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus

* Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh

Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao trùng và đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu, giảm sức đề kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất

Phan Địch Lân (2004) [17] đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172 trâu ở các tỉnh đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,l %), trâu 3

- 5 tuổi nhiễm cao hơn (6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9 - 14,8%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi Theo Phan Văn Chinh (2006) [3], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở

4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm tuổi (6,92% và 2,31%) Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng

ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9) Thời gian này điều kiện sinh thái thuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển, hoạt động mạnh Hút máu súc vật

và truyền tiên mao trùng

Trung tâm UNESCO (2005) [31] cho biết, mùa lây lan thường xảy ra trong các tháng nóng ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9), thời gian này

có điều kiện sinh thái thuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển, hoạt động mạnh chúng hút máu súc vật và truyền TMT

* Cơ chế sinh bệnh T evansi

Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) [10], khi vào máu của vật chủ thì TMT sẽ sinh sản bằng cách phân đôi theo chiều dọc nhiều lần, số lượng tăng lớn, gây tắc mạch máu Độc tố của TMT vào làm cho con vật trúng độc (độc tố gồm chất độc tiết ra của TMT, xác của chúng bị tan ra, những sản phẩm của quá trình trao đổi chất) Độc tố làm rối loạn điều hòa nhiệt gấy sốt TMT còn ngăn chức năng tạo hồng huyết cầu của lách tủy xương, làm hồng cầu giảm sút nhiều, máu nhạt, loãng chất đỏ trong máu (huyết sắc tố) biến thành chất

vàng của mật (đảm sắc tố) ngấm vào cơ thể làm niêm mạc vàng

Tiên mao trùng sinh sản nhiều còn làm tắc các mạch máu nhỏ, do các niêm mạc bị tụ máu, sinh chất màu dưới niêm mạc Do tiên mao trùng làm tổn thương vách mạch huyết, huyết dịch xuất ra ngoài nhiều sinh thủy thũng, dần dần máu chảy xuống vùng thấp Huyết dịch đông lại, một phần tổ chức biến thành mỡ nên thủy thũng chứa chất đặc như keo Do hệ thần kinh bị trúng độc, con vật bị ốm, phát ra những triệu chứng thần kinh: run rẩy, bại liệt, cứng chân, làm trâu bò điên cuồng trước khi chết Chất độc của tiên mao trùng còn ảnh hưởng đến gan của con vật, làm chức năng dự trữ đường của gan giảm trong khi cơ thể vẫn sử dụng đường, ký sinh trùng cũng tiêu hao đường nên lượng đường trong máu giảm sút Hồng cầu giảm sút, máu thiếu huyết sắc tố

vì vậy axit tích lại trong máu gây nhiễm độc

2.1.1.3 Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng

* Đặc điểm bệnh lý

Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò, ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da Ta có thể quan sát được phản ứng viêm ở da của thỏ, cừu, dê và bò gây nhiễm thực nghiệm tiên mao trùng, kích thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền (ước chừng khoảng 108 tiên mao trùng có thể gây viêm da - ở vị trí tiêm truyền), một số lượng lớn tiên mao trùng phát triển ở tại chỗ viêm này

Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia theo chiều dọc Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng như nhau Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗi

đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tục sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng thể đặc hiệu với chúng

Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ glucose và các chất đạm, chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩm thấu qua bề mặt cơ thể để duy trì hoạt động và sinh sản

Theo Nguyễn Đức Thạc (2006) [26], T evansi gây tác hại hút các chất dinh dưỡng của ký chủ và sản sinh độc tố Trypanotoxin phá hủy hồng cầu và ức

chế tạo máu gây thiếu máu Ở súc vật bị bệnh, trong 1 ml máu có thể có 10.000 - 30.000 tiên mao trùng Với số lượng nhiều như vậy, tiên mao trùng chiếm đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh gây còm, thiếu máu và mất dần khả năng sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng sinh sản và giảm sức

đề kháng với các bệnh khác

Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin,

độc tố này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá trình sống và độc tố do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau

15 - 30 ngày Độc tố của tiên mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ương làm rối loạn trung khu điều hoà thân nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt, lúc hết sốt xen kẽ nhau) Khi sốt thường có rối loạn về thần kinh (kêu rống, run rẩy, ngã vật xuống) Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức chế cơ quan tạo máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần Độc tố còn tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh

Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da

* Triệu chứng lâm sàng của bệnh TMT ở trâu, bò

Thời gian ủ bệnh từ 10 – 15 ngày

Trâu, bò mắc bệnh TMT có biểu hiện triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:

- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 – 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền TMT, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (400C – 41,70C) kéo dài 2 – 4 ngày rồi giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên Thời gian gián đoạn giữa hai cơn sốt dài hay ngắn tùy theo thể trọng con vật Khi sốt, kiểm tra máu thường thấy TMT Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [11] cho rằng, trâu, bò mắc bệnh TMT có biểu hiện sốt lên xuống, sốt 1 – 2 ngày, nhiệt độ 40 – 410C, nghỉ sốt 2 – 6 ngày

Có một số trường hợp ngoại lệ có thể sốt liên miên, kéo dài 16 – 18 ngày, nghỉ sốt ngày 19 – 20 ngày

- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện hội chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạy vòng quang kêu rống lên Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn ngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như trâu cảm nắng Sau 20 –

30 phút con vật đứng dậy đi lại được Những trâu mắc bệnh có triệu chứng lâm sàng như trên thường là mắc bệnh ở thể cấp tính

Trâu, bò bị bệnh mãn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết

- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như ở 4 chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục

- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh Mắt có dử vàng hay trắng, chảy liên tục, nếu bị nặng thì mắt sưng đỏ ngầu Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng (cùi nhãn) kéo che kín giác mạc

Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [11] trâu, bò mắc bệnh TMT có biểu hiện: niêm mạc mắt nhợt nhạt, mí mắt sưng, có hiện tượng hoàng đản

Có trường hợp con vật mắc bệnh có biểu hiện mắt đỏ, niêm mạc mắt sưng đỏ và chảy dử liên tục (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2009) [16]

- Hội chứng tiêu hóa: một số trâu, bò mắc bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và nhầy Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cắt quãng Ỉa chảy trong bệnh TMT thường dai dẳng và con vật vẫn ăn được

Khoảng 30% trâu, bò thể hiện viêm ruột ỉa chảy kéo dài sau cơn sốt (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2009) [16]

Tô Du (2005) [3] cho biết, trâu, bò mắc bệnh TMT có khi ỉa ra màng ruột, nát từng đoạn, từng miếng Thân nhiệt xuống thấp

- Gầy yếu, suy nhược: ở thể cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ sau 7 –

14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu Nếu bệnh kéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc màu nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng kéo và sinh sản Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu, bò dễ chết Trong thực tế, có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khỏe, làm việc bình thường khi được chăm sóc nuôi dưỡng tốt

Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T evansi gây ra Số

lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch cầu thay đổi (bạch cầu lympho, bạch cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính giảm), protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2009) [16], hồng cầu của con vật mắc bệnh giảm thấp, chỉ còn 3 triệu/1mm3 (trâu, bò khỏe: 5 – 6 triệu/1mm3)

- Một số trâu, bò có chửa bị sảy thai (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [11]) Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2009) [16] trâu, bò mất dần khả năng sinh sản và giảm lượng sữa 30 - 50% Trâu cái sảy thai vào tháng thứ 7 – 8 khi bị bệnh TMT

* Bệnh tích của bệnh Tiên mao trùng

Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có nhưng biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi xung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan sưng to, nhạt mầu; hạch lâm ba sưng và có tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang bụng và xoang ngực tích dịch màu vàng nhạt; có những đám keo nhày màu vàng dưới vùng da bị thủy thũng

2.1.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh

* Căn cứ vào triệu chứng lâm sàng

Các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa không phải lúc nào cũng phát hiện được Rất nhiều gia súc mang bệnh nhưng khó phát hiện các triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc mắc bệnh tiên mao trùng mãn tính Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính, các biểu hiện bệnh đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên loạn) và chết nhanh Trâu bị bệnh mãn tính có thể thấy triệu chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân

sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng, 1982 [12])

* Chẩn đoán thí nghiệm

Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm, mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc Tùy từng trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao

Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp

Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương pháp sau:

- Phương phám soi tươi tiên mao trùng (Direct smear)

Khi bệnh súc sốt, Trypanosoma evansi thường xuất hiện trong mao quản

ngoại vi; vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để soi tươi Cho một giọt máu nhỏ lên phiến kính sau đó đậy tấm lamen lên để cho máu dàn đều ra tấm lamen thành

một lớp mỏng (có thể thêm một giọt nhỏ chất chống đông máu EDTA 1% hòa chung vào giọt máu cần soi tươi) Soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 × 10, 10× 20 hoặc 10× 40) để phát hiện tiên mao trùng sống

- Nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)

+ Phương pháp giọt dầy: Đặt một giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng

một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính khoảng 1 – 1,25 cm Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn methanol, nhuộm giemsa (pha 1 ml giemsa mẹ với 9 ml nước cất tạo thành một dung dịch nhuộm giemsa), cho phiến kính trên đã cố định bằng cồn vào trong dung dịch giemsa đã được pha ngâm trong khoảng 25 – 30 phút sau đó đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 × 40, 10 × 90 hoặc 10 × 100 )

Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng, khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều loài tiên mao trùng cùng một lúc

+ Phương pháp giọt mỏng: đặt một giọt máu cách đầu phiến kính 2

cm, dùng một cạnh của lamen đặt chếch 45o và di la men đều tay cho đến khi giọt máu đó trải đều ra toàn bộ bề mặt của phiến kính Sau đó để khoảng 30 phút đến 1 giờ cho máu khô tự nhiên, rồi cố định bằng cồn methanol, nhuộm giemsa (pha 1 ml giemsa mẹ với 9 ml nước cất tạo thành một dung dịch nhuộm giemsa), cho phiến kính trên đã cố định bằng cồn vào trong dung dịch giemsa đã được pha ngâm trong khoảng 25 – 30 phút sau

đó đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 × 40, 10 × 90 hoặc 10 × 100 )

Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái các loài tiên mao trùng khác nhau và dễ dàng nhìn thấy tiên mao trùng hơn phương pháp giọt dầy

+ Phương pháp làm tan hồng cầu: Dung dịch SDS (Sodium dodecyl

Sulfat) là chất làm tan hồng cầu Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng được phát hiện trong máu Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da

và tránh hút bằng pipet Dung dịch SDS bảo quản ở nhiệt độ thường trong

nhiều tháng

* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:

Lấy máu con vật, cho vào ống ly tâm, thêm 2 – 3 giọt natri citrat 3,8%, lắc khẽ cho máu và chất chống đông máu hòa lẫn vào nhau, để yên 15 phút Dùng ống hút, hút 1 giọt huyết thanh ở ranh giới giữa hồng bạch huyết và huyết thanh cho lên phiến kính, soi kính hiển vi tìm căn bệnh

* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:

- Động vật thí nghiêm: chuột nhắt trắng, chuột lang, thỏ, mèo

- Lấy 0,2 ml máu gia súc nghi ngờ tiêm vào xoang phúc mạc chuột nhắt trắng Theo dõi sau 24 – 48 giờ, lấy máu đuôi chuột để kiểm tra, kiểm tra từ 1 – 2 tuần để phát hiện TMT

- Có thể lấy 0,5 ml máu tiêm xoang phúc mạc chuột lang, thỏ, mèo đều cho kết quả chẩn đoán chính xác

- Lấy máu đuôi chuột kiểm tra: cho một giọt máu đuôi chuột và một giọt citrat natri 3,8% lên phiến kính, đậy lamen, kiểm tra dưới kính hiển vi có

độ phóng đại 100 lần, 200 lần

Tiêm truyền động vật thí nghiệm mất nhiều thời gian theo dõi nhưng có

độ chính xác đạt 100% (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2009) [16]

- Phản ứng dương tính: khi thấy TMT di động, bơi trong huyết tương

Lê Ngọc Mỹ (1994) [21] và Đoàn Văn Phúc (1994) [25] đều cho rằng đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh TMT ở Việt Nam Phương pháp này có ưu điểm là chính xác do trực tiếp phát hiện thấy TMT sau khi nhân chúng lên trong động

vật thí nghiệm mẫn cảm Tuy nhiên phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm có nhược điểm là: khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được

* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:

Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu

- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng

Khi TMT ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:

+ Phản ứng ngưng kết trên phiến kính (CATT/T evansi: card Agglutination Test for Trypanosomiasis): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc

nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao trùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20 hoặc 10 x 40) Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-) Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng

+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)

LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt

T.evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao

trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường,

và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng TMT lại có

nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên Do đó, khi kháng nguyên TMT gặp kháng thể đặc hiệu kháng TMT, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại Kết quả là các hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể quan sát bằng mắt thường Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng nguyên bề mặt được tinh

chế từ chủng T evansi không nhuộm màu

Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng dụng ở cơ sở Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phương pháp này cho kết quả dương tính cả khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồn tại trong huyết thanh, mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMT trong huyết thanh chưa có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phương pháp LATEX sẽ cho kết quả âm tính

+ Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)

Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh

Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh

Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều Cho vào lọ kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml dung dịch buffer, lắc đều Dùng micropipet pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8) Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45µl) Sau đó cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn Dùng que nhựa trộn đều Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và đánh giá kết quả

+ Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test): Phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc

hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thực địa Ngoài việc được dùng làm phản ứng chuẩn để so sánh với các phương pháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT còn được dùng trong nghiên cứu các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins A G., 1988 [36]; Davison, 1999 [33])

Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu,

bò mắc bệnh TMT, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu, bò khoẻ mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh

Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu và cs (1994) [28] đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho phản ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng ớ 1/40 Theo Lương Tố Thu

và Lê Ngọc Mỹ (1996) [29], độ nhạy của phương pháp IFAT là 71,25%

Để tinh chế kháng nguyên T evansi dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh

quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh TMT ở trâu, bò, Vương Thị Lan Phương

(2004) [18] đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T evansi phân lập từ trâu, bò ở 6

tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6 mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT (Variable Antigenic Type) và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định được sự thay đổi kháng nguyên

bề mặt của T evansi: đa số các VAT của các kho kháng nguyên khác nhau là khác

nhau, chỉ có 8 VAT/26 VAT có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho kháng nguyên khác Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương pháp tách TMT để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán bệnh TMT cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao

+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng globulin (kháng kháng thể) có mang một enzym (phosphatase hoặc peroxydase) được gắn trên mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên Sau đó, cho cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạo nên màu So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng

Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế giới Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [21] đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta

- Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng

+ Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)

Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh Phản ứng dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với TMT Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [21] đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam Tuy nhiên, theo cơ quan năng lượng nguyên tử thế giới (IAEA) (1997), phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhậy kém hơn so với các phương pháp phát hiện tiên mao trùng cổ điển Vì vậy, phương pháp này đã không được phổ biến trong thời gian hiện tại và tương lai (IAEA đã không sản xuất đĩa Ag - ELISA cho nhiều nước trên thế giới)

+ Phản ứng Suratex:

Phản ứng Suratex là phản ứng ngưng kết giữa các hạt latex được gắn kháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm tiên mao trùng (Tamarit 2010 [42]) Phản ứng này hiện đang được thử nghiệm và đánh giá ở thực địa

+ Phương pháp phát hiện ADN của TMT bằng phản ứng PCR (polymerase Chain Reaction):

PRC là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để chẩn đoán bệnh TMT trong những năm gần đây

Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặt của gen ADN của TMT trong máu động vật nhiễm bệnh

Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi có trình độ kỹ thuật cao, trang thiết bị hiện đại nên hiện nay mới được tiến hành tại một số phòng thí nghiệm hiện đại

2.1.1.5 Phương pháp phòng - trị bệnh tiên mao trùng trên gia súc

* Phòng bệnh

Để phòng ngừa bệnh tiên mao trùng có hiệu quả cao, các nhà khoa học

đã đề nghị áp dụng 3 biện pháp sau:

- Diệt tiên mao trùng trên cơ thể ký chủ:

Diệt TMT ký sinh ở vật chủ không những ngăn chặn được tác hại gây bệnh của chúng mà còn làm cho bệnh mất khả năng lây lan Các biện pháp cụ thể là:

+ Phát hiện gia súc nhiễm TMT ở vùng có bệnh và những vùng lân cận, nhốt riêng trong chuồng có lưới để ngăn côn trùng và điều trị triệt để cho gia súc bệnh

+ Ở những vùng không có bệnh thì không nhập gia súc từ vùng có bệnh

về Nếu thật cần thiết thì chỉ nhập những gia súc khoẻ (có kết quả kiểm tra âm tính với tiên mao trùng), song vẫn cần nhốt riêng để theo dõi Nếu không bị + Ở những vùng không có bệnh thì không nhập gia súc từ vùng có bệnh

về Nếu thật cần thiết thì chỉ nhập những gia súc khỏe (có kết quả kiểm tra âm tính với tiên mao trùng), song vẫn cần nhốt riêng theo dõi Nêu không bị bệnh

mới cho nhập đàn Phát hiện và diệt những loài thú hoang nghi là nguồn tàng trữ mầm bệnh, hoặc không chăn thả gia súc trong những khu vực có những loài đó sinh sống

- Diệt côn trùng và môi giới truyền bệnh

Hội nghị lần thứ VI của Ủy ban khoa học Quốc tế nghiên cứu về tiên mao trùng đã đề ra những biện pháp tiêu diệt côn trùng như sau:

+ Diệt côn trùng bằng thay đổi sinh thái:

Thay đổi sinh thái là thay đổi điều kiện sống, làm cho côn trùng khồn sinh sản, không thực hiện được chu kỳ phát triển

Phát quang cây cối ở tưng khu vực, không để nước tù đọng, ủ phân để diệt trứng và ấu trùng ruồi, mồng, làm chuồng gia súc có lưới ngăn côn trùng… là các biện pháp hữu hiệu, tạo ra những điều kiện bất lợi cho đời sống của côn trùng

Tuy nhiên, do côn trùng có khả năng di chuyển khá mạnh nên các biện pháp trên phải thực hiện đồng thời trên phạm vi rộng mới có hiệu quả

+ Tiêm phòng cho vật chủ:

Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [11] khuyến cáo nên sử dụng thuốc trypamidium tiêm phòng cho trâu, bò với liều 0,5mg/kg TT, pha thành dung dịch

1 – 2% để tiêm phòng TMT vì trypamidium thải trừ chậm, có thể tồn tại trong

máu tới 4 tháng nên dùng phòng bệnh tốt hơn thuốc khác

Theo nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh TMT cho ngựa Kết quả

tiêm thử nghiệm vắc xin liều 3 x 105 T evasi ngựa, sau 30 - 60 - 90 ngày

dùng vắc xin, tỷ lệ bảo hộ đạt 100%; trong khi lô đối chứng chết trong thời gian 3 tháng

+ Diệt côn trùng bằng phương pháp sinh học:

Các nhà khoa học đã phát hiện được 25 loài ong và côn trùng ký sinh gây hại cho các loài ruồi, mòng môi giới truyền bệnh TMT

Một số loài vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể ruồi hút máu làm chúng mắc bệnh và chết

Nhìn chung, các biện pháp tiêu diệt côn trùng môi giới có hiệu quả nhất định nhưng cũng còn nhiều hạn chế

- Phòng bệnh bằng hóa dược

Có thể dùng các hoá dược tiêu diệt côn trùng môi giới của tiên mao trùng Các hoá dược đã được dùng là: endosulfan, brophos, dieldrine, tetracloreinphos… Phạm Sỹ Lăng và cs (2009) [16] cũng đưa ra phương pháp tiêu diệt côn trùng đó là: phun thuốc diệt côn trùng xung quanh chuồng trại theo định kỳ (1 tháng/lần) bằng hectomin 0,3% hoặc hantox spray

Theo Phan Lục (2006) [18] để tiêu diệt ruồi trâu (vật môi giới truyền bệnh TMT) mỗi ngày thực hiện vẩy 2 lần cho gia súc thả chăn hay làm việc ngoài trời một trong các dung dịch sau: crêin 5%, acid boric 10%, acid picric 1%, saporin 10% Nên bôi nhiều vào chỗ lông có máu, giữ chuồng sạch, rửa nền chuồng bằng crêin Ngoài ra, có thể phun tắm, bôi dung dịch permetin 0,1% cho gia súc

* Điều trị bệnh

Một số loại hoá dược đã được dùng để điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa ở nước ta gồm:

- Naganin, liều 10 mg/kgTT Pha thuốc với dung dịch nước muối sinh

lý hoặc nước cất thành dung dịch 10%, tiêm tĩnh mạch

Phạm Sỹ Lăng (1982) [12] đã thử nghiệm naganin và cho biết, thuốc có tác

dụng tốt trong điều trị bệnh do Trypanosoma evansi trên trâu, bò ở nước ta

Phùng Quốc Quảng và cs (2006) [24] đã đưa ra phương pháp sử dụng thuốc naganin như sau:

Nơi nhiễm TMT nhưng chưa có biểu hiện lâm sàng thì 1 năm chỉ nên phòng trị 1 đợt bằng naganin với liều 0,01g/kg TT vào dịp tháng 9 – 10 dương lịch (trước vụ đông giá rét)

Nơi có bệnh sảy ra, có bò ốm chết: năm đầu tiên phòng trị bằng naganin 2 đợt (tháng 3 – 4 và tháng 9 – 10 dương lịch) Từ năm thứ 2 trở đi mỗi năm chỉ cần phòng trị 1 đợt vào tháng 9 – 10 dương lịch Nếu dùng liên tục trong nhiều năm như vậy có thể thanh toán được TMT trong từng khu vực nhất định

- Novarsenobenzol, liều 10 mg/kgTT

Phạm Sỹ Lăng (1982) [12] đã sử dụng novarsenobenzol 2 lần cách nhau 2 ngày, thấy hiệu lực thuốc đạt 80%, tỷ lệ an toàn 80 - 82%

- Trybabe: là thuốc đặc trị ký sinh trùng đường máu cho gia súc Thuốc Trường hợp không xác định rõ trâu, bò nhiễm loại ký sinh trùng đường máu nào, dùng liều 1ml/ 7kg TT để đảm bảo hiệu quả trên tất cả các loại ký sinh trùng đường máu (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012) [11]

- Berenil, liều 5 mg/kgTT Pha thuốc với nước cất theo tỷ lệ cứ 0,8 gam thuốc trong 5 ml nước cất Tiêm sâu bắp thịt (không dùng quá 9 gam cho một gia súc)

Phạm Văn Chinh (2006) [3] dùng berenil điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò ở các tỉnh miền Trung và cho biết, thuốc đạt hiệu lực 100% với những trâu, bò bị bệnh

- Ngoài việc dùng thuốc điều trị cũng cần phải chăm sóc, nuôi dưỡng tốt như: + Cho gia súc nghỉ ngơi trong thời gian điều trị

+ Cung cấp thức ăn giàu dinh dưỡng như cháo cám, cỏ tươi, hỗn hợp tinh + Bổ sung khoáng, vitamin

+ Bổ sung nước sinh lý ngọt 5%: 200 – 300ml, tiêm tĩnh mạch hoặc nước sinh lý mặn 10%: 150 – 250ml

+ Tiêm tĩnh mạch tai thuốc trợ sức như: cafein 20% (10 – 20ml), long não nước 10% (40 – 50ml) trước khi tiêm thuốc điều trị

Phạm Sỹ Lăng và cs (2009) [12] đã đưa ra 3 phác đồ có hiệu lực cao trong điều trị bệnh TMT cho trâu, bò, bò sữa:

+ Pha thuốc: pha với nước cất theo tỷ lệ: 10% thuốc + 90% nước cất

+ Vị trí tiêm: tĩnh mạch tai hoặc tĩnh mạch cổ

+ Thuốc trợ sức: khi tiêm naganin cần tiêm thuốc trợ sức (cafein, long não nước)

+ Hộ lý: thời gian điều trị cho trâu, bò nghỉ làm việc 3 – 4 ngày, cho ăn

và chăm sóc nuôi dưỡng tốt

Phác đồ II: Dùng điều trị nhiễm TMT

+ Thuốc dùng: benrenyl (azidin, trypazen)

+ Liều thuốc: 3,5mg/kg TT

+ Liệu trình: tiêm 1 liều

Sau 15 ngày nếu súc vật chưa khỏi, chưa hết triệu chứng lâm sàng sẽ tiêm liều 2 với liều lượng như trên

Phác đồ III: Dùng để phòng và điều trị nhiễm TMT

+ Thuốc dùng: trypamidium (samorin)

+ Liệu trình: chỉ tiêm 1 liều/ngày

+ Liều dùng: 1mg/ ngày

+ Pha thuốc với nước cất theo tỷ lệ: 300mg + 20ml nước cất

+ Vị trí tiêm: tĩnh mạch hoặc bắp thịt

+ Hộ lý: thời gian điều trị cho trâu, bò nghỉ làm việc 3 – 4 ngày, cho ăn

và chăm sóc nuôi dưỡng tốt

2.1.2 Những hiểu biết về KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

2.1.2.1 Kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi

Kháng nguyên RoTAT 1.2 có bản chất là glycoprotein bề mặt của tiên mao trùng Theo Bajyana Songa và Hamers (1988) [32], kháng nguyên

RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt chính của T.evansi, nó xuất hiện sớm

ngay sau khi ký sinh trùng xuất hiện đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc hiệu của các loài ký sinh trùng khác, kháng nguyên này có

mặt ở hầu hết các VAT (variable antigen type) của Trypanosoma evansi

Hơn nữa, các tác giả này cũng chứng minh rằng RoTAT 1.2 là kháng

nguyên đại diện của T.evansi dựa trên cơ sở chỉ có các mẫu huyết thanh của gia súc gây nhiễm với T.evansi mới nhận biết được kháng nguyên RoTAT

1.2, trong khi đó tất cả các mẫu huyết thanh của gia súc được gây nhiễm bởi

T.brucei đều không nhận biết được kháng nguyên này Vì vậy, công tác

nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng cách khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2

2.1.2.2 Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi

Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR đã được xử lý cắt đầu bằng vector tách dòng pJET1.2/blunt của hãng Fermentas Phản ứng dựa vào đặc tính xúc tác hình thành

liên kết nối hai đoạn ADN của enzym T4 ADN - ligase Enzym này có nguồn gốc

từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự ADN cả đầu so le và

đầu bằng Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 22ºC trong thời gian 10 phút Đây

là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzym ADN T4 ligase hoạt động

Vector tách dòng pJET1.2/blunt được tách chiết từ dòng tế bào E.coli

DH5α/pJET1.2/blunt và được cắt mở vòng bằng enzym Klenow Đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermentas có kích thước gần 3kb (2974bp) Trên vector có gắn gen kháng sinh (bla) nên chỉ có những tế bào có mang vector này mới có thể sống được trên môi trường có ampicilin Đồng

thời trên vector này có chứa gen gây chết eco47IR mã hóa cho nuclease phân

hủy ADN nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ Vì vậy, vector khi được gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm mất đi hoại tính của enzym này dẫn đến sự không

phân hủy ADN của tế bào chủ Nhờ có eco471IR mà quá trình chọn lọc

plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn

Gen RoTAT 1.2 được thu nhận sản phẩm PCR có kích thước khoảng 205bp Việc sử dụng enzym Taq polymerase để xúc tác cho phản ứng PCR sẽ tạo ra các sản phẩm có gắn thêm một adenin ở đầu 3'.Gen RoTAT 1.2 được nối vào plasmid pJET1.2/blunt đã được mở vòng rồi được biến nạp vào tế bào

E.coli chủng DH10b Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, ADN plasmid tái tổ

hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao Quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt Vector pJET1.2/blunt có chứa gen mã hóa kháng kháng sinh ampicilin cho phép dễ dàng phát hiện vector tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 100µ/ml Trong môi trường chọn lọc, nếu có gen ngoại lai được gắn vào vector thì thấy xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa thạch Trên đĩa thạch nuôi cấy vi