Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển Gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tu mefaciens

Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 của thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu

Tr-ờng đại học s- phạm hà nội 2

=================================

Hoàng thị thủy

Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

và b-ớc đầu chuyển gen chỉ thị vào cây

khoai tây thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

luận văn thạc sĩ sinh học

Hà nội, 2010

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS

TS Lê Huy Hàm, Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu là người thầy đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự đào tạo và giúp đỡ nhiệt tình của các giáo viên

Bộ môn sinh – Trường đại học sư phạm Hà Nội 2, những người thầy đã dạy tôi trong suốt quá trình học tập để tôi hoàn thành chương trình các môn học cao học

Đồng thời tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ khoa học của Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình tôi đã luôn luôn bên tôi, quan tâm và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè đã dành cho tôi

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010

Học viên

Hoàng Thị Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010

Tác giả

Hoàng Thị Thủy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây 4

1.1.1 Hệ thống phân loại cây khoai tây 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.2 Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 5

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 6

1.2.2 Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật 7

1.2.3 Tái sinh cây khoai tây 8

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 8

1.3 Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật 11

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 11

1.3.2 Hệ thống vector chuyển gen 21

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 23

1.4.1 Các nghiên cứu sản xuất, nhân giống khoai tây 23

1.4.2 Một số thành tựu về cây trồng biến đổi gen 25

Chương 2 29

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.1.1 Vật liệu thực vật 29

2.2.2 Vật liệu di truyền 29

2.2 Nội dung nghiên cứu 30

2.2.1 Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi 30

2.2.2 Nghiên cứu tái sinh chồi 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 31

2.3.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu thực vật 32

2.3.3 Phương pháp chuẩn bị dịch vi khuẩn 32

2.3.4 Phương pháp chuyển gen 33

2.3.5 Môi trường nuôi cấy 34

2.3.6 Phương pháp đánh giá biểu hiện gen gus tạm thời 35

2.4 Bố trí thí nghiệm 35

2.4.1 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 35

2.4.2 Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens 37

2.5 Các chỉ tiêu đánh giá 39

2.6 Xử lý số liệu 39

2.7 Thiết bị nghiên cứu 39

2.8 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Xây dựng quy trình tạo callus và tái sinh cây ở khoai tây 40

3.1.1 Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau ở cây khoai tây 40

3.1.2 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 42

3.1.3 Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus ở khoai tây 46

3.1.4 Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus ở khoai tây 49

3.1.5 Ảnh hưởng của Casein hydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus 52

3.1.6 Nghiên cứu tái sinh chồi 55

3.2 Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium

tumefaciens 56

3.2.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn A tumefaciens thích hợp cho chuyển gen ở giống khoai tây Atlantic 56

3.2.2 Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn A tumefaciens 59

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD 600nm ) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 61

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 62

63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Phụ lục1: Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoogs, 1972) 73

Phụ lục 2: Thành phần môi trường N6 (Chu và cộng sự, 1975) 74

Phụ lục 3: Môi trường nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu 76

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bar Gen mã hóa tổng hợp phosphinothricin acetyl transferase ĐHST Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

Kinetin 6- furfuryl amino purin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lá cây

khoai tây 40

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân 41

cây khoai tây 41

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 43

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 45

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 48

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân

cây khoai tây 51

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 54

Bảng 3.12 Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở giống khoai tây Atlantic 56

Bảng 3.13 59

cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuẩn A tumefaciens 59

Bảng 3.14 Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào đoạn thân 60

cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuẩn A tumefaciens 60

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở cây khoai tây chuyển gen 61

64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.Cấu trúc Ti-plasmid 18

Hình 1.2 Cấu trúc đoạn T-DNA 18

Hình 1.3 Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 19

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 21

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 23

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 29

Hình 2.2 Cấu trúc vector p6d35S-GUS 30

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lá 41

cây khoai tây (1.Môi trường: N6; 2 Môi trường: MS) 41

Hình 3.2 Ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân khoai tây (3 Môi trường: N6; 4 Môi trường: MS) 42

Hình 3.3 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 44

CT1(1); CT9(2); CT(7) 44

Hình 3.4 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây CT1(1); CT9(2); CT(6) 46

Hình 3.5 Ảnh hưởng của xytokinin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây 48 Hình 3.6 Ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 49

Hình 3.7 Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ mẫu lá cây khoai tây 51

Hình 3.8 Ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 52

Hình 3.9 Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ mẫu lá cây khoai tây 53

Hình 3.10 Ảnh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây 54

Hình3.11 Tái sinh chồi từ mẫu callus tạo thành từ đoạn thân cây khoai tây Attlantic 56 Hình 3.12 Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mẫu lá khoai tây Atlantic sau khi lây nhiễm với các chủng vi khuẩn A tumefaciens khác nhau 58 Hình 3.13 Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đoạn thân khoai tây Atlantic sau khi lây nhiễm với các chủng vi khuẩn A tumefaciens khác nhau 58 Hình 3.14 Lựa chọn vector chuyển gen thích hợp vào mẫu lá khoai tây Atlantic(AA39: p6d35S-GUS; AA43: pCAMBIA1301) 60 Hình 3.15 Lựa chọn vector chuyển gen thích hợp vào đoạn thân khoai tây Atlantic (AA39: pCAMBIA1301; AA43: p6d35S-GUS) 60 Hình 3.16 Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus lên mẫu lá khoai tây 63 Hình 3.17 Ảnh hưởng của hàm lượng AS lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở thân khoai tây 63 Hình 3.18 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở đoạn thân khoai tây 65

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô Ở một số nước, khoai tây được xem là thực phẩm chính hàng ngày mặc dù giá thành thấp nhưng có giá trị dinh dưỡng cao

Việt Nam, có thời kỳ coi khoai tây là nhóm cây lương thực có tầm quan

trọng thứ ba sau lúa và ngô Cây con được nhân giống in vitro thường được dùng để sản xuất khoai tây giống phục vụ cho việc tạo củ in vitro [10] Hiện nay, nhiều cơ

quan như Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Công ty Giống cây trồng Trung ương đã đầu tư cho việc nghiên cứu, sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh, tuy nhiên cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có hệ thống sản xuất, xác nhận giống và

cung ứng giống khoai tây hoàn chỉnh [53]

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chúng ta đã chứng kiến các bước phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 của thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, chịu hạn, mặn, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, tăng cường hoạt chất sinh học và ứng dụng trong sản xuất Một trong những phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật

là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine [35]

Hiện nay người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp vaccine ở thực vật như lúa, thuốc lá, khoai tây, cà rốt, rau diếp, chuối, cà chua [20], [32], [33], [34], [41], [45], [47] Các nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất đáng kể giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật cho mọi mặt của đời sống Cây

khoai tây là một trong những đối tượng thực vật có vai trò quan trọng trong thành công của lĩnh vực này

Việt Nam có khả năng phát triển mạnh cây khoai tây, nhất là ở vùng đồng bằng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc trung Bộ và Tây Nguyên, ước tính, ít nhất có khoảng 200.000 ha đất có thể trồng được khoai tây Tuy nhiên trong những năm gần đây, diện tích trồng khoai tây chỉ dao động trong khoảng 30.000-35.000 ha với năng suất bình quân khoảng từ 10-11 tấn/ha Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất thấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt Củ giống trồng phổ biến là loại củ giống chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp) [53]

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:“ Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens“

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình tạo callus và tái sinh cây như: nền khoáng, chất ĐHST, xaccarozơ, casein hydrolysate

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình biến nạp gen

vào cây khoai tây thông qua A tumefacines như: Chủng vi khuẩn Agrobacterium

thích hợp cho biến nạp gen, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, AS

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

*Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tái sinh,

khả năng tiếp nhận gen từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số giống

khoai tây

* Ý nghĩa thực tiễn

Là cơ sở để áp dụng chuyển gen quan tâm vào cây khoai tây nhằm tạo ra các

giống khoai tây biến đổi gen

5 Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

( theo quy trình của Yee shirley và cộng sự, 2001)

 Phương pháp chuyển gen (theo quy trình của De Block, 1988)

 Phương pháp đánh giá biểu hiện gen gus tạm thời

(theo Jefferson và cộng sự 1987)

6 Giả thuyết khoa học

- Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô khác nhau của cây khoai tây

- Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây

1.1.1 Hệ thống phân loại cây khoai tây

Khoai tây - Solanum tuberosum L., thuộc họ Cà - Solanaceae

Giới (regnum): Plant

ae

Bộ

(ordo):

Solanales

Họ

(familia):

Solanaceae Chi

Rễ khoai tây thuộc loại rễ chùm (trồng từ củ), có rễ cọc (khi trồng bằng hạt),

từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác Phần lớn rễ tập trung ở độ sâu 30-40 cm, nhưng cũng có những rễ ăn sâu tới 1,5-2m Ngoài ra rễ còn phát triển ở trên củ nhưng ngắn, ít phân nhánh và cũng có chức năng giống các rễ khác

Rễ khoai tây phát triển mạnh ở thời kỳ ra hoa (ở dưới mặt đất lúc này đã hình thành củ và củ bắt đầu lớn lên)

b) Thân

Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo dích dắc, có 3-4 cạnh, cao trung bình từ 40-70 cm đến 1-1,2 m Phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà chiều cao cây có thể khác nhau Thân thường có màu xanh hoặc xanh nhạt

hay đậm, đôi khi có màu phớt hồng hoặc tím tuỳ thuộc vào từng giống Trên thân

có lớp lông tơ mềm (khi cây còn non) cứng dần và rụng theo thời gian sinh trưởng c) Lá

Lá khoai tây tương tự như lá cà chua nhưng khác một số điểm- thuộc lá phức tạp, bản lá to, có 3-7 đôi mọc đối xứng qua trục và 1 lá lẻ trên cùng thường lớn hơn được gọi là lá chét đỉnh Lá khoai tây dài khoảng 10-15 cm, mặt lá phẳng hoặc gợn sóng, lá bản to hơn lá cà chua Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà có thể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt

f) Hạt

Hạt khoai tây có dạng hình dẹt, màu cà phê sáng hoặc màu đen Khối lượng

1000 hạt khoảng 0,5 g Thời gian ngủ nghỉ hạt lâu

g) Củ

Củ là bộ phận làm thực phẩm cho con người Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ được hình thành là do thân phát triển dưới mặt đất, trong điều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây có thể tròn, elip, tròn dài, đôi khi hình vuông Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng, vàng nhạt trên củ có nhiều mắt củ, nhưng phân bố không đều Số lượng mắt

củ nhiều hay ít tuỳ thuộc vào từng giống Trên mắt củ có mi mắt và mắt Mi mắt dài hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đặc tính di truyền của giống Trên mỗi mắt thường có 2-3 mầm ngủ và thường tập trung nhiều trên đỉnh củ [7]

1.2 Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thuyết về tính toàn năng của tế bào do nhà thực vật học người Đức Haberland đưa ra vào năm 1902 Kế thừa quan điểm của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng tất cả các tế bào cấu tạo nên cơ thể thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền đủ để mã hoá hình thành một cơ thể, các nhà nghiên cứu cho rằng mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thể nếu được nuôi trong điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Từ đó đến nay, rất nhiều các công trình nghiên cứu đã tạo ra được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật [2], [5], [18]

1.2.1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan khác nhau, có chức năng khác nhau và được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên mọi tế bào đều bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu Tế bào hợp

tử đầu tiên lúc đầu phân chia thành khối tế bào chưa chuyên hoá Các tế bào chưa chuyên hoá này tiếp tục phân chia và biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc trưng cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Đó là hiện tượng phân hoá tế bào Tuy nhiên, các tế bào chuyên hoá thành các tế bào chuyên biệt lại không mất hoàn toàn sự biến đổi của mình Trong những điều kiện thích hợp nhất định chúng

có thể trở thành dạng tế bào chưa chuyên hoá Hiện tượng này gọi là hiện tượng phản phân hoá tế bào [2], [5]

Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt động của các gen Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số gen nào

đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho ra một tính trạng biểu hiện mới Ngược lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà

Sự hoạt hoá mô, cơ quan của cơ thể Khi tách riêng từng tế bào, hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [5]

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa và sự phân hoá và phản phân hoá tế bào thực vật Để điều khiển được phát sinh hình thái của tế bào, người

ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính là auxin và xytokinin Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc callus) của mô nuôi cấy khác nhau Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/xytokinin thấp thì mô nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo callus [5], [18]

1.2.2 Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật

Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và phát sinh cây hoàn chỉnh đạt hiệu xuất cao là tiền đề quan trọng cho thí nghiệm chuyển gen Đối với mỗi loài thực vật, nhất thiết phải nghiên cứu tối ưu hoá kỹ thuật nuôi cấy thích hợp Sau đây là các hướng tái sinh cây từ mô thực vật có thể được sử dụng để biến nạp gen :

Nuôi cấy callus: Callus là khối tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao

Callus thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như thân, lá, rễ, hoa

trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin

và điều kiện nuôi cấy thích hợp Callus có thể được duy trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kỳ Callus khi cấy chuyển lên môi trường thích hợp có thể phát sinh chồi trực tiếp hoặc tạo phôi soma và nảy mầm thành cây hoàn chỉnh Đây là hệ thống nuôi cấy có thể được sử dụng để biến nạp gen đạt hiệu quả cao Cây chuyển gen phát triển từ một tế bào callus không bị thể khảm [2]

Nuôi cấy tế bào huyền phù: Là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường lỏng Các tế bào này cũng được tạo ra từ callus có nguồn gốc

từ thân, lá, rễ, hoa phôi Tuy nhiên trở ngại của phương pháp này cần thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây [52]

Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh được gọi là tế bào trần (protoplast) Các tế bào trần sau khi được nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối callus và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ứng dụng có ý nghĩa nhất ở phương pháp này là tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp protoplast và úng dụng để biến nạp gen [11]

Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi từ mảnh lá hoặc đoạn thân không có chồi bên, cũng có thể được sử dụng để chuyển gen

1.2.3 Tái sinh cây khoai tây

Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem là mấu chốt quyết định đến

sự thành công trong quy trình tạo cây chuyển gen Nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm đã thu được tế bào sống sót trên môi trường chọn lọc nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh Do vậy hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh được cây hoàn chỉnh là công việc quan trọng đầu tiên khi tiến hành biến nạp gen Một trong yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy và tái sinh cây như: Nguồn mẫu vật nuôi cấy, môi trường và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng và các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc

Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tái sinh thành công cây khoai

tây in vitro từ các nguyên liệu như thân, lá thông qua con đường nuôi cấy thuỷ canh

in vitro phục vụ sản xuất củ bi khoai tây (Solanum tuberosum L.) và vi ghép in vitro cây cà chua (Lycopersicum esculentum) và cây khoai tây(Solanum tuberosum) [10]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

Môi trường nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro Ngoài chức năng làm giá thể cho mẫu cấy, môi trường nuôi cấy còn có nhiệm

vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn tại, phân hoá

và phát triển Vấn đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể

- Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự

sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Thành phần

của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2]

+ Nhóm nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg

và Ca Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và có chức năng xây nên thành tế bào

+ Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là nguyên tố khoáng được

sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển callus rất nhanh, nhưng có hiệu xuất tái sinh thấp Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy

+ Nguồn cacbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường xaccarozơ và glucozơ với liều lượng 20-30g/lít Guatheret (1959) cho thấy đối với phần lớn các mô, đường xaccarozơ và glucozơ là nguồn cacbon tốt nhất [13] Trong trường hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: maltozơ, lactozơ hay fructozơ

+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng

tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng Các vitamin thường được sử dụng như: B1 (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxy hóa khử cacbon ở axit hữu cơ Nồng

độ thường dùng từ 0,1-10 mg/l B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzim khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin, nồng độ thường dùng

từ 0,1-1 mg/l B5 (axit nicotinic) đi vào thành phần các enzim oxy hóa khử dehydrrogenase xúc tác việc tách hydro khỏi các axit hữu cơ Nồng độ thường dùng

từ 0,5-1 mg/l Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật [13]

+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của callus và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, myo-inositol và các chất hoạt tính auxin, các gluoxit của xytokinin

+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết

sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ

quá trình nuôi cấy Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất điều hoà sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì

vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm

ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy

mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất là auxin, xytokinin và gibberellin

Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự dãn tế bào, sự hình thành rễ bất định và callus Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng các loại auxin là: IAA, NAA và 2,4-D Các loại auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-0,5 mg/l tuỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy

Các chất thuộc nhóm xytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là: Kinetin và BAP Tỉ lệ giữa auxin và xytokinin quy định sự biệt hoá của mô, tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành callus Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ auxin/xytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo callus

+ Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy Thực tế đã chứng

minh pH thấp (pH<4,5) hoặc cao (pH>7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy Cụ thể, nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy Thông thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5-6,5 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng

cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro

+ Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của mô nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25±2o

C

+ Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12-16 giờ/ngày Ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000-3000 Lux, tương đương với khoảng cách 30cm từ đèn chiếu sáng tới

mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường độ thấp là phù hợp với nuôi

cấy in vitro Nuôi cấy callus có thể không cần ánh sáng Chất lượng ánh sáng cũng

ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của callus Nguồn chiếu sáng bằng đèn Compact 3U

có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây và cây hoa chuông [10]

1.3 Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật

1.3.1 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật

1.3.1.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

 Chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện (electroporation)

Kỹ thuật này áp dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần Người ta chuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200-600 V/cm trong khoảng thời gian ngắn 4-5 phần nghìn giây Kết quả làm cho màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời có đường kính khoảng 30 m, mà qua đó các DNA biến nạp ở bên ngoài có thể xâm nhập vào trong tế bào Quá trình biến nạp được thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc các “buồng xung điện” có các tấm cực bằng kim loại đặt cách nhau 1 – 4 mm Sau quá trình điện xung, tế bào trần được nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc để tách các tế bào trần đă thu nhận DNA Sau đó các tế bào trần này được nuôi cấy tái sinh cây và tiếp tục chọn lọc Các yếu tố chính tác động lên hiệu quả biến nạp bằng xung điện bao gồm: cường độ điện trường, điện dung, tính chất ion và nồng độ đệm, thời gian tiền

xử lý

 Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide

Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất Sợi silicon carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 m và dài khoảng 10 - 80 m Khi lắc một huyền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập vào Sau đó các tế bào này được nuôi cấy tạo callus, tái sinh cây và chọn lọc để tách ra những cây mang gen chuyển [14] Huyền phù tế bào đơn thường được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyển là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen

Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kích thước sợi silicon carbide, thông số vortex, dụng cụ chứa mẫu, nguyên liệu thực vật và đặc điểm tế bào thực vật, đặc biệt là độ dày của thành tế bào

Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, chi phí thấp và áp dụng được cho nhiều loài thực vật Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất là hiệu quả chuyển gen thấp và tổn thương gây ra cho tế bào có thể ảnh hưởng tới khả năng tái sinh sau này [46]

 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Chuyển gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là các phần tử kim loại nặng (wonfam hay vàng) có kích thước hiển vi (0,5 - 5 m) có

tỷ trọng cao để đạt được gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào [14], [42]

Ưu điểm:

- Có thể áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào

- Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh

- Dễ sử dụng, quy trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể được xử lý trong thời gian ngắn

- Các vector được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi các trình tự DNA cho

đoạn T-DNA như chuyển gen bằng Agrobacterium

- Cần một lượng nhỏ DNA plasmid

- Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp

Nhược điểm:

- Nhiều bản sao được chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vững

- Tần số biến nạp thấp, thường xuyên nhận được thể khảm

- Thiết bị đắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thể mua được, giá thành vật tư đắt

 Biến nạp bằng hoá chất PEG (polyethylene glycol)

Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp chuyển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần

Ở nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế bào trần [14]

Ưu điểm:

- Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công

- Có thể chuyển gen vào tế bào trần của bất kỳ loài thực vật nào

- Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

Nhược điểm:

- Quá trình biến nạp khó điều khiển Số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thể lớn

- Tần số biến nạp thành công biến động giữa các thí nghiệm

- Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen

- Đòi hỏi một hệ thống tái sinh tế bào trần vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài cây trồng do phụ thuộc vào các yếu tố ngoài thí nghiệm như: loài, kiểu gen trong loài, phản ứng tổn thương và tái sinh

 Phương pháp vi tiêm

Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào Kỹ thuật này có ưu điểm là: lượng DNA được biến nạp là tuỳ ý và xác định, DNA được đưa vào đúng

vị trí mong muốn, thậm trí là nhân tế bào Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như hạt phấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thể thực hiện đ-ược và có thể biến nạp vào các loài cây trồng, có thể thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các

tế bào vi tiêm Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa được DNA vào một tế bào duy nhất và chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao với những thiết bị tương đối đắt tiền [14]

 Phương pháp vĩ tiêm

Sử dụng kim tiêm có đường kính lớn hơn đường kính tế bào để đưa DNA vào tế bào Các tế bào này bị phá vỡ và DNA xâm nhập vào các tế bào bị tổn thương, sau đó được chuyển vào các tế bào bên cạnh Kỹ thuật này đơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen thấp [24] Chuyển gen bằng vĩ tiêm thường áp dụng cho những đối tượng có bầu nhụy lớn, dễ thao tác

 Phương pháp Agrolistic

Phương pháp Agrolistic kết hợp ưu điểm của hai phương pháp bắn gen và

chuyển gen thông qua Agrobacterium Trong phương pháp này, vector thiết kế có

đoạn T-DNA mang gen quan tâm được chuyển đồng thời với các gen mã hoá protein

virD1và virD2 vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật bắn gen, nhờ đó kích thích sự gắn kết của T-DNA trong hệ gen thực vật [44]

1.3.1.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

 Chuyển gen nhờ virus

Virus được sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ thâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào Tuy nhiên để trở thành vector chuyển gen thì virus cần có các tiêu chuẩn sau:

- Genome virus là DNA chứ không phải RNA

- Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ thành tế bào (plasmodest)

- Có khả năng tải được các đoạn DNA gắn vào

- Có phổ ký chủ rộng

- Không gây hại hoặc gây hại không đáng kể

Tuy nhiên hiện nay việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng, do virus về nguyên tắc không truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ vi rút phải tiến hành bằng phương pháp vô tính Điều này không phải thực hiện được với tất cả các loài cây Đây chính là một nhược điểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus

 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Từ những năm đầu của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện ra một loại

vi khuẩn Agrobacterium có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật

Agrobacterium là một loại vi khuẩn gram âm Cả chủng A tumefaciens và A rhizogenes đều được sử dụng phổ biến trong chuyển gen vào thực vật Theo cơ chế

tự nhiên, hai loại này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ

(hairy root) [2], [15], [19] Những tế bào của khối u hay lông rễ có thể phát triển in vitro khi vắng mặt bất cứ chất ĐHST thực vật nào Đây là do trong tế bào của các dạng hoang dại A tumefaciens và A rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt gọi

là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid) Ti-plasmid có kích thước khoảng 200 kb

đã được xác định trình tự, chứa một đoạn DNA có chiều dài khoảng 25 kb gọi là T- DNA (transfer DNA) có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ chế tự thiên [27] Do

đó Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên Bằng cách cải biên (cắt bỏ

các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào thực

vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens

Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã được áp dụng thành công

trên nhiều đối tượng cây trồng đặc biệt là cây hai lá mầm như: khoai tây, cà chua, thuốc lá [22], đậu tương, bông và một số cây hoà thảo như: lúa, ngô đã làm cho

phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn [13], [29], [31] Sự

chuyển nạp nhờ vi khuẩn vào cây một lá mầm khó thành công do cây một lá mầm như hoà thảo thường không có phản ứng với sự thương tổn Vết thương không dẫn đến sự phản phân hoá tế bào lân cận Mặt khác, vi khuẩn khó gắn kết với thành tế bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm, hoạt động của vùng vir bị ức chế

- Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid:

Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A tumefaciens gây nhiễm và

tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập (hình 1.1) dài khoảng 200 kb

và có trọng lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng VIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp

Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn sang genom của cây chủ và tồn tại bền vững ở đó Tuy nhiên, vùng này không mã hoá những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của

các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (gen chv)

Hình 1.1.Cấu trúc Ti-plasmid

- Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA:

Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp gần như hoàn toàn dài khoảng

25 bp, gọi là đoạn biên (hình 1.2) Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật

H

Hình 1.2 Cấu trúc đoạn T-DNA

Ở đoạn biên phải (Righ boder-RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình

chuyển T-DNA Đoạn biên trái (Left boder-LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [7], [41]

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật là một đoạn DNA liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (l) Các gen mã hoá những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u

như tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

2

Vï g g y k èi u (On )

nos

- Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào ở cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất của phenol như: Acetosyringon, hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng dẫn dụ của các hợp chất này,

A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào cây chủ Protein VirA nằm trên thành tế bào vi khuẩn Agrobacterium sẽ nhận biết sự có mặt và tương tác với các

phân tử acetosyringon Tiếp đến VirA sẽ phosphoryl hoá protein VirG làm cho VirG

trở thành dạng hoạt động Đến lượt VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE cũng như tăng cường mức độ phiên mã của gen virG bằng cách

tương tác với trình tự điều hoà của VIR box Sợi dưới của T-DNA bị cắt ở vị trí giữa

nucleotid thứ 3 và 4 của trình tự biên nhờ hoạt động của VirD1/VirD2 endonuclease [38] Đồng thời với quá trình cắt là quá trình tổng hợp mới sợi thay thế cho sợi bị cắt Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T, sợi T được chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5’ đi trước [50] Đầu 5’ của sợi T được liên kết đồng hoá trị với protein VirD2 ở vị trí axit amin tyrosine 29 [27]

Trong quá trình di chuyển, protein VirE2 gắn với sợi T tạo thành phức hợp T dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của các enzyme thuỷ phân và các enzyme endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ Protein VirB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khuẩn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T

có thể được vận chuyển sang tế bào cây chủ [50] Protein VirD2 gắn ở đầu 5’ của sợi

T đóng vai trò là tín hiệu nhận biết trong hệ thống vận chuyển này [30] Sau khi DNA qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên (hình 1.3)

T-Hình 1.3 Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật

Tại đó nhờ sự điều khiển của gen thực vật mà các gen trên T-DNA bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u [6], [49]

- Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A tumefaciens

Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh hoàn chỉnh cây chuyển gen từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp Đối với

phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc

vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn, các yếu tố liên quan đến thực vật và một số các yếu tố khác Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật

độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các

cây chủ và loại vector Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm: loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích [14], [22]

Mật độ vi khuẩn cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển nạp T-DNA Theo Hiei

và cộng sự (1994) thì mật độ vi khuẩn Agrobacterium thích hợp nhất cho chuyển

gen vào lúa từ 1,0 x 106 đến 1,0 x 1010 cfu/ml [29], mật độ này cũng đã được nhiều thử nghiệm thành công ở ngô [31]

Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng chuyển T-DNA của các gen

vir Tăng khả năng biểu hiện của các gen vir đạt được bằng cách gây tiền cảm ứng

vi khuẩn với hợp chất phenol như acetosyringone (AS) Tiền xử lý trong môi trường chứa AS đã làm tăng tần suất biến nạp gen ở các cây thuốc lá Bổ sung AS vào môi trường nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển gen thông qua

Agrobacterium

Ngoài ra pH của môi trường lây nhiễm cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự

chuyển nạp T-DNA vào tế bào thực vật Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi giá trị

pH dao động từ 5,2 - 5,8

Nhiệt độ thích hợp cho chuyển nạp T-DNA phụ thuộc vào loài và mô thực vật Đối với lá cây thuốc lá thì nhiệt độ thích hợp là 220C Hiệu quả chuyển gen vào

ngô thu được ở nhiệt độ 200C cao hơn ở 230C khi sử dụng vector nhị thể [26], còn nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen vào huyền phù ở lúa là 23 - 250C và ở ngô là

230C [26]

1.3.2 Hệ thống vector chuyển gen

1.3.2.1 Hệ vector nhị thể

Trên cơ sở phát hiện vùng vir không cần nằm trên cùng một plasmid với

vùng T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-DNA vào hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể trong đó

vùng T-DNA và vùng vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng A tumefaciens

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể

Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:

(1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm:

- Các đơn vị sao chép để DNA plasmid có thể tự nhân lên trong cả E coli và Agrobacterium

- Các gen chọn lọc, gen chỉ thị

- Vùng đa nhân dòng nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải để chèn gen mong muốn

(2) Vector bổ trợ: nằm trong A tumefaciens, với toàn bộ vùng vir được giữ

lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và biên phải, biên trái Plasmid này được

cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật

Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacterium, khi các gen trên vector

bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến việc chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật

Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững

trong E coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động Tuy nhiên, vector nhị thể có một

số ưu điểm như:

- Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid

- Kích thước vector khá nhỏ

Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E coli sang A tumefaciens đã tăng

lên Hiện nay, vector nhị thể được sử dụng rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen [6]

1.3.2.2 Hệ vector liên hợp

Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng

nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E coli) với vùng T-DNA trên plasmid của A tumefaciens Trong đó, người ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng mã

Ti-hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid (hình 1.5)

Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:

(1) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của

vi khuẩn

(2) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được

sử dụng để bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước lớn và thiếu

vùng MCS) Chúng được nhân lên trong E coli và chuyển sang A tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp Do không thể sao chép trong A tumefaciens nên chúng mang

những đoạn tương đồng với T-DNA

(3) Vector trợ giúp: tồn tại trong E coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào A tumefaciens [48]

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Các nghiên cứu sản xuất, nhân giống khoai tây

Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã và đang có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và trong nghiên cứu phát triển khoa học công nghệ trên thế giới và Việt Nam

* Nghiên cứu trong nước:

Trong các giải pháp nhân giống khoai tây vô tính thì công nghệ nhân giống

bằng invitro có nhiều ưu thế Từ năm 1978, qua nghiên cứu thử nghiệm của nhiều

nhà khoa học, của nhiều cơ quan ở nhiều vùng sinh thái, đến năm 1984 đã thành công

ở vùng Đà Lạt Từ năm 1984 đến nay, nông dân Đà Lạt trồng khoai tây bằng giống

sản xuất từ in vitro, năng suất bình quân 35-40 tấn/ha, cao tới 60 tấn/ha, bền vững,

song diện tích trồng khoai tây ở đây còn ít, khoảng 300-500 ha Công nghệ này còn đang được ứng dụng để sản xuất vật liệu bố mẹ để sản xuất hạt khoai tây lai và bảo quản những nguồn gen quý của khoai tây Đây là công trình do Trung tâm Công nghệ

Sinh học miền Nam chủ trì, Viện KHKTNNVN là cơ quan phối hợp [54]

Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Khoa học và Công nghệ - Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn áp dụng quy trình trên diện tích 1 ha nhà lưới, thời gian 2007-

2008 đã sản xuất được 700.000 tấn củ giống siêu nguyên chủng từ nuôi cấy mô Tỉnh tiếp tục phấn đấu sản xuất được 1.000 tấn giống xác nhận vào năm 2010, đáp ứng nhu cầu trồng cho 60% diện tích khoai tây [54]

Từ việc ghép ngọn cây cà chua trên gốc cây khoai tây, Nguyễn Thị Trang Nhã [53] đã cho ra đời loại cây trồng mới vừa cho thu hoạch củ khoai tây lại vừa cho trái cà chua với năng suất cao, đồng thời hàm lượng các chất trong củ khoai tây cũng như quả cà chua đều cao hơn loại cây đơn (cây chưa ghép) Cụ thể, khi được trồng thử nghiệm trên đồng ruộng tại Đà Lạt, loại cây “hai trong một” này đã cho năng suất khá cao, bình quân đạt hơn 19 tấn củ khoai tây/ha và hơn 38 tấn cà chua/ha/vụ trên cùng diện tích, trong khi hàm lượng các chất trong củ và quả như vitamin C trong cà chua ghép đạt 8,77% (cà chua thường trồng đối chứng là 3,53%), còn khoai tây ghép là 0,27% (khoai tây không ghép là 0,03%); tinh bột trong cà chua ghép là 0,02% (không ghép là 0,02%), khoai tây ghép là 2,04% (không ghép là 1,66%)… Việc ghép và trồng thành công không chỉ giúp tiết kiệm diện tích đất, công chăm sóc, phân bón mà còn mở ra nhiều triển vọng mới về cây giống kháng bệnh cho nông dân Đà Lạt

* Nghiên cứu ở nước ngoài:

Trong sản xuất giống khoai tây, điều mong muốn tốt nhất là: giống phải có

độ sạch cao, ít sử dụng hóa chất độc hại cho môi trường và giống thương mại phải được sản xuất ra từ giống gốc tạo ra bằng điều kiện nhân tạo Trên thế giới, việc sản xuất giống khoai tây sạch bệnh ngày càng được chú ý, cụ thể: Ở Hungari 100% các

vật liệu khởi đầu là từ nhân giống in vitro Ở Ba Lan gần 100% các vật liệu khởi đầu từ nhân giống in vitro Ở Đức, các nhà chọn tạo giống chịu trách nhiệm về sản xuất giống tiền gốc với mức độ 95% từ in vitro Ở Hà Lan, việc sử dụng vật liệu in vitro đang tăng lên một cách vững chắc Ở Hàn Quốc, công nghệ sản xuất giống

khoai tây sạch bệnh đã phát triển ở trình độ cao Giống khoai tây sạch bệnh chủ yếu

được sản xuất từ in vitro và công nghệ thủy canh Năm 2001, diện tích trồng khoai

tây bằng nguồn giống khoai tây sạch bệnh chiếm khoảng 50% tổng diện tích trồng khoai tây ở Hàn Quốc [54]

Các thành tựu trên đã cho thấy kĩ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào

đã và đang đóng góp quan trọng trong việc nhân nhanh, chọn tạo và cải thiện giống cây trồng nông - lâm nghiệp Nhiều giống cây trồng có giá trị đang được úng dụng vào thực tiễn sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân, các công ty ở nhiều quốc gia Trong tương lai gần, nhiều giống cây trồng chất lượng cao được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào sẽ thay thế dần các cây giống sản xuất

từ phôi hạt, đặc biệt là các cây nông nghiệp

1.4.2 Một số thành tựu về cây trồng biến đổi gen

1.4.2.1 Thành tựu về cây trồng biến đổi gen

Hiện nay, phần lớn những nghiên cứu về cây trồng biến đổi di truyền (GMC) đều được tiến hành ở các nước phát triển, chủ yếu là Bắc Mỹ và Tây Âu Tại các nước công nghiệp, các công ty công nghệ sinh học đã đi đầu trong việc ứng dụng kỹ thuật biến đổi gen vào cây trồng nông nghiệp Tuy nhiên, gần đây, nhiều nước đang phát triển cũng đã bắt đầu những nghiên cứu về công nghệ gen

Thử nghiệm ngoài đồng ruộng đầu tiên là cây thuốc lá biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ, được tiến hành ở Mỹ và Pháp năm 1986 Trong giai đoạn 1986 -

1997, bắt đầu thời điểm thương mại hoá cây trồng biến đổi gen Các thử nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tượng là 60 loại cây trồng Trong thời

kỳ này, những loại cây trồng biến đổi gen được thử nghiệm là : Ngô, cà chua, đậu tương, cải dầu, khoai tây và bông với các đặc tính được quan tâm nhất như kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu và kháng virus Các cây chuyển gen đầu tiên được thương mại hoá trên thị trường Mỹ là cây cà chua chuyển gen Flavor Saver mang gen chín chậm

Năm 2009 có 25 nước canh tác các giống cây trồng biến đổi gen đã được thương mại hóa và có 32 nước cho phép nhập khẩu và sử dụng cây trồng biến đổi gen làm lương thực và thức ăn chăn nuôi, nâng tổng số nước cho phép sử dụng cây trồng biến đổi gen trên toàn thế giới lên con số 57 nước Ưu tiên hàng đầu của CNSH trong giai đoạn 2010 - 2015 là phát triển và sử dụng hệ thống quản lý mới, phù hợp hơn, tiết kiệm thời gian và chi phí hơn Tiếp theo là tăng cường hỗ trợ tài

chính, khoa học và chính sách cho các hoạt động nghiên cứu phát triển và ứng dụng cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu

1.4.2.2 Các nghiên cứu chuyển gen vào cây khoai tây

a) Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 2007, Soto đã nghiên cứu biến nạp gen bar kháng thuốc diệt cỏ vào

đoạn thân cây khoai tây Theo phương pháp này hiệu quả biến nạp đạt 68%, chồi tái sinh hình thành sau 4-5 tuần nuôi cấy trong môi trường chọn lọc có bổ sung 2 mg/l

phosphinothricin [43]

Theo Gonzalez (2008), có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến quá trình biến nạp của khoai tây như ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng, ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy hay nồng độ AS Ông cho rằng, ở 280C, nồng độ AS 200

uM cho hiệu quả biến nạp cao hơn so với nồng độ AS 400 uM Tuy nhiên ngược lại

ở 250C hiệu quả biến nạp như nhau ở hai nồng độ AS này [28]

Tổ chức Dịch vụ nghiên cứu Nông nghiệp (ARS) của Bộ Nông Nghiệp Hoa

Kỳ đã phát triển một dòng khoai tây mới kháng được tuyến trùng gây bệnh sưng rễ (Columbia root-knot nematode: CRN), một vi sinh vật gây thiệt hại hàng năm cho ngành khoai tây Hoa Kỳ khoảng 40 triệu USD Tuyến trùng này phát triển ở vùng Tây Bắc Thái Bình Dương và một số vùng trồng khoai tây chủ lực ở Hoa Kỳ Người ta thường sử dụng hoá chất dạng xông hơi để quản lý tuyến trùng Kiểm soát CRN bằng hoá chất khá hiệu quả, nhưng rất đắt tiền Người ta ước chừng người trồng khoai tây phải mất 20 triệu USD mỗi năm để kiểm soát tuyến trùng Tính

trạng kháng tuyến trùng CRN được quan sát từ giống khoai tây hoang dại Solanum bulbocastanum Nhưng loài hoang dại và loài thuần hoá có bộ nhiễm sắc thể khác

nhau, không tương hợp nhau, do đó, không thể áp dung lai cổ điển để có con lai mong muốn Vì thế, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần Họ

tiến hành dung hợp tế bào trần của S bulbocastanum và giống khoai thuần, rồi tiến

hành lai hồi giao để loại bỏ các tính trạng không mong muốn Các gen marker liên kết với gen kháng RMc1 của giống khoai tây hoang dại đã được sử dụng để xác

định của mức độ kháng sau khi lai Giống khoai tây mới này sẽ phải được khảo

nghiệm trên đồng ruộng hai năm trước khi nó có thể trở thành giống thương mại

b) Tình hình nghiên cứu trong nước

Công nghệ sinh học đã làm nên nhiều điều kỳ diệu, góp phần tăng năng suất

và đáp ứng nhu cầu của cuộc sống Chỉ tính riêng trong lĩnh vực nông nghiệp, nhiều giống cây trồng vật nuôi có giá trị đã được chọn tạo bằng công nghệ sinh học Nhiều gen quý như các gen quy định năng suất, chất lượng, chống chịu đã được phân lập và chuyển gen vào cây trồng, vật nuôi tạo nên những giống lý tưởng Ở Việt Nam, nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang đựơc tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng chủ yếu tại Viện công nghệ sinh học, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện sinh học nhiệt đới và Viện nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long

Trong lĩnh vực chuyển gen, do còn nhiều hạn chế về thiết bị, kỹ thuật nên các công trình về chuyển gen còn ít nhưng trong thời kỳ gần đây cũng thu được những thành công bước đầu Năm 1994, Phan Tố Phượng và cộng sự đã chuyển gen

qua Agrobacterium vào cây Arabidopsis Cùng năm đó tại thành phố Hồ Chí Minh,

Nguyễn Thị Liên Chi và cộng sự đã chuyển thành công gen kháng kanamycin vào cây thuốc lá Năm 1995, Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự đã thu được những cây cà chua

có khả năng kháng kanamycin với nồng độ 100 mg/l và các mô lá, thân, rễ, đều có

phản ứng mầu với X-Gluc biểu hiện sự có mặt của gen gus Tiếp đó năm 1997 Trần

Thị Phương Liên và Nông Văn Hải đã tiến hành nghiên cứu và chuyển tổ hợp gen

GUS-BNG vào cây thuốc lá Đặng Trọng Lương và Nguyễn Đức Doanh cũng đã sử dụng phương pháp chuyển gen gián tiếp để đưa gen Cryla(c) vào một số giống bắp

cải và đã thu được những giống mới có giá trị kinh tế cao

Tại Viện di truyền nông nghiệp, nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành nhằm mục đích xây dựng quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng, làm cơ sở cho bước chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng Một số phòng thí nghiệm đã thu được thành công nhất định khi nghiên cứu và áp dụng thành công để đưa các gen giá trị vào hàng loạt các cây trồng quan trọng như: lúa, cà chua, khoai tây, bắp cải, xúp lơ

Ở Việt Nam cho đến nay chưa có nghiên cứu nào về chuyển gen vào khoai tây Nguyên nhân là do chưa có văn bản quy phạm về hệ thống tiêu chuẩn giống khoai tây của Việt Nam để làm cơ sở cho việc sản xuất, kiểm định và xác nhận chất lượng giống khoai tây; công nghệ bảo quản khoai tây giống cũ kỹ và thiếu thốn; hệ

thống phòng nuôi cấy in vitro, phòng kiểm tra bệnh, hệ thống nhà lưới, địa điểm

nhân giống còn chưa đáp ứng yêu cầu Có lẽ, đây chính là lý do vì sao các dự án nông nghiệp công nghệ cao của nước ta thực hiện chậm chạp, thậm chí thất bại và chặng đường vươn tới nền nông nghiệp hiện đại vẫn còn xa vời

Chương 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Chúng tôi sử dụng hai giống khoai tây Atlantic do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

Cho các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen, hai loại mẫu mô là đoạn cắt đốt

thân và mẫu lá đã được sử dụng làm vật liệu khởi đầu

2.2.2 Vật liệu di truyền

Chúng tôi đã sử dụng các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58, AGL-1, EHA105 mang vector nhị phân pCAMBIA1301 chứa gen chỉ thị gus và gen chọn lọc hpt (hygromycin phospho transferase) do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp Trong vùng T-DNA có gen chỉ thị gus, gen này được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi đoạn intron Catalase Đoạn gen khởi động (Promoter) của gen gus là CaMV35S, đoạn kết thúc là chuỗi NOS polyA Chỉ thị chọn lọc thực vật là gen hpt (gen kháng hygromycin) được điều

khiển bởi CaMV35S, kết thúc bởi chuỗi polyadenine (hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 Chủng AGL-1 mang vector nhị phân p6d35S-GUS (ký hiệu AA39) được sử

dụng trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của vector chuyển gen đến khả năng

biểu hiện gen gus tạm thời ở khoai tây Vector này cũng mang gen chỉ thị gus, được

điều khiển bởi promoter Ubiquitin (Ubi), và gen chỉ thị chọn lọc hpt được điều

khiển bằng promoter p6d35S-GUS (hình 2.2)

Hình 2.2 Cấu trúc vector p6d35S-GUS

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi

- Đánh giá ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng

mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng taọ callus từ các dạng mô khác nhau

- Đánh giá ảnh hưởng của Casein hydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

2.2.2 Nghiên cứu tái sinh chồi