Góp phần nghiên cứu sàng lọc acid shikimic trong một số cây thuốc ở việt nam

Trong những năm gần đây, acid shikimic còn được biết đến với vai trò quan trọng mới, nó là nguyên liệu dùng để tổng hợp osletamivir – hoạt chất chính của Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1. Hiện nay, acid shikimic dùng để tổng hợp Tamiflu được chiết xuất chủ yếu từ quả của cây Hồi đây là nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòng chống cúm gia cầm.

ĐẶT VẤN ĐỀ Acid shikimic từ lâu được biết đến là một hợp chất trung gian quan trọngtrong quá trình sinh tổng hợp một số acid amin thơm như phenylalanine,tyrosin, tryptophan; và một số hợp chất alcaloid Acid shikimic có thể đượcphân lập từ vi khuẩn như E coli hay từ một số loài thực vật.

Trong những năm gần đây, acid shikimic còn được biết đến với vai trò quantrọng mới, nó là nguyên liệu dùng để tổng hợp osletamivir – hoạt chất chínhcủa Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1 Hiện nay, acidshikimic dùng để tổng hợp Tamiflu được chiết xuất chủ yếu từ quả của câyHồi - đây là nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòngchống cúm gia cầm

Tuy nhiên, Hồi không phải là loại cây dễ trồng, và phải đợi khoảng 5-7năm mới có thể thu hoạch quả được, và phải hơn 10 năm mới cho thu hoạch ổnđịnh Hơn nữa, cây Hồi là cây có vùng phát triển hẹp, cây thích nghi vùng đồinúi thấp, nhiệt độ trung bình 21-230C; lượng mưa hàng năm vào khoảng 1450-1600mm Như vậy, nếu chỉ trông chờ vào cây Hồi thì sẽ không đáp ứng đượcnhu cầu về nguyên liệu acid shikimic, việc tìm ra các nguồn dược liệu khác cóchứa acid shikimic là rất quan trọng

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Góp phần nghiên cứu sàng lọc acid shikimic trong một số cây thuốc ở Việt Nam” nhằm mở rộng nguồn dược liệu

có chứa acid shikimic

Đề tài gồm các nội dung sau :

1 Định tính acid shikimic trong một số dược liệu bằng SKLM

2 Định lượng hàm lượng acid shikimic trong các dược liệu bằng HPLC

3 Xây dựng quy trình chiết tách và tinh chế acid shikimic từ dược liệu cóhàm lượng cao ở quy mô phòng thí nghiệm

PHẦN I :

TỔNG QUAN

1.1.ACID SHIKIMIC

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất chung :

Acid shikimic có công thức phân tử C7H10O5 ; tên khoa học (3α,4α,5i)]-3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexem-1-carboxylic acid ; phân tử khối174,15 [30]

[3R-Công thức cấu tạo :

nhiều trong nước (18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,5%), không tan trongether, cloroform, benzen và ether dầu; có đỉnh hấp thụ cực đại trong ethanol ởbước sóng 213nm [30]

1.1.2 Các phương pháp định tính, định lượng acid shikimic

hiệu cho SA, một số acid hữu cơ khác như acid quinic cũng cho màutương tự [27].

- Phương pháp SKLM: được sử dụng để định tính SA từ những năm 1960[27] Sử dụng hệ dung môi thích hợp để chấm sắc ký so sánh chất thửvới SA chuẩn Một mẫu có SA dương tính nếu có vết cùng Rf và cùngmàu sau khi phun thuốc thử với SA chuẩn

- Phương pháp HPLC: gần đây HPLC là phương pháp phổ biến để địnhlượng các chất trong đó có SA [10], [20], [23]

* Phương pháp định lượng acid shikimic

Có nhiều phương pháp được áp dụng để định lượng acid shikimic như:

- Phương pháp HPLC với detector UV: phương pháp này được áp dụng dựavào việc xác định đường chuẩn của SA chuẩn, phát hiện SA ở bước sóng210nm [20], [23], [24]

- Phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC): phương pháp này được tiến hànhbằng cách tạo dẫn xuất trimethylsilyl Sử dụng cafein làm chất chuẩn nội,cột IO và 200 mesh gas – chrom Q với detector FID, nhiệt độ buồng tiêmmẫu và buồng cột lần lượt là 210 và 1850C [18], [19]

- Phương pháp chuẩn độ: SA sau khi được tách cột Dowex-1x 8 column,chuẩn độ bằng NaOH loãng [16], [25]

1.1.3 Vai trò và tác dụng

* Vai trò

Acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp củanhiều hợp chất thiên nhiên như các acid amin thơm như phenylalanin,tryptophan và tyrosin, và các alcaloid, các hợp chất phenolic, các phenylpropanoid [27], [11], [28]

Acid shikimic là chất trung gian hóa học quan trọng trong các quá trìnhchuyển hóa trong thực vật và vi sinh vật (con đường shikimat)

Những năm gần đây, acid Shikimic được biết đến với vai trò mới, nó lànguyên liệu để bán tổng hợp oseltamivir làm thuốc điều trị cúm H5N1

* Tác dụng

Các nhà khoa học đã chứng minh acid shikimic có tác dụng giảm đau,chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa, ngăn cản sự phát triển của tế bàoung thư [24]

1.1.4 Tình hình sản xuất acid shikimic hiện nay

Hiện nay,đã có nhiều nghiên cứu công bố về việc phân lập và tinh chế SA

từ quả Hồi Theo đó, người ta nghiên cứu chiết xuất SA từ quy mô phòng thínghiệm đến pilot và quy mô công nghiệp Các cơ sở nghiên cứu công bố có thểđáp ứng được một khối lượng lớn SA [9]

Trong những năm gần đây, xuất hiện nhiều nghiên cứu mới về các phươngpháp sản xuất SA khác nhau, có thể lên men vi khuẩn E coli, có thể ức chếcon đường shikimat ở thực vật để tăng tích lũy SA, và cũng có những nghiêncứu tổng hợp hóa học hoàn toàn [9] Tuy nhiên những nghiên cứu đó vẫn chỉdừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào công nghiệp donhiều hạn chế Vì vậy, cho tới nay, việc sản xuất SA đi từ dược liệu vẫn làphương pháp được áp dụng, do vậy việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới cókhả năng cung cấp SA thay thế cho cây Hồi là một vấn đề cấp thiết hiện nay

1.2 Các dược liệu có chứa acid shikimic

Acid shikimic được phân lập lần đầu tiên từ cây Hồi Nhật Bản (Illicium

anisatum) vào năm 1885 Tuy nhiên phải sau gần 50 năm cấu trúc của nó mới

được xác định[32] Sau đó, acid shikimic cũng được tìm thấy và được phân lập

từ nhiều cây khác như Hồi (Illicium verum Hook.f.), Canh-ki-na (Cinchona

spp.), Kha tử (Terminalia chebula), Chuối tiêu (Musa sapientum), Hướng

dương (Heliantuns annuus), Bạch quả (Ginko biloba), Tiểu hồi (Foeniculum

vulgare), Liquidambar styraciflua…[32], [26].

Hiện nay, phần lớn acid shikimic để sản xuất Tamiflu vẫn chủ yếu đượcchiết xuất từ quả Hồi Tuy nhiên, phải mất 5-7 năm sau khi trồng cây mới bắtđầu cho thu hoạch quả được, và phải hơn 10 năm mới bắt đầu cho thu hoạch

ổn định Hơn nữa, cây Hồi là cây có vùng phát triển hẹp, cây thích nghi vùngđồi núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-230C; lượng mưa hàng năm vào khoảng1450-1600mm Cây được trồng trên loại đất feralit đỏ vàng, mới được khaiphá, có pH 4-5,5 [2] Như vậy, nếu chỉ trông chờ vào cây Hồi thì sẽ không đápứng được nhu cầu về nguyên liệu acid shikimic, việc tìm ra các nguồn dượcliệu khác có chứa acid shikimic là rất quan trọng

Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát acid shikimic trêncác cây sau : một số loài Hồi, Cỏ ngọt, Bụp giấm, Dây thìa canh, Bồ công anh,

Ban tròn

1.2.1 Đại Hồi (Illicium verum Hook.f Illiaceae )

* Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái

Đại Hồi còn gọi là Bát giác hồi hương, Hồi hương, Hồi sao, Mác chác, MácHồi (Tày), Pit cóc (Dao) [2]

Là cây gỗ nhỏ, cao 6-8m, có thể đến 10m hay hơn Cây có nhiều ở miềnNam Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, đây là hai khu vực cung cấp nguồnnguyên liệu và tinh dầu Hồi chủ yếu cho thế giới

Ở Việt Nam, cây Hồi có nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng Gần đây phát triểnrộng ra Quảng Ninh, Bắc Kạn, Lai Châu và Hà Giang [1,2] Cây thích nghivùng đồi núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23 0C, lượng mưa trung bình hàngnăm từ 1450 – 1600mm

Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng 8-10,

vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho

thu hoạch Sau 15 năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm,năng suất tương đối ổn định ở mức 20-30 kg/năm [2].

* Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của cây hồi, nhất là quả Hồi đã được nghiên cứu khá kỹ.Ngoài hai thành phần chính được quan tâm nhiều là tinh dầu và acid shikimic,quả hồi còn có chứa các thành phần catechin, protocatechin, tinh dầu, dầu béo,acid protocatechuic, acid shikimic, secocycloartan, phenpropanoid và các chất

vô cơ… Lá có chứa tinh dầu Hạt chứa dầu béo [2], [20]

* Công dụng

Người ta chiết xuất lấy tinh dầu Hồi dùng làm nước hoa, hương liệu cho đồuống…Tinh dầu Hồi là một thành phần trong các cao xoa, cao dán để giảmđau khi bị sai khớp, bong gân, chấn thương bầm tím, đau lưng [2], [8]

Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam, các phương pháp chiết xuất, định tính,định lượng SA từ quả Hồi đã và đang được nghiên cứu khá kỹ Hàm lượng SAtrong quả Hồi được công bố khoảng 5 – 8% [8]

1.2.2 Các loài Hồi khác

Chi Illicium ở Việt Nam hiện có 14 loài [5] Trong số các loài Hồi đó, chỉ

loài Hồi trồng (I verum) là loài có diện tích lớn, tập trung và có giá trị cao do

sản phẩm (tinh dầu, quả khô) được sử dụng rộng rãi và hàm lượng acidshikimic thu được khá cao Các loài còn lại chủ yếu mọc hoang và sử dụngtrong dân gian trong một số bài thuốc dân tộc (rễ Hồi núi ngâm rượu chữabong gân, hoặc trong một vài bài thuốc trị thương của những người học võnghệ) Với mục đích tìm kiếm nguồn dược liệu có SA, chúng tôi đã thu mẫu vàtiến hành khảo sát SA trong 2 loài Hồi mọc hoang là Hồi lá nhỏ và Hồi lámỏng

Hồi lá nhỏ có tên khoa học là I parviflorum, hiện nay mới chỉ thấy phân bố

ở Bạch Mã (TT Huế), Bà Nà ( Đà Nẵng) Trong đề tài này chúng tôi gọi tênmẫu là Hồi Bạch Mã và Hồi Bà Nà

Hồi lá mỏng có tên khoa học là I tenuifolum, phân bố ở Nghệ An, Gia Lai,

Lâm Đồng, Khánh Hòa Mẫu được sử dụng trong đề tài được lấy từ Pù Mát –Nghệ An, nên gọi tên là Hồi Pù Mát

1.2.3 Bụp giấm

Bụp giấm còn được gọi là Cây giấm, đay Nhật; tên khoa học là Hibiscus

sabdariffa L họ Bông Malvaceae.

* Mô tả, phân bố, sinh thái

Bụp giấm là cây bụi, cao 1 – 2 m, sống nhiều năm, nhưng trong sản xuấtngười ta chỉ trồng một năm rồi phá đi trồng lại Cây dễ trồng, không kén đất,

có khả năng chịu hạn, không chịu úng, được nhân giống bằng hạt và cành.Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á và châu Phi

Bộ phận dùng là đài hoa, lá và quả Để chiết xuất SA, người ta sử dụng đài hoaBụp giấm [10]

Lá, đài hoa và quả cong chữa bệnh scorbut Đài hoa mọng nước sắc lấy nướcuống hoặc hãm uống giúp tiêu hoá và trị các bệnh về mật, cũng dùng điều trịbệnh về tim và thần kinh, huyết áp cao và xơ cứng động mạch [2], [5].

1.2.4 Cỏ ngọt

Cỏ ngọt còn được gọi là Cỏ đường, Cúc ngọt, có tên khoa học là Stevia

rebaudiana Bert họ Cúc Asteraceae.

* Mô tả, phân bố, sinh thái

Cây thảo, sống nhiều năm, cao 30-60cm Mùa hoa tháng 5-9 Bộ phận dùng

là lá Hiện nay được trồng phổ biến ở Việt Nam Là cây ưa ẩm và ưa sáng, sinhtrưởng tốt vào vụ xuân – hè, trồng một lần có thể thu hoạch trong 2 – 3 nămMùa hoa tháng 5-9 Bộ phận dùng là lá [2], [4], [5]

* Thành phần hoá học

Lá chứa các heterosid diterpenic dẫn xuất của phyllocladen: steviosid (7%),rebaudiosid và dulcosid

Steviosid có độ ngọt gấp 150-280 lần cao hơn saccharose [2], [4], [5]

Ngoài ra lá Cỏ ngọt còn chứa acid shikimic với hàm lượng 0,66% [10]

* Công dụng

Cỏ ngọt được sử dụng rộng rãi để lấy chất thay thế đường (steviosid) trongcông nghiệp thực phẩm (làm chất điều vị cho bánh mứt kẹo, nước giải khát),trong công nghiệp dược phẩm (thuốc thay thế đường trong đái tháo đường vàmập phì) Người ta sử dụng bột lá Cỏ ngọt khô để làm chất điều vị ngọt cho tràtúi lọc, trà thuốc[2], [5]

1.2.5 Dây thìa canh

Còn có tên khác là Dây muôi, tên khoa học là Gymnema sylvestre họ Thiên

lý Acclepiadaceae

* Mô tả

Dây leo cao 6-10m, lá có phiến bầu dục Thường mọc trong các bờ bụi, hàngrào tại một số nơi ở miền Bắc Việt Nam như Haiir Dương, Hải Phòng, BắcGiang, Ninh Bình, Thanh Hóa.

Hoa nhỏ, màu vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, dài 8mm, rộng 15mm, đài có lông mịn; tràng không có lông ở mặt ngoài, tràng phụ là 5 răng[4].Quả đại dài 5,5cm, rộng ở nửa dưới, hạt dẹp, lông mao dài 3cm

1.2.6 Bồ công anh – Trung Quốc

Tên khác là Bồ công anh thấp, tên khoa học là Taraxacum officinale, họ Cúc

Asteraceae

* Mô tả, phân bố, sinh thái

Cây thảo, sống một năm hay nhiều năm, cao 0,2 – 0,4 cm, không có thân [2],[4], [5] Phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm, á nhiệt đới thuộc châu Âu, châu

Mỹ và châu Á Được nhập vào Việt Nam từ lâu nhưng đến nay đã trở nênhoang dại ở một số vùng núi cao 900m trở lên như Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sa

Pa, Bắc Hà (Lào Cai), Sìn Hồ (Lai Châu), Đà Lạt (Lâm Đồng)…[2]

Cây được nhân giống từ hạt Sau khi ra hoa quả, cây tàn lại, hạt có túm lôngđược gió phát tán đi khắp nơi Vòng đời của cây dài khoảng 3 – 5 tháng

Bộ phận dùng là toàn cây, gồm rễ, thân và lá

* Thành phần hóa học

Toàn cây Bồ công anh TQ chứa 0,98% flavonoid toàn phần: lactopicrin,taraxacin, taraxasterol,  - sitosterol, stigmasterol…Ngoài ra còn có nhựa, tinhdầu, pectose, acid béo, sáp [2],[4],[5]

Theo nghiên cứu gần đây, cây Bồ công anh có chứa 1,21% acid shikimic [10]

* Công dụng

Toàn cây dùng để chữa sưng vú, viêm tuyến vú, ít sữa, tiểu tiện khó, nhiễmkhuẩn tiết niệu, mụn nhọt, sưng tấy

Ở Trung Quốc còn dùng để chữa đau mắt, tiêu hóa kém, rắn cắn

Ở Pháp, Bồ công anh thấp còn chữa các bệnh gan mật, các bệnh tiêu hóa, sỏithận, tiểu tiện ít, tăng cholesterol, xơ vữa động mạch, béo phì…[2], [4], [5]

1.2.7 Ban tròn

Tên khoa học là Hypericum patulum họ Ban Hypericaceae.

* Mô tả, phân bố, sinh thái

Cây thảo nhỏ, sống một năm hay hai năm, cao 10 – 20 cm Thân cứng, nhẵn,không phân nhiều nhánh

Cây phân bố ở hầu hết các tỉnh từ vùng đồng bằng đến trung du và miền núiphía Bắc Cây mọc từ hạt vào cuối xuân hoặc đầu hè, sinh trưởng và phát triểnnhanh, khoảng 3 – 4 tháng là lụi tàn Quả khi chín tự nứt, hạt vương vãi trên

mặt đất, có thể tồn tại trong một thời gian dài, qua đông đến mùa xuân sangnăm mới nảy mầm.

Bộ phận dùng là toàn cây phơi khô

* Thành phần hóa học

Toàn cây chứa sarotranol, isojaca

Từ phần trên mặt đất đã phân lập được 2 chromon glycosid

Cho tới nay, đã có một số thông báo về sự có mặt của SA trong một số loài

thuộc chi Hypericum, nhưng chưa có bất cứ tài liệu nào công bố về H patulum

* Công dụng

Theo dân gian, cây Ban được dùng để chữa viêm gan vàng da, trẻ em lên sởi,vết thương sưng đau, mụn nhọt, sâu răng, hôi mồm, ho, có nơi dùng chữa rắncắn

Ở Trung Quốc còn dùng để chữa viêm gan cấp hoặc mãn, viêm ruột thừa,viêm amidan, cam tích ở trẻ em

Trong số các dược liệu trên, hiện nay ở Việt Nam mới chỉ có các nghiên cứu

về acid shikimic trên các loài Đại Hồi (Illicium verum), những loài Hồi khác

và dược liệu còn lại đang được bước đầu nghiên cứu trên thế giới Chính vìvậy chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mở rộng nguồn nguyên liệu cho acidshikimic

PHẦN II:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu :

- Lá các mẫu Hồi được thu hái tại Bà Nà (Đà Nẵng), Bạch Mã (Thừa Thiên

Huế), Pù Mát (Nghệ An) vào tháng 8/2009; hiện đang được lưu mẫu tại khoaTài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu

- Đài hoa Bụp giấm, được thu hái tại Bắc Giang và được lưu giữ tại khoa Phântích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu

- Lá Cỏ ngọt, Ban tròn lấy tại nơi lưu mẫu dược liệu chuẩn của khoa Phân tích,Viện Dược liệu

- Lá Dây thìa canh do Thạc sĩ Ngô Quốc Luật, trung tâm cây thuốc Hà Nộicung cấp

2.2 Dụng cụ và hóa chất :

* Dụng cụ :

- Sinh hàn đối lưu

- Bản mỏng tráng Silicagel GF 254 (Merk)

- Máy cất quay “Buchi”

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến “Carry 1E”

- Tủ sấy “Model UNB 500”

- Cân “Presica B220A”

- Máy siêu âm Ultrasonic

- Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC Shimadzu LC 10ATvp, detector chuỗi diodSPD-M10Avp

Các máy móc thiết bị được đặt tại phòng Phân tích, Viện Dược liệu

* Hóa chất :

Acid formic, cloroform, ethanol, ethylacetat, methanol, buthanol…

2.3 Phương pháp nghiên cứu :

2.3.1 Định tính acid shikimic trong các dược liệu bằng phương pháp SKLM

Chuẩn bị dịch chiết các mẫu dược liệu đem sàng lọc Tiến hành SKLM vớibản mỏng tráng sẵn silicagel (Merk) Chấm trên bản mỏng 2 vết: vết chuẩn vàvết thử Mẫu thử được cho là dương tính với SA nếu có vết cùng Rf với chuẩn

và cho cùng màu với chuẩn sau khi phun thuốc thử

2.3.2 Định lượng acid shikimic trong các dược liệu bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.2.1 Điều kiện HPLC

Hàm lượng SA trong các dược liệu được định lượng bằng phương phápHPLC với các điều kiện sau:

- Pha tĩnh: Cột Shimpac MRC (250mm  4,6mm ID, 5m)

- Pha động: Acetonitril – Dung dịch acid acetic 0,5% (5 – 95)

* Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn mẹ acid shikimic (Sigma) có nồng

độ 0,4mg/ml Từ dung dịch này pha loãng để được các dung dịch chuẩn cónồng độ thích hợp

* Dung dịch thử:

Cân chính xác 2g (chính xác đến 0,0001g) dược liệu đó nghiền nhỏ cho vàotúi giấy lọc Chiết dược liệu bằng bộ dụng cụ shoxhlet với 200 ml ethanol phântích 85% đến hết acid shikimic Thu hồi dung môi đến cạn Hòa tan cắn thuđược vào khoảng 30ml nước cất Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 20phút

Lọc lấy dịch, rửa giấy lọc bằng 5ml nước cất Gộp dịch lọc và dịch rửa, thêmnước cất vừa đủ bình định mức 50ml (ddA) Pha loãng ddA 50 lần với dungmôi pha động, lọc qua màng lọc Supelco trước khi tiêm mẫu

2.3.2.3 Khảo sát phương pháp định lượng acid shikimic

Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Được xác định từ 6 lần tiêm

lặp lại của dung dịch chuẩn có nồng độ SA thích hợp, ghi lại các giá trị về thờigian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột Xử lýthống kê các số liệu thu được để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp: Khảo sát sự phụ thuộc

tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng bằng cách pha cácdung dịch acid shikimic chuẩn có nồng độ thích hợp Xây dựng đường chuẩnhồi quy: y = ax + b Trong đó x là diện tích pic (mAU.s), y là nồng độ củadung dịch tiêm (µg), a và b là các hệ số thực nghiệm Đánh giá đường chuẩnthông qua hệ số tương quan r

Khảo sát độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại của phương pháp được

đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 phép đo riêng biệt thông qua độ lệch chuẩntương đối RSD (Relative Standard Deviation)

Khảo sát độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được

đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn

Khảo sát giới hạn định lượng của phương pháp: Đánh giá các mẫu có

nồng độ acid shikimic thấp nhất về khả năng phát hiện trên sắc ký đồ, độ đúng

và độ lặp lại bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn và tiến hành địnhlượng theo phương pháp HPLC khảo sát được

2.3.2.4 Định lượng acid shikimic trong các dược liệu nghiên cứu

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, tiếnhành phân tích và ghi lại sắc ký đồ

So sánh thời gian lưu và phổ UV-VIS của pic trên sắc ký đồ của dung dịchthử với thời gian lưu và phổ UV-VIS của pic acid trên sắc ký đồ của dung dịchchuẩn để xác định pic acid shikimic

Xác định diện tích của pic acid shikimic trên sắc ký đồ dung dịch thử Tínhnồng độ acid shikimic trong dung dịch thử dựa vào diện tích pic của dung dịchthử và đường chuẩn xây dựng

2.3.3 Xây dựng quy trình chiết tách và tinh chế acid shikimic từ dược liệu

có hàm lượng cao

2.3.4 Phương pháp xử lý kết quả

Các số liệu được xử lý bằng công cụ Data analysis của Microsoft Exel