Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN các PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ để sản XUẤT CHẤT tạo NGỌT THƯƠNG mại mới

Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN các PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ để sản XUẤT CHẤT tạo NGỌT THƯƠNG mại mới

[Type text] Page 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC THỰC PHẨM MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

Tác giả: Barry J Lamphear và các cộng sự, Plant Biotechnology Journal (2005)

GVHD: ThS Nguyễn Minh Hải SVTH:

Nguyễn Ngọc Phương Anh 11116003

BIỂU HIỆN CÁC PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ

ĐỂ SẢN XUẤT CHẤT TẠO NGỌT THƯƠNG MẠI MỚI

Barry J Lamphear*, Donna K Barker, Christopher A Brooks, Donna E Delaney, Jeffrey R Lane, Katherine Beifuss, Robert Love, Kevin Thompson, Jocelyne Mayor, Rich Clough, Robin Harkey, Miranda Poage, Carol Drees, Michael E Horn, Stephen

J Streatfield, Zivko Nikolov†, Susan L Woodard‡, Elizabeth E Hood§, Joseph M Jilka¶ and John A Howard**

ProdiGene, Inc , 101 Cổng Boulevard, Suite 100 , College Station , TX 77.845 , Hoa Kỳ

Nhận được ngày 22 tháng 4 năm 2004, sửa đổi ngày 06 tháng 8 năm 2004, chấp nhận ngày 09 tháng 8 năm 2004

*Thư từ (fax 979 690 9527, e -mail blamphear@prodigene.com)

†Địa chỉ hiện tại: 303F Scoates Hall, Sinh học và kỹ thuật nông nghiệp, Đại học Texas

A & M, 2117 TAMU, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ

§Đại chỉ hiện tại: Đại học Tiểu bang Arkansas, Jonesboro, AR, Hoa Kỳ

¶Địa chỉ hiện tịa: 2308 Ferguson St, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ

**Địa chỉ hiện tại: Stallion Ridge, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ

Từ khóa: brazzein, natural sweetener (chất ngọt tự nhiên), sweet protein (protein

ngọt), Zea mays

MỤC LỤC

TÓM TẮT 1

GIỚI THIỆU 1

KẾT QUẢ 3

Biểu hiện của brazzein trong ngô 3

Đặc tính của protein brazzein biểu hiện trong ngô 7

Phân tích cảm quan brazzein ngô 9

Kiểm tra ứng dụng của sản phẩm bột phôi bắp 11

THẢO LUẬN 12

PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 16

Cấu trúc của plasmid 16

Chuẩn bị dịch chiết protein hòa tan từ hạt ngô 17

Sự chuyển đổi ngô gián tiếp thông qua Agrobacterium 18

Định lượng brazzein tái tổ hợp trong ngô biến đổi gen 18

Phân tích trình tự đầu N của amino của đồng phân brazzien 19

Tinh chế brazzen tái tổ hợp loại 3 từ ngô biến đổi gen để phân tích cảm quan 19

Kiểm tra cường độ ngọt 20

Tách chiết hạt 21

Hiện tượng điện chuyển 21

LỜI CẢM ƠN 22

TÀI LIỆU BỔ SUNG 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

TÓM TẮT

Sự sẵn có của thực phẩm hàm lượng đường thấp nhưng hương vị cao là rất quan trọng cho hàng triệu cá nhân có ý thức về lượng tiêu thụ carbohydrate với mục đích phòng hoặc trị bệnh tiểu đường hoặc ăn kiêng Brazzein là một protein ngọt tự nhiên

có trong thực vật nhiệt đới Về mặt kinh tế, việc sản xuất kinh tế brazzein trên quy mô lớn không thực tế, do đó hạn chế tính sẵn có của brazzein cho sản phẩm thực phẩm Chúng tôi trình bày ở đây lợi ích của một hệ thống biểu hiện ngô để sản xuất protein ngọt tự nhiên này Người ta thu được biểu hiện cao của brazzein với độ tích lũy lên đến 4% tổng lượng protein hòa tan trong hạt ngô Brazzein ngô tinh khiết sở hữu mức

độ ngọt lên đến 1200 lần so với đường mía trên mỗi trọng lượng cơ sở Ngoài ra, kiểm tra ứng dụng đã chứng minh rằng bột mầm ngô chứa brazzein có thể được sử dụng trực tiếp trong các ứng dụng thực phẩm, cung cấp vị ngọt cho sản phẩm Những kết quả này chứng minh rằng cường độ cao protein ngọt được cho vào các sản phẩm thực phẩm có thể đem lại các thuộc tính tạo ngọt hữu ích trong ngành công nghiệp thực phẩm

GIỚI THIỆU

Sự tồn tại của các protein có nguồn gốc tự nhiên có vị ngọt đã được biết đến trong nhiều năm (xem xét trong Faus, 2000) Sự quan tâm đến các protein này đã tăng lên với nhu cầu ngày càng gia tăng cho chất làm ngọt “ít calo” và các sản phẩm thực phẩm “tự nhiên” và “có lợi cho sức khỏe” để giải quyết các nhu cầu của hàng triệu cá nhân có ý thức về lượng tiêu thụ carbohydrate vì lý do ăn kiêng và bệnh tiểu đường Điều này dẫn tới việc thương mại hóa duy nhất một chất trong loại protein này, thaumatin, như chất tạo ngọt và tăng hương vị (Witty và Higginbotham, 1994; Faus, 2000) Thật không may, sản xuất thương mại của thaumatin, cũng như tất cả các protein ngọt khác, đã bị hạn chế do các nguồn tự nhiên cho tất cả các protein là loài thực vật nhiệt đới mà các loài thực vật này khó có thể trồng trọt Việc cố gắng lặp đi lặp lại để sản xuất protein ngọt tái tổ hợp trong các hệ thống vi sinh vật và thực vật biến đổi gen đã thất bại trong việc mang lại những protein ở mức độ đủ lớn để thương mại hóa rộng rãi có tính khả thi về kinh tế (Witty và Higginbotham, 1994; Zemanek và Wasserman, 1995; Faus, 2000) Brazzein là một protein được xác định gần đây có

nguồn gốc từ thực vật châu Phi, Pentadiplandra brazzeana Baillon, nó có vị ngọt bên

trong gấp 500 – 2000 lần so với đường mía (Ming và Hellenkant, 1994) Quả chứa

brazzein từ cây P brazzeana đã được tiêu thụ trong khu vực bản địa của vùng châu Phi

nhiệt đới vì tính chất ngọt của nó, nơi mà nó đã gắn liền với tên tiếng Pháp “l'oubli”,

có nghĩa là “lãng quên” (Hladick, 1989; Hladick, 1993) Điều này là do những đứa trẻ bản địa trở nên quá tập trung vào việc thu thập nhiều hơn các trái cây chín ngon lành đến nỗi chúng “quên” mất mẹ của chúng đang tìm kiếm chúng Tuy nhiên, hạn chế về quả và sự phức tạp liên quan đến sản xuất quy mô lớn của các cây trồng bản địa làm cho sản xuất quy mô lớn của brazzein từ các nguồn tự nhiên không đem lại khả năng kinh tế Vì vậy, sản xuất thương mại rộng rãi brazzein có thể sẽ yêu cầu việc chuyển giao biểu hiện protein với một hệ thống dị hợp bằng phương tiện của công nghệ DNA tái tổ hợp Sự phù hợp của brazzein cho biểu hiện tái tổ hợp đã được chứng minh bằng

Escherichia coli, cho phép mô tả đặc điểm hơn nữa của đặc tính sinh hóa của protein

(Assadi-Porter và cộng sự, 2000a, b)

Brazzein là một chuỗi polypeptide đơn 6,5 kDa với bốn cầu nối disulfua nội phân tử cho phép nó duy trì tính ngọt đặc trưng ngay cả sau khi ủ ở 80ºC trong 4 giờ (Ming và Hellenkant, 1994; Ming và các cộng sự, 1995.) Ba hình thức của protein chỉ khác nhau ở đầu cuối N của amino acid Brazzein loại 2 tương ứng với sản phẩm dịch

mã 54 - amino acid dự đoán chứa glutamine ở đầu cuối N của nó Hình thức này xuất hiện với vòng đời ngắn như đầu cuối N của glutamine phải trải qua chuyển đổi tự nhiên thành pyroglutamate, kết quả là brazzein loại 1, và sự mất mát đầu cuối N của glutamine (hoặc pyroglutamate) tạo ra brazzein loại 3 có 53 amino acid Chỉ có hai loại cuối được phát hiện trong quả chín Cường độ ngọt khác nhau giữa các dạng, ở loại 3 ngọt hơn gấp hai lần so với loại 1 (Izawa và cộng sự, 1996)

Chúng tôi trình bày ở đây thế hệ của các dòng ngô với hàm lượng cao protein brazzein biểu hiện trong hạt giống Các phân đoạn của hạt ngô biểu hiện brazzein bởi các phương pháp xay xát khô tiêu chuẩn dẫn đến làm giàu hơn nữa brazzein trong bột mầm, được biểu hiện để phục vụ như là chất tạo ngọt trong các ứng dụng sản phẩm Hơn nữa, brazzein tinh sạch từ hạt giống ngọt hơn đường mía đến 1200 lần trên mỗi trọng lượng cơ sở Những kết quả này hỗ trợ trồng ngô một cách hiệu quả, hệ thống biểu hiện kinh tế cho sản xuất thương mại của protein ngọt, brazzein

KẾT QUẢ

Biểu hiện của brazzein trong ngô

Chiến lược phát triển các dòng ngô để sản xuất thương mại brazzein được thiết

kế với việc xem xét các mục tiêu tạo ra protein ở mức biểu hiện cao cùng với sự cần thiết phải tạo ra sản phẩm biểu hiện cấu trúc và chức năng tương đương với các protein từ nguồn tự nhiên của nó Chỉ có dạng loại 1 và loại 3 của brazzein được phát

hiện trong các quả chín muồi của P brazzeana (Ming và Hellenkant, 1994), và do đó

mục tiêu là tạo ra những dạng thông qua một hệ thống biểu hiện thực vật tái tổ hợp Tuy nhiên, cơ chế sản sinh ra các dạng trong cơ thể sống có thể liên quan đến việc chuyển đổi từ một sản phẩm dịch mã brazzein loại 2 làm trung gian (chứa glutamine ở đầu cuối N của nó) cho loại 1 và loại 3 Như vậy, biểu hiện của một mRNA có chứa khung đọc mở brazzein loại 2 được lựa chọn gần giống với các thiết kế tự nhiên để biểu hiện và có khả năng sản sinh ra chủ yếu là protein brazzein loại 1 thông qua việc chuyển đổi amino ở đầu cuối N của glutamine thành pyroglutamate trong cơ thể sống Ngoài ra, để chọn lọc biểu hiện các dạng loại 3 của brazzein, một phương pháp di truyền phân tử giống hệt sự mất đầu cuối N của glutamine (hoặc pyroglutamate) đã được lựa chọn bằng cách trực tiếp mã hóa các hình thức cắt ngắn của protein Vì vậy, khung đọc mở mã hóa một trong hai brazzein loại 2 hay loại 3 được tổng hợp và hợp nhất thành các trình tự quy định khác nhau ở thực vật để tạo thành tám cấu trúc biểu hiện khác nhau Các khung đọc mở mã hóa brazzein được thiết kế thành một vector[3] biểu hiện (cấu trúc biểu hiện) có chứa một promoter cố định (một promoter giống như polyubiquitin[1] trong ngô; Hood và cộng sự, 2003), một promoter ưa phôi (globulin-1 trong ngô; Belanger và Kriz, 1991) hoặc một promoter ưa nội nhũ (22-kDa alpha-zein trong ngô, Tem AF090447) Chúng tôi thử nghiệm sự kết hợp của các promoter, nhắm đến chuỗi RNA và các yếu tố để xác định các thông số tốt nhất để đạt được mức độ biểu hiện cao brazzein trong hạt ngô Sự kết hợp bao gồm promoter mô tả ở trên với các vị trí được nhắm đến của thành tế bào và tế bào chất Ngoài ra, để biểu hiện nhắm đến thành tế bào, ưa phôi, vùng không được phiên mã 5’ (UTRs) từ nguồn gốc virus thực vật (virus khắc acid thuốc lá) (TEV, Tem M15239) và virus gây bệnh khảm còi

1

Ubiquitin được biết như là một protein điều hòa nhỏ được tìm thấy ở tất cả các mô của sinh vật nhân thực Polyubiquitin là chuỗi ubiquitin gắn vào lysine đơn trên protein bề mặt

cọc trên ngô (MDMV, Tem AJ001691)] đã được sử dụng Hình 1 cho thấy khu vực bên trong của một vector[3] biểu hiện điển hình, cùng với các đơn vị phiên mã trong

tám cấu trúc sử dụng cho Agrobacterium – biến đổi gián tiếp của ngô

Hình 1: Vector[3] chuyển đổi cây trồng (A) Bản đồ khu vực intraborder của cấu trúc chuyển đổi bậc 2 điển hình Vị trí của các phần tử trình tự sau đây được chỉ định: loại promoter [phôi ưa thích và virus khảm súp lơ 35S (CAMV35S)]; alpha-amylase lúa mạch::vùng mã hóa bazzein (BAASS :: Brazzein); khu vực đầu sao chép Pin II khoai tây; khung đọc mở gen kháng thuốc diệt cỏ tối ưu hóa ngô (moPAT); đầu cuối CaMV (CAMV35St); và trình tự mép trái

và phải của một Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid (LB và RB); (B)

đơn vị phiên mã thực vật (PTUs) được sử dụng để tạo ra thực vật chuyển gen biểu hiện brazzein loại 2 và loại 3 Số cấu trúc được thể hiện bên trái của mỗi đơn vị Loại promoter và tiêu chí nhắm đến cho mỗi cấu trúc được chỉ định Cấu trúc 5 và 6 bao gồm các yếu tố di truyền giống nhau với một sự thay đổi vị trí của các điểm hạn chế thiết kế Nguồn gốc của vùng không được phiên mã 5’ của các bản sao cho cấu trúc 7 và 8 được chỉ định BAASS, chuỗi tín hiệu alpha-amylase lúa mạch; MDMV, virus gây bệnh khảm còi cọc trên ngô; Pin II, gen chất ức chế protease II từ khoai tây; TEV, virus khắc acid thuốc

lá

Cấu trúc bậc 5 về cơ bản giống như cấu trúc bậc 6, ngoại trừ vị trí của các điểm hạn chế để thích nghi với tạo dòng phụ sau đó cho việc tạo ra các cấu trúc 7 và 8 Biến nạp đã được lựa chọn để kháng thuốc diệt cỏ và sau đó thụ phấn tự do sử dụng dòng

bố mẹ ưu tú cho thế hệ của hạt giống T1 (thế hệ đầu tiên, được sàng lọc sử dụng một brazzein – hấp thụ miễn dịch sử dụng phương pháp ELISA[2] để đo lường sự tích tụ của các protein Kết quả của năm hạt đơn T1 cao nhất (đại diện cho năm cây trồng riêng biệt) cho mỗi dòng có nguồn gốc từ tám cấu trúc được thể hiện trong hình 2A Không có sai lệch so với kiểu hình bình thường về tích hợp của các gen chuyển đổi đã

[2] Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme

được quan sát trong các cây trồng mang cấu trúc biểu hiện bất kỳ Biểu hiện protein brazzein được quan sát thấy trong các dòng có nguồn gốc từ tất cả các cấu trúc Biểu hiện bằng phương pháp ELISA[2] phát hiện tương quan với sự hiện diện của một vùng phản ứng miễn dịch 6,5 kDa trên phân tích Western blot sử dụng huyết thanh chống brazzein Kết quả chiết xuất điều chế từ hạt giống của các cấu trúc 1, 3 (hình 2B) và 5 (Hình 3B) được hiển thị Mức brazzein cao nhất được phát hiện trong hạt giống từ các dòng thiết kế để biểu hiện các dạng brazzein từ một promoter ưa phôi và nhắm đến các

tế bào thực vật (cấu trúc 2, 5 và 6) Hơn nữa, cả hai dạng brazzein tích lũy được ở mức cao, khoảng 4% tổng lượng protein hòa tan (TSP) (Hình 2A; cấu trúc 2, 5 và 6), cho thấy sự khác biệt tinh tế tại đầu cuối N của protein không giới hạn cho biểu hiện protein brazzein hay sự ổn định trong ngô Khi trình tự UTR 5’ từ hai loại virus thực vật (TEV và MDMV) đã được hợp nhất như là UTRs 5’ của cấu trúc 7 và 8, không làm tăng biểu hiện protein được quan sát thấy khi so sánh với cấu trúc 5 và 6 Điều thú

vị là, chỉ có biểu hiện rất thấp (≤ 0,005% TSP) được phát hiện trong hạt giống từ các dòng trong đó biểu hiện brazzein được nhắm đến

các tế bào chất (cấu trúc 4)

Hình 2: Protein brazzein trong hạt ngô và trong các

phân đoạn kết quả từ quá trình xay xát khô của hạt

giống (A) mức độ biểu hiện của protein brazzein

trong hạt T1 cao nhất từ năm cây trồng riêng lẻ hàng

đầu trong tám vector[3]

được sử dụng để tạo ra các kết quả chuyển gen độc lập cho biểu hiện brazzein

trong ngô Số liệu cho năm hạt giống biểu hiện cao

nhất từ vector[3] 1-8 được lấy từ kết quả chuyển gen

4, 15, 13, 9, 12, 19, 10 và 7 tương ứng TSP, tổng

protein hòa tan (B) immunodetection (phát hiện

miễn dịch) của brazzein trong chiết xuất từ hạt Chiết

xuất từ hạt riêng lẻ tùy thuộc vào gel điện di natri

[3]

Trong nhân bản phân tử, một vector là một phân tử DNA được sử dụng như một phương tiện để mang vật liệu di truyền từ bên ngoài vào một tế bào, nơi nó có thể được tái tạo hoặc biểu hiện Bốn loại chính của vector là plasmid, vector vius, cosmids và nhiễm sắc thể nhân tạo.

dodecylsulphate-polyacrylamide (SDS-PAGE) trên 18% gel, chuyển giao cho polyvinylidene difluoride (PVDF) và brazzein được phát hiện bởi immunoblotting4 với kháng thể kháng brazzein như được mô tả trong “Phương pháp thí nghiệm” Giếng 1, kiểm soát chiết xuất hạt giống ngô (20 μg); giếng 2 và 3, nấm men brazzein (100 và 50 pg, tương ứng); giếng 5 -7, chiết xuất từ cấu trúc 1 hạt giống (10 μg); giếng 8, chiết xuất từ cấu trúc 3 hạt giống (20 μg) Lượng protein được xác định bằng cách xay nhuyễn hạt từ 5 dòng được chọn Mục “hạt” và

“mầm” đại diện cho lượng protein trong các cấu tử của nội nhũ và phôi, mục “vỏ” thể hiện lượng protein ở lớp ngoài của hạt bắp Mục “sai số” thể hiện độ lệch chuẩn từ các giá trị trung bình thu thập từ các mẫu

Cấu trúc bậc 2 và 5 sử dụng một promoter ưa phôi để kích thích biểu hiện lần lượt của protein brazzein loại 2 hay loại 3 và do đó các protein brazzein được dự đoán

sẽ tích lũy đến mức cao nhất trong phôi Để đánh giá khả năng tích lũy brazzein trong các mô hạt giống, ngũ cốc nguyên hạt từ dòng bắt nguồn từ cấu trúc bậc 2 và 5 được tạo thành, và mỗi hạt gộp đã được phân đoạn sử dụng một phương pháp nghiền khô để phân tách các thành phần mầm của hạt giống Brazzein được xác định trong thành phần từ quá trình nghiền cấu trúc bậc 5 của hạt được thể hiện trong Hình 2C Brazzein tập trung gấp năm lần trong phần mầm như một đặc trưng của phần trọng lượng khô khi so sánh với ngũ cốc nguyên hạt Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trên một phần của các hạt từ cấu trúc dòng bậc 2 (dữ liệu không hiển thị) Như vậy, hiệu quả của nghiền khô tiêu chuẩn là làm giàu hàm lượng brazzein sử dụng hạt từ dòng mà biểu hiện nhằm vào phôi

Bảng 1: Phân tích trình tự amino acid ở đầu cuối N của brazzein đƣợc tinh sạch từ hạt ngô của cấu trúc bậc 2 và bậc 5 dòng

Sequence origin (nguồn gốc trình tự) 10 amino acid đầu

Cấu trúc brazzein bậc 2 sqdkxkkvye

Cấu trúc brazzein bậc 5 dkxkkvyeny

[4]

Immunobloting hay Western blot: kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, là một kỹ thuật phân tích

sử dụng rộng rãi sử dụng để phát hiện các protein cụ thể trong một mẫu của đồng mô hoặc từ chiết xuất

*Chỉ chu kì trong đó sự phân chia amino acid không được thực hiện

†Có nghĩa là trình tự mã hóa brazzein dự đoán được mà không cần chuyển amino acid ở đầu cuối N của glutamine thành pyroglutamate

Đặc tính của protein brazzein biểu hiện trong ngô

Các dòng biểu hiện brazzein cao nhất sử dụng một trình tự tín hiệu thực vật hợp nhất để đầu cuối của amino kết thúc brazzein trực tiếp biểu hiện protein với thành tế bào thực vật Nói chung, trình tự tín hiệu được lấy ra trong quá trình vận chuyển protein đến thành tế bào (Hood và các cộng sự, 1997) Vì vậy, để đánh giá xem liệu việc loại bỏ trình tự tín hiệu có thích hợp không xảy ra trong các dòng ngô chuyển gen, protein brazzein được tinh chế từ cấu trúc dòng bậc 2 và 5 Sắc ký ái lực miễn dịch sử dụng kháng kháng thể brazzein liên kết hóa trị cùng với Sepharose đã được sử dụng để tinh sạch hoặc brazzein loại 2 hoặc loại 3 tương ứng từ cấu trúc dòng bậc 2 và 5 Phần phân ước lượng mẫu được lấy trong quá trình sắc ký được phân tích bằng gel điện di natri dodecylsulphate–polyacrylamide (SDS–PAGE) tiếp theo là nhuộm với Coomassie Kết quả khi tách brazzein từ cấu trúc bậc 5 của hạt được thể hiện trong Hình 3 Băng 6.5 kDa lớn phát hiện khi nhuộm với Coomassie trong phân tách rửa bằng độ pH thấp (Hình 3A, đường 7–9) cũng đã được phát hiện bởi kỹ thuật immunobloting[4] sử dụng kháng thể kháng brazzein (Hình 3B, đường 7–9), và sự hiện diện của băng tương quan với việc phát hiện brazzein bằng phương pháp ELISA[2](Hình 3C) Sắc ký ái lực miễn dịch của chiết xuất từ hạt của một cấu trúc dòng bậc 2 mang lại kết quả tương tự (con số bổ sung, xem phần sau) Protein brazzein ngô được tinh sạchcó nguồn gốc từ cả hai cấu trúc dòng bậc 2 và 5 được cho vào sự suy thoái Edman để có được những trình tự đầu cuối N của amino acid (Bảng 1) Các trình tự đầu cuối N của amino acid của dạng brazzein tự nhiên loại 2 và 3 được hiển thị để tham khảo Acid amin không được gán trong các trình tự phân tích tương ứng với vị trí của các phần đuôi cysteine trong khung đọc mở rộng brazzein để tạo thành cầu disulfua nội phân tử trong protein brazzein (Kohmura và các cộng sự, 1996) Kết quả cho thấy brazzein trong cấu trúc dòng bậc 5 được xử lý chính xác để sản xuất đầu cuối

N loại 3 tự nhiên Tuy nhiên, brazzein tinh sạch từ cấu trúc dòng bậc 2 có thêm vào một amino acid bổ sung ở phần kết thúc đầu cuối N, một serine Amino acid này tương ứng với amino acid cuối cùng trong trình tự tín hiệu được sử dụng trong cấu trúc bậc

2, và do đó các kết quả này cho thấy xử lý các protein dung hợp một acid amin ra khỏi glutamine

Hình 3: Sự phân tách protein brazzein loại 3 bởi sắc ký ái lực miễn dịch (Immunoaffinity chromotography) từ hạt ngô có cấu trúc bậc 5 Phần chiết được xử lý sơ bộ từ hạt giống của cấu trúc dòng bậc 5, và tùy thuộc vào sắc ký ái lực miễn dịch như mô tả trong “Phương pháp thí nghiệm” Phần phân ước của phân đoạn tùy thuộc vào natri dodecylsulphate–polyacrylamide gel điện (SDS–PAGE) trên 18% gel Băng protein được nhận thấy khi nhuộm với Coomassie blue (A), khi chuyển sang polyvinylidene difluoride (PVDF), brazzein được nhận thấy bởi kỹ thuật immunobloting[4]

với kháng thể kháng lại brazzein (B) hoặc đo bằng phương pháp ELISA[2] (C) Vị trí của các protein tiêu chuẩn của trọng lượng phân tử được chỉ thị (×10–3) được đưa ra trên bên trái của gel và blot Giếng 1, phosphatebuffered saline (PBS) chiết xuất từ hạt giống; giếng 2, dịch chảy qua phân đoạn; giếng 3, PBS rửa; giếng 4, thứ ba PBS rửa;giếng 5–9, các phân đoạn tách rửa với bộ đệm pH thấp

Một ứng dụng tiềm năng của brazzein là như một loại phụ gia thực phẩm tinh chế Do đó, một phương pháp tinh sạch đã được phát triển để tạo ra đủ số lượng protein brazzein loại 3 đã tinh sạch cho đánh giá cảm quan để kiểm tra xem nguyên

liệu tinh khiết vẫn giữ được vị ngọt bên trong cao Một bản phác thảo của thử nghiệm được sử dụng để làm giàu thêm protein brazzein được hiển thị trong Hình 4A Các phân đoạn được tạo ra trong suốt hoạt động tinh sạch tiêu biểu được thử nghiệm cho

sự hiện diện của protein brazzein, và kết quả được tóm tắt trong Bảng 2 Phân tích các phân đoạn của SDS–PAGE cũng đã được thực hiện, và kết quả được thể hiện trong Hình 4B Brazzein đã được làm giàu thêm tới khoảng 70% protein hòa tan của thử nghiệm này, và mang lại một băng đơn bởi SDS–PAGE Thử nghiệm này là lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo ra một lượng vừa đủ brazzein loại 3 tinh sạch để đánh giá cảm quan

Bảng 2: Tinh sạch protein brazzein từ hạt đƣợc thu nhận từ ngô cấu trúc bậc 5 dòng

Bước tinh sạch Protein

tổng † (mg)

Brazzein

‡ (mg)

Độ tinh khiết (%

TSP)

Fold enrichment

Hiệu suất (%)

TSP, total soluble protein: tổng protein hòa tan

*Tinh sạch brazzein loại 3 từ 80 g bột bắp thu được từ cấu trúc bậc 5 dòng

† Protein tổng trong phần bột bắp được xác định sử dụng phép phân tích BCA

‡ Hàm lượng brazzein của phần bột bắp được xác định bằng phép phân tích sử dụng phương pháp ELISA[2] cho brazzein đặc hiệu (là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm)

Hình 4: Việc làm phong phú thêm brazzein loại 3 để thử nghiệm hương vị (A) Lưu đồ của hệ thống làm sạch nhiều bước để phân lập brazzein từ hạt ngô Hạt gộp từ cấu trúc dòng bậc 5 đã được sử dụng để tinh chế brazzein loại 3 theo các phương pháp nêu trong “Các phương pháp thí nghiệm” Phần phân ước của các phân đoạn được gộp thu được từ các bước khác nhau tùy thuộc vào natri dodecylsulphate–polyacrylamide gel điện di (SDS–PAGE) trên 18% gel (B) Coomassie bluestained gel Vị trí của các protein tiêu chuẩn với trọng lượng phân tử được chỉ thị (×10–3) được cho ở bên trái Giếng 1, chiết xuất dầu thô của brazzein loại 3 trong hạt giống ngô (5 g); giếng 2, nước nóng/trích lọc (5 g); giếng 3, điểm cực đại brazzein từ phương pháp sắc ký trao đổi cation (5 g); giếng 4, điểm cực đại của brazzein loại 3 từ phương pháp sắc ký lọc gel (hay phương pháp sắc ký rây phân tử) (5 g)

Phân tích cảm quan brazzein ngô

Như các ứng dụng tiềm năng cho biểu hiện của brazzein trong ngô có thể yêu cầu sử dụng hoặc là một protein tinh sạch hoặc một phân đoạn tinh sạch ít hơn được thu nhận từ hạt ngô, thật hữu ích để xác định cường độ ngọt của brazzein cả bên trong phân đoạn ngô và protein tinh sạch Để xác định xem protein brazzein trong phân đoạn mầm sở hữu vị ngọt bên trong hay không , bột mầm được dùng để đánh giá cảm quan Bột mầm đối chứng và bột mầm từ cấu trúc dòng bậc 2 và 5 (0.04% và 0.02% tương ứng với trọng lượng khô của bột và brazzein) đã được sử dụng để tạo ra chiết xuất đã được đánh giá cường độ ngọt tương đối so với tiêu chuẩn tham khảo dung dịch đường mía sử dụng phương pháp thử nghiệm tiêu chuẩn Chiết xuất từ bột mầm có chứa brazzein loại 2 hoặc loại 3 được nếm thử và có số điểm tương đối so với cường độ ngọt của tiêu chuẩn tham chiếu đường mía chuẩn bị ở mức 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0% và 5.0%, chúng đã được tìm thấy có độ ngọt có thể so sánh với dung dịch tương ứng 1.8

% và 2.0% đường mía (Bảng 3) Điều này tương ứng với vị ngọt tương đương khoảng

40% và 35% đường mía cho bột mầm có chứa 0.02% brazzein loại 3 và 0.04% brazzein loại 2 tương ứng Dựa trên hàm lượng brazzein đo được trong các phần bột mầm, những kết quả này chỉ ra rằng bột brazzein loại 3 là ngọt nhất trên một đơn vị brazzein, cung cấp một cường độ ngọt của khoảng 1700 lần so với đường mía trên mỗi trọng lượng cơ sở tại 2.0% đường mía, so với 900 lần so với đường mía cho ngô brazzein loại 2 Không có độ ngọt nào được phát hiện theo các điều kiện của phân tích này trong bột mầm đối chứng Những kết quả này chứng minh rằng brazzein biểu hiện trong ngô sở hữu một cường độ ngọt cao, mà vẫn còn khi thu hoạch hạt giống, lưu trữ, phân đoạn, de-fatting (loại gốc acid béo nhằm giảm hàm lượng béo) và nghiền

Bảng 3: Độ ngọt tương đối của brazzein trong bột phôi ngô và protein brazzein loại 3 được tinh sạch từ bắp

Nguồn vật liệu Loại

brazzein

brazzein trong mẫu thử (p.p.m)

Độ ngọt đo được (SEV) (%)†

Độ ngọt brazzein ‡

*Bột phôi chứa cả brazzein loại 2 và loại 3 được thu nhận lần lượt từ hạt cấu trúc bậc 2 và 5 dòng

†SEV (Đường mía Equivalence Value): giá trị đường mía tương đương tương ứng với độ ngọt của dung dịch đường mía (w/v %)

‡ Độ ngọt tương đối được so sánh với đường mía bằng trọng lượng thành phần brazzein

Việc ước lượng độ ngọt của brazzein loại 3 được tinh sạch từ bắp cũng được biểu diễn ở bảng 3 Hai nồng độ brazzein được pha lẫn vào một hệ đệm muối citrate sẽ được ước lượng bằng cách so sánh với bảng đường mía tiêu chuẩn mà bảng này tạo ra

từ việc hòa tan đường mía vào cùng một hệ đệm muối citrate Kết quả cho thấy rằng, brazzein loại 3 đã tinh sạch có độ ngọt từ 940–1200 lần của đường mía ở cường độ đường mía tương ứng đã được kiểm định Kết quả này nằm trong phạm vi báo cáo của brazzein loại 3 biểu hiện trong hệ thống biểu hiện vi khuẩn (Assadi–Porter và các cộng