Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo và tiếp nhận gen gus của một số giống lúa thông qua vi khuẩn agrobacterium tumerfaciens

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hư

LÂM THỊ MẠNH

Tên đề tài:

ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TIẾP NHẬN GEN GUS

CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THÔNG QUA VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMERFACIENS”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2010 – 2014 Giáo viên hướng dẫn : 1 PGS.TS Ngô Xuân Bình

2.ThS Lương Thị Thu Hường

Khoa CNSH & CNTP Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công

nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô

sẹo và tiếp nhận gen gus của một số giống lúa thông qua vi khuẩn agrobacterium

tumerfaciens”.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình

trưởng khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện giúp đỡ cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s Lương Thị Thu Hường, Ks Lã Văn Hiền những người trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm đề tài và

hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên tạo

điều kiện để em hoàn thành khóa luận này

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn

để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Lâm Thị Mạnh

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây lúa 3

2.1.1 Nguồn gốc cây lúa 3

2.1.2 Phân loại cây lúa 3

2.1.3 Sinh thái học của cây lúa 4

2.1.4 Giá trị cây lúa 6

2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 6

2.2.1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 6

2.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA 7

2.2.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật 9

2.3 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu 10

2.3.1 Gen gus 10

2.3.2 Gen bar 10

2.4 Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa 11

2.4.1 Phương pháp vi tiêm 11

2.4.2 Chuyển gen bằng xung điện 11

2.4.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) 11

2.4.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen 12

2.5 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam 12

2.5.1 Trên thế giới 12

2.5.2 Ở Việt Nam 13

2.6 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào lúa ở thế giới và Việt Nam 14

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15

Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Vật liệu nghiên cứu 16

3.1.1 Vật liệu thực vật 16

3.1.2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium và vector biến nạp 16

3.2 Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu 17

3.3 Hóa chất và thiết bị 17

3.3.1 Hóa chất 17

3.3.2 Thiết bị 17

3.4 Nội dung nghiên cứu 17

3.5 Phương pháp nghiên cứu 18

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa 22

4.2 Kết quả ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa 25

4.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp với kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa 27

4.4 Kết quả ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống lúa 30

4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống lúa 33

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

A tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens

Ti -plasmid : Tumor Including Plasmid

X-gluc : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronidase Acid

Bảng 2.1 Một số loài lúa Oryza, nhiễm sắc thể, và sự phân bố 4

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh thái của một số bộ phận cấu tạo cây lúa 5

Bảng 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa trên thế giới qua các năm 13

Bảng 2.4 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa của Việt nam qua các năm 13

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa 22

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa 25

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa 27

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống lúa 30

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen gus của một số giống lúa 33

Hình 2.1 Vi khuẩn A tumefaciens 6

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 7

Hình 2.3 Cấu trúc Ti-plasmid 7

Hình 2.4 Cấu trúc T-DNA 9

Hình 2.5 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 9

Hình 3.1 T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải) 16

Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc của vector pCambia 3301 16

Hình 3.3: Phương pháp biến nạp gen gus vào lúa (Hiei Y và cs, 2008) [34]Error! Bookmark not defined. Hình 4.1 Mô sẹo của 3 giống lúa được nuôi cấy trên môi trường N6 và MS 24

Hình 4.2 Mô sẹo của 3 giống lúa nuôi cấy trên môi trường N6 có bổ sung 2,4D 2mg/l (sau 14 ngày) 26

Hình 4.3 Mô sẹo của 3 giống lúa được nuôi cấy trên môi trường bổ sung nồng độ 2,4D 2mg/l kết hợp với nồng độ kinetin 0,5mg/l (sau 17 ngày) 29

Hình 4.4 Mô sẹo của các giống lúa sau khi tiếp nhận gen gus 32

Hình 4.5 Mô sẹo của 3 giống lúa sau khi biến nạp và nuôi cấy trên môi trường có bổ sung AS 35

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Lúa có tên khoa học là Oryza sativa, thuộc họ Hòa thảo (Poaceae) Lúa

là một trong năm loại cây lương thực chính phục vụ nhu cầu thiết yếu hằng ngày của hơn một nửa dân số trên thế giới Đặc biệt, đối với người dân Châu Á và Châu Phi, lúa gạo là nguồn lương thực chính, cung cấp dinh dưỡng có giá trị trong khẩu phần ăn do trong lúa gạo có hàm lượng tinh bột cao, giàu protein và các acid amin thiết yếu như Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan Vì vậy lúa gạo đóng vai trò to lớn trong đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu Bên cạnh đó, lúa còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước trên thế giới, trong đó bao gồm cả Việt Nam và có tiềm năng rất lớn trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất rượu cồn và ngành thương mại [11] Với những giá trị đó, lúa được trồng ở nhiều quốc gia trên trế giới như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc, Ấn

Độ,…Năm 2011, FAO thống kê sản lượng lúa trên thế giới đạt đến 721 triệu tấn

(tương đương 481 triện tấn gạo), tăng lên 3% hay 24 triệu tấn so với 2010 [1] Ở Việt Nam, sản lượng lúa cả năm 2012 đạt 43,7 triệu tấn, tăng 1,3 triệu tấn so với năm trước do diện tích và năng suất đều tăng, trong đó diện tích gieo trồng đạt 7753,2 nghìn ha, tăng 97,8 nghìn ha; năng suất đạt 56,3 tạ/ha, tăng 0,9 tạ/ha [15] Tuy nhiên, năng suất và chất lượng lúa gạo phụ thuộc rất nhiều yếu tố như khí hậu, thời tiết, đặc điểm thổ nhưỡng, giống và đặc biệt là yếu tố sâu bệnh hại đã gây thiệt hại nghiêm trọng Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế các tác nhân làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo, hiện nay xu hướng sử dụng các giống lúa biến đổi gen đang được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan tâm Một số các nhà nghiên cứu cũng đã thành công trong tạo giống lúa biến đổi gen như:

- Daisuke Tokuhara và cs đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [29]

- Nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chuyển gen thành công

vào giống lúa IR64 [13]

- Phan Tố Phượng và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21

kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A.tumerfaciens [17]

Trên thực tế hiệu quả chuyển gen ở lúa còn gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ nhân nhanh và hiệu quả tái sinh còn thấp, còn phụ thuộc khả năng xâm

nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu quả biến nạp gen còn thấp (chỉ khoảng 11%)

[13] Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh

hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo và tiếp nhận gen gus của một số giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” đề đánh giá

hiệu quả biến nạp gen ở lúa và phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyển gen ở nhiều giống lúa khác nhau

- Xác định được ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp nhận gen gus

của một số giống lúa, bao gồm các yếu tố sau:

+ Độ tuổi của mô sẹo

+ Nồng độ của AS

1.4 Ý nghĩa của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố, hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu

- Biết được phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày một bài báo khoa học

- Dựa trên kết quả đó tiến hành các nghiên cứu tiếp theo và là cơ sở để áp dụng công nghệ chuyển gen cho các giống lúa và các loài cây trồng khác

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây lúa

2.1.1 Nguồn gốc cây lúa

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khảo cổ học, lúa có nguồn gốc từ vùng

Đông Nam Á và Đông Dương, những nơi có nhiều di tích phổ biến của cây lúa phát

triển khoảng 10.000 năm trước Công Nguyên Các giống lúa Indica được trồng ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á, các giống Japonica được trồng phổ biến ở vùng

Trung và Nam Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Đài Loan có điều kiện khí hậu lạnh hơn [11]

2.1.2 Phân loại cây lúa

- Về mặt phân loại thực vật, cây lúa thuộc họ Poacae (hòa thảo), chi Oryza

Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm của Châu Phi, Nam

và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần ở Châu

Úc [12] Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận

diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L Loài lúa này có mặt ở khắp nơi như vùng

đầm lầy, sườn núi, vùng nước ngọt, nước mặn, vùng xích đạo,và cả vùng nhiệt và

ôn đới Loài Oryza glaberrima Steud., chỉ được trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Phi Châu và hiện đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L [15]

Chi Oryza có 23 loài, có 3 loài phụ là Indica, Japonica và Javanica [11]

Lúa Indica thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới có thân cao, dễ đổ ngã, nhiều nhánh, lá xanh nhạt, cong và kháng được nhiều sâu bệnh Hạt

gạo dài và trung bình, chứa nhiều tinh bột nhưng năng suất kém hơn Japinica

Lúa Japonica thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc nơi có độ cao trên 100m (so với mực nước biển), có thân ngắn, chống đổ, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít nhánh hơn, hạt gạo thường ngắn và tròn hơn, có năng suất cao hơn Indica

Lúa Javanica (Japonica nhiệt đới): Có tính chất trung gian giữa lúa Japonica

và lúa Indica Loại lúa này có hạt to rộng, chất amylose cao, thường có đuôi, trấu có

lông dài, ít chồi, gié dài, thân cây dày thẳng đứng, cây rất cao giàn, không chịu lạnh, chịu hạn hán

Bảng 2.1 Một số loài lúa Oryza, nhiễm sắc thể, và sự phân bố

Loài lúa Oryza Số NST

O alta Swallen 48 Trung và Nam Mỹ

O australiensis Domin 24 Châu Úc

O barthii Chev (O breviligulata) 24 Tây và Đông châu Phi

O brachyantha A Chev & Roehr 24, 48 Tây, Đông và Trung châu Phi

O eichingeri A Peter 24 Đông và Tây châu Phi

O glaberrima Steud 48 Tây châu Phi

O grandiglumis (Doell) Prod 48 Nam Mỹ

O granulata Ness & Arn Ex Hook

O latifolia Desv 24 Châu Úc, Trung và Nam Mỹ

O longiglumis Jansen 48 Đông Nam Á, Nam Trung

Quốc, New Guinea

Nguồn: Nguyễn Ngọc Đệ,2008[11]

2.1.3 Sinh thái học của cây lúa

Các giống lúa có những đặc điểm như chiều cao, thời gian sinh trưởng (dài hay ngắn), chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh khác nhau Song cây lúa đều có những đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và đều có chung các bộ phận rễ, thân, lá bông và hạt Mỗi bộ phận đều có đặc điểm sinh thái phù hợp với các chức năng nhất định [15]

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh thái của một số bộ phận cấu tạo cây lúa

Rễ

Bộ rễ lúa thuộc loại rễ chùm Những rễ non có màu trắng sữa,

rễ trưởng thành có màu vàng nâu và nâu đậm, rễ đã già có màu đen Gồm rễ mầm và rễ phụ: Rễ mầm là rễ mọc ra đầu tiên khi hạt lúa nẩy mầm, thường mỗi hạt lúa chỉ có một rễ mầm Rễ phụ mọc ra từ các mắt (đốt) trên thân lúa Rễ có nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng nuôi cây, giúp cây bám chặt vào đất

Nguồn: Nguyễn Đăng Nghĩa, 2008[15]

2.1.4 Giá trị cây lúa

Lúa gạo là lương thực chính của người dân Châu Á và khoảng 40% dân số thế giới, cũng như ngô của người dân Nam Mỹ và lúa mì ở Bắc Mỹ Lúa gạo có giá trị rất lớn không chỉ về mặt dinh dưỡng mà còn về mặt sử dụng và thương mại [11]

- Về mặt dinh dưỡng: Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra nhiều hơn và trong gạo chứa hàm lượng acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan… có cao hơn lúa mì [11]

- Về giá trị sử dụng: Ngoài làm nguồn lương thực chính, gạo còn dùng để chế biến nhiều loại bánh, sản xuất rượu, cồn, thức ăn chăn nuôi… Cám là các lớp vỏ ngoài của hạt gạo do chứa nhiều protein, chất béo, chất khoáng, vitamin, nhất là vitamin nhóm B, nên được dùng làm bột dinh dưỡng trẻ em và điều trị người bị bệnh phù thũng và là thành phần cơ bản trong thức ăn gia súc, gia cầm,…Trấu ngoài công dụng làm chất đốt, chất độn chuồng còn dùng làm ván ép, vật liệu cách nhiệt, cách âm, chế tạo carbon và silic….[11]

- Về mặt giá trị thương mại: Trên thị trường thế giới, giá gạo xuất khẩu tính trên đơn vị trọng lượng cao hơn rất nhiều so với các loại hạt ngũ cốc khác Nói chung, giá gạo xuất khẩu cao hơn lúa mì từ 2 – 3 lần và hơn ngô 4 lần [11]

2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật

2.2.1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

Hình 2.1 Vi khuẩn A tumefaciens

A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x

0,7-0,8µm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí,

nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn A.tumefaciens là loài vi khuẩn

gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Chỉ

rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối

u hình chóp [2]

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

2.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA

- Ti-plasmid

Hình 2.3 Cấu trúc Ti-plasmid

Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vòng, nằm

độc lập trong tế bào chất Plasmid có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc

vào sự sao chép DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn [2]

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở

nhiệt độ dưới 300C Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị hợp, người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Trong đó, vùng T-

DNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành

khối u còn hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong

Agrobacterium [8]

Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ở thực vật Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình tiếp

hợp giữa A tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương Hiện nay trong kỹ

thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen cần

chuyển vào thực vật Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không được

chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình chuyển

T-DNA vào trong tế bào thực vật [8]

- T-DNA

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border)

Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng

một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một

đoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá

những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u

như tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

auxin và cytokinine Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA vùng

được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi

là vùng vir Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2 [31]

Hình 2.4 Cấu trúc T-DNA

2.2.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật

Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn như: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các

hợp chất này, A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển DNA vào tế bào thực vật Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và

T-RB, LB Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng

vir hoạt động và tăng cường biểu hiện [20] Sự tiếp xúc của A.tumerfaciens với các

hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của

Ti-plasmid được hoạt hóa và phiên mã

Hình 2.5 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A tumefaciens

Khi A.tumerfaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc As tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác

với As và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của

gen virG [18]

Sau đó protein virG đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virG Các sản phẩm của operon virD mã hóa một loại endonuclease tạo ra vết cắt trên Ti-plasmid tại hai trật tự

biên 25bp Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương

tác giữa protein VirD2 với một hoặc hai protein do gen VirC mã hóa Còn protein

VirE2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong

quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật Còn gen VirB mã hóa cho các protein hình

thành nên một cầu nối cho T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật [20]

2.3 Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi

khuẩn A tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu

2.3.1 Gen gusA

Gen gusA: chỉ thị nhuộm màu mô tế bào thông qua phản ứng oxy hóa cơ chất

X-Gluc không màu thành màu xanh lam dưới tác dụng xúc tác của β-Glucuronidase

(gus) [10]

Gen gusA lần đầu tiên được phân lập từ E coli β-glucuronidase thường được

sử dụng để làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyển gen bởi ưu điểm dễ nhận biết

thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và độ ổn định cao Hoạt tính gus trong tế

bào, dịch chiết, cặn tế bào còn có thể định lượng được thông qua phản ứng xúc tác cơ chất huỳnh quang MUG (4-methylumbelliferyl β-D-Glucuronide) và đo bằng RE-Mini 150 Fluometer (Schimadzu; Columbia) với chất chuẩn là MU (4-methylumbelliferone, Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm [42]

2.3.2 Gen bar

Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ dòng vi khuẩn Streptomyses hygroscopicus,

là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT) là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos, Finale, Buster, Harvest và Basta Glufosinate là hợp chất tự nhiên được phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chế hoạt tính của enzyme tổng

hợp glutamin, enzyme cần thiết cho sự tạo thành glutamin và độc tính ammonia Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật Điều này làm cho quá trình quang hợp ngừng và cây chết sau này [14].

2.4 Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa

Ngoài phương pháp biến nạp gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens,

các phương pháp biến nạp gen trực tiếp cũng đã được ứng dụng nhiều trong chuyển gen vào lúa, cụ thể:

2.4.1 Phương pháp vi tiêm

Các nhà nghiên cứu sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn Phương pháp này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác vị trí đã xác định và có thể quan sát được Phương pháp này cần thiết bị có độ chính xác cao, các thao tác thực hiện cần chính xác và thành thạo [6]

2.4.2 Chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh Khi

đặt các tế bào trần trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên

sinh thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành, DNA sẽ đi vào tế bào qua các lỗ hổng Một số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện mà không cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì [5] Zang và cs, (1988) đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần nhờ sử dụng phương pháp xung điện [51]

Năm 1989, Shimamoto và cs đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở lúa

Japonica cũng sử dụng phương pháp chuyển gen qua xung điện [46]

2.4.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)

Phương pháp này lần đầu tiên được Z Luo và Ray Wu và các cộng sự ở trường

Đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên cây lúa [52] Khi hạt phấn rơi trên núm

nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ này mầm hình thành ống phấn Lúc này tiêm gen mong muốn theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào Phương pháp này khá thành công đặc

biệt trên cây lúa và bông [6]

2.4.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs, (1991) và được cải tiến bởi Cao và cs, (1992) [21]; Li và cs, (1993) [49] Sau đó kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa Japonica Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lua Japonica sử dụng súng bắn gen [25] khi sử dụng súng bắn gen tạo áp lực đẩy viên đạn được làm bằng kim loại đã được bọc plasmid mang gen thiết kế, có kích thước khoảng 1µm, với vận tốc 130m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ Hiệu quả chuyển gen lúa thông qua phương pháp này cũng khá cao [6]

2.5 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam

2.5.1 Trên thế giới

Theo FAO, sản lượng lúa thế giới năm 2011 đạt 724 triệu tấn (tương đương

480 triệu tấn gạo) so với 703 triệu năm 2010, tăng 3% Sản lượng tăng cao do mở rộng diện tích canh tác lên đến 163,6 triệu ha, chủ yếu diễn ra ở các nước châu Á,

đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ và Indonesia Tại châu Á sản lượng lúa đạt 653 triệu

tấn, tăng 10% so với năm 2010 Tại châu Phi sản lượng cũng đạt 25,5 triệu tấn, tăng 1% so với năm 2010 do được mùa ở Ai Cập, Guinea, Nigeria a Sierra Leone Nhưng mất mùa cũng diễn ra ở Mali và Madagascar Châu Mỹ La-tinh và vịnh Caribea cũng tăng sản lượng ở các nước ngoại trừ Ecuador và Peru và một số châu lục khác như Úc, Nga và Mỹ

Năng suất lúa cao nhất đạt 204,285 triệu tấn tại Trung Quốc, Ấn Độ đạt 152,6 triệu tấn (FAO, 2012) Trong đó sản lượng lúa Châu Á đạt 651,58 triệu tấn, tổng sản lượng trên thế giới năm 2005 đạt 632,176 triệu tấn tăng lên 703,154 triệu tấn năm 2010

và đạt 719,738 triệu tấn vào năm 2012 (FAO, 2014)

Bảng 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa trên thế giới qua các năm

Năm Diện tích

(triệu ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Sản lượng (triệu tấn)

được 7 triệu ha lúa Năng suất lúa bình quân 4,2 tấn/ha vào năm 2000 đã tăng lên 5,3

tấn/ha vào năm 2010 Năm 2012 theo số liệu tính năng suất đạt mức cao nhất từ trước

đến nay là 5,6 tấn/ha [4]

Sản lượng lúa gạo Việt Nam đạt với tới 32,9 triệu tấn 2002 và lượng gạo xuất khẩu hàng năm khoảng 3,5 triệu tấn gạo Năm 2009, lần đầu tiên Việt Nam đạt 6,05 triệu tấn gạo xuất khẩu Sản lượng xuất khẩu cũng tăng liên tiếp trong năm 2010 (6,75 triệu tấn) và năm 2011 (7,10 triệu tấn) Sản lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam đã cung cấp lương thực cho 120 nước trên toàn thế giới [4]

2.6 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào lúa ở thế giới và Việt Nam

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Theo thông báo tóm tắt của ISAAA, năm 1995, diện tích gieo trồng cây chuyển gen đầu tiên là 0,5 triệu ha, tăng lên 67 triệu ha năm 2003 và có gần 100 triệu ha cây trồng chuyển gen được trồng trên phạm vi toàn cầu vào năm 2005 Trong giai đoạn

1986 – 1997 trên toàn cầu có tới 25,000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây biến đổi di truyền với trên 60 loại cây trồng khác nhau [10]

Ở Philippine lúa là cây trồng chuyển gen đầu tiên được chính thức cho phép

thương mại hóa vào năm 2002 Trong năm 2004, Nam Phi đã trồng 84.000 ha lúa chuyển gen, diện tích trồng ngô biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ cũng tăng mạnh cho thấy xu hướng cây trồng biến đổi gen chiếm tỷ lệ lớn trong diện tích cây trồng toàn cầu [10]

Một bước ngoặt trong nghiên cứu chuyển gen lúa trông qua A.tumerfaciens đã

được đánh dấu bởi công trình nghiên cứu của Smith và Hood (1995) [47]; Hiei và cs

(1997) [33] Trong nghiên cứu của Hiei và cs, tác giả đã thiết kế thành công vector

đặc hiệu Superdinary, Cheng và cs đã thành công trong việc tạo ra quần thể lớn các

giống lúa chuyền gen Cry1Ab, Cry1Ac bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A.tumefaciens [27]

Một số công trình nghiên cứu đã tạo được các dòng lúa Japonica và Indica chuyển gen Bt kháng được sâu đục thân màu hồng, sâu đục thân sọc, sâu đục thân màu vàng và sâu cuốn lá của các tác giả Fujimote và CS, 1993[28]; Nayak và CS, 1997[35], Wu và CS, 1997, báo cáo giống lúa Japonica chuyển gen cry1A(b) tạo

được tính kháng sâu đục thân ở thế hệ R6 và trong điều kiện thí nghiệm ngoài đồng

ruộng [50]

Năm 2013, Daisuke Tokuhara và cs đã tạo ra giống lúa chuyển gen ARP1có khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [29]

MucoRice-2.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, lĩnh vực nghiên cứu về cây trồng biến đổi gen đang được tiếp cận,

đầu tư và triển khai nghiên cứu Nhiều gen quý có giá trị như gen quy định làm tăng

năng suất, tăng khả năng chống chịu, tăng chất lượng đã được phân lập và nghiên cứu nhằm chuyển vào nhiều loại cây trồng như cây lúa, ngô, bông vải cây, cây đu đủ, cà chua,…

Việt Nam đã tiến hành một số nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa như chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng sâu đục thân, kháng rầy, kháng virus,…

Trong chương trình Công nghệ Sinh học (CNSH) giai đoạn 1996 – 2000, Viện

CNSH đã thực hiện đề tài cấp Nhà nước đó là : “ Chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc

lá ở lúa“[15] Giai đoạn 2001 – 2005, Viện CNSH thực hiện đề tài KC,04,13 :

“ Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi”[9] Theo đó, Nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền

Nông nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13] Phan Tố Phượng

và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây

lúa thông qua A.tumerfaciens [17]

Nos ployA

35S bar

LB

RB

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu thực vật

Vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu là một số giống lúa được trồng ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam gồm: U17, Syn 6, Khang Dân

3.1.2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium và vector biến nạp

- Chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 mang hệ thống vector pCambia

3301 chứa gen chỉ thị gus do phòng thí nghiệm khoa CNSH-CNTP, trường ĐH

Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp

Hình 3.1 T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải)

- Vector pCambia 3301

Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc của vector pCambia 3301 Vector pCambia 3301 (hình 2.7) mang gen chọn lọc thực vật là gen bar, gen

chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này

được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi

đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là

pUC18-lacZa, dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus) và

được quy định bởi trình tự CaMV35S polyA Chủng vi khuẩn Agrobacterium được sử

dụng là chủng EHA105 [53]

3.2 Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian: Từ 12/2013 - 06/2014

- Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá khả năng tiếp nhận gen gus của các giống lúa

U17, Syn6, Khang Dân ở quy mô phòng thí nghiệm

3.3 Hóa chất và thiết bị

3.3.1 Hóa chất

- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962); các chất kích thích sinh trưởng: BAP (Duchefa), IAA (Trung quốc), GA3 (Duchefa), IBA (Duchefa), NAA (Trung quốc), Acetoseringone (Sigma), L-pyroglutamic (Duchefa), L-asparagine (Duchefa),

- Kháng sinh: Rifamycin, spectomycin, cefotaxim, vancomycin, ticarcillin,

- Hóa chất khác: Yeast tract, pepton, NaCl, agarose, sucrose,

3.3.2 Thiết bị

Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức), tủ nuôi lắc LSI (Hàn Quốc), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo (Nhật bản), micropipette,

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ2,4D kết hợp với kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen gus

3.5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa được tiến hành dựa trên

phương pháp chuyển gen lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của

Hiei Y và cs (2008) [32] Có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và

được tiến theo quy trình dưới đây:

: Agrobacterium stock cấy trải trên đĩa

Hạt giống YEP (spec 50mg/l + rifam 25mg/l)

Cảm ứng mô sẹo MSD 2-3 ngày

Hình 3.3: Phương pháp biến nạp gen gus vào lúa (Hiei Y và cs, 2008) [34]

Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa ở Việt Nam được tiến hành như sau:

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo

mô sẹo của một số giống lúa

Mẫu hạt lúa chín được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo phục vụ cho biến nạp gen Mẫu hạt được rửa bằng nước xà phòng loãng, để ráo nước Tiến hành bóc bỏ

vỏ trấu của hạt Sau đó, khử trùng bằng cồn 700C trong 2 phút, tráng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút, tráng 5-7 lần bằng nước cất vô trùng Ngâm mẫu 5 phút trong nước cất vô trùng và để mẫu khô trên giấy thấm vô trùng Cấy mẫu vào đĩa pettri chứa môi trường tạo mô sẹo Các thí

nghiệm được bố trí theo công thức sau:

- CT1: Môi trường N6

- CT2: Môi trường MS

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo tạo thành, màu sắc mô sẹo và chất lượng mô sẹo

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của mộ số giống lúa

Cách tiến hành: sau khi xác định được môi trường tạo mô sẹo theo kết quả ở thí nghiệm 1, mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường nền N6 có bổ xung 2,4D theo công thức sau:

CT1 (đ/c): Môi trường nền N6 (không bổ xung thêm 2,4D)

Chỉ tiêu theo dõi: số mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp với kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của mộ số giống lúa

Tiến hành chuẩn bị môi trường cảm ứng tạo mô sẹo theo kết quả ở thí nghiệm 1

có bổ sung nồng độ 2,4D tối ưu đã nghiên cứu ở thí nghiệm 2 (2mg/l), kí hiệu môi trường A Tiến hành bổ sung nồng độ kinetin vào môi trường nuôi cấy và bố trí thí nghiệm theo công thức sau:

CT1 (đ/c): Môi trường A + kinetin 0mg/l

CT2: Môi trường A + kinetin 0,1mg/l

CT3: Môi trường A + kinetin 0,3mg/l

CT 4: Môi trường A + kinetin 0,5mg/l

CT 5: Môi trường A + kinetin 1mg/l

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: số mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp

nhận gen gus của một số giống lúa

Tiến hành thí nghiệm tạo mô sẹo theo phương pháp ở thí nghiệm 1và 2 Sau khi mô sẹo được hình thành, tách các mô sẹo ra và tiếp tục nuôi cấy ở 250C trong tối Thời gian nuôi cấy tạo mô sẹo để lấy mẫu biến nạp được bố trí thí nghiệm theo công thức sau:

- Công thức 1: mẫu tạo mô sẹo 10 ngày tuổi

- Công thức 2: mẫu tạo mô sẹo 14 ngày tuổi

- Công thức 3: mẫu tạo mô sẹo 17 ngày tuổi

- Công thức 4: mẫu tạo mô sẹo 20 ngày tuổi

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp, tỷ lệ mẫu có màu xanh chàm

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, sử dụng kết quả ở thí nghiệm 3 để phục vụ cho thí nghiệm 4

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AS đến biến nạp gen

gus của một số giống lúa

Mẫu mô sẹo có độ tuổi phù hợp được lựa chọn ở thí nghiệm 3 sử dụng làm vật liệu biến nạp Mô sẹo biến nạp theo tốc độ và thời gian thích hợp nhất theo kết quả

đã nghiên cứu ở thí nghiệm 4 Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy có

bổ sung AS theo công thức sau:

- Công thức 1: không bổ sung AS

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, sử dụng kết quả ở thí nghiệm 3 và 4 để phục vụ cho thí nghiệm 5

- Đánh giá sự biểu hiện gen gus:

Sau khi lây nhiễm 3 ngày, mẫu cấy được nhuộm với dung dịch X-gluc (Phụ lục 4) và được ủ 48h ở 370C Sau đó rửa mẫu với ethanol 96% để loại diệp lục tố

và ghi nhận sự biểu hiện của gen gus Khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa thí nghiệm được đánh giá thông qua sự biểu hiện tạm thời của gen gus theo

phương pháp của Hiei Y và cs, 2008) [27]

3.6 Chỉ tiêu đánh giá

Chỉ tiêu của các thí nghiệm sau khi theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:

- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo:

Tỷ lệ mô sẹo tạo thành = ∑ mô sẹo tạo thành

x 100

∑ mẫu vào

- Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sau biến nạp:

Mức độ biểu hiện của gen gus được đánh giá dựa trên vùng biểu hiện và độ

đậm của màu xanh chàm Trong đó:

+++: màu xanh đậm, vùng biểu hiện rộng

++: màu xanh nhạt và vùng biểu hiện trung bình

+: màu xanh nhạt, vùng biểu hiện hẹp

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Excel 2003 và phần mền IRRISTAT 4.0

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số

giống lúa Bảng 4.1: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số

giống lúa Giống CT Môi trường Số mẫu Tỷ lệ mô sẹo (%) Chất lượng mô sẹo

Mẫu sau khi khử trùng được cảm ứng tạo mô sẹo trên hai môi trường khác nhau là MS (Murashige ADN Skoog, 1962) [36] và N6 (Chu & cs., 1978) [24] Kết quả tạo mô sẹo được thể hiện trong bảng 4.1

Qua bảng 4.1 cho thấy rằng cả 3 giống lúa Syn 6, Khang Dân và U17 đều có khả năng tạo mô sẹo trên môi trường N6 tốt nhất trên môi trường N6, tỷ lệ tạo mô sẹo lần lượt là 29,6%; 35,3%; 14,3% Tỷ lệ tạo mô sẹo của cả 3 giống trên MS đều thấp

đạt:13,3%; 15,6 và 8,3%

Mô sẹo của cả 3 giống lúa này được tạo trên môi trường N6 đều có màu vàng, chất lượng mô sẹo tốt Mô sẹo được tạo trên môi trường MS có màu vàng nhạt, chất lượng mô sẹo kém (hình 4.1)

Kết quả nghiên cứu của Z Rahman và cs (2010) [54] cho thấy, các giống lúa khác nhau cho khả năng tạo mô sẹo trên các môi trường khác nhau Ông tiến hành nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo của giống lúa Taipei và MR81 trên 2 loại môi trường là N6, MS và môi trường B5 và thu được kết quả MR81 có khả năng tạo mô sẹo tốt hơn trên môi trường MS nhưng giống lúa Taipei cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trường N6 cao hơn Theo kết quả của Võ Thị Minh Tuyển (2010) trên các giống lúa: MT508-IRBB5, MT508-IRBB7, MT508-IRBB62 cũng cho tỷ lệ tạo mô sẹo ở môi trường N6 tương ứng là 4,2%; 4,7 và 5,3% [21]

Kết luận trên cũng trùng với kết luận của tác giả Obert và cộng sự (2004) chỉ khác là nguồn gen ông sử dụng là giống lúa Japonica Ông đã nuôi cấy bao phấn lúa tạo mô sẹo trên 4 môi trường khác nhau (Mo, N6, MS, N&N)

Thí nghiệm của ông cũng cho thấy trên môi trường N6 cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất (12%) [38] Tương tự, Herath và cộng sự (2007) cũng làm thí nghiệm về các môi trường tạo mô sẹo trên giống lúa Japonica, tác giả cũng rút ra kết luận là môi trường N6 với nguồn cacbon là sucrose là 0,5% cho tỷ lệ tạo mô sẹo (29,4%) cao hơn môi trường B5 và MS ở giống lúa Japonica [32]

Từ kết quả nghiên cứu trên, môi trường N6 sẽ được sử dụng phục vụ cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo

Môi trường MS Môi trường N6

Lúa Syn 6

Lúa Khang Dân

Môi trường MS

Môi trường N6

Lúa U17 Hình 4.1 Mô sẹo của 3 giống lúa được nuôi cấy trên môi trường N6 và MS