Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ.

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ ...37 4.1.1.. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích

PHẠM VĂN ĐẠI

Đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TRÍCH LY HOẠT CHẤT SINH HỌC DITERPENOID TỪ NẤM ĐẦU KHỈ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm

Khoa : CNSH & CNTP

Khóa : 2010 - 2014

Giảng viên hướng dẫn : 1 ThS Nguyễn Đức Tiến

(Viên Cơ điện Nông nghiệp & Công nghệ sau thu hoạch)

2 ThS Trần Thị Lý

(Khoa CNSH & CNTP - Trường ĐH Nông lâm Thái Nguyên)

Thái Nguyên, năm 2014

trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã

được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ

nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Phạm Văn Đại

Công nghệ sau thu hoạch dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Đức Tiến - Viện

Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và Th.S Trần Thị Lý - Khoa Công sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn của các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bè

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Lý - Khoa Công nghệ thực phẩm

- Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, động viên, hỗ trợ phương

tiện nghiên cứu, kiến thức và đã có những góp ý sâu sắc trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm

và Môi trường nông nghiệp - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu

hoạch đã hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè đã là nguồn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu những lời cảm ơn chân thành nhất

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Phạm Văn Đại

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Phân 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về nấm Đầu Khỉ 3

2.1.1 Khái niệm và phân loại nấm Đầu Khỉ 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của nấm Đầu Khỉ 4

2.1.3 Thành phần hóa học của nấm Đầu Khỉ 5

2.1.4 Hoạt chất sinh học và tác dụng của nấm Đầu Khỉ 6

2.2 Giới thiệu về hoạt chất sinh học Diterpenoid 9

2.2.1 Khái niệm Diterpenoid 9

2.2.2 Hoạt tính sinh học của Diterpenoid 11

2.3 Trích ly các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ 13

2.3.1 Cơ sở khoa học của quá trình trích ly 13

2.3.2 Phương pháp trích ly 13

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 15

2.3.4 Một số quá trình xảy ra trong quá trình trích ly 17

2.4 Thu nhận các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ 19

2.4.1 Cô đặc 19

2.4.2 Sấy thu nhận sản phẩm 20

2.5 Các sản phẩm chế biến từ nấm Đầu Khỉ 20

2.6 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới và Việt Nam 21

2.6.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới 21

2.6.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu về nấm Đầu Khỉ ở Việt Nam 23

3.1.1 Đối tượng 25

3.1.2 Hoá chất và thiết bị 25

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý 26

3.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 28

3.4.3 Quy trình công nghệ trích ly và thu nhận Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 28 3.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 37

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 37

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 39

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 39

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 40

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 42

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng các thông số trích ly tới hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 44

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiểu quả trích ly Diterpenoid 44

4.3.2 Nghiên cứu ảnh của hưởng nhiệt độ trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 46 4.3.3 Nghiên cứ ảnh hưởng của thời gian trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 47

4.3.4 Nghiên cứ ảnh hưởng của số lần trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 49

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g nấm Đầu Khỉ khô .6

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly Diterpenoid 37

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 39

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 41

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 42

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiểu quả 44

trích ly Diterpenoid 44

Bảng 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 46

Bảng 4.7 Ảnh hưởng thời gian trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 47

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của số lần trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 49

Bảng 4.9 Ảnh hưởng nhiệt độ cô đặc đến quá trình thu nhận chế phẩm Diterpenoid 50

Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả

trích ly Diterpenoid 38

Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 40

Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 41

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liêu/dung môi tới hiệu quả 43

trích ly Diterpenoid 43

Đồ thị 4.5 Ảnh phương pháp trích ly đến hiểu quả trích ly Diterpenoid 45

Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 46

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng thời gian trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 48

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của số lần trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid 49

Hình 1.1 Nấm Đầu Khỉ 3

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Erinacines Diterpenoid (A – I) trong nấm Đầu Khỉ 11 Hình 2.2 Nấm hầu thủ dạng viên nang .21

Hình 2.3 Nấm hầu thủ dạng khô 21

Sơ đồ 3.1 Quy trình dự kiến trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 28

Sơ đồ 4.1 Quy trình quy trình trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ 52

HPA : Hericium Polysaccharides A

HPB : Hericium Polysaccharides B

GC-MS : Gas Chromatography Mass Spectometry (Sắc kí ghép khối phổ)

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, nhu cầu về thực phẩm không chỉ dừng lại ở những yêu cầu về số lượng, chất lượng mà hướng tới tính an toàn, khả năng phòng và chữa bệnh Vì thế xu hướng thực phẩm chức năng đang rất được quan tâm Thực phẩm chức năng là thực phẩm có thể cải thiện tình trạng sức khỏe và làm giảm nguy cơ mắc bệnh, do chứa những thành phần có hoạt tính sinh học cao Các hoạt chất sinh học này có thể được tách chiết từ các nguồn gốc khác nhau như động vật, thực vật, vi sinh vật Trong đó việc tách chiết các hoạt chất sinh học từ thực vật

và đặc biệt là các loại nấm ăn hiện đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm

Từ nhiều thế kỷ qua nấm ăn được biết đến như một nguồn thực phẩm bổ dưỡng có lợi cho sức khỏe Nấm ăn là loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịt, nó có rất ít chất béo, cung cấp ít năng lượng nhưng lại rất giàu protein và acid amin

Trong các loại nấm ăn hiện nay được quan tâm hơn cả là nấm Đầu Khỉ (Hericium

erinaceum) Từ lâu, tại Trung Quốc và Nhật Bản nấm Đầu Khỉ đã được biết tới như

là loại thực phẩm bổ dưỡng được nhiều người ưa chuộng Nấm Đầu Khỉ chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao (β-glucan, ergosterol và Diterpenoid erinacine A đến I…) có tác dụng rất tốt trong việc hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh viêm loét dạ dày, ung thư dạ dày, ung thư thực quản Nấm có tác dụng tốt lên hệ thần kinh, cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi, tăng cường hệ miễn dịch, nâng cao sức đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi, lưu thông tuần hoàn máu…[6;7] Vì vậy, các nhà khoa học hiện nay đang nghiên cứu xoay quanh về các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ Đặc biệt là nhóm hoạt chất sinh học Diterpenoid có tác dụng tốt trên bệnh Alzeimers, ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các neuron thần kinh

Với lợi thế là một nước nông nghiệp có nguồn phụ phẩm giàu chất xơ (cellulose), chất gỗ (lignin) hết sức phong phú, đồng thời có nhiều vùng khí hậu nên

có thể trồng nấm quanh năm với hàng chục loại nấm ăn và dược liệu, thị trường tiêu

thụ nấm rộng lớn Mặc dù vậy, nấm Đầu Khỉ vẫn còn khá mới đối với người dân nước ta, nhất là những sản phẩm mang tính tiện lợi có bổ sung các hoạt chất sinh học từ nấm như: Sử dụng làm đồ uống, chiết xuất thành dạng viên nang, ứng dụng trong sản xuất trà túi lọc, trà hòa tan… Hiện nay, trên thị trường Việt Nam những sản phẩm từ nấm Đầu Khỉ chủ yếu dưới dạng khô và dạng bột từ quả thể nấm, vừa không tiện dụng lại hiệu quả kinh tế thấp

Để tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có và những tác dụng ưu việt của nấm

Đầu Khỉ chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ

trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ”

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ

1.2.2 Yêu cầu

Xác định được ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích

ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

Xác định được ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

Xác định được ảnh hưởng các thông số trích ly (nhiệt độ, thời gian, số lần trích ly) đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

Lọc, cô dịch trích ly và thu nhận chế phẩm Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ Xây dựng được quy trình trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid trong nấm

Đầu Khỉ

Phân 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về nấm Đầu Khỉ

2.1.1 Khái niệm và phân loại nấm Đầu Khỉ

Nấm Đầu Khỉ có tên khoa học là Hericium erinaceus là một loài nấm ăn

được và được sử dụng làm dược liệu thuộc họ Hericiaceae Nấm Đầu Khỉ còn có

tên gọi khác là nấm Hầu Thủ, nấm Lông Nhím [1]

Hình 1.1 Nấm Đầu Khỉ

Nấm Đầu Khỉ là loại nấm có kích thước lớn Quả thể nấm Đầu Khỉ thường hình cầu hoặc hình ellip, mọc riêng rẽ hoặc thành chùm, có tua nấm dày đặc, rũ xuống như đầu khỉ, lúc già tua dài và chuyển sang màu vàng trông như bờm sư tử (Hình 1.1)

Theo phân loại thực vật, vị trí của nấm Đầu Khỉ trong giới nấm được phân loại như sau [7]:

Thuộc Giới (kingdom): Mycota (Fungi)

Chi (Genus): Hericium

Loài (Species): Hericium erinaceum

Qua nghiên cứu có 9 loài thuộc chi Hericium [6;7]:

1 Hericium erinaceum (Bull.) Pers

2 Hericium ramosum (Bull.) Letell

3 Hericium flagellum (Scop.) Pers

4 Hericium abietis (Weir.) Harrison

5 Hericium caputmedusa

6 Hericium cirrhatum (Fr.) Nikol

7 Hericium laciniatum (Leers) Banker

8 Hericium clathroides (Palles.) Pers

9 Hericium caput-ursi (Fr.) Corner

Theo hệ thống phân loại cổ điển, cho đến giữa thế kỷ 20, dựa vào đặc trưng

hình thái học đại thể (macromorphology), người ta vẫn xếp các nấm có thể dạng tua gai vào cùng một nhóm Trước đây chi Hericium được xếp vào họ Hydnaceae [6]

Về phương diện phân loại học, năm 1964 Donk đã xác lập họ nấm tua

Hericiaceae với chi chuẩn là Hericium và xếp vào họ Hericiaceae trong bộ Cantharellales Đến năm 1981, Julich đã nâng lên thành bộ Hericiales, tách biệt với

bộ Cantharellales

2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của nấm Đầu Khỉ

Quả thể Nấm Đầu Khỉ thường hình cầu hoặc hình ellip, mọc riêng rẽ hoặc thành chùm, không phân nhánh có kích thước 5 - 20cm Nấm Đầu Khỉ có nhiều sợi dài dạng lông dày đặc, rũ xuống như đầu khỉ, lúc già tua dài và chuyển sang màu

vàng trông như bờm sư tử Các tua nấm chính là tổ chức bào tầng (Hymenium) [9]

Quả thể non tua ngắn, mỏng manh, khi trưởng thành tua dài 0,5 - 3cm,

đường kính từ 1,8 - 3mm Quả thể khi non có màu trắng đến trắng ngà, thịt màu

trắng, khi già nấm ngả sang màu vàng đến vàng sậm Quả thể cắt dọc mô thịt có màu trắng kem, khi để lâu ngoài không khí ngả sang màu nâu đến nâu vàng, có hương thơm dễ chịu [9]

Nấm Đầu Khỉ có khả năng sống trên thân cây khác Nó vẫn có thể tồn tại khi vật chủ đã chết hoặc đã bị mục nát Nấm Đầu Khỉ không thể tự sản xuất được thức

ăn riêng của nó mà lấy chất dinh dưỡng từ vật chủ Nấm Đầu Khỉ chỉ phát triển được ở những nơi khí hậu mát mẻ Nhiệt độ thích hợp để nấm phát triển là 16 -

200C, nhiệt độ cao nhất có thể trồng được là 19 - 220C [9]

Nấm Đầu Khỉ được tìm thấy châu Âu, châu Á, Bắc Mỹ và trong suốt vĩ độ Bắc ôn đới Theo ghi nhận của các nhà khoa học thì nấm xuất hiện ở 435 địa phương

ở 23 quốc gia châu Âu và có trong sách đỏ của 13 các quốc gia như Anh, Pháp… Ở

một số nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản loại nấm này lại khá phổ biến được

sử dụng như một loại nấm ăn và dược liệu Tại Việt Nam nấm Đầu Khỉ được trồng thử nghiệm ở nhiều nơi, chủ yếu là những vùng có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, Lâm

Đồng Việc nuôi trồng ở những địa phương khác như Hà Tĩnh, Hải Phòng, Hưng

Yên, Hà Nội trong môi trường được quản lý chặt chẽ về nhiệt độ [9]

Đối với một số loại nấm trong họ Hericium như Hericium cirrhatum,

Hericiumcoralloides được tìm thấy trên thực vật hạt kín, nhưng nấm Đầu Khỉ

(Hericium erinaceum) lại mọc trên cây hạt trần Ở Anh hầu hết các nghiên cứu cho

thấy nấm Đầu Khỉ chủ yếu mọc trên gỗ cây lá rộng, đặc biệt là cây sồi chiêm 80%

(Fagus sylvatica) và thường mọc thành từng đám lớn Nấm Đầu Khỉ có thể sinh

trưởng trên thân cây hoặc cành lớn, với đường kính > 10cm Nấm Đầu Khỉ sinh trưởng và phát triển từ cuối tháng 8 đến tháng 12 [6]

2.1.3 Thành phần hóa học của nấm Đầu Khỉ

Các nghiên cứu cho thấy nấm Đầu Khỉ là loại thực phẩm bổ dưỡng, có mức cung cấp năng lượng vừa phải, thành phần dinh dưỡng cân đối, giầu chất khoáng và vitamin Tuy nhiên ở các điều kiện nuôi trồng khác nhau cũng sẽ có chất lượng của chúng cũng khác nhau về thành phần dinh dưỡng, hàm lượng acid amin… Các kết quả phân tích về thành phần của nấm Đầu Khỉ trồng tại các nước khác nhau trên thế giới được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g nấm Đầu Khỉ khô [5;19]

Nấm Đầu Khỉ khá phong phú về nguồn khoáng chất, với hàm lường P chiếm tỷ

lệ cao Các loại vitamin trong nấm Đầu Khỉ cũng rất phong phú, đặc biệt là vitamin PP

và D chiếm tỷ lệ khá cao.Thành phần amino acid cũng có giá trị cân đối về dinh dưỡng,

đặc biệt trong nấm Đầu Khỉ có sự hiện diện đầy đủ của 7 trong số 16 loại acid amin

thiết yếu cần cho cơ thể động vật [2]

2.1.4 Hoạt chất sinh học và tác dụng của nấm Đầu Khỉ

2.1.4.1 Hoạt chất sinh học trong nấm Đầu Khỉ

Từ lâu nấm Đầu Khỉ đã được biết tới như là loại thực phẩm bổ dưỡng được nhiều người ưa chuộng Đặc biệt nấm Đầu Khỉ chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng rất tốt trong việc hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh viêm loét

dạ dày, ung thư dạ dày, ung thư thực quản, cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi, tăng cường hệ miễn dịch, nâng cao sức đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi, lưu thông tuần hoàn máu… [12] Cho đến nay đã thống kê

được hàng chục hợp chất hữu cơ có trong nấm Đầu khỉ như: Diterpenoid, Acid

amin, Polysaccharides, Peroxide, nguyên tố vi và đa lượng Gần đây các phương pháp phân tích đã chứng minh được trong nấm Đầu Khỉ có các hoạt chất chính sau:

a Nhóm Polysaccharides:

Các Polysaccharides của nấm Đầu Khỉ như: xylan, glucoylan, heteroxyglucan

và phức hợp protein của chúng có các đặc tính cải thiện đáp ứng sinh học, có lợi

cho khả năng miễn dịch Trong nghiên cứu thực nghiệm kháng ung thư của Polysaccharides ở nấm Đầu Khỉ có 5 loại Polysaccharides được phân lập là Flo-a-α; Flo-a-β; Flo-b; FIIo-1 và FIII-2b có hoạt tính kháng ung thư và tác dụng kéo dài thười gian sống [19] Polysaccharides trích ly từ nấm Đầu Khỉ rất phong phú, trong

đó hợp chất chính có hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch là 1,3; 1,6- β-Glucan:

- Beta 1,3/1,6 D glucan

Beta Glucan D đã được khẳng định chức năng hạn chế tăng trưởng của vi khuẩn hình xoắn ốc, đẩy nhanh cicatrisation áp xe, kháng ung thư dạ dày và niêm mạc ruột Hiện nay, tại Nhật Bản chế phẩm chứa Beta Glucan D đã được phổ biến rộng rãi như 1 loại thuốc phòng chống ung thư [10]

b Nhóm Diterpenoid (Erinacine H & I)

Theo Eun Woo Lee và cộng sự (2000), đã nghiên cứu Diterpenoids erinacines H

và I được phân lập từ nấm Đầu Khỉ có tác dụng tốt đối với hệ thống thần kinh trong chống bệnh Elzheimer Cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu quang phổ Erinacine H cho thấy hoạt động kích thích sinh tổng hợp yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF - nerve growth factor) của các tế bào hoạt động astroglial của chuột Số NGF (31,5 ± 1,7 pg/ml) tiết vào môi trường với sự có mặt 33,3 mg/ml erinacine H lớn hơn năm lần so với trường hợp không cung cấp hợp chất này [11]

c Nhóm Alcaloid

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản

ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng Các alcaloid ở

dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol

và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: Cloroform, eter, benzen

Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược Các alcaloid có tác dụng tốt lên hêh thần kinh, tác dụng tri ung thư [14]

2.4.1.2 Tác dụng của nấm Đầu Khỉ

Các thí nghiệm về độc tính của nấm Đầu Khỉ được nghiên cứu kỹ và cho thấy cả quả thể lẫn sợi nấm đều không hề có độc tính đối với người, không những vậy mà nấm

Đầu Khỉ còn thể hiện những tác dụng dược lý vượt trội so với một số loài nấm khác [2]

Nấm Đầu Khỉ là nguồn nguyên liệu quý để sản xuất một số loại dược phẩm phục vụ sức khỏe con người Bởi nấm Đầu Khỉ có tác dụng ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các noron thần kinh, tăng cường hệ miễn dịch và đặc biệt hiệu quả với các bệnh nhân ung thư phổi di căn Polysaccharides chiết xuất từ nấm có hiệu quả chống ung thư dạ dày, thực quản và ung thư da [16]

Y học cổ truyền Trung Quốc cho rằng nấm Đầu Khỉ tính bình, vị ngọt, chuyên chữa trị rối loạn tiêu hóa, suy nhược thần kinh, loét dạ dày, nó vừa là món

ăn bổ dưỡng vừa là thuốc bổ quý hiếm, có công hiệu “trợ tiêu hóa, lợi ngũ tạng” cho

cơ thể Sử dụng nấm Đầu Khỉ đặc biệt có lợi cho người già và những người cơ thể suy nhược Y học hiện đại đã chứng minh được rằng nấm Đầu Khỉ là dược liệu tốt giúp trị liệu các bệnh về hệ thống tiêu hóa và khống chế cơn đau dạ dày Dùng nấm Đầu Khỉ chế thành dược phẩm đối với các bệnh về đường tiêu hóa như viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày hành tá tràng … hiệu quả đến 85,2% [2]

- Tác dụng trên hệ tiêu hóa

Trong lâm sàng, các bác sĩ Trung Quốc đã sử dụng rộng rãi nấm Đầu Khỉ để điều trị các bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng, viêm loét ruột, co thắt dạ dày và các bệnh đường tiêu hóa khác Có nghiên cứu thực hiện trên 227 bệnh nhân, có bệnh từ 2 năm trở lên, có hiệu quả đạt tới tỷ lệ 85,2% - 92,5% Đặc biệt ở Trung Quốc người ta đã dùng để điều trị ung thư dạ dày, kể cả trường hợp điều trị bằng hóa chất không hiệu quả [21]

- Tác dụng trên hệ thần kinh

Theo Eun Woo Lee và cộng sự (2000), đã nghiên cứu và kết luận nấm Đầu Khỉ có tác dụng tốt trên bệnh Alzeimers, ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các neuron thần kinh [11]

Theo Muzino và cộng sự (1998), đã nghiên cứu cho thấy nấm Đầu Khỉ có một số hợp chất có khả năng sinh tổng hợp yếu tố tăng cường thần kinh có khả năng

điều kiển bệnh Alzheimer như: Hericinone, hericinone D, hericinone E [19]

- Tăng cường hệ miễn dịch và chống lại tế bào ung thư

Theo Kim và cộng sự (2011), đã nghiên cứu tác dụng chống khối u của các chất chiết xuất của nấm Đầu Khỉ trên chuột thực nghiệm được cấy ghép các tế bào ung thư ruột, chế phẩm β-glucan thu được bằng trích ly trong nước và trích ly trong nước bằng vi sóng, được tiêm hàng ngày trong 2 tuần, đều cho thấy giảm đáng kể trọng lượng khối u là 38 và 41%, tương ứng [16]

- Tác dụng ngăn chặn quá trình lão hóa, giúp cơ thể tráng kiện

Theo Eun Woo Lee và cộng sự (2000), đã nghiên cứu và kết quả cho thấy nấm

Đầu Khỉ có hoạt lực đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi, chống oxy hóa,

chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến việc tuần hoàn máu, chống lão hóa [11] Trong y học cổ truyền Trung Quốc, sử dụng nấm Đầu Khỉ sấy khô chiết bằng nước nóng giúp tăng sức tiêu hóa và làm cho cơ thể cường tráng Các khảo nghiệm về độc tính

đã nghiên cứu kỹ và cho thấy quả thể nấm Đầu Khỉ không hề có độc tính đối với người

2.2 Giới thiệu về hoạt chất sinh học Diterpenoid

2.2.1 Khái niệm Diterpenoid

Diterpenoid là một hợp chất không bay hơi, có bộ khung 20 Cacbon và tuân theo quy tắc isopren trong cấu trúc phân tử Chúng chủ yếu được tìm thấy trong các loài nấm hoặc trong thực vật và bao gồm các acid nhựa và các hocmon sinh trưởng thực vật nhóm gibberellin Đặc tính chung của các Diterpenoid là tan trong các dung môi hữu cơ (eter ethyl, cloroform, ethanol…), không tan trong nước trừ khi chúng kết hợp với đường tạo thành glycosid [11]

Các Diterpenoid có một số nét riêng đặc trưng Sự oxi hoá thường hay xảy ra hơn ở các nhóm trong phân tử và ta thấy xuất hiện nhiều phản ứng tạo ete hoặc lacton Các tương tác giữa các nhóm không liên kết trực tiếp với nhau thường làm cho khung Cacbon bị biến dạng và dẫn tới nhiều chuyển hóa khác nhau Cách gọi tên

và cấu trúc hoá học của chúng rất đa dạng, từ loại khung không vòng cho đến khung

đa vòng giáp nhau

Đa số các Diterpenoid là hợp chất vòng Đối với các Diterpenoid chủ yếu

kiểu đóng vòng điển hình thành các dẫn xuất của perhidronaphtalen và perhidrophenantren Có hai kiểu đóng vòng:

Kiểu 1: Đóng vòng do sự proton hoá nối đôi của đơn vị isopropyliden xuất

phát Kiểu thứ nhất thuộc về cùng dãy lập thể với steroid

Kiểu 2: Nhóm pyrophotphat rời khỏi phân tử cho một cacbacation và khai

Erinacines là Diterpenoid được phân lập từ sợi nấm của nấm Đầu Khỉ Hợp chất này kích thích mạnh mẽ các yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF - nerve growth factor) sinh tổng hợp và tăng catecholamine Erinacine A đên I làm tăng yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) sản xuất trong tế bào nuôi cấy bởi astroglial lớn hơn năm

lần so với kiểm soát Cả hai NGF và catecholamin là yếu tố rất quan trọng cho chức năng bảo vệ tế bào thần kinh NGF cảm ứng tương quan với tốc độ tăng trưởng tế bào thần kinh tự nhiên NGF đã được chứng minh là một phân tử dinh dưỡng thần kinh yêu cầu cho sự sống còn của tế bào thần kinh và ở cả trung ương (não và tủy sống) và hệ thống thần kinh ngoại biên Các nghiên cứu gần đây cho thấy các hợp chất Diterpenoid (Erinacine A đến I) được triết xuất từ nấm Đầu Khỉ có thể cải thiện các bệnh liên quan đến thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer, sa sút trí tuệ tuổi già và suy giảm nhận thức Sau đây là công thức cấu tạo của các Diterpenoid Erinacine A đến I [21;16]

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Erinacines Diterpenoid (A – I) trong nấm Đầu Khỉ 2.2.2 Hoạt tính sinh học của Diterpenoid

Các Diterpenoid có hoạt tính sinh học vô cùng phong phú:

Điển hình là các hocmon sinh trưởng thực vật dãy gibberellin Người ta đã

phân lập và tinh chế được acid gibberellic từ nấm Gibberella fujikuroi tác dụng đặc

trưng cho sự phát triển bình thường của cây

Các acid nhựa thuộc vào số các sản phẩm thiên nhiên xuất hiện với lượng lớn Chúng có tác dụng cố kết các sợi gỗ, đặc biệt là các acid nhựa có nhóm phenolic có hoạt tính kháng sinh nhẹ và bảo vệ cho gỗ khỏi bị vi sinh vật làm mục nát (acid podocarpic và acid ferruginol)

Tuy nhiên, các hoạt động sinh học quan trọng nhất của diterpenoid là kích thích sự tổng hợp các yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) Đây là một tác dụng nổi bật của Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

Yếu tố tăng trưởng thần kinh là một hoạt chất trong não có vai trò thúc đẩy

sự tăng trưởng và phát triển của tế bào thần kinh Yếu tố này đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển và tồn tại của các tế bào thần kinh trong cả hệ thống thần kinh trung ương và ngoại vi NGF thấp hơn so với mức bình thường có thể là dấu hiệu liên quan đến giai đoạn đầu của bệnh Alzheimer và chứng mất trí Deterpenoid erinacine đã thể hiện tiềm năng đáng kể trong việc kích thích tổng hợp NGF, khả năng này như là tác nhân để điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer hoặc bệnh Parkinson [18]

Yamada và cộng sự năm 1997, đã phân lập Diterpenoid erinacines A, B, C,

D, E, F, G, H, I từ sợi nấm của nấm Đầu Khỉ và đưa ra kết luận các Diterpenoid erinacines đã thể hiện được khả năng kích thích sản xuất các yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) trong các thử nghiệm với động vật và là tác nhân điều trị tốt trong

điều trị bệnh Alzheimer và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác [21]

Theo Kawagishi và cộng dự năm 2005, các erinacines là các hợp chất diterpenoid có khả năng kích thích mạnh đối với việc sản xuất NGF và đã được chứng minh làm tăng một số mức độ dẫn truyền thần kinh và làm tăng mức độ NGF trong não của những con chuột thí nghiệm được liều erinacines là 0,023 mg/g [15]

Một nghiên cứu lâm sàng gần đây tại Nhật Bản với một nhóm người là phụ

nữ độ tuổi 50 - 80 được chẩn đoán suy giảm nhận thức nhẹ và được điều trị với chế phẩm diterpenoid được phân lập từ nấm Đầu Khỉ Các kết quả của nghiên cứu cho thấy các đối tượng trong nhóm điều trị đã cải thiện đáng kể chức năng nhận thức ở thời gian 8, 12, 16 tuần và sự cải thiện này kéo dài không quá 4 tuần sau khi ngừng

sử dụng chế phẩm Điều này cho thấy các Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ có khả năng điều trị bệnh suy giảm nhận thức nhẹ [17]

2.3 Trích ly các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ

2.3.1 Cơ sở khoa học của quá trình trích ly [4]

Trích ly là dùng những dung môi hòa tan các chất khác, sau khi hòa tan, ta

được hỗn hợp gồm dung môi và chất cần tách, đem hỗn hợp này tách dung môi ta sẽ

thu được chất cần thiết

Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly là dựa vào sự khác nhau về hằng số

điện môi của dung môi và chất cần trích ly Những chất có hằng số điện môi gần

nhau sẽ dễ hòa tan vào nhau Phương pháp này có thể tiến hành ở nhiệt độ thường (khi trích ly) và có thể lấy được những thành phần quí như sáp, nhựa thơm trong nguyên liệu mà phương pháp chưng cất không thể tách được Quá trình trích ly gồm hai giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó thấm sâu

vào bên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiếp tục hòa tan các hoạt chất trong các ống mao dẫn

của nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong

tử cần tách Dung môi mới là một chất lỏng thứ hai có tác dụng kéo các cấu tử cần tách mà chúng là các cấu tử dễ hòa tan vào dung môi mới nhất Như vậy trong nguyên liệu chỉ còn lại các cấu tử không thể hòa tan vào trong dung môi mới Sau

quá trình trích ly, hệ tồn tại hai pha không tan lẫn Việc phân tách hai pha được thực hiện bởi quá trình gạn lắng

Trích ly rắn - lỏng là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất rắn bằng một chất lỏng khác - gọi là dung môi Vì mục đích của đề tài là trích ly các hợp chất khô hòa tan trong nấm Đầu khỉ cụ thể là hợp chất Dterpenoid chúng tôi sẽ trình bày về phương pháp trích ly rắn - lỏng Đối với phương pháp này phải có các yêu cầu sau:

Yêu cầu đối với dung môi: Dung môi phải có tính hoà tan chọn lọc, không

độc, không ăn mòn thiết bị, rẻ và rễ tìm

Cơ chế hoà tan: Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào nguyên

liệu, thời gian thấm phụ thuộc vào đường kính, chiều dài mao quản, bản chất dung môi Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất tan và dung môi Các chất có nhiều nhóm phân cực (-OH, -COOH) dễ tan trong dung môi phân cực (nước, cồn, propyl, ) Các chất có nhiều nhóm không phân cực (chất béo, CH3

- C2H5- và đồng đẳng) dễ tan trong dung môi không phân cực

Các phương pháp trích ly:

Dựa vào trạng thái nguyên liệu và đặc tính dung môi có 2 loại: Trích ly tĩnh

và trích ly động Ở phương pháp trích ly tĩnh nguyên liệu và dung môi không được

đảo trộn ở phương pháp trích ly động nguyên liệu và dung môi được đảo trộn bằng

cánh khuấy, do đó hiệu suất cao hơn

Dựa vào phương pháp và số bậc trích ly có hai loại là trích ly một bậc và nhiều bậc Với phương pháp trích ly một bậc thì toàn bộ quá trình trích ly được thực hiện trong thiết bị trích ly, nguyên liệu và dung môi chỉ tiếp xúc một lần Phương pháp trích ly nhiều bậc được tiến hành trong một số thiết bị trích ly Thiết bị cuối cùng dung dịch đậm đặc đi vào nồi chưng Hơi dung môi từ thiết bị chưng đi vào thiết bị ngưng tụ rồi vào thùng chứa rồi vào thiết bị thứ nhất Quá trình tiếp tục cho đến khi

đạt được độ trích ly cần thiết của nồi thứ nhất Sau đó tháo hết dung môi và bã ra khỏi

thiết bị thứ nhất rồi cho vật liệu mới vào, lúc này thiết bị thứ nhất thành thiết bị cuối

và thiết bị thứ hai giờ thành thiết bị thứ nhất Quá trình cứ tiếp tục như vậy, hệ thống làm việc liên tục

Hiện nay, có nhiều cách trích ly các hợp chất sinh học, dựa vào đặc tính vật

lý và hóa học ta chọn phương pháp trích ly thích hợp mang lại hiệu quả cao:

Phương pháp ngâm: Chuẩn bị nguyên liệu đổ vào bình có kích thước nhất

định Đổ dung môi vào nguyên liệu ngâm qua đểm để chiết hoạt chất Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi thu hoạt chất

Phương pháp ngấm kiệt: Cho dược liệu vào bình ngâm nhỏ giọt Đặt giấy

lọc dưới đáy bình kim loại có đục lỗ Cho từ từ nguyên liệu đã được làm ẩm vào bình, san đều, nén nhẹ Cho tới 2/3 thể tích bình rồi đặt giấy lọc và các bi thuỷ tinh hoặc tấm sứ, thép không gỉ lên bề mặt nguyên liệu Đổ dung môi vào bình

và ngâm lạnh, mở ống khoá thoát dịch chiết và đổ dung môi lên khối nguyên liệu, khi có vài giọt dịch chảy ra thì đóng lại Đổ dung môi cách mặt nguyên liệu

3 - 4cm, ngâm lạnh 2 - 4 giờ

Phương pháp trích ly bằng thiết bị Soxhlet: Chuẩn bị nguyên liệu, bọc giấy, bịt

2 đầu rồi đặt vào trụ chiết Dùng dung môi chiết trong thời gian nhất định Sau khi thực hiện các chu trình chiết lấy dịch chiết ra đem cô chân không thu được hoạt chất thô

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly [4]

2.3.3.1 Kích thước nguyên liệu

Khi kích thước của nguyên liệu to quá, dung môi sẽ khó thấm ướt được vào nguyên liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi kích thước của nguyên liệu giảm xuống, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian trích ly sẽ nhanh hơn Tuy nhiên thực tế nếu nguyên liệu trích quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau:

Bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau tạo thành dạng bột nhão vón cục, khi

đó sẽ làm chậm quá trình trích ly Mặt khác khi lọc dịch trích ly, dịch sẽ chảy chậm

hoặc không chảy được vì bột nguyên liệu dính kết vào nhau và do các hạt kích thước nhỏ bít kín lỗ chảy của màng lọc

Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch trích ly bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản

Từ đó phải lựa chọn độ mịn nguyên liệu thích hợp, tùy trường hợp cụ thế, tùy vào nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp trích ly

2.3.3.2 Dung môi

Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng trích ly không giống nhau Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình

trích ly là: Độ phân cực, độ nhớt, sức căng bê mặt

- Độ phân cực của dung môi: Dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan

những chất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực

- Độ nhớt và sức căng bề mặt: Độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt

càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần trích ly Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất chiết làm giảm hiệu quả chiết

2.3.3.3 Nhiệt độ trích ly

Khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình trích ly trong một số trường hợp sau:

- Đối với hợp chất kém bền ở nhiêt độ cao: Nhiêt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất như: Vitamine, glycosid, alkaloid…

- Đối với tạp chất: Khi nhiêt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một

số tạp như: Gôm, chất nhầy… Khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa,

độ nhớt của dịch trích ly sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình trích ly, tinh chế

- Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: Khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

- Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: Khi nhiệt độ tăng,

độ tan của chúng lại giảm Do đó, để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựu chọn nhiệt

độ trích ly sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu trích ly, dung

môi, phương pháp trích ly…)

2.3.3.4 Thời gian trích ly

Khi bắt đầu trích ly, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất

sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân

tử lượng lớn (thường là tạp như nhựa, keo…) Do đó, nếu thời gian trích ly ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong nguyên liệu, nếu thời gian trích ly quá dài, dịch trích

ly sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Vì vậy, cần lựa chọn thời gian trích ly phù hợp

2.3.3.5 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi góp phần quan trọng trong việc trích ly, tạo

điều kiện khuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ

nguyên liệu/dung môi quá thấp dẫn đến tốc độ khuếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu suất trích ly thấp, ngược lại, nếu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi cao quá sẽ tạo ra hiệu suất cao thời gian ngắn, nhưng tốn kém trong thu hồi dung môi

và tốn dung môi

2.3.4 Một số quá trình xảy ra trong quá trình trích ly [4]

Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc nhau, lúc đầu dung môi vào trong dược liệu, sau đó hoạt chất trong tế bào hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dung dịch trích ly trong thành tế bào và dung môi bên ngoài Hoạt chất được khuếch tán ra ngoài tế bào Trong quá trình trích ly thường xảy ra một số quá trình: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích

2.3.4.1 Quá trình khuếch tán

Quá trình di chuyển vật chất từ pha này sang pha khác khi hai pha tiếp xúc trực tiếp nhau gọi là quá trình khuếch tán (quá trình chuyển khối) Quá trình tách

chất hòa tan trong nguyên liệu bằng dung môi chính là quá trình trích ly và nguyên liệu là pha rắn, dung môi là pha lỏng

Khi hai pha chuyển động tiếp xúc nhau thì trên bề mặt phân chia pha tạo thành lớp màng, ở lớp màng luôn có chế độ chuyển động dòng và ở giữa dòng có thể có chuyển động xoáy Đặc trưng di chuyển vật chất trong màng và trong nhân của dòng khác nhau

Trong lớp màng, quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các phân tử và sự tác dụng tương hỗ giữa chúng, do đó quá trình khuếch tán qua màng được gọi là quá trình khuếch tán phân tử Trong nhân, quá trình di chuyển vật chất nhờ sự xáo trộn các phân tử của dòng, vì thế gọi là khuếch tán đối lưu

Quá trình khuếch tán trong lớp màng xảy ra rất chậm so với quá trình khuếch tán trong nhân của dòng, do đó mặc dù lớp màng rất mỏng nhưng vẫn có giá trị quyết định đối với quá trình khuếch tán Vận tốc khuếch tán chung phụ thuộc nhiều vào vận tốc khuếch tán trong màng

2.3.4.2 Quá trình thẩm thấu

Là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất bán thấm, có nghĩa là màng chỉ cho dung môi đi qua mà không cho chất tan đi qua Màng đó gọi là màng bán thấm Do áp lực thẩm thấu của các phân tử chất tan, dung môi sẽ được thấm từ pha lỏng có nồng độ chất tan thấp hơn sang pha lỏng có nồng

độ cao hơn, cho đến khi áp suất thủy tĩnh cân bằng với áp lực thẩm thấu

Ứng dụng: Trong tế bào nguyên liệu có chất nguyên sinh có tính bán thấm, vì

vậy khi còn tươi chỉ có dung môi thấm được vào tế bào, làm cho nguyên liệu bị trương nở, còn chất tan trong tế bào không khuếch tán ra ngoài được Do đó trong trích ly, người ta tìm cách phá hủy nguyên sinh chất bằng nhiệt hoặc cồn để thực hiện quá trình trích ly

2.3.4.3 Quá trình thẩm tích

Là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất thẩm tích, có nghĩa là màng không chỉ cho dung môi đi qua mà còn cho cả chất tan đi qua, nhưng chỉ cho qua các phân tử nhỏ

Ứng dụng: Màng tế bào nguyên liệu có tính chất của một màng thẩm tích, do

đó khi trích ly nếu màng tế bào còn nguyên vẹn thì chỉ có chất tan là phân tử nhỏ và

ion (phần lớn là hoạt chất) khuếch tán qua màng tế bào, còn các chất có phân tử lớn (thường là chất keo, tạp chất…) thì không qua được màng tế bào nên không bị chiết vào dịch chiết Như vậy có thế coi màng tế bào như một màng lọc sinh học có tính chọn lọc Đây chính là ưu điểm của màng tế bào đối với quá trình trích ly Do đó, trong quá trình trích ly không nên xay quá mịn, vì khi đi màng tế bào bị phá vỡ, tính chọn lọc của màng tế bào không còn, dịch chiết lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình nghiên cứu về sau

2.4 Thu nhận các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ

2.4.1 Cô đặc

Cô đặc là phương pháp dùng để nâng cao nồng độ các chất hoà tan trong dung dịch gồm 2 hai nhiều cấu tử Quá trình cô đặc của dung dịch lỏng - rắn hay lỏng - lỏng có chênh lệch nhiệt độ sôi rất cao thường được tiến hành bằng cách tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn); đó là các quá trình vật lý - hoá lý Tùy theo tính chất của cấu tử khó bay hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó), ta có thể tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn) bằng phương pháp nhiệt độ (đun nóng) hoặc phương pháp làm lạnh kết tinh Quá trình cô đặc gồm các phương thức sau:

Cô đặc áp suất thường (thiết bị hở): nhiệt độ sôi và áp suất không đổi;

thường được dùng trong cô đặc dung dịch liên tục để giữ mức dung dịch cố định, nhằm đạt năng suất cực đại và thời gian cô đặc ngắn nhất

Cô đặc áp suất chân không: Dung dịch có nhiệt độ sôi thấp ở áp suất chân

không Dung dịch tuần hoàn tốt, ít tạo cặn và sự bay hơi dung môi diễn ra liên tục

Cô đặc nhiều nồi: Số nồi không nên quá lớn vì nó làm giảm hiệu quả tiết

kiệm hơi Người ta có thể cô chân không, cô áp lực hay phối hợp cả hai phương pháp Đặc biệt có thể sử dụng hơi thứ cho mục đích khác để nâng cao hiệu quả kinh tế

Cô đặc liên tục: cho kết quả tốt hơn cô đặc gián đoạn Tuỳ theo điều kiện kỹ

thuật và tính chất của dung dịch, ta có thể áp dụng chế độ cô đặc ở áp suất chân không, áp suất thường hoặc áp suất dư

2.4.2 Sấy thu nhận sản phẩm

Một số phương pháp sấy:

Sấy đối lưu là phương pháp dùng khá phổ biến trong sản xuất, sử dụng tác

nhân sấy là khí nóng, vừa làm nhiệm vụ truyền nhiệt vừa lấy ẩm ra khỏi vật liệu Tác nhân sây có nhiều dạng khác nhau, tùy thuộc vào kiểu máy sấy

Sấy tiếp xúc là một hệ thống chuyên dùng Vật liệu nhận trực tiếp từ bằng

dẫn nhiệt hoặc từ một bề mặt nóng hoặc từ môi trường chất nóng Người ta chia hệ thống tiếp xúc thành 2 loại: Loại tiếp xúc trong chất lỏng và loại tiếp xúc bề mặt Nguyên tắc cơ bản của thiết bị sấy tiếp xúc là quá trình gia nhiệt, vật liệu sấy tiếp xúc trực tiếp với bề mặt gia nhiệt

Sấy bức xạ là phương pháp sấy dùng tia bức xạ chiếu vào đối tượng cần làm

khô Nguồn nhiệt bức xạ thường dùng đèn hồng ngoại, điện trở, chất lỏng hay khí, tấm được đốt nóng ở nhiệt độ nhất định, để vật nóng phát ra tia hồng ngoại

Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm khỏi vật liệu sấy trực tiếp từ trạng thái rắn

sang trạng thái rắn sang trạng thái hơi nhờ quá trình sấy thăng hoa Để tạo điều kiện sấy thăng hoa, vật liệu sấy phải được làm lạnh dưới điểm ba thể (lỏng, rắn, khí), nhiệt độ t = 0,00980C và áp suất p = 4,6mmHg

2.5 Các sản phẩm chế biến từ nấm Đầu Khỉ

Theo các nhà khoa học trên thế giới nấm Đầu Khỉ chứa rất nhiều hoạt chất sinh họccó có lợi cho sức khỏe con người Với phương pháp truyền thống, loại thảo dược này có trong các bài thuốc đông y và sắc lấy nước uống Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học phát triển và đặc biệt là sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm chức năng Các dạng thương phẩm của nấm Đầu Khỉ trên thi trường chủ yếu dưới hình thức bột nấm, dạng khô, hoặc kết hợp cùng các loại nấm khác tạo thành dạng viên nén

Hình 2.2 Nấm hầu thủ dạng viên nang Hình 2.3 Nấm hầu thủ dạng khô

2.6 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới và Việt Nam

2.6.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới

Ngay từ đầu thế kỷ thứ 19 nấm Đầu Khỉ được biết đến như một loại nấm ăn mang giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời còn là nguồn dược liệu quý Tới năm 1960 nấm Đầu Khỉ được nuôi trồng thành công, nhưng phải hơn 40 năm sau tức là gần 10 năm trở lại đây mới phát triển

Tính đến năm 1991, tổng sản lượng nuôi trồng nấm Đầu Khỉ trên thế giới là 66.000 tấn nấm tươi, chỉ chiếm 1,2% so với tổng lượng nấm trên toàn thế giới, và còn rất thấp đối với nhu cầu của thị trường Nói chung, từ năm 1981 đến 1997 sản lượng trồng nấm Đầu Khỉ tăng lên ít, trong những báo cáo về tình hình nuôi trồng nấm trên thế giới sản lượng vẫn bị xếp chung vào cùng các loài nấm khác Nhận thấy tiềm năng về mặt sinh học của nấm Đầu Khỉ, là thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, được chiết xuất thành các chế phẩm y dược Một số nước châu Âu, châu Mỹ bắt đầu quan tâm đến việc nuôi trồng loài nấm này Hoa Kỳ, Pháp… Sản lượng nấm Đầu Khỉ trên trên thế giới tăng một cách đáng kể trong năm 2003, đứng

đầu về sản lượng nuôi trồng là Trung Quốc với sản lượng 30.500 tấn, tiếp theo là

Nhật Bản với sản lượng 1.821 tấn Năm 2004 sản lượng nấm Đầu Khỉ tăng mạnh ở Hoa Kì với sản lượng lên tơi 42.5 tấn [16]

Năm1995, Pan Jihong Li và cộng sự, đã nghiên cứu các phương pháp trích ly Polysaccharides của quả thể nấm Đầu Kkhỉ bằng các dung môi khác nhau: Bằng nước, dung dịch ammonium oxalate 0,5% và dung môi NaOH 1N, kết quả cho thấy

trích ly bằng dung môi NaOH 1N đạt 30,8% so với tổng số Polysacchrides và xác

định được thành phần Polysacchrides bao gồm: D-mannose, D-galactose, U-glucose

và D-xylose [20]

Năm 2009, Han Wei và cộng sự, đã đưa ra được quy trình trích ly nấm Đầu

khỉ ở nhiệt độ 850C trong 4h với dung môi ethanol, thu hồi Polysaccharides bằng phương pháp tửa với ethanol 75%, lượng Polysaccharides này có vai trò quan trọng

đối với hệ miễn dịch khi kích hoạt tế bào LAK và IL-2 [12]

Năm 2009, HU Bin-jie, SHI Zhao-zhong, Trung Quôc, đã sử dụng phương pháp siêu âm trong trích ly Polysaccarides từ nấm Đầu Khỉ ở điều kiện cơ chất/ dung môi nước = 1/15, 500C, 2 giờ trích ly Cho hiệu suât trích ly đạt trên 40% (so với tổng số Polyasaccharides), thời gian trích ly ngắn hơn phương pháp trích ly bằng nước nóng truyền thống là 4-5 lần [13]

Năm 2010, Zhang Shuai và cộng sự, đã nghiên cứu trích ly Polysaccharides

từ nấm Đầu Khỉ, sử dụng hỗn hợp enzyme bao gồm các cellulase và pectinase (tỷ lệ khối lượng 1:2) Các điều kiện quá trình thủy phân được xác định bằng cách kiểm tra đơn yếu tố và sau đó tối ưu hóa điều kiện quá trình, xác định được: pH 4,2, nhiệt

độ 500C, thời gian phản ứng 90 phút và 2,0% enzyme, điều kiện tối ưu…lượng Polysaccharidese trích ly được là 4,38%, so với các phương pháp khác, phương pháp trích ly có hỗ trợ bằng enzyme là phương pháp trích ly Polysaccharides được

đơn giản, nhanh chóng và cho trích ly tỷ lệ cao [22]

Năm 2010, Chai Junhong và cộng sự, đa nghiên cứu công nghệ trích ly nấm

Đầu khỉ bằng công nghệ sóng siêu âm Quy trình tiến hành 2 lần trong thời gian 45

phút, nhiệt độ 60°C, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lỏng = 1/15 So với công nghệ truyền thống trích ly bằng nước ấm, trích ly sóng siêu âm giảm tới 4/5 thời gian và lượng dịch chiết Polysaccharides tăng thêm 40% [10]

Năm 2000, Eun Woo Lee và cộng sự, đã nghiên cứu phân lập Diterpenoid erinacines H và I từ nấm Đầu Khỉ bẳng methanol 80% và chứng mình rằng chúng

có tác dụng tốt đối với hệ thống thần kinh trong chống bệnh Elzheimer Cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu quang phổ [11]

2.6.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu về nấm Đầu Khỉ ở Việt Nam

Với một nước khí hậu nhiệt đới như Việt Nam thì việc nuôi trồng nấm Đầu Khỉ có rất nhiều khó khăn Nhưng nhờ vào áp dụng khoa học kỹ thuật và nuôi trồng nấm trong một môi trường khắt khe lần đầu tiên vào năm 1998, viện nghiên cứu Đà Lạt đã thành công trong nuôi trồng loài nấm này, nhưng sản lượng nấm ít chỉ đáp

ứng cho các đề tài nghiên cứu

Cuối năm 2000, chi nhánh công ty Đông Nam dược Bảo Long tại Hà Tây cũng đã thử nghiệm nuôi trồng ở nhiệt độ 17 - 250C và thu được kết quả khả quan Năm 2001, Tiến sĩ Lê Xuân Thám (viện hạt nhân Đà Lạt) kết hợp với trường Đại học thành phố Hồ Chí Minh đã chọn lọc và nuôi trồng ra quả thể hoàn chỉnh tại thành phố Hồ Chí Minh Ông cũng cho biết quả thể nấm Đầu Khỉ thu được vào mùa mưa có tua dài và trắng đẹp hơn so với quả thể thu được vào mùa khô [7]

Các chuyên gia thuộc Công ty cổ phần dược liệu Trung ương 2 đã tạo được dòng nấm Đầu Khỉ sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ cao (từ 28 đến 330C) Với thành công này người tiêu dùng Việt Nam đã có cơ hội thưởng thức các món ăn ngon, giàu chất dinh dưỡng chế biến từ nấm đầu khỉ phổ biến ở các nước châu Âu Cho tới nay, loài nấm này đã được trồng ở quy mô lớn tại Lâm Đồng trong điều kiện bình thường có nhà lưới bao quanh, mái lợp tôn và không cần tác động về nhiệt

độ Tính tới tháng 10 năm 2005, công ty đã sản xuất được 6000 tấn nấm tươi và đang bán dưới dạng sấy khô [1]

Tổng sản lượng các loại nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam hiện nay đạt trên 100.000 tấn/năm, kim ngạch xuất khẩu khoảng 40 triệu USD/năm, riêng nấm

Đầu Khỉ đạt khoảng 6.000 tấn So với nấm dược liệu như nấm Hương, nấm Linh

Chi con số này còn rất nhỏ Hiện nay, tại nhiều nơi như Sơn La, Sapa, Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Hồ Chí Minh, Đà Lạt bắt đầu trồng thử nghiệm loại nấm này [8]

Từ năm 2005, sau gần 2 năm thực hiện, nhóm các nhà khoa học của Trung tâm nghiên cứu Linh Chi và nấm dược liệu thành phố Hồ Chí Minh và Hội sinh học thành phố Hồ Chí Minh (thuộc Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật thành phố Hồ

Chí Minh) đã thực hiện thành công dự án “Nghiên cứu quy trình công nghệ trồng nấm hầu thủ chịu nhiệt” Ngoài việc cung cấp thêm một món ăn mới trong bữa ăn hàng ngày cho người tiêu dùng, thành công của dự án này còn mở ra một triển vọng trồng nấm hầu thủ để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược và xuất khẩu [3] Nấm Đầu Khỉ đang mở ra một hướng phát triển mới cho ngành trồng nấm.việc xuất khẩu sẽ mang lại nguồn lợi rất lớn Tuy nhiên nấm Đầu Khỉ vẫn còn khá xa lạ với người dân Việt Nam.Việc nuôi trồng nấm vẫn chưa được quan tâm và phổ biến rộng rãi Nấm Đầu Khỉ còn khá mới đối vối Việt Nam nên những nghiên cứu về nấm chỉ hạn chế ở việc nuôi trồng nấm đạt năng quả chứ chưa chú trọng đến việc trích ly các hợp chất thành các sản phẩm chức năng

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng

Nguồn nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus) được thu mua tại công ty TNHH

nấm Linh Chi ngõ 330 Nguyễn Trãi - Thanh Xuân - Hà Nội

Nấm Đầu khỉ thu mua ở dạng nguyên liệu khô, sau khi mua về được đem đi xác định độ ẩm để điều chỉnh độ ẩm về mức an toàn (13%) và được bảo quản kín trong túi nilon ở nơi thoáng mát để tránh ẩm mốc

3.1.2 Hoá chất và thiết bị

3.1.2.1 Hóa chất

Cồn (960), nước cất, phenol, methanol, acetone, vanilin, acid sunfuric (96%)…

3.1.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Máy sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc)

Máy đo OD (Zuzi 4110ED Spectrophotometer, Đức)

Máy siêu âm (Ultrasonic LC30, Đức)

Cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ)

Thiết bị Soxhlet (TC 15, Trung Quốc)

Cân kỹ thuật (Cent-0-Gram Balance, OHAUS, Mỹ)

Tủ lạnh (Samsung SR-15NFBA, Nhật bản)

Máy xay (Điện cơ An Phát, Việt Nam)

Bình tam giác, bình định mức, pipet, đĩa péptri

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm: Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường nông nghiệp - Viện

Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH, 126 Trung Kính, Trung Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội

Thời gian: Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến

hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

- Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly

Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

- Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

- Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

- Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng các thông số trích ly tới hiệu quả

trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

- Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiểu quả trích ly Diterpenoid

- Ảnh hưởng nhiệt độ trich ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

- Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

- Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid

Nội dung 4: Lọc, cô dịch trích ly và thu chế phẩm Diterpenoid trong nấm

Đầu Khỉ

Nội dung 5: Xây dựng quy trình trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid

trong nấm Đầu Khỉ

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý

3.4.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm

- Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách lượng nước tự do và nước

liên kết bên trong sản phẩm Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đến khi khối lượng lần trước và lần sau nó không thay đổi thì dừng sấy Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại là chất khô

- Công thức tính: Độ ẩm (W%) được tính theo công thức sau:

0 1

G G

Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)

G0: Khối lượng chén sứ (g)

3.4.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng Diterpenoid

Hàm lượng Diterpenoid được xác định bằng phương so mầu dùng thuốc thử

là Vanilin 1% trong H2SO4 ở bước sóng 610nm

* Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng tạo mầu của các Diterpenoid với thuốc thử Vanilin/H2SO4

* Xây dựng phương trình đường chuẩn

- Pha vanilin 1% trong H2SO4

Ta có:

% mct 100

C mdd

- Lấy 50ml dung dịch mẫu (gốc) dùng MeOH pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5

- Lấy 5ml mỗi nồng độ đã pha cho vào 7 ống nghiệm khác nhau Thêm lần

lượt các ống nghiệm 1ml thuốc thử vanilin/H2SO4 1% lắc đều, để trong 5 phút sau

đó đưa đi đo OD ở bước sóng 610nm

* Kết quả xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn Diterpenoid được dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1 Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ

chất chuẩn Phương trình thể hiện mối tương quan giữa Diterpenoid và OD610nm là:

y = 5,5459x + 0,0168

Trong đó y là hàm lượng Diterpenoid trong 1ml dịch (mg/ml), x là giá trị

OD610nm tương ứng Hệ số tương quan R2 = 0,9998 chứng tỏ mối liên quan giữa x

và y là chặt chẽ

Dựa vào đường chuẩn, phương trình đường chuẩn y = 5,5459x + 0,0168 và

kết quả đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 610nm của các mẫu phân tích, xác định

được nồng độ của các mẫu phân tích Hàm lượng Diterpenoid được xác đinh thông

qua công thức dưới đây

* Tính toán xác định hàm lượng Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ

- Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích

- Hàm lượng Diterpenoid được tính theo công thức sau: