Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tiêu

phân vi sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan; chế phẩm vi khuẩn lam; chếphẩm nấm rễ...So với lịch sử phát triển của phân bón vi sinh vật trên thế giới, việc nghiêncứu thử nghiệm p

PHẦN 1: MỞ ĐẨU

Phân bón là yếu tố quan trọng trong sản xuất nông nghiệp Từ đầu thế kỷ XX,việc sản xuất và sử dụng phân bón vồ cơ đã góp phần quan trọng nâng cao sản lượngnông sản, giải quyết nạn đói cho nhân loại Tuy vậy, nếu chỉ sử dụng phân vô cơ đểnâng cao năng suất cây trổng sẽ dẫn đến sự ô nhiễm môi trường và suy giảm chấtlượng nông sản vì các lý do sau:

- Để sản xuất phân vô cơ , cần sử dụng một lượng lớn nhiên liệu: Than đá ,dầu mỏ quá trình thiêu đốt các loại nhiên liệu, đã tạo nên hàng triệu tấn khí thảiđộc hại, thổi vào khí quyển và hàng tỷ mét khối nước thải đổ vào các nguồn nướcmặt Nguồn khí, nước thải này đã góp phần làm ô nhiễm môi trường sinh thái củatrái đất, tăng cường hiệu úng nhà kính [18]

- Sử dụng phân vô cơ lâu ngày với liều lượng cao, sẽ hạn chế sự đa dạng củaquần thể sinh học đất, mật độ tế bào vi sinh vật trong đất giảm, số lượng giun đấtgiảm nghiêm trọng thậm chí bị mất đi Chính những yếu tô này, làm cho đất ngàycàng trở nên chai cứng, độ phì nhiêu của đất giảm nghiêm trọng

Chính vì vậy, trong những năm gần đây xu hướng xây dựng một nền nôngnghiệp bền vững, nhằm nâng cao năng suất nông sản nhưng vẫn giữ được độ phì củađất lâu dài đang được phát triển Sử dụng cân đối giữa phân vô cơ, phân hữu cơ( phân xanh, phân chuồng, phân ủ ) và phân vi sinh vật là một nội dung quan trọngcủa nền sản xuất nông nghiệp bền vững[18]

Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học, có tác dụng nâng cao năng suất

và chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ và góp phần tạo cânbằng sinh thái Phânbón vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trọng việc bảo vệ môitrường và xây dựng nền nông nghiệp sạch bền vững Do vậy, nghiên cứu sử dụngrộng rãi phân bón vi sinh vật trong nông - lâm nghiệp đã và đang được nhiều nướctrên thế giới quan tâm và đầu tư phát triển Kết quả nghiên cứu từ các nước Mỹ ,Canada, Nga, An Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản Cho thấy sử dụng chếphẩm vi sinh vật có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30-60 kg N / ha /năm hoặcthay thế một lượng lớn lân vô cơ bàng quặng photphat Ngoài ra, qua hoạt động sốngcủa vi sinh vật cây trồng được nâng cao khả năng trao đổi chất , khả năng chống chịubệnh tật và qua đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Các loạiphân bón vi sinh vật đang được thế giới nghiên cứu và sử dụngcó thể kể đến là :Phân vi sinh vật cố định Nitơ cộng sinh, hội sinh và tự do;

phân vi sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan; chế phẩm vi khuẩn lam; chếphẩm nấm rễ

So với lịch sử phát triển của phân bón vi sinh vật trên thế giới, việc nghiêncứu thử nghiệm phân vi sinh vật ở Việt Nam còn rất mới mẻ Việt Nam mới chỉ tậptrung nghiên cứu về vi sinh vật cố định Nitơ và đang được sản xuất, ứng dụng tạimột sô đối tượng cây trồng nông nghiệp chính như: Lúa, đậu, lạc song qui mô cònhết sức hạn chế và chưa đáp ứng được yêu cầu của người sử dụng Trong khi đó,thực tế sản xuất nông - lâm Việt Nam lại đòi hỏi một số lượng lớn, không chỉ phân visinh vật cố định Nitơ mà cả phân vi sinh vật phân giải lân - Một loại phân vi sinh vậtmới được dề cập đến trong khuôn khổ đề tài cấp nghành mà Viện KHKTNN ViệtNam đã tiến hành trong giai đoạn 1992-1995 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng

vi sinh vật phán giải lân có thể thay thế 30-50% phân vô cơ bằng quặng photphat mànăng suất cây trồng không thay đổi [18]

Tiếp tục nghiên cứu để mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân bón visinh vật, đề tài KHCN 02-06 giai đoạn 1996-2000 do Ts: Phạm Văn Toản làm chủnhiệm đề tài đã nghiên cứu và tạo thêm một số chế phẩm phân vi sinh vật phục vụcho sản xuất nông - lâm nghiệp [18]

Nhằm góp phần tạo sản phẩm phân bón vi sinh vật phục vụ cho sản xuất

nông - lâm nghiệp chúng tôi chọn đề tài: ” Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điếm sinh học của một số chùng vi sinh vật có khá năng phân giải lân khó tiêu “

Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi tập chung giải quyết những vấn đềchính sau:

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giảiPhotphat khó tan

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng tuyển chọn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển củachủng vi sinh vật phân lập được , nhằm tạo điều kiện phát huy hoạt tính sinhhọc của chúng

PHẨN 2: NỘI DUNG

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lý thuyết về phân giải photpho

1.1.1 Vai trò của photpho đôi vói sự sinh trưởng phát triển của cây trồng

Photpho là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dưỡng đalượng chính của cây trồng( N,P,K) là nguyên tố cơ bản cần thiết cho sự sống của tất

cả các loài sinh vật đặc biệt là thực vật Photpho là thành phần xây dựng nên các hợpchất quan trọng bậc nhất của tế bào như: Photphoprotein, photpholipit, photphoeste,trong các vitamin( B,,B6).Đặc biệt photpho là thành phần không thể thiếu của ATP,ADP,GTP,FAD,NADP,coA, đây là những phân tử trao đổi năng lượng, có vai tròđặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thực vật [ 7 ]

Photpho có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây trồng Dưới tác độngcủa photpho cây trồng có hạt chín sớm hơn 5 -7 ngày, cây ăn quả có số quả chín sớmnhiều hơn đạt tới 78%( nếu không bón phân photpho chỉ chín 32%) [2]

Bón photpho làm tăng tính chịu rét, tăng độ đường cho củ cải, tăng lượng tinhbột cho củ khoai tây, nói chung là photpho có tác dụng tăng chất lượng cùng năngsuất cho cây trồng lên rất nhiều [12]

Ngoài ra, photpho còn giúp cho cây chịu hạn tốt hơn nhờ khả năng ngậm nướccao của nó Đối với cây họ đậu photpho còn giúp cho quá trình cố định Nitơ tốt hơn[3]

Trong quá trình sinh trưởng của cây, photpho có tác dụng khống chế độ độccủa lượng đạm khoáng cao trong cây vì nó giúp cho thực vật tăng cường việc chuyênhoá đạm khoáng thành đạm Protein Hơn nữa sự có mặt của photpho làm cây hấp thụđược lượng đạm khoáng nhiều hơn [1]

Thực tế đã chứng minh rằng khi thiếu photpho sự hình thành tế bào mới bị chậmlại, cây còi cọc ít phân cành đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng ThiếuPhotpho năng xuất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng , ngay cả khi cây được cungcấp đầy đủ Nitơ

1 12 Vòng tuần hoàn của Photpho trong tự nhiên

vật

phẩmbàitiếtPhân huỷ sinh học

vsv phân giảiphotphat

Các photphat tan

Sư đồ 1: Chu trình chuyến hoá Photpho trong đất [23]

1.1.3 Các dạng của Photpho trong tự nhiên

Các khoáng chất chứa Apatit, photphorit là những loại quặng chứa Photphohoặc từ xác động thực vật Photpho tồn tại ở trong đất có hai dạng chính: Photpho

vô cơ và Photpho hữu cơ Trên thực tế Photpho vô cơ chiếm ưu thế

Cây trổng rất khó sử dụng phohot hữu cơ Quá trình chuyển hoá từ photpho hữu

cơ thành Photpho vô cơ để cây trồng có thể sử dụng được là nhờ hệ vi sinh vật

Photpho vô cơ thì tồn tại ở hai dạng chính sau:

+ Loại Photphat không tan chiếm đa phần, hầu như không tan trong nước.Thực vật không trực tiếp sử dụng loại Photphat này đó là các Apatit, các muối gốcPhotphat của kim loại mang tính axit như: FeS04, A1S04, Photphat của kim loại kiềmthổ mang tính kiềm hoặc trung tính: Ca3(P04)2; A13(P04)2

+ Loại Photphat tan trong nưóc thường gặp là KH2P04; Na2HP04; K2HP04;Ca(HP04)2; Mg(HP04)2 Thực vật dễ dàng sử dụng tốt các loại Photpho này, nhưng

đáng tiếc là hàm lượng của chúng lại rất thấp ( chỉ chiếm 0,1- 1% so với lượng

Photpho tổng số ) cho nên cây trồng thưòng bị thiếu Photpho nghiêm trọng

Photpho hữu cơ tồn tại ở các chất có nguồn gốc từ động vật, thực vật Từ xáccủa động thực vật qua sự phân giải của vi sinh vật trong đất tạo thành dạng chấtmùn Do vậy, việc sử dụng lâu dài phân chuồng có thể làm tăng hàm lượng Photphohữu cơ trong đất

1.1.4 Các dạng chế biến phân Photpho

Chia làm hai loại: Phân Photpho chế biến bằng axit và phân Photpho chế biếnbằng nhiệt

1.1.4.1 Phân photpho chê biến bằng axit

Phân photpho chế biến bằng axit còn được gọi là Superphotphat, nó có côngthức là CaHP04.CaS04 về nguyên tắc sản xuất, người ta cho quặng Apatit chứa P205

đã nghiền nhỏ tác dụng vói H2S04 theo tỷ lệ 1: 1

Phương trình phản ứng xảy ra như sau:

Ca3(P04)2.CaF2 + 3 H2SƠ4 = Ca(HPƠ4)2 + CaS02 + HFTrong thành phần của Superphotphat, ngoài monohidrophotphatcanxi còn

có 40% CaCo3, một phần axit H3P04 tự do với hàm lượng 5- 6 %.Superphotphat làmột loại phân mang tính axit nên chỉ sử dụng cho đất bão hoà kiềm hoặc trung tính.Nếu sử dụng cho đất chua có nhiều Fe, Al sẽ làm mất hiệu lực của phân Photpho[14] [4],

1.1.4.2 Phân Photpho chê biến bằng nhiệt.

Phân Photpho chế biến bằng nhiệt còn được gọi là phân lân nung chảy, được sảnxuất từ sự gia nhiệt làm nóng chảy Apatit với Mg, Silicat ở nồng độ loãng sau đóđược làm lạnh đột ngột Đây là phương pháp để chuyển các hợp chất muối Ca, psang dạng dễ tan

Phân Photpho nung chảy có thành phần dinh dưỡng như sau:

Tên chủng vi sinh

vật

Nguồn Photphat % phân giải Nguồn tài liệu

Vi khuẩn Photphat Canxi 3 3-17 Moreau - 1995

Pseudomonas Photphat Canxi 3 13-58 Ostwaba.Bhide -1992

Photphat Canxi 3 30,8Aspergillus Photphat Canxi 2 58,4 Gaura Gaind-1983

Photphat nhôm 24,0Photphat sắt 25,6Photphat Canxi 3 90,0Pénicillium Photphat sắt 49,3 Gaura Gaind-1983

Photphat nhôm 28,1Bacillus Quặng Photphat 5-10 Gaura Barrdiga-1972

Bacillus Quặng Photphat 12-20 Gaur et al-1973

Pénicillium Quặng Photphat 10-17 Asea et Al-1988

1.1.5 Cơ chê phân giải hợp chất Photphat khó tan nhờ vi sinh vật.

Cơ chế của quá trình phân giải hợp chất Photphat khó tan đến nay vẫn còn chưađược hiểu đầy đủ và còn rất nhiều tranh cãi trong vấn đề này Sản sinh ra

axit hữu cơ có thể là nguyên nhân chính song C02, H2S, axit, kiềm cũng là các yếu tốđuợc nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến.

1.1.6.1 Phân giải Photphat khó tan do sự tạo thành axit của vi sinh vật [10].

Theo nghiên cứu của Bardia và Gaur( 1972-1974), cho thấy trong quá trình nuôicấy vi sinh vật khi mà pH môi trường bị giảm sút mạnh, lúc đó hàm luợng Photphotan trong môi truờng tâng lên Sau khi nuôi cấy vi sinh vật phân giải hợp chấtPhotphat khó tan nguời ta tìm thấy nhiều axit hữu cơ nhu: Axit axetic, axit focmic,axit glucolic, axit oxalic,axit sucinic, axit malic, axit xitrìc trong môi tnrờng Cácaxit hữu cơ này tác dụng với hợp chất Photphat không tan nhờ sự liên kết với Cation:

Mg+2, Ca"2, AP3 , Fe+3 qua đó tạo nên hợp chất Photpho mới tan trong nuớc

Kapoor (1998), cho rằng phần lớn các chủng nấm sợi có khả năng phân giảimạnh các hợp chất Photphat khó tan là nhờ axit hoá mồi trường, do tạo ra các axithữu cơ,

Goldstein A.H (1996) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxi hoá glucoza sảnsinh ra axit gluconic và 2-ketogluconic có ở vùng xung quanh tế bào vi khuẩn dẫnđến làm tan Ca3(P04)2 của môi trường

1.1.6.2 Sự phân giải Photphat khó tan nhò phản ứng Cacbondioxit (C0 2 và

H 2 S).

Nhiều nghiên cứu trước đây cho rằng C02 sản sinh bởi rễ cây và vi sinh vật cótác dụng phân giải các hợp chất Photphat khó tan Sau đó Goerge (1938) tìm ra ràng:C02 làm tăng cường khả năng tan của Photphat và sử dụng Photpho của cây trồng.Trong quá trình phát triển, cây trồng và vi sinh vật đã tạo ra một lượng lớncacbondioxit Hợp chất này cùng với nước đồng thời tác dụng lên các hợp chấtPhotphat khó tan biến chúng thành dạng dễ tan như phương trình sau [24]:

Ca3(P04)2 +C02 +H20 = 2 CaHP04 + CaC03

Ca3(PƠ4)2 + 2 C02 + 2H20 = Ca(H2PƠ4)2 + 2CaC03

Năm 1958 Sawby và Sperber đã chứng minh rằng vi sinh vật phân huỷaminoaxit chứa Lưu huỳnh hoặc vi khuẩn Lưu huỳnh oxi hoá khử Sulfur hoặc tạo ra

H2S , H2S có khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan như phương trình sau[24]:

H2S + FeS04 = FeS + H2S04

1.2 Nhưng thành tựu nghiên cứu vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan trên thế giới và ứng dụng.

Trên thế giới vấn đề khu hệ vi sinh vật sống dị dưỡng trong đất, vùne: rễ đãđược nghiên cứu khá nhiều Hàng loạt vi sinh vật phân giải lân khó tiêu đã được thuthập và tuyển chọn Đặc biệt có các chủng vi sinh vật có thể pphaan giải tới 70%quặng Photphat thành lân dễ tiêu Khi sử dụng loại phân vi sinh này có thể tiết kiệmđược 50% lượng lân cần bón mà vẫn không thay đổi năng suất chất lượng nông sản.Điều này đã mở ra một triển vọng cực kỳ to lớn cho nhu cầu lương thực toàn cầu Nó

đã khắc phục được tình trạng bế tắc, thiếu hiệu quả của các loại phân bón hoá họctrước đây Theo tài liệu công bố tổ chức lương thực thế giới (FAO) thì để tăng sảnlượng nông sản lên 2- 3 lần thì con người phải tạo ra một lượng phân đạm tăngkhoảng 30 lần, Kali 10 lần Điều đó cho thấy là hết sức tốn kém về công sức và củacải Việc sử dụng các chế phẩm phân vi sinh trong đó có vi sinh vật phân giải lân đãđược sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới như Hoa Kỳ, Canada, Nga, TrungQuốc chế phẩm “Điền lực bảo “ do Trung Quốc sản xuất là loại phân có nhiều giátrị sinh học và thực tiễn Trong mỗi gam phân bón đã phát hiện thấy có chứa tới trên5.109 tế bào vi sinh vật có khả năng chuyển hoá lân khó tan thành dạng dễ tan

Năm 1970 ở Liên Xô đã dùng Bacillus Megatheriumval Photphatium để sản xuất chế phẩm Photphohacterin Chế phẩm này được sử dụng rộng rãi ở Liên Xô và

các nước Đông Âu dùng bón cho lúa mỳ, ngô, lúa nước Kết quả cho thấy sản lượngtăng 5-10% so với đối chứng

Grimer và Mount (1981) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas Putida phân

lập từ đất xung quanh cây họ đậu Phaseollus Vulgaris Các ông tthấy rằng khi bổ

xung p.putida vào đất trồng làm cho cây họ đậu này tạo ra nhiều nốt sần hơn, do đó

tăng khả năng hấp thu Photphat của cây [22]

Năm 1982, Datta và cộng sự đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus

có khả năng phân giải Photphat khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc Ân

Độ Chủng này vừa có khả năng sinh IAA (Inđolactic axit) - là hooc môn sinh trưởngrất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hoá Photphat khó tan [23]

L3 Tình hình nghiên cứu vỉ sinh vật phân giải lân và ứng dụng trong phân bón

vi sinh ở Việt Nam.

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật cố định Nitơ cũng như phângiải Photphat khó tan đã được tiến hành từ những năm 60 Năm 1968 Lê Văn Căn vàĐặng Văn Ngữ đã nghiên cứu một số nấm mốc có khá năng phân giải

Photpho khó tan, trong đó có Aspergiỉlus niger sau 4 tuần nuôi cấy đã chuyển hoá

được 17,2% Photpho tổng số trong Photphorit

Hiện nay, chế phẩm phân hữu cơ vi sinh được công ty Thiên Nông sản xuất lânđầu tiên ở nước ta từ tháng 10-1990 Đó là một dạng chế phẩm bao gồm nhiều loại vikhuẩn được công bố là có khả năng chuyển hoá Photpho vô cơ và nhiều tác dụngkhác Mục tiêu chung của các nhà khoa học Việt Nam là phấn đấu có được nhiềuloại phân bón sinh học tốt, để có thể giảm dần việc sử dụng phân hoá học trên đồngruộng đó cũng là mong muốn của những người làm nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu về phân lân vi sinh trong khuôn khổ đề tài cấp nghành màViện Khoa Học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992 - 1995 cho thấy sửdụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế được 30-35% lượng lân vô cơ cần bónbằng quặng Photphorit mà năng suất cây trồng không thay đổi [17]

Nguyễn Hoài Hà và cộng sự (1960 )[8], đã phân lập từ đất trồng ngô ngoại thành

Hà Nội được 100 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải Photphat khó tan, trong đó

có 52% phân giải yếu (D-d <5 mm), 45% phân giải trung bình (D-d =5- 10 mm) và3% có khả năng chuyển hoá tốt ( D - d >10 ram ) Ba chủng mạnh có khả năngchuyển hoá được >41% quặng Photphorit

Nghiên cứu của Nguyễn Phương Chi và cộng sự (1998), Viện CNSH đã lựa

chọn chủng Aspergỉllus awamori Nakazawa MN1 [11] Chủng này đã chuyển hoá

được 84,7% P2Os sang dạng dễ tiêu từ quặng Photphorit chứa 20% P205 Mặt khác,chủng này cũng chuyển hoá được quặng Apatit chứa 25% Pi05 sang dạng dễ tan, tuy

nhiên ở mức độ nhỏ hơn (61,5%) Do đó chủng A.awmori Nakazawa MNI được sử

dụng làm phân lân vi sinh, giúp cây trồng sử dụng Photphat hữu cơ hữu hiệu hơn.Trone khuôn khổ đề tài cấp nhà nước, KHCN 02-04 giai đoạn 1996-1998 do GS-

TS Lê Văn Nhương TTCNSH-Đại học Bách Khoa làm chủ nhiệm, các cán bộ khoa

học, đã phân lập và nghiên cứu chủng nấm sợi Aspergills japonicus VTCCN n \ừa có

khả năng phân giải Photphat khó tan vừa có khả năng phân giải Xenluloza Chủngnấm sợi này, có thể chuyển hoá 18,4% P205tan từ quặng Photphorit, 6,6% từ quặngApatit và 18,84% từ Ca3(P04)2 Chủng nấm sợi trên đã được sử dụng để tạo chế phẩmphân vi sinh vật [12]

Đề tài Khoa học cấp nhà nước KHCN 02 - 06 giai đoạn 1996- 2000 do TS PhạmVăn Toản Viện Khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp chủ nhiệm, đã nghiên cứu hàng loạtchủng giống vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ, phân giải Photphat phục vụ choNông Nghiệp Đề tài đã xây dựng quy trình chế phẩm vi sinh vật phân giải hợp chất

Photphat khó tan từ nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn

pseudomonas Sản phẩm được chứng minh có tác dụng tốt đối với sự sinh trưởng,

phát triển của ngô và lúa [17]

1.3.1 Tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh vật phân giải Photphat khó tan ở Việt Nam

1.3.1.1 Các loại phân lân vi sinh

Hiện nay trên thị trường phân lân vi sinh thường được chia làm hai nhóm sau:

+ Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng

Quy trình sản xuất phân vi sinh trên nền chất mang thanh trùng được thể hiệnthông qua sơ đồ 2 Các loại phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng có mật

độ vi sinh vật hữu hiệu lớn từ 10s- 10 9tế bào / gam, vi sinh vật tạp ít Sử dụng phânbón vi sinh vật này để nhiễm vi sinh vật vào hạt, tưới vào gốc cây non Hiệu quả củaphân dựa trên năng suất và phẩm chất của nông sản [14]

Sơ đồ 2: Quv trình sản xuất phân lân vi sinh vật trên nền chất mang

thanh trùng [14]

Vi sinh vật phân giải

Nhân sinhkhối

Xử lý tiềmsinh

Đóng gói bảo quản, sửdụng

+Phân lân vi sinh vật trên nên chất mang không thanh trùng

Phân lân vi sinh được sản xuất trên nền chất mang không thanh trùng cómật độ vi sinh vật hữu ích thấp chỉ khoảng 106-108 tế bào /gam và vi sinh vật tạp khácao Hiệu quả của phân bón dạng này thường dựa trên các chất dinh dưỡng có trongchất mang Chất mang ở đây thường là các chất hữu cơ: than bùn, phế thải nôngnghiệp, rác thải thành phố và các chất vô cơ khó tiêu: Apatit, Photphorit, bột đávôi Các loại chất mang hữu cơ thường được ủ háo khí hay yếm khí tuỳ

xưởng Cuối hạnbảo hành Khi xuấtxưởng Cuối hạnbảo hành

1 Vi sinh vật phân giải

Cho đến nay, có nhiều nhà sản xuất phân lân hữu cơ vi sinh như: Phân hữu

cơ Thiên Nông, phân lân sinh hoá hữu cơ Komlx của công ty hoá sinh nông níĩhiệp

và thương mại Thiên Sinh, phân sinh hoá hữu cơ Biomix của công ty phân bón hoáchất Kiên Giang, Biofer của Hội Phân Bón Việt Nam đều sản xuất phân lân vi sinhnhưng số lượng không nhiều, hiệu quả chưa thật ổn định, giá thành đắt, khó khăn vềbảo quản và vận chuyển hơn nữa không phải bón cho vùne đất nào cũng phù hợp vàcho hiệu quả cao [14]

Mặt khác thành phần, số lượng , hoạt tính của các vi sinh vật phân giải hợp chấtPhotphat khó tan trong các mẫu đất ở các vùn2 địa lý khác nhau cũng rất khác nhau[17] Bởi vậy, việc tìm kiếm và bổ xung các vi sinh vật phân giải lán khó tan từ cácvùng đất có khí hậu và điều kiện địa lý đặc thù, để đưa vào ứng dụng trong thực tế

mà có hiệu quả là điều rất cần thiết, đòi hỏi các nhà nghiên cứu quan tâm và đầu tư

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứư.

II 1 Vật liệu và thiết bị:

11.1.1 Vật liệu.

11.1.1.1 Chung vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất

trồng ngô, lúa, đậu tương và đất vườn trên địa bàn Hà Nội

11.1.1.2 Giông cây trồng thí nghiệm đỏi với chủng vi sinh vật phân giải lân khó tiêu,

Sử dụng giống đậu tương DT84 do bộ môn giống cây trồng Trường Đại họcNông Nghiệp cung cấp

II 1.2 Thiết bị thí nghiệm.

Thiết bị được sử dụng của phòng các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật-Viện CNSH

Nồi khử trùng ướt (Trang Quốc)

Nổi khử trùng khô (Trang Quốc)

Máy đo pH Mettler Toledo -320 (Nhật)

Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật)

Máy lắc do Viện Khoa học Việt Nam chế tạo 220 vòng /phút

Tủ ấm (Trung Quốc)

Cân phân tích ADNHR- 200 (Nhật)

Máy đo độ đục Novaspec II (Pharmacia- Thuỵ Điển)

Và các dụng cụ khác phục vụ cho thí nghiệm: Micro pipetống nghiệm,bình tam giác, hộp Petri do Trang Quốc và Đức sản xuất

II.2 Môi trường nuôi vi sinh vật phân giải Photphat.

II.2.1 Môi trưòng Pikovskaya [27,6] (dùng phân lập giữ giống và nghiên cứu khả

nâng phân giải photphat của các chủng vi sinh vật)

II 2.2 Môi trường Pikovskav lỏng: dùng để nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến

khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phân giải lân khó tiêu

11.2.3 Môi trường nước chiết đất.

Cân 1.5kg đất (đất Cổ Nhuế) +1000 ml nước máy, hoà đều rồi đem đun sôitrong 30- 40 phút Để lắng rồi gạn ra và ly tâm bỏ cặn Phân phối vào các bình tamgiác và đem khử trùng ở 1 atm / 45 phút

11.3 Phương pháp nghiên cứu.

II 3.1 Phương pháp lấy mẫu.

Dùng thìa vô trùng lấy đất ở vùng bể mạt ( độ sâu từ 2-5 cm ) cho vào bìnhtam giác, túi nilon sạch Mỗi khu đất thường lấy từ 8-10 vị trí khác nhau,mỗi vị trílấy từ 10-15g đất, buộc kín hoặc đậy nút và ghi lý lịch, ngày lấy mẫu

II.3.2 Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa [6].

Các mẫu đất lấy ở mỗi địa điểm khác nhau được trộn đều Cân mỗi mẫu đấtlOg cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng lắc thật đều Sau đó pha loãngliên tục bằng nước vô trùng sao cho đạt đến độ pha loãng từ 10'-107

- Dùng Pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch từ ống nghiệm có độ pha loãngnhất định nhỏ lên bề mặt môi trường thạch đĩa Thông thường ta lấy dịch ở độpha loãng 102, 10\ 105, và 107,

- Dùng que trang thuỷ tinh dàn đều dịch vừa nhỏ lên bề mặt thạch saocho bề mặt thạch thật khô Các thao tác làm trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ Box

để tránh nhiễm vi sinh vật

Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 25-30'C từ 3- 5 ngày vi sinh vật phát triểnthành các khuẩn lạc có vòng phân giải Ca3(P04)2 Mỗi khuẩn lạc khác nhau về mặthình thái được coi là một chủng vi sinh vật

- Cấy truyền vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng, giữ ở

tủ ấm 3- 5 ngày Khi các chủng vi sinh vật đã phát triển dày kín mặt thạch ởtrong ống nghiệm thì cất giống vào tủ lạnh ỏ nhiệt độ 4°c.

II 3.3 Phương pháp giữ giông [6 ].

Các chủng vi khuẩn có thể giữ ở 4- 5°c trong tủ lạnh khoảng 2- 3 tháng Cấytruyền định kỳ trên các môi trường tương ứng, hai tháng một lần

n 3.4 Phương pháp đếm số lượng tế bào

Số lượng tế bào sống trong các cơ chất phân lập trên môi trường dinh dưỡngđặc, được biểu thị bằng đơn vị CPU (colony foming Unit) 1 CFƯ là 1

khuẩn lạc phát triển từ một tế bào (hay bào tử) lúc đầu , của một loại vi sinh vật trênmôi trường dinh dưỡng trong đĩa thạch mà mắt thường ta quan sát được.

Cách đếm: Tiến hành pha loãng như phương pháp phân lập trên môi trườngthạch đĩa Sau khi nuôi cấy một thời gian thích hợp (3- 5 ngày) ở 30°c trong tủ ấm,lấy ra đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong một đĩa Petri, từ đó tính ra

số lượng tế bào trong lg ( hay lml) cơ chất theo công thức:

N = a.b.c

Trong đó : N: Tổng số CFU trong lg (lml) cơ chất đem phân tích

a: Số CFU trung bình đếm được trên một đĩa Petri (số tế bào trên0,1 ml dịch mầu phân tích ở độ pha loãng b)

b: độ pha loãngc: Số lượngvi sinh vật trong lml dịch ở độ pha loãng b

Số khuẩn lạc trên dĩa Petri được coi là tốt để tính CFU nếu khi lấy 0,lml dịchpha loãng mẫu trên môi trường có khoảng 5- 100 khuẩn lạc Nếu sô lượng này nhỏhơn 5 thì kết quả loại bỏ

II 3.5 Phương pháp xác định khả năng phân giải Ca 3 (P0 4 ) 2 [12].

- Cấy chấm điểm vi sinh vật đã phân lập được trên môi trường thạch đĩaPikovskaya

- Theo dõi khả năng hình thành vòng phân giải của các chủng vi sinh vậttrong thời gian 3- 7 ngày

- Vi sinh vật có hoạt tính phân giải sẽ tạo thành vòng tròn trong suốtxung quanh khuẩn lạc còn vùng chưa phân giải có màu đục hơn

- Hoạt tính phân giải được đánh giá bằng hiệu số D - d (mm) trong đó D

là đường kính vòng phân giải, d là đường kính của khuẩn lạc vi sinh vật

II 3.6 Quan sát hình thái tê bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram và nhuộm đơn giản.

II 3.6.1 Phương pháp nhuộm đơn giản.

- Mục đích: Quan sát đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn

Làm tiêu bản

Lấy phiến kính sạch, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn

Nhỏ một giọt nước vô trùng lên phiến kính.

Khử trùng que cấy Dùng que cấy lấy ít vi khuẩn trong ống thạch nghiêng,đưa vào giọt nước trên phiến kính, giàn đều một lớp mỏng có diện tích 1- 2 cnr

Cố định vết bôi: Hơ nhẹ phía dưới vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn

Tiến hành nhuộm:

Nhuộm vết bôi bàng cách nhỏ vài giọt thuốc Saĩrarin giữ trong 1 - 2 phút.Rửa nước

Làm khô tiêu bản

Đem quan sát bằng vật kính dầu

II 3.6.2 Phương pháp nhuộm Gram.

Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm đặc biệt do nhà khoa học ĐanMạch Chriatian Gram tìm ra năm 1884 Muc đích của phương pháp này là xác địnhđược chủng là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-), để có thể phân biệt sự khác nhaugiữa các loại vi khuẩn giống nhau về hình thái và kích thước

Phương pháp nhuộm Gram được tiến hành như sau:

Làm vết bôi (giống như nhuộm đơn)Nhuộm bằng tím gential lên vết bôi giữ trong 1-2 phútNhỏ dung dịch lugol bằng cồn 95° trong 30-40 giâyRửa bằng nước máy, để khô

Nhỏ fucsin lên vết bôi, giữ từ 1-2 phútRửa nước, làm khô

Quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu Tế bào vi khuẩn Gram(+) bắt mầu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt mầu theo màu của thuốc nhuộm bổsung (mầu đỏ hồng của íucsin)

n.3.7 Phương pháp nhuộm bào tử của Miler.

Mục đích: xác định được tế bào của chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử haykhông Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm bào tử của Miler

Làm vết bôi, cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn

Nhỏ dung dịch axit HC1 1% (hoặc phenol 5%) trong 1-2 phút

Rửa nước làm khô tiêu bản.

Nhuộm fucsin ziel trong 1-2 phút Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đếnkhi thấy bốc hơi

Để nguội, rửa sạch

Dùng cồn 33° hayH2S04 tẩy mầu cho đến khi hầu như không còn mầuhổng đỏ nữa ( khoảng 1- 2 phút)

Rửa nước, nhuộm lại bằng xanh Metylen - loeffler trong lphút

Rửa nước, làm khô Khi quan sát tế bào vi khuẩn sẽ nhuộm mầu xanh,còn bào tử bắt mầu hồng đỏ ( mầu của fucsin ziel)

II 3.8 Phương pháp xác định các yêu tô ảnh hưởng đến sự sinh trương và phát triển của chủng vi khuẩn phân giải Photphat.

11.3.8.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu

Chủng vi khuẩn phân giải photphat được tuyển chọn, cấy vào bình tam giácchứa 100ml môi trường Pikovskaya đã được điều chỉnh các độ pH khác nhau: 4 ; 5 ;

6 ; 7 ; 8

Nuôi cấy trên máy lắc ( 220 vòng/ phút ), nhiệt độ 30°c trong 60 giờ Xácđịnh khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng bằng cách đo độ đục OD ở bướcsóng 560 ran trên máy so màu

11.3.8.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau.

Sử dụng 1% các nguồn cacbon khác nhau là: sacaroza, rỉ đường và tinh bột để

thay thế lần lượt cho glucoza trong lOOml dịch lỏng Pikovskaya

Nuôi trên máy lắc t 220 vòng/ phút) trong 60 giờ ở 30°c Cứ sau 12 giờ lại đo

OD một lần để xác định sinh khối

II 3.8.3 Ảnh hương của nguồn nitơ khác nhau.

Chủng vi khuẩn được tuyển chọn nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 100 mlmôi trường Pikovskaya với 1% các nguồn nitơ khác nhau là: (NH4)2S04, NaN03,pepton, Ure.Nuôi cấy trên máy lắc (220 vòng/phút) trong 60 giờ Cứ 12 giờ lại tiếnhành đo OD một lần trên máy so màu ở bước sóng 560 nm

II 3.8.4 Ảnh hưửng của nhiệt độ khác nhau.

Sử dụng môi trường lỏng Pikovskaya có pH = 7 Sau đó cấy chủng vi khuẩntrong các ống nghiệm chứa mồi trường đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ