Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký và điện di mao quản để kiểm nghiệm chất lượng một số hợp chất phenolic trong cây chè vằng (jasminum subtripliberve blume oleaceae)

Các bước xây dựng quy trình định lượng mẫu dược liệu KIEM NGHIEM CÁC HOP CHAT TU NHIEN Xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên bằng phô MS, NMR Phuong pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Nguyễn Thị Hồng Hương

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ

VA DIEN DI MAO QUAN DE KIEM NGHIEM

CHAT LUQNG MOT SO HOP CHAT PHENOLIC

TRONG CAY CHE VANG

(Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc

Mã Số: 62.73.15.01

LUẬN ÁN TIỀN SĨ DƯỢC HỌC

“Thầy hướng dẫn: PGS TS Trịnh văn Quỳ

PGS TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu

của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong

luận án là trung thực và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyen Thi Hing Huong

LOI CAM ON

Tôi xin bay tö lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Trịnh Văn Quỳ, nguyên Viện trưởng Viện Kiểm Nghiệm Thuốc

TW và nguyên Chủ tịch Hội đồng Dược Điển Việt Nam đã tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên

cứu để tôi hoàn thành luận án

PGS.TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, nguyên Trưởng ban Nghiên cứu

Khoa học - Đại học Y Dược TP.HCM, người thầy đầu tiên đã tận tình

hướng dẫn tôi trong công tác nghiên cứu — giảng dạy, đã giúp đỡ và tạo

iều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành mọi nhiệm vụ trong những năm qua

PGS.TS Dặng Văn Hòa, nguyên Chủ nhiệm bộ môn lúa phân tích —

Kiểm nghiệm, Đại học Y Dược TP.HCM người thầy đầu tiên dẫn dắt tôi

vào chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc đã gợi ý và giới thiệu đẻ tài để tôi

nghiên cứu luận án

GS.TS Hermann Stuppner Vign trường Viện Được liệu, các GS PGS

TS và các đồng nghiệp tại Đại Học Innsbruck đã giúp đỡ và tạo điều kiện

thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu tại Cộng hòa Áo

Ban Giám hiệu, Trưởng Đại học Dược Hà Nội ; Ban Chủ nhiệm Khoa

Dược Đại học Y Dược TP.HCM; Các giảng viên và nhân viên bộ môn

Hóa phân tích — Kiểm nghiệm, bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược

TP.HCM, bộ môn Hóa phân tích, phòng Sau đại học Trường Đại học

Được Hà Nội và ban Giám đốc cùng anh chị em nhân viên Khoa Vật lý đo

lường Viện Kiểm Nghiệm Thuắc TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và

gitip đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Các thầy cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn

thành luận én này

Và cuối cùng con cấm ơn Ba Mẹ, cám ơn các anh chị em, các cháu, hai

con gái và chẳng tôi đã nâng đỡ, động viên — chia sẻ mọi khó khăn trong

cuộc sống để tôi có được kết quả này

Nguydn Thi King Kurong

MỤC LỤC

‘Trang phy bìa Loi cam đoạn Lời cám ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng Danh mục các hình

DAT VAN DE

CHUONG 1 TONG QUAN

HOP CHÁT TỰ NHIÊN TRONG DUOC LIEU tt: Chất chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu

1.1.2 Các bước xây dựng quy trình định lượng mẫu dược liệu

KIEM NGHIEM CÁC HOP CHAT TU NHIEN

Xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên bằng phô MS, NMR

Phuong pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

Phương pháp điện di mao quan - CE

SƠ LƯỢC VỀ HỢP CHAT PHENOLIC

13.1 Đại cương

iv viii xii xiv

DUNG MOI, HOA CHAT VA TRANG THIET BI

Dung môi hóa chất

Các chất chuẩn

Thiết bị thí nghiệm

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

Nghiên cứu chiết tách các hợp chất phenolic glycosid

Xác định cấu trúc các hợp chất tỉnh khiết

Xây dựng phương pháp định lượng một số hợp chất phenolic

trong ché ving bing HPLC

Xây dựng phương pháp định lượng một số hợp chat phenolic

trong chè vằng bằng CE

Phân tích số liệu thực nghiệm

CHƯƠNG 3 KÉ T QUA THYC NGHIEM

CHIẾT TÁCH CAC HOP CHAT PHENOLIC TRONG

CHE VANG LAM CHUAN BOI CHIEU

Chiết xuất các hợp chất phenolic trong ché ving

Dinh tính và kiểm tra độ tỉnh khiết cdc hop chit Ju

Định tính các chất phenolic trong chè vằng bằng LC-MS

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC

BANG PHO MS, NMR

Xác định cấu trúc flavonoid

Xác định cấu trúc các chất phenylethanoid glycosid

Biện giải cầu trúc một phenylethanoid glycosid mới

Xác định hàm lượng một số hợp chất phenylethanoid

glycosid bing LC-MS

DINH LUGNG MOT SO HOP CHAT PHENOLIC TRONG

CHE VANG BANG PHUONG PHAP HPLC

39

39

40

40 4I 4I

DINH LUGNG MOT SO HOP CHAT PHENOLIC TRONG

CHE VANG BANG PHUONG PHAP CE

Jo Jos J Ju trong che

3.4.1 Quy trình xử lý mau thir

34.2 Chuẩn bị các dung dịch nội chuẩn và chuẩn ngoại

3443 Định tính các chất IS, Ji, Jo, Js, Jo };, Jạ¡ bằng phương pháp CE

3.4.4 Xây dựng phương pháp phân tích 3.4.5 Đánh giá phương pháp phân tích

34.6 Định lượng các hợp chất I,, J›, Jo, Jn trong cdc mau ché ving

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN

41 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

4.1.1 Chiết tách pha rắn (SPE) 4.12 Sắc ký ngược dòng tốc độ cao HSCCC 4.143 Sắc ký cột sephadex LH 20

4.14 Phương phápprep-HPLC 4.1.5 Phuong phap LC-MS

TRONG CHE VANG BANG PHUONG PHAP HPLC

Quy trình chiết, xử lý mẫu

TRONG CHE VANG BANG PHUONG PHAP CE

4.5.1 Quy trinh tach CZE

45.2 Kết quả thâm định phương pháp

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BÓ CỦA TÁC GIẢ

LIEN QUAN DEN BE TAI

‘TAI LIEU THAM KHAO

Bis-tris: bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl) methane

Bis-tris-propane: 1,3 bis{tris(hydroxymethyl) methylamino}propane CAPSO Acid 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-I-propanesulfonic CHAPS _ 3-|(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonat CHAPSO — 3-{(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1-

CZE Điện di mao quản vùng (Capillary zone electrophoresis)

EOF Electro-osmotic flow — đòng điện thấm

EF Dang dign di Electrophoretic flow) DTAB Dodecyltrimethylammonium bromid HDB Hexadimethrin bromid

MEKC Sắc ký mixen điện động (Micellar Electrokineic

Chromatography) Mops Acid 3 — morpholinopropanesulfonic MOPSO Acid B— hydroxy 4— morpholinopropanesulfonic SDS Natri dodecyl sulphat (Sodium dodecyl sulfate) STS Natri tetradecyl sulphat (Sodium tetradecyl sulfate)

tự “Thời gian di chuyển (Migration time)

TRIS ‘Tris (hydroxymethyl) aminomethane

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

ECD Detector dign héa (Electrochemical detector)

LC-MS Sắc ký lỏng ghép detector khéi phd (liquid chromatography

"Thời gian lưu (Retention time)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Preparative high

performance liquid chromatography)

Sac ky ct (Column chromatography) Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (High Speed countercurrent

chromatography) Phân đoạn

Số vòng quay trong một phút (Rotation per minute)

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonanee) Methanol deteuri hóa

Nhiều đỉnh không xác định (Multiplet) Đỉnh bến (Quartet)

Dinh don (Singlet) Triplet (dinh ba)

Độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation)

Độ lệch chuẩn (standard deviation)

Acid acetic Dung dich Ethyl acetat Ethanol Aceloniil Methanol

Nong độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration)

37 3.8

3.9 3.10

3.11 3.12

3.13 3.14 3.15 3.16

'Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật chè vằng

Kết quả phản ứng màu định tính các hợp chất phenolic trong

ø

"Thời gian lưu, phổ UVvà MS của các hợp chất J - Ju

Dữ liệu phổ 'H, 'C NMR ` với tương tác HMBC quan trong

chè

cia Jy, 6’ — O = menthiafoloylverbascosid so sánh với phổ 'H,

PC NMR của verbascosid và C NMR của acid 6 - O

Độ chính xác trong ngày và giữa các ngày

Độ đúng của các hợp chất Jy, Jo, Jo Jy Jus trong mẫu Jass 3a

Hàm lượng (mg/g) cae chat J), Jp, Iq, Jp 45, Ji) trong các mẫu chè vằng (œ = 0,05)

Đô lặp trung gian của thời gian di chuyển trung bình

Độ đúng của Jụ, Jạ, Jos Jr trong mau ché vằng Jass 3b

Ham lugng (mg/g) cdc chit Jy, Jp, Js, Jø, J; trong các mẫu chè

viing bing CE (0 = 0,05)

Khoang tuyén tinh va hé sé tuong quan R cua cac chit Ji, J2

đe J› Jịị trong phương pháp HPLC

Bang so sánh độ chính xác và độ đúng của các chat Jr, Jn, Jo,

Jn, Su trong phurong phép HPLC

Khoảng tuyến tính và hệ số tương quan R của các chất Jj, Jo

Jc, J› trong phương pháp CE

Bảng so sánh độ chính xác và độ đúng của các chit Jt, Ja, J« Jy

trong phương pháp CE

Hình số 'Tên hình Trang

12 Sơ đồ điển hình máy điện di mao quản 21

14 Điện di đồ các flavonoid trong dich chiết ethanol Azadirachta 29

indica

15 Dign di dd cia verbascosid, echinacosid, pediculariosid A& M 29

trong P longifolia

17 Khung cấu tạo của phenylethanoid 31 L8 Mét sé terpenoid cé trong 14 ché ving Jasminum subtriplinerve 35

Blume Oleaceae

19 Các chế phẩm trà tir ché ving 37

2.10 (Canh la ché ving Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae 39

3.11 Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenolic glycosid từ cành lá chè 52

ving

3.12 Sơ đồ phân lập các hợp chất phenolic từ cành lá chè vằng 53 3.13 Sic ky dé TLC cia cdc chit tich tir ché ving 54 3.14 Sac ky dé HPLC va phé UV cita cdc hop chat J2, Js, Js Js Jao 55 3.15 Sắc ky 4 HPLC va phé UV cia cdc hop chit Ji, Ja, Js, Je Jr 56

Ju 3.16 Sic ky dé HPLC cita cdc hgp chat J,- Jy, va cao EtOAc toàn 57

phan (PDA 360 nm)

3.17 Sic ky dé LC cita céc hop chat Ji, Jz, Js, Ia Je J, Io, Sto, Jun 60

(MS) va cao EtOAc toan phn (PDA 360 nm)

3.19 Công thức hóa học của các hợp chất Jy astragalin 61

Công thức hóa học của các hợp chất Jaoisoquercitrin

Công thức hóa học của các hợp chất Js kaempferol rutinosid

Công thức cấu tạo của Jạ verbascosid

Công thức cấu tạo của J, isoverbascosid

Công thức cấu tạo của J„ isooleoacteosid

Công thức cấu tạo của J; apiosylverbascosid

Công thức cấu tạo của Jụụ 6- O — menthiafoloylverbascosid

Sắc ký đồ của dịch chiết thứ 5 mẫu Jass 3a

Đồ thị tương quan giữa nông độ và diện tích pic chuan DC J,

Đồ thị tương quan giữa nồng én tich pic chuan DC Jz

Đồ thị tương quan giữa nồng tích pic chuẩn ĐC J«

ich pic chuan DC Jy tích pic chuan DC Jy,

Đồ thị tương quan giữa nồng

Đồ thị tương quan giữa nồng độ và

Sắc ký đồ HPLC của mẫu Jass la

Sắc ký đồ HPLC của mẫu Jass 2a

Điện di đồ định tính các chất IS, J¡ J› J4 J« J+, Ju

Ảnh hưởng của nằng độ đệm photphat lên độ phân giải của các

chat Jas Jos Jo Jr

Ảnh hưởng của nồng độ đệm borat lên độ phân giải của các

chất Jụ, Jy, Jos Jr

Ảnh hưởng của pH lên độ phân giải của các chất Jạ, J, Js J

Ảnh hưởng của loại dung môi lên độ phân giải của các chất J¡,

I Jos J›

Ảnh hưởng của nồng độ MeOH lên độ phân giải của các chất

Say Say Vos Jr

Điện di đồ của các chất chuẩn đối chiếu điều kiện điện di:

đệm photphat 10 mM - nati tetraborat 50 mM, pH 9,16; chiều

11

8 T8

3.49 3.50

451 4.52

4.53

dai mao quan: 63,5 cm (chiều dài hiệu dụng: 55 cm), điện thế

20 kV; Nhiệt độ cột 25°C, mẫu tiêm 50 mbar x 5 s; phát hiện ở

360 nm

Điện di đồ của mẫu Jass.3b điều điện di như hình 3.43

Đồ thị tương quan giữa corA J/ cor A IS và nồng độ tương ứng

Điện di đồ của mẫu Jass.Ib điều kiện điện đi như hình 3.43

Điện di đồ của mẫu Jass.2b điều kiện điện di như hình 3.43

Quy trình chiết xuất và tỉnh chế verbascosid từ chè vằng (đề nghị)

Điện di đồ chè vằng với điều kiện di: natri tetraborat 75

mM, pH 9,33; chiéu dai mao quản 66,5 cm (58 cm), điện thế

25 kV; Nhiệt độ mao quản 30C, mẫu tiêm 50 mbar x 30 s; Detector PDA (a: 205, b: 360 nm)

Công thức cấu tạo của naringin (nội chuẩn)

triển chiến lược của ngành Dược Việt Nam trong giai đoạn tới Các chương trình

thực hiện GMP, GLP, ISO/EIC trong các công ty, xí nghiệp Dược, trung tâm

kiểm nghiệm thuốc, đều nhằm mục đích nâng cao hơn nữa chất lượng thuốc sản

xuất tại Việt Nam Nhưng chất lượng dược liệu và các thuốc đông dược hiện đang,

là một tồn tại bất cập cần giải quyết cấp bách Theo thanh tra Sở Y tế Hà Nội “được

liệu rác” (không còn hay còn rất ít hoạt chất) và các thuốc đông dược giả có trộn lẫn

tân dược đang lưu hành phổ biến trên thị trường không kiểm soát được, vì phần lớn

chúng được nhập lậu theo đường tiêu ngạch không có số đăng ký lưu hành và không,

có tiêu chuẩn kiểm nghiệm [22] Để khắc phục tình trạng trên các cơ quan quản lý

cần tăng cường nhiều khâu trong đó có công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu và thuốc

đông dược

Tiêu chuẩn hóa các được liệu và thuốc đông dược bao gồm nhiều nội dung rất quan

trọng như: thiết lập đánh giá dược liệu chuẩn, thiết lập đánh giá chất chuẩn đối

chiếu từ dược liệu, thống nhất quy trình đánh giá phương pháp định lượng các hoạt

chất trong dược liệu, Các nội dung này tuy tách rời nhau nhưng phải được thực

hiện đồng bộ Một trong nhiều nguyên nhân hạn chế việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm

nghiệm cho các dược liệu và thuốc đông dược là rhiếu chất chuẩn đối chiếu hóa học

từ được liệu Hầu hết các tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu và thuốc đông dược

hiện nay đều thiếu chỉ tiêu định lượng, ngay cả trong Dược điển Việt Nam [2] Viện

Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương đã xây dựng được bộ chất chuẩn gồm hàng trăm

chuẩn đối chiếu nhưng chủ yếu là các chuẩn đối chiếu hóa học từ hóa dược - cho

đến nay mới chỉ điều chế thành công 2 chất chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu là

rutin tir hoa hde (Sophora japonica L.) và dihydromyricetin tit ché day (Ampelopsis

cantoniensis (Hook et Am.) Planch.) Hai chất này đều là các hợp chất phenolic -

nhóm hợp chất có mặt trong rất nhiều dược liệu Việt Nam Theo hướng nghiên cứu

nay, cy ché ving (Jasminum subtriplinerve Blume.) họ Nhài Oleaceae — một trong

chiếu

Cành con và lá chè vằng đã được y học cổ truyền sử dụng làm thuốc bổ, lợi gan,

tăng tiết một, trị sưng viêm vú [15] và các bệnh viêm nhiễm ngoài da [20] Trên thị

trường hiện đang lưu hành một số chế phẩm từ chè vằng ở dạng trà hòa tan, trà túi lọc với tác dụng chống nhiễm khuẩn, kích thích tiêu hóa, tiêu độc và giảm cholesterol Một số nhà khoa học

nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học và tác

dụng dược lực của ché ving [9], [73], [87], nhưng dược liệu này vẫn chưa được

nghiên cứu đầy đủ về thành phần hóa học, chưa có một hợp chất flavonoid cụ thể nào được công bố và cũng chưa có một phương pháp định lượng của bất kỳ hợp chất nào có trong chè vằng Hiện chè vằng đã được đưa vào dự thảo Dược điển Việt

Nam IV nhưng vẫn thiếu chỉ tiêu định lượng

Để nâng cao giá trị sử dụng nguồn dược liệu thiên nhiên, các nhà khoa học trên thế

giới đã và đang ứng dụng nhiễu phương pháp phân tích hiện đại như GC, HPLC, điện di mao quản (CE), trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên [94], [118], [57]

Ở Việt nam, hiện cũng đã có nhiều ứng dụng các phương pháp HPLC và CE trong,

nghiên cứu dược phẩm [16|, [19], [121] và được liệu [14], [71],

Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký và điện di mao

1g lam chất chuẩn đối chiếu

2 Xây dựng quy trình định lượng một số hợp chất phenolic trong chè vằng

1.1 NỘI DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

CÁC HỢP CHÁT TỰ NHIÊN TRONG DƯỢC LIỆU

Các hợp chất tự nhiên trong dược liệu thường có hàm lượng thấp và dịch chiết của

chúng luôn chứa hàng loạt các chất có trong mẫu cùng tan Để phân tích các hợp

chất này chính xác, bên cạnh việc sử dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại thích hợp,

vấn đề chất chuẩn đối chiếu hóa học và các kỹ thuật thắm định phương pháp cũng

có vai trò to lớn, ảnh hưởng đến kết quả phân tích Do vậy các quy định về chất

chuẩn đối chiếu từ dược liệu, cách xây dựng và thâm định phương pháp phân tích

cần được đề cập

1.1.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu

1.1.1.1 Một số định nghĩa về chất chuẩn hóa học [41], [117]

- Chất chuẩn hóa học sơ cấp (chuẩn gốc) là chất đồng nhất có độ tỉnh khiết cao, có

những đặc tính nhất định, được áp dụng trong những phạm vi đặc biệt và giá trị của

nó được chấp nhận mà không cần so sánh với bất cứ chất hóa học nào khác

(WHO/PHARM/96.590)

- Chất chuẩn hóa học thứ cấp là chất có độ tỉnh khiết cao và những đặc tính của nó

được xác định bằng cách so sánh với một chất chuẩn hóa học sơ cấp Phạm vi áp

dụng của chuẩn thứ cấp không rộng rãi như chất chuẩn sơ cấp

Định nghĩa này có thể được áp dụng cho một vài chất với thuật ngữ “chuẩn làm

việc” (WHO/PHARM/96.590)

- Chuẩn đối chiếu là một lô hay mè được chất được bào chế đặc biệt bằng sự tổng

hợp độc lập, bằng những nguyên liệu tỉnh khiết và được chứng minh bằng một tập

hợp các phương pháp phân tích là nguyên liệu chuẩn mực với độ tỉnh khiết cao nhất

có thể đạt tới được một cách hợp lí Chuẩn đối chiếu thường được dùng để làm sáng

tỏ cấu trúc và là chất chuẩn cho chuẩn làm việc (Theo FDA Guideline for

Submitting Documentation in Drug)

đối chiếu được sử dụng cho các dược chất mới cần theo dõi hàm lượng tạp chất

(định tính và định lượng) thường xuyên

- Chuẩn làm việc là những dược chất được chứng minh về chất lượng và độ tỉnh khiết bằng cách so sánh với chuẩn đối chiếu, được dùng như một chất chuẩn cho

phòng thí nghiệm, trong việc phân tích hàng loạt dược chất mới hay sản phẩm mới

(Theo FDA Guideline for Submiting Documentaon in Drug) Chuẩn làm việc

- Chất chuẩn gốc của Viện là các chất chuẩn dùng cho phương pháp

hóa học hoặc vi sinh được thị

tại các trung tâm sau [21], [18]:

» _ Trung tâm hợp tác về chất đối chiếu hóa học của WHO - chuẩn quốc tế

(ICRS)

»_ Hội đồng dược điển Châu Âu ~ chuẩn theo dược điển Châu Âu (EPRS)

»_ Hội đồng chất đối chiếu ~ chuẩn theo dược điển Mỹ (USRS)

» _ Trung tâm hợp tác kỹ thuật ASEAN trong lĩnh vực dược phẩm - chuẩn

ASEAN (ARS)

1.1.1.2 Chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu

" Vai trò chất chuẩn đối chiếu

Chất chuẩn đối chiếu hóa học chiếm một vị trí rất quan trọng trong công tác quản lý chất lượng thuốc từ khâu sản xuất đến lưu hành trên thị trường Mỗi khi sản xuất một chế phẩm từ dược liệu luôn cần chiết xuất, tỉnh chế hoạt chất của dược liệu đó làm chất chuẩn đề kiểm tra, giám sát chất lượng chế phẩm - “ức nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học từ được liệu Các nước có nền y học dân tộc phát triển như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản đều nghiên cứu thiết lập được nhiều

chất chuẩn đối chiếu hóa học chiết ra từ dược liệu, dùng cho kiểm nghiệm dược

trình thiết lập chuẩn đối chiếu hóa học chung, nhưng có một số đặc thù riêng Chất

chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu thường có nhiều tạp liên quan có trong dược

liệu đi kèm Do đó một số nước, như Trung Quốc chỉ yêu cầu chất chuẩn đối chiếu

hóa học từ dược liệu phải có hàm lượng tỉnh khiết > 90% Nếu đòi hỏi độ tỉnh khiết

cao hơn nữa sẽ phải tăng chỉ phí cho quá trình tỉnh khiết lên nhiều lần - làm tăng

giá thành sản xuất chất chuẩn Giá thành chất chuẩn đối chiếu là một trong các

nguyên nhân chính gây tăng kinh phí kiểm nghiệm, ảnh hưởng quản lý chất

lượng thuốc cũng như kiểm soát giá thành của chế phẩm

Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương (VKNT TU) đang nghiên cứu

chiết tách và tỉnh chế 14 chất từ dược

làm chất chuẩn quốc gia gồm: hesperidin,

emodin, gardenosid, acid asiatic, conessin, dihydromyricedin, holothurin B,

keampferol, malloapelta, myricetin, naringin, nuciferin, phyllanthin, silybin

= _ Mục ấích sử dụng của chuẩn đối chiễu trong ngành được

Các chất chuẩn đối chiếu thường được sử dụng trong các thử nghiệm:

~ Định tính ~ xác định phổ IR, UV

~ Xác định tính tương thích của hệ thống phân tích

~ Thử tỉnh khiết

- Định lượng

Ngoài ra chất chuẩn đối chiếu luôn được sử dụng trong các kỹ thuật định tính và

định lượng dựa trên nguyên tắc so sánh, như:

- Các phương pháp so màu, đo hấp thụ UV, đo huỳnh quang

~ Các phương pháp sắc ký và điện di

1.1.1.3 Các phương pháp phân tích đẻ đánh giá chất chuẩn |41 | [1 17]

Việc thiết lập những phép thử riêng cho một chất dùng làm chất chuẩn là rất cẳn

thiết và vô cùng quan trọng Tính chính xác và chọn lọc của phương pháp thử quyết

định phẩm chất của chất chuẩn

một số kĩ thuật đo phổ: IR, MS, NMR Xác định các chỉ tiêu vật lý: năng suất quay cực, điểm nóng chảy, phô UV ~ vis Năng suất quay cực càng gần với giá trị ấn định, hợp chất càng tỉnh khiết

» _ Đề thứ tỉnh khiết, cần xác định

~ Các tạp hữu cơ bằng các phương pháp GC, LC, CE

- Khối lượng nước bằng phương pháp Karl ~ Eischer, hay mắt trọng lượng khi

1.1.1

| Những chỉ tiêu của chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu Các chỉ tiêu chung cho các chuẩn đối chiều hóa học từ dược liệu

© Dinh tinh: phải có kết quả dương tính với các phản ứng hóa học đặc

trưng, phải được xác định cấu trúc hóa học dựa theo phỏ MS, NMR

© Tạp liên quan: <5,0% (bằng phương pháp HPLC)

s Hàm lượng nước: <2% (bằng phương pháp Karl~ Fisher)

* Hàm lượng: > 95,0 % (bằng phương pháp HPLC)

Đóng gói chất chuẩn Bắt kì một chất chuẩn nào cũng phải tuân theo những nguyên tắc chung về thiết lập, đóng gói, phân phối và bảo quản [41], [117] Bao bì cho chất chuẩn phải có khả năng chống ẩm, ánh sáng, oxy và được kiểm tra về khả năng thấm ẩm Việc đóng

trong các ống được hút chân không ~ 50 mm Hg, nạp khí nitrogen 99,99 % trước

khi hàn kín Mỗi ống hoặc lọ chất chuẩn phải chứa một lượng đủ cho một lần kiểm

tra so sánh trong phép thử định tính và định lượng (10 ~ 100 mg)

Trên lý thuyết, độ ổn định của một chất sẽ được kéo dài khi bảo quản ở nhiệt độ

thấp Tuy nhiên đối với những chất ngậm nước thì việc bảo quản dưới 0°C sẽ làm

mắt độ ôn định Các chất chuẩn thường được bảo quản ở nhiệt độ + 2°C đến + 5°C

Các phương pháp định lượng các chất xây dựng theo bất kỳ kỹ thuật nào (đo hấp

thụ UV, GC, LC và CE ) đều phải được thực hiện theo các bước sau

lượng chất nhiều nhất với lượng tạp ít nhất) Phương pháp chiết có khả năng chiết

kiệt (nhóm) hợp chất cần xác định Dung môi chiết phải đảm bảo vừa hòa tan các

chất cần định lượng vừa không ảnh hưởng đến kết quả Cách loại tạp cần đơn giản

nhưng hiệu quả Lượng mẫu sử dụng vừa phải (0,1 ~ 1g), không quá nhiều

Các bước cần làm: chọn kỹ thuật chiết, chọn dung môi chiết có tính tan tốt, chọn

lọc đối với (nhóm) hợp chất cần xác định; Thăm dò tỷ l

liệu; nhiệt độ, thời gian chiết, số lần chiết, cách loại tạp [1],

»_ Xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trên máy sử dụng

Phương pháp HPLC

Dựa vào cấu trúc hóa học, tính chất và độ phân cực của những chất phân tích để

chọn kỹ thuật và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tách của các chất trong

mẫu như: pha tĩnh-cột sắc ký (loại cột, kích thước hạt, độ dài, đường kính trong),

Phuong phdp CE

Dựa vào cấu trúc hóa học, tính chất và khả năng ion hóa của những chất phân tích

để chọn kỹ thuật điện di phù hợp CZE hay MEKC Sau đó khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng lên quá trình tách của các chất trong mẫu như: kích thước mao quản (độ dài,

đường kính trong), dung dịch đệm: thành phân, tỷ lệ, pH; Thành phần dung môi và

tỷ lệ; Thành phần và tỷ lệ chất phụ gia; Điện thế áp đặt (10-25 kV); Điều kiện tiêm

mẫu: thời gian, áp suất; Nhiệt độ mao quản [32]; Detector và điều kiện làm việc của

detector,

1.1.2.2 Thắm định phương pháp

'Việc này nhằm xác định độ tin cậy của kết quả nghiên cứu đề được áp dụng cho tắt

cả các phương pháp phân tích khi xây dựng Nội dung thẩm định gồm các điểm sau:

tính đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống phân tích, độ tuyến tính, độ chính xác và

độ đúng của phương pháp [II], [12], [34]

© Tinh dic higu là khả năng xác định được chất phân tích khi có mặt các thành

phần khác trong mẫu như tạp chất, sản phẩm phân hủy, tá được

~ Đối với phép thử định tính: Phải đảm bảo phát hiện được chất phân tích

- Đối với phép thử định lượng: Phải đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng hay

hoạt lực của chất phân tích trong mẫu

®_ Độ thích hợp của hệ thắng phân tích được đánh giá dựa trên sai số tương đối

của năm phép thử song song đối với tín hiệu đo lường cùng một mẫu chuẩn trên các thiết bị phân tích trong cùng điều kiện

©_ Khoảng tuyến tính đề đàm bảo sự chính xác của phép định lượng, cần xác định khoảng phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ chất nghiên cứu với tín hiệu đo Xây

dựng đường hồi quy tuyến tính biểu thị sự tương quan giữa nồng độ chất nghiên

cứu với tín hiệu đo với hệ số tương quan R > 0,99 [132]

©_ Độ chính xác của phương pháp được biêu thị bằng độ lặp lại của phương pháp.

trong cùng ngày phân tích và giữa các ngày khác nhau Tiền hành trên mẫu thử

*_ Độ đúng của phương pháp thường được xác định dựa trên kỹ thuật thêm chuẩn

Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích hoặc mẫu tự tạo phải đảm bảo sao

cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng

tuyến tính đã được khảo sát [27], [67]

hi

= Xéc dinh gidi han pl (LOD Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của

chất phân tích có thể xác định được coi như là nồng độ chất phân tích gây nên sự

tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng của mẫu trắng

»"- Giới hạn định lượng (LOQ Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất trong

mẫu thử có thể định lượng được x‹ đúng và độ chính xác chấp nhận được

LOQ được chấp nhận khi tín hiệu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10

lần đáp ứng của mẫu trắng [67]

Với thiết bị HPLC và CE, giới hạn phát hiện (LOD) của quy trình là lượng hoạt chất

nhỏ nhất đưa vào máy, để được pic sắc ký (điện di) có chiều cao gấp 3 lần độ nhiễu

đường nền ở độ nhạy tối đa có thể được khi vận hành Giới hạn định lượng (LOQ)

di)

có chiều cao gấp 10 lần độ nhiễu đường nên với cùng điều kiện kỹ thuật như xác

định LOD [116], [118]

của quy trình là lượng hoạt chất nhỏ nhất đưa vào máy để được pic sắc ký (‹

Có hai phương pháp xác định LOD và LOQ

"Theo kết quả thực nghiệm — Xác định LOD: pha loãng mẫu chuẩn tới nồng

độ cho pic có chiều cao gấp 3 lần độ nhiễu của đường nền Từ kết quả LOD

tính LOQ theo công thức LOQ = LOD x 3,3

» _ Theo phương trình hồi quy tuyến tính thu được từ chất chuẩn

Sau khi xây dựng quy trình định lượng hoàn chỉnh, tiến hành định lượng các mẫu

(tối thiểu 3 mẫu) theo phương pháp và các điều kiện kỹ thuật đã xác định Tính toán

và biện luận kết quả

1.2 SƠ LƯỢC VE CAC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁU

TRÚC VÀ KIEM NGHIEM HỢP CHAT TỰ NHIÊN

Các hợp chất tự nhiên thường được chiết xuất từ cây cỏ Muốn nghiên cứu hoạt tính

Là kỹ thuật xác định cấu trúc của các hợp chất với lượng mẫu phân tích rất nhỏ (ug) PI

bao gồm một loạt các tin hiệu của các phân mảnh có được từ sự va chạm của phân

lối (MS) cung cấp thông tin về kích thước và khối lượng phân tử MS

tử với điện tử Mỗi tín hiệu cho thông tin về tỷ lệ khối lượng trên điện tích của

mảnh ion (m/z) Phẩn lớn các mảnh ion đều mang điện tích +1 nên m⁄z tương đương với khối lượng ion

Các ion phân tử không phân mảnh [M] - ion mẹ, [M-I]* - mắt đi 1 nguyên tử

hydrogen và [M+1] nhận thêm 1 nguyên tử hydrogen rất quan trọng cho việc xác

định khối lượng phân tử Sau đó, xác định các phân mảnh chính có liên quan dựa

vào sự mất khối lượng hợp lý của ion phân tử Các phân mảnh thường gặp trong ESI MS 1a: [M-17] * mat di 1 nhóm — OH; [M-18]*; mắt đi 1 H;O, thường gặp trong.

các hợp chất phenolic có 2 nhóm OH ở vị trí ortho; [M-28]” mắt đi 1 nhóm >C=O;

[M-29]* mat di 1 nhém ~CHO; [M-44]” mắt đi I nhóm CO;; [M-31]" mất đi gốc

OCHs [23]; [M-134]* mat I géc dihydroxyphenylethyl; [M-146]* mat đi 1 gốc

thamnose; [M-162]* mat di 1 géc glucose hay 1 géc caffeoyl [107]; [M-164]* mat 1

gốc feruoyl [37]

1.2.1.2 Ph6 NMR

Phổ NMR cho phép xác định cấu trúc của chất nghiên cứu về khung sườn carbon —

hydro với 2 loại phổ 'H và 'C NMR [74] NMR chỉ sử dụng các dung môi hữu cơ

mà nguyên tử hydro được thay thế bằng deuteri như CDCI;, CD;OD, DMSO

"Phổ ”H NMR xuất hiện ưu tiên trong vùng ồ = 0-10 ppm so với tín hiệu đối

chiếu của TMS 6 = 0 ppm Một proton riêng lẻ có thể biểu hiện trong phổ là I

tín hiệu với tích phân là 1, hay một nhóm tín hiệu với tổng tích phân cũng là I

Bang 1.1 Dé chuyén dich héa hoc 5-'H NMR của các hợp chất tự nhiên

Tới 1,0 Rhamnose C - CH; (doublet rộng)

Tới 1,7 Nhóm prenyl (- CH;~ C = C(CH;);) methyl

(Các proton khác 3,5 & 5,2 ppm) Acetat (- OCOCH;) & C-CH; vòng thơm

C-H của hầu hết các đường

H¬ của các đường Methylenedioxy (O ~ CH; ~O) singlet 60~8/0 Proton nhân thom, phenyl

Tín hiệu cộng hưởng của CHạ có tích phân diện tích gắp 3 lần so với tích phân diện

tích của một proton nhân thơm Hiện tượng tách 1 tín hiệu thành nhóm tín hiệu chỉ

xảy ra khi có các proton không tương đương lân cận nằm gần kề với proton “thể

hiện” (tương tác 'H — 'H), được gọi là hiện tượng “GHÉP” hay “TÁCH” Một proton khi ghép với n proton lân cận không tương đương, sẽ có 1+ n tín hiệu với

cường độ vạch tuân theo tam giác Pascan Trị số tương tác 7 (Hz) cho biết “số” và

“vị trí” ciia proton lân cận

= Phổ”*C NMR [14]

Nằm trong vùng 0 ~ 200 ppm so với tín hiệu đối chiếu của TMS 8 = 0 ppm Mỗi

carbon khác nhau được thể hiện bằng một tín hiệu mà cường độ ông hưởng của nó

(hay tích phân diện tích) không phản ánh số carbon mà nó thể hiện Sự tương tác

carbon với các proton lân cận rất phức tạp (ghép 'H~'?C), do đó thường phải “giải ghép proton” ~ khử tương tác spin - spin để phổ dễ đọc hơn Trong phổ giải ghép

(proton decoopled spectrum), mỗi carbon là một tín hiệu đơn không ghép - phổ

carbon toàn phẩn Số vạch phổ cho biết số nguyên tử carbon trong phân tử Độ chuyển dịch hóa học ö của tín hiệu cộng hưởng cho biết loại carbon trong phân tử của vòng thơm, phần đường hay các nhóm thế khác Phổ DEPT (Distorsionless

Enhanced by Polarization Transfer) cho phép xác định số proton đính trên carbon

nhờ 2 lần đo khác nhau, mỗi CH, CH;, CH; cho 1 singlet Ở phổ DEPT 135° CH va

CH; > 0, CH; < 0, với phổ DEPT 90° CH >0 Trên phổ DEPT không có tín hiệu carbon bậc 4

* _ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2Ð NMR) [17]

Phổ 2D NMR đã được nghiên cứu từ năm 1965 để khắc phục những vấn đề về cấu

trúc mà phổ I chiều ('H NMR, ''C NMR) không giải quyết được Các loại phổ 2D

NMR thường sử dụng là:

~ Phổ 'H ~ 'H COSY (Correlation Spectroscopy) là phổ 2 chiều quan trọng nhất, nó

cho biết trong phân tử các proton_nào ghép cặp với nhau theo tín hiệu đường chéo

và tín hiệu giao, nghĩa là cho biết các proton nào ở liền kể nhau

- Phổ 'H~ 'H NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy) sử dụng,

hiệu ứng NOE để tìm hiểu vị trí gần nhau trong không gian của 2 proton H, và Hạ

nào đó của phân tử Phổ NEOSY chỉ được thực hiện khi với các phổ thong dung

CH, °C, COSY, HMQC, HMBC, INADEQUAT ) mà vẫn còn những vấn đề về

hóa lập thê

~ Phổ TOCSY (Totally Correlated SpectroscopY) chuyên dùng khảo sát các hợp

chất có hệ thống spin đặc trưng như carbonhydrat, peptid, Phổ TOCSY cho biét

'H, và Hạ kể nhau và kế bên Hạ là H,, Hạ Phổ HMQC ~ TOCSY cho biết H, gắn vào

C; và còn cho biết thêm kế bên H, là Hạ, H,, Hạ

- Phổ HSQC (Heteronucleaer single quantum correlation) va HMQC (Hetero

nucleaer multiple quantum correlation) 1a kỹ thuật đảo ngược của HETCOR cũng

cho biết về 'Jcụ các nhóm CH; (n > I) mà không cho các tương tác xa ngang qua 2

hay 3 nối nhưng có độ nhạy cao hơn phổ HETCOR

- Phổ HETCOR (HETeronuclear Chemical shift Coorrelation) cho biết sự liên quan

giữa 'H ~ ''C qua hằng số ghép '7cp nghĩa là cho biết về các nhóm CH, (n >1) mà

không có thông tin về carbon bậc bốn

- Phổ HMBC (Heteronucleaer Multiple Bond Correlation) khác với pl

ô HMQC cho biết các tương tác xa giữa 'H — °C qua hing sé ghép "Jeu, Ì/c„ mà không cho

thông tin về ‘Yor

- Phổ 'C-!°Œ INADEQUAT (Incredible Natural Abudance DoublE Quantum

‘Transfer Experiment) cho biét trong phan tir cdc nguyén tir carbon nao lién ké nhau

Để xác định cấu trúc của một hợp chất tự nhién thudng chi cin cdc phé co ban [a 'H

NMR, °C NMR, HSQC, HMBC và COSY Và tùy theo mức độ phức tạp của các

đồng phân mà cần thêm sự hỗ trợ của các phổ 2D khác nữa

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

HPLC được coi là

quả Phương pháp này có

›t kỹ thuật phân tích các hợp chất từ một hỗn hợp rất có hiệu

-hính xác cao [56] Quá trình tách các chất

nhạy và

phân tích trong HPLC liên quan đến hệ số phân bố của chúng trong hai pha (pha

tĩnh và pha động), tức liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với hai pha

Do đó, thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột, cần được điều

chỉnh để rửa giải các chất này với thời gian hợp lý

1.2.2.1 Các kỹ thuật HPLC

HPLC có 4 cơ chế tách cơ bản là: sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và ray phan

rứ Hiện nay sắc ký phân bố được sử dụng rộng rãi nhất trong kiểm nghiệm Tùy

theo độ phân cực của hai pha (pha tĩnh, pha động) mà người ta gọi sắc ký pha thuận

hay sắc ký pha đảo

*_ Sắc ký pha thuận: có pha tĩnh phân cực hơn pha động (thường là các dung môi không phân cực) Trong kỹ thuật này các chất không phân cực sẽ được

rửa giải sớm Thứ tự rửa giải sẽ chậm dẫn theo chiều tăng độ phân cực của các chất trong mẫu thử

*_ Sắc ký pha đảo: có pha tỉnh không phân cực và pha động phân cực Trong

kỹ thuật này các chất tan càng tốt trong nước sẽ được rửa giải càng nhanh

Thứ tự rửa giải sẽ ngược với sắc ký pha thuận Cặp dung môi thường dùng

nhất trong kỹ thuật này là MeOH - H;O và MeCN - H;O Sắc ký pha đảo được sử dụng nhiều nhất vì tách được nhiều chất có độ phân cực khác nhau

và dung môi (HO) có giá thành thấp hơn các dung môi hữu cơ

Trong sắc ký pha đảo tùy theo quy mô và mục đích sử dụng người ta còn phân chia

thành 3 loại như sau:

* HPLC phan tích (analytical HPLC) thường được sử dụng để định tính và định lượng các mẫu thử Lượng mẫu phân tích nhỏ từ 1 -10 ug Cột thường

có kích thước 250 (150) x 4,6 mm i.d.; 150 x 3,2 mm i.d Những tiểu phân

nhổi cột có kích thước 3-5 jm

© HPLC diéu ché (prep- HPLC) là phương pháp phân lập các chất tỉnh khiết

hữu hiệu nhất Lượng mẫu phân tích từ 10 ~ 500 mg Cột thường có đường

kính trong (i.d) 810mm Những tiểu phân nhồi cột có kích thước 5 ~ 30 um

© HPLC diéu ché 6 qui mé céng nghiép (preparative and process-scale HPLC) dùng phân lập chất tỉnh khiết qui mô lớn có thê đến hàng kg Kỹ thuật tương

tự prep- HPLC, nhưng tài liệu công bố khá hạn chế vì bảo mật.

1.2.2.2 Các thơng số kỹ thuật trong HPLC |2], [1 16], [118]

Trong phân tích HPLC các thơng số kỹ thuật thể hi

lượng (k'), số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải (Rs), hệ số đối xứng (¿

*- Hệ số dung lượng (capacity factor) là tỳ số giữa nồng độ của chất tan trong pha

Vo: Thé tich luu ly tuéng(ctia dung mơi)

tạọ: Thời gian lưu lý tưởng tạ: Thời gian lưu của chất tan

Thể tích lưu Vụ (Retention volume) của một chất tan 1a thé tích của lượng pha động

đi ra khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên

sắc ký đồ TI

ích lưu được biểu thị: Vạ = tạ x Fo 4)

Fo: La lượng của pha động

“Thể tích lưu lý tưởng là thể tích lưu của một chất tan khơng bị giữ lại trong pha

tĩnh Trên thực tế thể tích lưu lý tưởng là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm

mẫu đến khi ra khỏi hệ thống

*_ Thời gian lưu (Retention tỉme - tạ) của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu

đến khi đỉnh của nĩ xuất hiện trên sắc ký đồ

~ ta, txạ: Thời gian lưu của đỉnh

'Trong những điều kiệ ký nhất định (cột, pha động nhiệt độ, tốc độ dịng, ) thời

gian lưu của một chất tan là một hằng số, đơn vị tính là phút Thời gian lưu lý tưởng

tạ là thời gian lưu của một chất tan khơng bị giữ lại bởi pha tĩnh Trên thực tế, thời gian lưu lý tưởng là thời gian cần thiết để pha động đi ra khỏi hệ thống tính từ lúc bơm mẫu

=_ Hiệu lực cột (Column efficiency)

là thơng số về hiệu suất phân tích của cột, được biểu thị bởi các đại lượng số đĩa lý thuyết (N) hay chiều cao tương đương của đĩa lý thuyết (Height equivalent of' theoretical plate — HETP) Số đĩa lý thuyết càng lớn thì hiệu lực của cột càng cao (pic cao và nhọn) Số đĩa lý thuyết được tính theo cơng thức sau:

Với tạ: Thời gian lưu dịp: Đường kính tiểu phân (tIm) L: Chiéu dai c6t (Cm) Noge: 86 dia lý thuyết tối ưu

Nhạc số dia lý thuyết 101 da Nope Nix = 4000 L đáp

'Thí dụ cột dài 25 cm, đường kính tiểu phén 5 um thi N „„„„ là 20.000

HETP = L /N, HETP càng nhỏ, hiệu lực cột càng cao ~ thường từ 0,03 — 1 mm

"_ Độ phân giải Rs (Resoludon) =

lệ số tách của cột mm 6 Hiệu lực của dung mơi (solvent effiency) và hiệu lực của W, —W, cột được thể hiện qua độ phân giải của cột

trọc tụ: Thời gian lưu của hai đỉnh 2 và 1 Wz, Wy: Chiéu rộng của đỉnh 2 và l

Rs>1,5: 2 đỉnh tách nhau hồn tồn

*_ Tỉ số signaÏ— fø— noise cho phép xác định LOD và LOQ của chất cần phân tích

— LOD ứng với S/N = 3, LOQ ứng với S/N = 10 2H @

H: chiều cao của pic h: tin hiệu đường nền h

1.2.2.3 Máy sắc ký lịng hiệu năng cao

tiêm mẫu, cột ~ pha tinh, detector, hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Cột trong HPLC cĩ vai trị rất quan trọng, được lựa chọn phù hợp với đối tượng

phân tích Các hợp chất phenolic thường cĩ tính phân cực nhẹ, nên sử dụng cột pha

đảo RP 18 với pha động phân cực để tách theo cơ chế phân bố [103]

Detector là

động có mang chất tan thoát ra khỏi

HPLC như: detector khiic xq vi sai RID (Refractive index detector), detector day

diod quang PDA (Photodiode array), detector hujnh quang FD (Fluorescence

detector), detector dién hod ECD (Electrochemical detector), NMR [47], [105],

[124] Do vậy cần phải chọn lựa detector phù hợp với tính chất hoá lý của chất

i detector được sử dụng trong

phân tích

PDA được dùng rất rộng rãi trong nghiên cứu vì có thể tạo được phổ UV của các

chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, từ đó kiểm tra sự tỉnh khiết cia pic

Có thể sơ

định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ UV của dinh trong

ứng trên sắc ký đồ với phô của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của một chất

chuẩn biết trước

Detector phd khdi MSD (Mass spectroscopy detector) là detector hiện đại có khả

năng phân tích các hợp chất tự nhiên ở dạng vết Phổ khối của mỗi chất có tính đặc

hiệu cao và có thể dựa vào phổ khối để xác định được trọng lượng phân tử của các

chất tan ngay cả khi độ phân giải chưa tốt (định tính chính xác) 90], (93] Tuy

nhiên, MSD rất đắt tiền so với các detector thông dụng khác

Dưng môi sử dụng phải có chất lượng cao và được loại khí hòa tan để tránh gây

Đây là phương pháp phân tích hiện đại có phạm vi ứng dụng rất rộng rãi trong các

ngành sinh học, dược phẩm [28], [131], thực phẩm [88], 92], môi trường [56],

HPLC được dùng chủ yếu cho định lượng, nhưng cũng có thể dùng cho cả định tính

và xác định tạp liên quan

Định tính các chất bằng HPLC chủ yếu dựa vào 2 yếu tố: thời gian lưu và các

su phổ UV (hay MS, NMR) do detector cung cấp Trong những điều kiện

lưu tạ của một chất tan là mí

~_ So sánh thời gian lưu tạ của chất phân tích với tạ của chất chuẩn đối chiếu trong điều kiện sắc ký giống nhau Pic của mẫu thử phải trùng với pic cia chất chuẩn đối chiếu về thời gian lưu tạ; dạng phổ UV và Amax (detector PDA) hay các dữ liệu khác do detector cung cấp

~_ §o sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã

thêm chuẩn đối chiều

~_ Theo dược liệu chuẩn — phương pháp dấu vân tay (finger print technique FPT): dược liệu chuẩn và mẫu thử được chiết và phân tích HPLC trong cing điều kiện (dung môi, phương pháp chiết, pha động, nhiệt độ ) Nếu dược liệu chuẩn và mẫu thử cho hai sắc ký đồ tương tự nhau về số pic, tạ của mỗi

tạ và có những phân mảnh ion tương đương về m/z [47], [93]

Định lượng bằng HPLC là phương pháp thường quy đối với các hợp chất tự nhiên trong được liệu hay các hoạt chất trong các chế phẩm đa thành phần vì cần phải có quá trình tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Nguyên tắc của phương pháp này là diện tích (chiều cao) của từng pic tương đương với tổng lượng của chất

tương ứng Có bốn kỹ thuật thường dùng trong định lượng HPLC là:

Bang 1.2 M6t sé thi du dinh lwong flavonoid va phenylethanoid bang HPLC

isorhamnetin /Ginkgo biloba | 4,0 x 100 mm, | nm 0,5%H;PO,

Quercetin 7 Allium cepa L.| Bondapak C18| UV — 362 | H,0-THF-TFA

Vicenin, vitexin, luteonin |Xtera MS Cø|PDA =|HạO- MeOH-

rutinosid/Sechium edule (Jacq) | 4,6 x 250, 1|250nm, |MeCN 005%

Myricetin, luteonin, quercetin, | Zorbax Eclipse | PDA — | MeCN - MeOH

apigenin, naringenin, kaemp-|XBD Cis 4,6 x| 260 &|-H;O (TEA

ferol, apigenin, cyanin, / tea, | 250, ml/phút | 370nm | 0,05% ) grad

fruit juice can [55]

Acteosid, baicalein, baicalin,|ODS-A 6,0 x|UV 331 | MeCN-H;O

wogonin/ § baicalemsis|100 mm, 1|& 275 | 1,5% aacetic 12

Georgi Labiatea [128] ml/phút nm — 88 100-0

‘Acteosid, arenariosid, oroban - | Lichrospher 100 UV 204 | MeCN - Hz0 G:

chosid, poliumosid /O.caeru -| Cis, 4 x 125) & 330/95) > (37,5 -

lesens Orobanchaceae [78] | mm, 1 ml/phit | nm 625)

Verbascosid, echinac Kromasil Cj, PDA 331 | MeCN-H;O-

pediculariosid A / Pedicularis | 4,6 x 250 mm, | nm a.acetic(80:20:1)

tích pic chuẩn đối chiếu của chất đó Có hai cách dùng chuẩn đối chiếu: so

sánh một điểm — một nồng độ, hay so sánh nhiều điểm ~ nhiều nồng độ hay đường, hồi quy tuyến tính Kỹ thuật chuẩn nhiều điểm được dùng phổ biến trong các

Nhưng kỹ thuật này cần nhiều thời gian do phải chuẩn hóa từng mẫu

~ Chuẩn hóa diện tích (Area normalization): kỹ thuật này ít dùng vì đồi hỏi mọi cầu

từ trong hỗn hợp cần phân tích phải được rửa giải và phát hiện Sự đáp ứng của

detector với các cấu tử trong mẫu phải như nhau [5]

'Trong định lượng các chất phenolic từ dược liệu thường sử dụng các cột silicagel

RP 18 véi các pha động là MeOH - H;O, MeCN ~ H;O, MeOH ~ MeCN - H;O có thêm một tỷ lệ nhỏ các acid như formic, acetic, TFA [38], [119]

1.2.3 Phương pháp điện di mao quản (CE) Điện di mao quản là một phương pháp phân tích hiện đại, đang được các nhà khoa

hoc nghiên cứu ứng dụng trong phân tích các hợp chất tự nhiên vì có nhiều ưu điểm như: thao tác đơn giản, hiệu lực cao, thời gian phân tích ngắn, giá thành thấp [107] Phương pháp này hiện đã có một số ứng dụng ban đầu trong kiểm nghiệm nguyên liệu hóa được ở nước ta [16], [36] Dưới đây là một số khái niệm cơ bản nhất của

CE trong phân tích các hợp chất tự nhiên

1.2.3.1 Khái niệm chung

— EP) va dòng điện thẳm (electro-osmotic flow — EOF) ~ dòng di chuyển của dung

dịch đệm là hai yếu tố tạo nên hiệu ứng tách của điện di mao quản [46]

Cột mao quản

phân tích dữ liệu

Điện thế cung cấp

Hình 1.2 Sơ đồ điễn hình máy điện di mao quan

1.2.3.2 Điện di mao quan ving (Capillary zone electrophoresis - CZE)

Là dang CE được dùng phổ biến nhất do rất đơn giản trong vận hành thao tác Sự

tách chủ yếu dựa vào sự ion hóa của nhóm chức acid hoặc sự proton hóa của các

nhóm chức base của chất tan nên các chất tan di chuyển trong những băng riêng rễ ở

các tốc độ khác nhau Các anion, cation di chuyển nhờ vào hai dòng điện di và điện

thẳm EOE Riêng các chất trung tính được kéo đi chỉ bởi dòng EOF [35], [54] [69],

[125]

Sự lựa chọn chất đệm (buffer)

Lưựa chọn chất đệm là vấn đề cực kỳ quan trọng để thành công trong bắt kỳ kỹ thuật

CE nao Dung dich đệm cần có độ dẫn tương đương với độ dẫn của mẫu phân tích

để giảm thiểu sự biến dạng của pic Dòng EOF rất nhạy cảm với sự thay đổi pH, vì

vậy trong điện di cần sử dụng đệm để duy trì sự không đổi của pH Các đệm sử

dụng trong CE cần đáp ứng các tiêu chuẩn: khả năng đệm tốt ở mức pH đã lựa

chọn; Sự hấp thụ thấp ở bước sóng phát hiện; Linh độ điện di thấp (ion mang điện

tích tối thiểu) hạn chế phát sinh dòng điện Đệm phosphat và citrat có nhiều pKa nên có thể dùng được ở nhiều mức pH Các đệm TRIS, natri tetraborat, histidin,

CAPSO có kích thước ion lớn và ở các nồng độ cao không phát sinh các dòng điện

đáng kể, nhưng có tính hấp thụ UV mạnh [64], [82]

pH đệm mao quản có thể chịu được khoảng pH 2 - 12, nhưng pH đệm thường bị

giới hạn bởi pH ổn định chất tan Sự thay đổi pH sẽ kéo theo sự thay đối dong EOF

Sự phân giải có thể nhận được ở pH thấp, nhưng khi tăng pH để thay đổi điện tích chat tan thì dòng EOE trở nên quá lớn, đây chất tan ra trước khi nhận được sự phân giải nên phải tăng chiều dài hữu dụng của mao quản hoặc giảm EOF bằng phương

các chất tan trong quá trình điện di có thể được thay đổi thông qua sự thay

đổi đệm, pH dung dịch đệm, thêm chất phụ gia (chất diện hoạt, chọn lọc

chiral, SDS, TRIS, CTAB, TWEEN, CHAPS, CHAPSO, polyacrylamid,

PVA, cyclodextrin)

Cac chat dign hoat 6 néng độ thấp hơn nồng độ mixen tới hạn có thể hoạt động như

các tác nhân hòa tan các chất ky nước, cặp ion hoặc các chất gia có thành mao quản

Chất diện hoạt có thẻ bị hấp phụ vào thành mao quản làm thay đổi sự tích điện hay

tính ky nước của thành mao quan, lam thay đổi dòng EOE và hạn chế sự hấp phụ

chất tan [69]

1.2.3.3 Sắc ký mixen dign déng (Micellar Electrokinetic Chromatography—

MEKC)

MEKC được Terabe giới thiệu năm 1984 và đã trở thành một trong những kỹ thuật

CE được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Đây là kỹ thuật điện di duy nhất có thể

tách các chất trung tính cùng các chất mang điện tích bằng cách thêm các chất diện

hoạt trong dung dịch đệm [58], [120] Ở nồng độ cao hơn nồng độ mixen tới hạn

(CMC), chất diện hoạt sẽ tự ngưng tập để cho các mixen Mixen thường có dạng

hình cầu với các đuôi hydrocarbon thân dầu của chất diện hoạt hướng vào trung tâm

để tránh tương tác với chất đệm thân nước và các đầu phân cực có thể là anionic

hoặc cationic hướng ra dung dịch đệm Các dung dịch mixen có thé hoà tan các hợp

chất thân dầu mà bình thường không thể tan được trong nước Các chất diện hoạt

thường sử dụng trong MEKC như: SDS, STS, DTAB, CTAB, CHAPS,

CHAPSO, [54]

Nguyên tắc tách: Các chất diện hoạt anionic (SDS) sẽ di chuyển hướng về anod -

ngược chiều với EOE Vì EOF thường nhanh hơn tốc độ điện di của mixen ở pH

trung tính hoặc base nên mixen sẽ di chuyển theo chiều EOE Trong quá trình di

chuyển, các chất tan có thể tương tác với mixen theo cơ chế sắc ký (phân bố và tĩnh

điện) Chất tan tương tác với mixen càng nhiều (thân dẫu) thì thời gian di chuyển

càng dài Khi chất tan không tương tác với mixen thì nó chỉ được mang đi bởi EOF

(tạ) Tắt cả các chất tan trung tính đi ra giữa t; và t„ (thời gian di chuyển của mixen)

“Thời gian di chuyển có thể được thay đổi bằng cách giảm bớt EOF và dùng các chất

diện hoạt (mixen) có linh độ điện di cao Trong dung dịch đệm, các mixen thường

mang điện tích và di chuyển cùng chiều hoặc ngược chiều với dòng EOF tiy theo

lên tích của chúng Khi thêm các chất diện hoạt caion như CATB, HDB vào dung

dịch đệm dòng EOE có thể bị đảo ngược [60] Trong mọi trường hợp, các thay đổi

về nồng độ dung dịch đệm, pH, nhiệt độ, sử dụng các chất phụ gia (như urea, ion kim loại), các chất chọn lọc chiral, các chất diện hoạt đều có thể được sử dụng để

thay đổi tính chọn lọc Cũng như trong sắc ký, các dung môi MeOH, MeCN và iso-

propanol có thể được thêm vào dung dịch đệm đang chạy như một chất phụ gia để làm giảm các tương tác thân dầu giữa chất tan và mixen ở các nồng độ từ 1- 50% (v/v) Chúng có thể duy trì cấu trúc mixen và giúp quá trình di chuyển sắc ký nhanh hơn Các chất đệm có pH cao thường duy trì dòng EOF hợp lý và quyết định chiều

di chuyển

1.2.3.4 Điện di môi trường không nước (Nonaqueous capillary electropho- resis NACE)

Là kỹ thuật điện đi được thực hiện với một số chất không tan [25] hay không ổn

định trong nước hoặc các alkaloid có tinh base yếu Các dung môi thường dùng là MeOH, MeCN, isopropanol [26], [31], DMSO [60] Các chất phụ gia như

cyclodextrin, thuốc thử cặp ion, các chất diện hoạt cation [69] cũng được thêm vào

để thay đồi tính chọn lọc, tăng khả năng tách trong NACE Ưu điểm nỗi bật của kỹ

thuật này so với CZE và MEKC là thời gian phân tích rất nhanh (5 — 10 phat) [60]

1.2.3.5 Các thông số kỹ thuật

«_ Linh độ của dòng điện di và dòng điện thẩm `

Mu ane =—T— () ve =„eE (9) Ho =£2 (10) = 7 anbe é

Trong đó: & Bé day lop khuéch tan kép r: Bén kinh ion hydrat hóa

e: Điện tích trên một đơn vị bễ mặt nụ: Độ nhớt dung dịch đệm

E: Điện trường áp dụng (volt/cm) veo: Van téc dong EOF

per: Linh độ của dòng điện di q: SỐ điện tích iom

to: Linh độ điện di của dòng EOF (EOF mobility): Thé Zeta

e: Hang sé dién méi ctia dung dich dién ly (dielectric constant)

= Thai gian di chuyén (mobility and migration time): là thời gian cần thiết đề

một chất tan di chuyển từ đầu mao quản đến điểm phát hiện (detector)

toy

Elle + Hao) Vilar Heo) ˆ

»_ Số đĩa lý thuyết N là đại lượng thể hiện hiệu năng tách của ống mao quản có

thể được tính trực tiếp từ điện di đồ theo công thức (6)

t N-(ẾP P)V (3) lay NET =554( 7)" (9)

D: Hệ số khuắch tán của chất hòa tan — wap: Bễ rộng pic ở nửa ch

và các ký hiệu khác đã được định nghĩa ở trên

»_ Diện tích pic được chuẩn hóa

Trong CE mỗi chất phân tích di chuyển qua detector với vận tốc khác nhau Những

chất ra sau thường có diện tích pic lớn hơn và không tỷ lệ với nồng độ như các chất

ra trước Do đó thông số corrArea - diện tích pic đã được chuẩn hóa về thời gian

(Spic/)) được sử dụng để định lượng (CorrArea = diện tích pic/ tụ)

"Tỉ số signal — to-n‹

Giống như HPLC, trong CE thông số này cũng cho phép xác định giới hạn phát

hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của chất cần phân tích

Cơ chế tách của các chất tan trung tính ở MEKC chủ yếu là cơ chế sắc ký và các

thông số có thể được mô tả như các tương quan về sắc ký [10] Thời gian di chuyển

th được tính theo công thức (15) Hệ số dưng lượng k° (capacity factor) được tính

bằng công thức (16) Độ phân giải R của 2 tiểu phân trong MEKC có thể được cải thiện bằng cách tối ưu hoá hiệu năng tách, độ chọn lọc, yếu tố k'và được tính theo

công thức (17)

tự Thời gian lưu của chất tan trung tính tục: Thời gian di chuyển của mixen tụ: Thời gian chất tan không bị lưu giữ đi qua chiều dài hiệu dụng của mao quản 1.2.3.6 Ứng dụng

Hiện nay điện di mao quản CE (với CZE, CEC, MEKC) là một trong những phương

pháp phân tích các hợp chất tự nhiên đã có các ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm [83], [95], dược phẩm [104], kiểm soát môi trường, dược liệu [58]

gồm các hợp chất tự nhiên nhu: alkaloid [107], [119], flavonoid [80], [108], [123],

terpenoid, các acid polyphenol [30], [57], [130], saponin, antraglycosid, quinon,

CE được dùng chủ yếu cho định lượng, nhưng cũng có thể dùng để xác định tạp

điện di xác định, mỗi hợp chất tỉnh khiết sẽ cho một

tir detector (phd UV, MS )

pic có thời gian di chuyển và các dữ li Cách thực hiện: Các dịch chiết của mẫu thử dược liệu thường chứa nhiều chất cùng

điện di đồ mẫu thử có thể sẽ khác với điện di đồ từng

tan trong dung môi Do vật

chất chuẩn đối chiếu (tỉnh khiết) Để khắc phục nhược điểm này người ta dùng phương pháp thêm chuẩn và xét dữ liệu phổ của pic cần xác định trùng với mẫu chuẩn trong cùng điều kiện CE

"_ Định lượng: dựa trên việc so sánh tỷ lệ diện tích pic đã được chuẩn hóa của

mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện phân tích theo nguyên lý diện tích pic đã

được chuẩn hóa tỷ lệ với nồng độ của chất cần định lượng

'Trong CE lượng mẫu tiêm rất nhỏ khoảng 5 ~ 50 nl và phụ thuộc vào áp suất Do

vậy rất khó đạt được sự đồng đều lượng mẫu tiêm Để khắc phục nhược điểm này

người ta dùng phương pháp nội chuẩn [64], [125], [128] [129] Chất nội chuẩn

được dùng thường có công thức cấu tạo gần giống với chất cần định lượng [104]

Nội chuẩn được thêm một lượng chính xác vào cả hai mẫu thử - mẫu chuẩn và điện

di trong cùng điều kiện

"Một số thí dụ ứng dụng phương pháp CE

đại được dùng để phân tích

Điện di mao quản là phương pháp phân tích hii

hợp chất tự nhiên như flavonoid [120], alkaloid, peptid Đã có nhiều báo cáo khoa

học đề cập tới kết quả định lượng một số hợp chất tự nhiên từ dược liệu bằng CE

+ _ Xác định tạp đồng phân trong dexchlopheniramin nguyên liệu [36]

Điều kiện điện di: mao quản fused silica 50 um; chiều dài tổng cộng 72 cm (chiều

dài hiệu dụng 63,5 cm) Tiêm mẫu 50 mbar trong 5 giây Dung dịch đệm -

cyclodextrin 3% trong TRIS 50 mM, pH 2,5 (điều chỉnh pH với H;PO, sau khi

pha); Dign thé 25 kV; Detector PDA, phát hiện tại 270 nm

Yêu cầu: chất kết tỉnh đồng hình là pic phụ trong điện di đồ mẫu thử phải có diện

tích đình nhỏ hơn diện tích pic chính trong điện di đồ của dung dịch đối cl

~_ Xác định tạp đồng phân của Lavumicin [16]

Điều kiện điện di: mao quản fused silica 50 um; chiều dài tổng cộng 72 cm (chiều

đài hiệu dụng 63,5 cm) Tiêm mẫu 50 mbar trong 10 giây Dung dịch đệm B-

cyclodextrin 3% trong TRIS 50 mM, pH 2,5 (điều chỉnh pH với H;PO, sau khi

pha); Dign thé 25 kV; Detector PDA, phát hiện tại 214 nm

Yêu cẩu: phải có ít hon 0,3% lavumicin hữu truyền - diện tích pic phụ trong điện di

đồ mẫu thử phải có diện tích đỉnh nhỏ hơn diện tích pic chính trong điện di đồ của

dung dịch đối chiếu

*_ Xác định tạp đồng phân trong ropivacain HCI nguyên liệu [1 18]

Điều kiện điện di: mao quản fused silica 50 um; chiều dài 72 cm; Tiêm mẫu 5 giây

trong 50 mbar, Đệm hestakis -2,6-(điometyl) B-cyclodextrin 13,3 mg/ml trong H;PO, 1%, pH 2,9 ~ 3,1; Điện thế 375 V/cm; Detector PDA phát hiện tai 206 nm

*_ Định lượng rutin, kaempferol, quercetin trong Morus alba L [108] Điều kiện điện di: mao quan fused silica 50 pm, L = 65,5 cm, (le = 42,5 em) Acid boric 150 mM, pH 10,0, 18 kV, 32°C; phát hiện ở 275 nm, inj 50 mbar x 10s

* _ Định lượng ecdyson, 3,7dimethoxyquercetin, verbascosid & rutin trong Laminum maculatum (106)

Hình 1.3 Điện di đỏ của dịch chiết cành lá Laminum maculatum

Điều kiện điện di: mao quản silica nung chảy 75 tim, chiều dài tổng cộng 51 cm

(chiều dài hiệu dụng 43,4 cm) Dung dịch đệm natriborat 30 mM, pH 9,47, điện thé

20 kV; tiêm mẫu 50 mbar x 5 gidy, nhigt 4 mao quan 21,5 + 0,5°C; Detector UV -

254 nm Ecdyson (3), 3,7dimethoxyquercetin (1), verbascosid (2), rutin (4)

= Dinh lwong astragalin, nicotiflorin, isoquercetin, rutin, quer

cy Azadirachta indica (120)

trong

Diéu kign dign di: mao quan silica 75 jum; chiéu dài tổng cộng 48,5 cm (chiều dài

hiệu dụng 40 cm) Dung dịch đệm phosphat 20 mM, SDS 50 mM, ở pH 2,5 với THF 5% & MeCN 15%, dign thé - 22 k ; tiêm mẫu 30 mbar x 3 s, nhiệt độ mao quan 30°C; Detector UV phat hign tai 255 nm

Với điều kiện như trên astragalin, nicotiflorin, isoquercetin, rutin và quercitrin trong cây Azadirachra indica được định lượng bằng kỹ thuật MEKC

Hình 1.4 Điện di đỗ các flavonoid trong dịch chiết ethanol Azadirachta indica

'Trong môi trường acid pH 2,5 các flavonoid glycosid trên tồn tại ở đạng trung tính

“Thời gian di chuyển của mỗi chất phụ thuộc vào tương tác của từng chất với SDS

ậc thêm MeCN vào đệm sẽ

Các flavonoid glycosid này tan tốt trong MeCN, nên

giúp quá tình tách và làm giảm thời gian di chuyển của các chất này khi điện di

Điện thế áp đặt 22 kV, như vậy dòng điện di sẽ đảo cực so v đi íp dương,

do dó thời gian di chuyển của các chất sẽ theo thứ tự sau: tạ quercitrin (12) < tạ

astragalin (10) < tg nicotiflorin (11) < tg isoquercetin (13)< tg rutin (14)

= Dinh long verbascosid, echinocosid, pediculariosid A & M trong P

longifolia & P kansuensis Scrophulariaceae |62]

¡ hiệu dụng 30 cm) Dung dịch đệm natri borat 25 mM, MeOH 10%, pH 9,0, di

thé 15 kV, nhi độ mao quản 25%

điện di như trên đây là

iêm mẫu 50 mbar x 10 s; Detector UV phát

ÿ thuật CZE

hiện tại 250 nm Với điều ki

1.3 SƠ LƯỢC VỀ HỢP CHÁT PHENOLIC 1.3.1 Đại cương

Hop chat phenolic bao gdm nhóm các hợp chất tự nhiên có chứa vòng thơm mang một hay nhiều nhóm hydroxyl [53] Đây là một nhóm lớn bao gồm nhiều nhóm nhỏ

nhu: flavonoid, tannin, phenylethanoid, phenylpropanoid, cic quinon Trong tổng,

quan này chỉ đề cập tới 2 nhóm hợp chất có liên quan 1a flavonoid va

có màu xanh, tím, đỏ nên những hợp chất này thường được coi là chất tạo sắc tố cho

cây, nhưng một số ít flavonid lại không màu [51], [52]

Phenylethanoid glycosid (PhGs) là một nhóm nhỏ trong các hợp chất phenolic có

hoạt tính sinh học, có ở hầu hết các cơ quan thực vật như: rễ, vỏ thân, cành, lá, phần thân trên mặt đất, phôi, hoa và phân bố rộng trong nhiều họ thực vật bậc cao Theo thống kê chưa đầy đủ, PhGs có mặt trong hơn 150 loài của khoảng 30 họ thực vật

bậc cao như Planiaginaceae, Verbenaceae, Acanthaceae, Orobanchaceae,

Oleaceae [63], [71], [85] Về cấu trúc PhGs gồm nhân phenylethanol gắn với B — glucopyranose (hay mannose) qua nối liên kết glycosyl rat chic cl

phenylethanoid glycosid còn được gọi là phenylpropanoid glycosid vi trong phân tử

của chúng có hai gốc, một gốc phenylethanol và một trong các gốc sau: caffeoyl,

feruoyl, coumaroyl, cinnamoyl [96] Như vậy sẽ có một số hợp chất có thể xếp

trong ca hai nhém phenylethanoid glycosid và phenylpropanoid glycosid

(verbascosid)

Hình 1.7 Khung cấu tạo của phenylethanoid 1.3.2 Kiểm nghiệm

1.3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học |6]

»_ Các phản ứng màu chung cho hợp chất phenolic

Với dung dịch AICI; /cần: các flavonoid có nhóm OH ortho so với nhóm ceton sẽ

tạo phức tăng màu với AICI, trong môi trường acid

Với vanilin / HCI (1g vanilin trong 10 mÌ HCI đổ) hay vanilin / H;SØ, (10%

vanilin trong EtOH — H,SO, dd 2:1) tao phite có màu thay đổi tùy theo cấu trúc (từ

hồng ~ nâu - nâu đỏ - đỏ gạch) [33]

Với dung dich FeCl, 1 — 5% / cầm: tạo phức màu lục, xanh hay nâu

Với thuốc thử Folin ~4

iocalteu: các hợp chất phenolic cho màu xanh rất bền Có

thể dùng phản ứng này để định lượng các chất phenolic bằng phương pháp so màu ở

750 nm [116] Nhưng thuốc thử này không đặc hiệu cho riêng các chất polyphenol,

mà bất kỳ chất khử nào cũng có thể tham gia phản ứng này (Hòa tan 10 g Na

tungstat và 2,5 ạ molybdat vào 70 mÌ HạO Thêm 5 ml acid phosphoric 85% & 10

ml acid hydroclorid dam đặc, để yên 10 gid Thém 15 g lithi sulfat va 1 giọt brom

Dé yén 15 phút Làm lạnh ở nhiệt độ phòng và thêm nước cất vừa đủ 100 mi.)

Véi thude thir Gibbs (2,6 dicloroquinon cloroimid 2% / CHCl) va dung dich

amoniac 2M, các hợp chất phenolic cho màu thay đổi (vang — nau - đỏ nâu — xám) tùy theo cấu trúc [53]

*_ Các phân ứng màu đặc trưng của flavonoid [52]

Với H,SO, đậm

màu vàng đậm, chalcon và auron có màu đỏ thắm, flavanol cho màu đỏ cam

isoflavon, isoflavonon cho màu vàng, flavon, flayonol cho

'Với HCI: anthocyanidin, leucoanthocyanidin có màu đỏ, chalcon và auron mắt màu Với

oflavon, isoflavonon cho màu vàng đậm ~ đỏ (tạo chalcon); Flavon, flavonol từ không màu, vàng nhạt —» vàng sáng, vàng cam; Chalcon và auron từ

vàng cam chuyển sang đỏ da cam tới tía; Flavanol cho màu đỏ cam, anthocyanidin,

leucoanthocyanidin từ đỏ, tím chuyển xanh dương

Với SbCl; / CCl, (phan ing Martini Bertolo): chalcon cho màu đỏ đến tím, flavon cho màu vàng đến vàng cam Dihydrochalcon không cho màu

Phản ứng Cyanidin, Shinoda hay Willstater: là phản ứng đặc hiệu của các

flavonoid, dung dịch phản ứng sẽ có màu hồng đến đỏ Lắc dung dịch phản ứng có màu với octanol Nếu lớp octanol có màu, chất thử dạng aglycon; nếu lớp octanol

không màu, chất thử ở dạng glycosid Flavonon, flavanonol cho màu đỏ thẫm;

Flavon, flavonol cho màu hồng đến đỏ; Chalcon cho màu đỏ thắm; Các methoxy

flavon (tangeretin) không màu

1

2 Dinh tinh flavonoid va phenylethanoid bang TLC [122]

Thường dùng bản mỏng silica gel 60 trong phân tích flavonoid va PhGs Sau khi

triển khai trên lớp mỏng silica gel, flavonoid được phát hiện trên sắc đồ dựa vào màu sắc của chúng dưới ánh sáng thường, nhưng phần lớn flavonoid được phát hiện

theo màu sắc phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại 365 nm sau khi phun AICl;, NP 28/PEG 1% (Natural Products Polyethylen glycol) trong MeOH, NH,OH; hay làm

tắt quang ở bước sóng 254 nm và có thể dùng một số thuốc thử khác của nhóm phenol Các PhGs cũng được phát hiện trong sắc đồ theo các thuốc thử trên hoặc

phun FeCl, 1 — 5%, H,SO, 10% trong cồn, rồi sấy 110% Có thể dùng một trong

các hệ dung môi khai triển sau: CHCI; ~ MeOH (7:3) hay (3:2), BuOH AcOH ~

HạO (4:1: 0,5), EIOAc - MeOH (19 :1), CH;CI;~ MeOH (1

lượng nhỏ acid formic hay acid acetic để quá trình tách được hiệu quả hơn

vào đó các hợp chất phenolic có hiệu ứng bathchromic khi thêm kiềm vào dung,

dịch [53] Do đó, các phương pháp quang phổ rất quan trọng trong định tính và định

lượng các hợp chất này Phổ UV của flavonoid có hình dạng rất trưng với 2

băng cực đại hấp thụ Băng I (> 290 nm) chủ yếu do vòng B gây ra, băng II (< 290

nm) chủ yếu do hệ thống nối đôi vòng A, C gây ra [81] Mỗi flavonoid có cực đại

hấp thụ A„„„ và cường độ hap thụ riêng Phổ UV của các phenylethanoid cũng có

hình dạng rất đặc trưng với hai vai đi kèm hai đỉnh cực đại hấp thụ

„ độ đúng và đi ính xác cao, có thể định lượng hàng loạt mẫu với

nhỏ Nội dung này được trình bày chỉ tiết trong phần “Phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao”

1.3.2.5 Định tính và định lượng hợp chat phenolic bang CE

Các hợp chất phenolic trong dược liệu có thể được định tính và định lượng bằng

phương pháp CE Các chất phenolic là những acid yếu, trong môi trường kiềm

chúng phân ly thành những anion có độ âm điện khác nhau nên sẽ di chuyển trong

điện trường với vận tốc khác nhau (điện di vùng CZE) Trường hợp chúng là những

chất trung tính không phân ly sẽ điện di theo kỹ thuật MEKC Nội dung này đã

được đề cập chỉ tiết trong phần “Phương pháp điện di mao quản”

canh déu nhin Ld moc déi, dau 14 thuén hinh mii mac, mép nguyén,

rộng 2- 4,5 cm, có 3 gân rõ rệt tỏa từ gốc Những lá phía trên nhỏ hơn những lá

phía dưới, những lá ở gần cụm hoa nhỏ đều trông như những lá bắc Cuống lá nhẫn,

đài 3-12 mm Hoa mọc thành xim nhiều hoa (7- 9 hoa), cánh hoa màu trắng Quả

hình cầu, đường kính 7 ~ 8 mm, khi chín có

vàng hay đen, trong quả có một

hạt rắn chắc Hoa nở vào tháng 3-4, mùa quả vào tháng 5-6 [3], [4]

Bộ phận dùng: lá và cành con của cây chè vằng (Foliưm er Ramulus Jasmini) phơi

hay sấy khô, đưc

c hái quanh năm [20]

Ở Việt Nam cây mọc hoang ở rừng núi và trung du, có nơi trồng như Lào Cai, Hòa

Bình, Vĩnh Phú, Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh,

Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Khánh Hòa Trên thế giới cây chè vằng mọc hoang ở rừng núi và trung du các nước Ấn Độ, Mianma, Campuchia, Lào, các tỉnh phía nam Trung Quéc [17], [20]

1.4.2 Thành phần hóa học Theo Nguyễn Thị Ninh Hải, lá ché ving chita alkaloid, saponin, flavonoid, nhựa

terpen, polyphenol, nhưng chưa có hợp chất tỉnh khiết nào được phân lập [9] Kraus va cộng sự đã chiết được 6 hợp chất terpenoid glycosid có hoạt tính sinh học

gồm: 6” epi ~ anatoliosid A, chevangin A, B, C, D va 6 — epi = chevangin B từ lá chè vắng mọc ở Thái Nguyên [73] (Hình 1.8)

Dai Hug Ngan va cộng sự đã chiết được 3 triterpen steroid 1a: acid 3B — acetyl —

oleanoic, lupeol va - sitosterol từ dịch chiết ether dầu và EtOAc của cành lá chè

ving moc 6 Quảng Trị [87] (Hình 1.8)

Nhiều loai Jasminum khác đã được dùng làm thuốc cổ truyền ở châu Á [61], [113]

Mét s6 lodi Jasminum đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu

về thành phần hóa học như:

*_ Jasmimam grandiflorum L có 2-(3,4-dihydroxyphenyl) ethanol, acid ursolic

oleacein, isoquercitrin [97] và hoa của nó có chứa verbascosid [63]

* Jasminum nudiflorum Lindl có 8 hợp chất phenylethanoid glycosid là

isooleoverbascosid, nudiflosid D, jasnudiflosid E, G, H, I, K va L [111] Hoa

cia J nudiflorum Lindl ¢6 chita verbascosid, forsythosid B, poliumosid [63]

* Jasminum polyanthum Franch c6 jaspolyosid, jaspolyanthosid, oleuropein,

ligstrosid [98], [110], [112]

* Jasminum primuliunum Hemsl va Jasminum mesnyi Hance c6 jasminin

[102], [61] Hoa cia J mesnyi Hance có chứa verbascosid, forsythosid B, poliumosid, echinacosid [63]

= Jasminum urophyllum Hemsley có jasurolignosid, jasurosid E, F, G và urolignosid [99], [101]

= Jasminum laceolarium Roxb có jaslanceosid C, D, E

* Jasminum azoricum L có ba secoiridoid glycosid là ambacein l, II, HI [97], [100] và hoa của nó có chứa verbascosid [63]

= Jasminum absyssinicum R Br có craigosid A, B, C [43]

* Jasminum officinale L - hoa c6 chita verbascosid [63]

Tìm hiểu về thành phần hóa học của một số loài Jasmimm trên thế giới đã được

công bố giúp định hướng nhóm hợp chất có thể có trong J subriplinerve Blume Phần lớn các loài /asminưmn đều có chứa verbascosid một phenylethanoid glycosid

trong một vài bộ phận của cây Phenylethanoid glycosid (PhGs) cùng với iridoid là hai nhóm hợp chất được dùng để làm khóa phân loại hóa học của họ Oleaceae [61]

a Dịch chiét EtOAc, MeOH va dich chiết nước của cành lá chè vằng có tác dụng kháng khuan (E coli, S aureus, B subtilis), kháng 2 dòng nắm A niger

va F oxysporum, khong có tác dụng với P aeruginosa, C albicans và có tắc

dụng chống oxy hóa Riêng dịch chiết ether dầu có tác dụng ức chế 3 dòng tế

bào ung thư của người là ung thư biểu mô gan HEP-2 (Human hepatocellular carcinoma cell line), ung thy mang tim RD (Human heart membrane cell line)

và ung thư ruột kết DLD —1 (human colon cancerous cell line), xc dinh bang

phương pháp SRB [87]

Hai tai liệu [9] và [87] có sự khác biệt nhau về tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết

ché ving trén P aeruginosa va B subtilis

œ Theo y học cổ truyền: nước sắc cành lá chè vằng có tác dụng lợi gan, tăng tiết

mật, kháng sinh, kháng viêm, nhất là phụ nữ sau khi sinh bị nhiễm trùng, sốt

cao (viêm tử cung, viêm tuyến sữa, viêm hạch bạch huyết) [15] Chè vằng còn

được dùng chữa phong thấp, đau nhức các đầu chỉ và khớp xương, các bệnh

viêm ngoài đa, [20] Hiện nay dân gian dùng chè vằng hàng ngày với tác

dụng kích thích tiêu hóa, tiêu độc, giảm cholesterol và đường huyết

Ở Việt Nam có tám loài /asminum gồm: J amplexicaule Buch.- Ham (nhài nhăn),

J funale Decne (nhai diy), J anuolarium Roxb (nhài thon), J multiflorum

(Burm.f.) Andrews (nhài nhiéu 14), J nerrosum Lour (nhai gan), J scandens Vahl

(nhai leo), J subtriplinerve Blume (ché ving) va J sambac (L.) Aiton (nhai)

Ngoài chè vằng, những loài khác chưa thấy tài liệu nào đề cập đến tác dụng làm

thuốc của chúng Nhài chủ yếu dùng hoa làm hương liệu, ít được dùng làm thuốc,

trong hoa nhài có chứa verbascosid [63] Nước sắc hoa nhài dùng rửa mắt, trà uống

Đối tượng nghiên cứu là lá và cành nhỏ của cây chè vằng

Mẫu chè vằng dùng để nghiên cứu chiết xuất các hợp chất phenolic được thu hái

xã Nam Thanh, Nam Đàn, tỉnh Nghệ An (Tháng 5 — 2005) đang thời kỳ ra hoa

Các mẫu chè vằng dùng để nghiên cứu phương pháp định lượng một số hợp chất phenolic glycosid trong đề tài gồm 6 mẫu (Bảng 2.3) Độ ẩm và tro toàn phần được

thực hiện theo Dược điển Việt nam III [2]

Bang 2.3 Các mẫu chè vằng dùng định lượng trong đề tài

Ký Jass.la | Jass Ib | Jass 2a | Jass 2b | Jass 3a | Jass 3b

Thời kỳ sinh Đangra Chưara Đangra Chưara Đangra | Chưara

Để đảm bảo tính chính xác và khoa học của các kết quả nghiên cứu tiếp theo, các

mẫu chè vằng nghiên cứu cần được xác định tên khoa học chính xác Mẫu chè vằng

tươi (cành lá có hoa) đã được ép tiêu bản và lưu trữ tại bộ môn Thưc vật, khoa

Dược, đại học Y Dược TP

subtriplinerve Blume ho Nhài

Oleaceae (PL1) theo khóa phân

loại của H Lecomte [76] và so Hình 2.10 Cành lá chè vằng

sánh với mẫu tiêu bản gốc lưu — Jasminum submriplinerve Blume Oleacea

trữ tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM

2.2 DUNG MÔI, HÓA CHÁT VÀ THIÉT BỊ THÍ NGHIỆM

2.2.1 Dung môi hóa chất

Các dung môi MeOH, EIOH, EtOAc, n-BuOH, CHCI; dùng trong chiết xuất dược

liệu là loại kỹ thuật (P) Bản mỏng siica gel Faa tráng trên bản nhôm (Merck)

Lichroprep RP 18 (Merck) cỡ hạt 40 ~ 63 um; Sephadex LH 20 (Pharmacia)

‘MeOH, EtOH, EtOAc, CHCl, MeCN, dùng trong các kỹ thuật sắc ký (TLC, CC,

HSCC) là loại tinh khiết (pure analyse PA)

MeOH, MeCN, TFA dùng trong HPLC, prep- HPLC, MS, LC ~ MS và các chất

natritetraborat, NagHPO, NaH;PO¿, HạPO,, SDS, ding trong CE, là loại tỉnh

khiết chuyên dùng cho HPLC, CE (Merck) H;O dùng trong HPLC được xử lý trên

máy Dubuque (USA) theo kỹ thuật NANO H;O dùng trong CE được cất trên máy

Aquatron va xit lý qua cột trao đổi ion Aries Vaponics

“Thuốc thử dùng trong các phản ứng hóa học, dung dịch đệm được pha chế theo

được điển Việt Nam II

2.2.2 Các chất chuẩn

'Rutin chuẩn đối chiếu (Roth Art 7176) có hàm lượng 91,5%, (đã trừ độ ấm và tạp —

lọ 5 g) thay cho Ja

Naringin chuẩn đối chiếu (Sigma) có hàm lượng 97,0%

Ji Verbascosid, Je isooleoverbascosid, J; apioverbascosid, J,, 6’—O-menthiafoloyl

verbascosid chuẩn đối chiếu là những chất tỉnh khiết thu được từ quá trình chiết xuất các hợp chất phenolic glycosid trong chè vằng đã được xác định hàm lượng bằng LC ~ PDA ~ MS

Bang 2.4 Hàm lượng các chất chuẩn đối chiếu J„ J„ J+„ Jị

*_ Bể siêu âm Brason 5200 và Bandelin

= May do nang suất quay cực Horiba METTLER Sepa 300

*_ Kính hiển vi quang học Olympus

*_ Máy soi tử ngoại và chụp hình MAG (254, 365 nm và ánh sáng trắng)

®_ Máy quang phổ hồng ngoại FTIR — 8201 PC ~ Shimadzu (dia KBr) va FTIR

~IES 25 Bruker (đĩa Zn Se diy 2,0 mm)

*_ Máy quang phổ UV - Vis hiệu MPC ~ 2200 ~ Shimadzu

= May dién di mao quan Hewlett Packard ** CE, detector PDA (autosampler,

bộ

u chỉnh nhiệt), mao quan silica gel Unbehandelte FS— Kapillax, 50 um,

* May sic ký long higu nang cao Hewlett Packard HP 1050 detector PDA va

HP 1100 detector PDA và MS; Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế

DIONEX; Pump P 580; Autosampler ASI ~ 100; Ultimate 3000 column

compartment; Detector UV D 170U; Fraction collection 2106 GILSON

ABIMED

= May sắc ký ngược dòng tốc độ cao (High speed counter-current

chromatography - HSCCC): PHARMA-TECH RESEARCH CORP Model

CCC 1000

» Máy đo phổ khéi (MS) BRUKER — Daltronics, Esquire 3000 plus ion trap;

Máy đo phổ khi cao HR - EIMS FINNIGANT MAT 95

* May do phd cOng huéng từ hạt nhân (NMR): BRUKER Avance 300MHz

('H) & 75 MHz (ÊC) tại Viện Hóa Học, Dai hoc Innsbruck, Austria

Và các dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm

phan gi

Nơi thực hiện đề tài:

- Bộ môn Hóa Phân tích Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược

TP.HCM

~_ Khoa Vật lý đo lường Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM

- Khoa Dược liệu, Viện Dược học, Đại học Innsbruck, Cộng hòa Áo

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu chiết tách các hợp chất phenolic glycosid

2.3.1.1 Xử lý mẫu dươc liệu thô

Chè vằng là một dược liệu nên trước tiên cần được xác định chính xác tên khoa học

thông qua các đặc điểm thực vật của mẫu thu hái (Gửi chuyên gia về thực vật xác

định tên khoa học) Cành lá chè

thành bột mịn qua rây 0,5 mm rồi cho vào lọ kín bảo quản nơi khô mát

ig sau khi thu hái được phơi khô ngay và xay

2.3.1.2 Khảo sát sơ bộ thành phân hóa thực vật

“Trước khi chiết xuất phải pl

hóa thực vật của chè vằng

2.3.1.3 Chiết xuất hợp chat phenolic glycosid Tir thanh phan hóa học của chè vằng và theo hướng nghiên cứu đề tài, các hợp chất phenolic glycosid sẽ được chiết xuất để làm chất đối chiếu trong phần định lượng bằng phương pháp HPLC và CE

Bột chè vằng được làm âm và chiết ngắm kiệt với ethanol 80% Gộp các dịch chiết

và cất thu hồi dung môi rồi để lạnh trong 24 giờ cho tủa nhựa, clorophyl Lọc loại tạp tủa xuống Cô tiếp dịch lọc đến đậm đặc 1/10 — 1/20 thể tích chiết ban đầu thu được cao lỏng Cao lỏng được chiết phân đoạn lần lượt với cloroform, EtOAc, n- BuOH Các dịch chiết cloroform, EtOAc, n-BuOH được cô áp suất giảm thu hồi

dung môi cho các bột cao 1, 2, 3 tương ứng

2.3.1.4 Phan lap phenolic glycosid Tất cả các quy trình chiết tách pha rắn, sic ky (TLC, CC, HSCCC, prep- HPLC, HPLC) và CE trình bày trong chương 2 này đều là kết quả tối ưu sau khi thăm dò

hàng loạt điều kiện thực nghiệm

Bột cao 2 của chè vằng được tiến hành hàng loạt các sắc ký phân lập các hợp chất

bằng các kỹ thuật sau: chiết tách pha rắn (giá mang là Lichrosob RP 18), HSCCC; Sắc ký rây phân tử sephadex LH 20; HPLC điều chế (prep- HPLC)

Tắt cả các phân đoạn thu được trong các quá trình chiết tách pha rắn, sắc ký CC sephadex, HSCCC và prep-HPLC để tách các phân đoạn nhóm chất hay tách hợp.

chat tinh khiét déu duge kiém tra bing TLC va HPLC với các điều kiện như sau:

= Kiém tra bing TLC bin mỏng DC-Alufolien Kieselgel 60 Fzs; (Merck) với hệ

dung môi là (J) EtAc — acid formic — acid acetic = HạO (13,5 : 0,8 : 1,5 : 2,5);

(II) EtOAc - HCOOH - H;O (8,5 : 1: 0,5); (II) CHCls— EtOAc ~ HCOOH (5: 4: 1);

Phát hiện vết bằng các thuốc thử NP/PEG No 28 (Natural Products Polyethylen

glycol) 1% trong MeOH va soi UV 254 & 366 nm, phun AIC; 3% trong MeOH,

FeCl; 3%, hơ hơi NHẠOH [6|, [122]

»_ Kiểm tra bằng HPLC sử dụng máy Hewlett Packard HP1050 detector PDA, cột

Phenomenex® Hydro RP 80 Ä (5um) 150 x 4,6 mm Pha động MECN- H;O

(gradient, như bảng 2.6) Tốc độ dòng 1,0 ml/phút và nhi ‘ot 40°C, phat

tại bước sóng 210 và 360 nm Thể tích tiêm mẫu 10 pL

2.3.1.5 Quy trình téch phenolic glycosid bang chiét tách pha rắn

'Nhỏi 50 g Lichroprep RP 18 trong cột thủy tỉnh và hoạt hóa pha tĩnh lần lượt với 50

ml MeOH, H;O Cân 3 g bột cao 2 và trộn với 3 ml H;O thành một hỗn hợp đồng

nhất Rót hết hỗn hợp mẫu vào pha tĩnh và rút chân không để mẫu phân bố đều

trong pha tĩnh Mẫu được rửa giải lần lượt với nước, hỗn hợp nước - MeOH

gradient (9:1, 8:

bằng 200 ml MeOH và 100 mi H;O Lặp lại quy trình trên 2 lầ

phân đoạn cùng tỷ lệ dung môi thu được 11 phân đoạn (A;: H;O; Az: H;O - MeOH

Ajo: HO - MeOH 1: 9; An: MeOH) Céc phan doan này sẽ được kiểm tra

2.3.1.6 Quy trình tách phenolic glycosid bang HSCCC

'Từ các tài liệu tham khảo [28], [29], [39], [40], [46], [50], [59], [84] và qua thực

hành đã xác định hệ dung môi tối ưu cho việc tách các hợp chất phenolic từ chè

ving la: EtOAc — EtOH — HO (500: 100: 500) Tach rigng từng lớp, lớp trên pha

tĩnh - SP, lớp dưới pha động - MP Rửa coi! bằng MeOH tốc độ đòng 2 ml / phút x

10 phút (đuôi);

Nạp pha tĩnh và mở máy ly tâm tốc độ 1000 rpm liên tục tử lúc nạp pha nh đến khi pha động chiết hết mẫu từ pha tĩnh Pha mẫu trong 10 mÍ MP, tiêm mẫu (đầu) 'Quy trình sắc ký: bơm MP (đầu) và hứng từng phân đoạn I0 ml Kiểm tra các phân đoạn hứng bang TLC va HPLC tới khi không còn chất tách trong phân đoạn hứng (khoảng 100 — 120 phân đoạn) Tắt máy ly tâm và thay pha động bằng MeOH và để

đẩy pha tĩnh ra khỏi coi! — vẫn liên tục hứng phân đoạn tới khi dung môi ra không

màu Kiểm tra các phân đoạn hứng bằng TLC và HPLC thấy không còn chất tách trong phân đoạn hứng Rửa sạch coi! bằng MeOH với tốc độ dòng 2 ml / phút x 10

phút

2.3.1.7 Quy trình tách phenolie glycosid bằng prep-HPLC

Từ các tài liệu tham khảo [5], [48] và qua thực hành đã xác định các điều kiện tối

ưu cho việc tách các hợp chất phenolic từ chè vằng bằng prep- HPLC như sau:

Quy trình 1: Máy DIONEX, cột Phenomenex RP I8 (5um), 125Ä, 250 x 10 mm, tiền cột: LiChroCARKT 4 — 4 LiChrospher 100 RP 18 (5 um), nhiệt độ cột 40 C; pha động MeCN - H;O (grad.), tốc độ dòng 2,5 ml/phút;

MeCN ~ H;O (grad.), tốc độ dòng 2,0 ml/ phút; thể tích tiêm mẫu 20 uL

2.3.1.8 Quy trinh téch phenolic glycosid bang CC sephadex (5), (56]

Sephadex được ngâm trong dung môi khoảng 30 phút trước khi nhồi cột Cột thủy

tinh sử dụng có kích thước đài 100 cm, đường kính trong 3,5 cm Tùy theo từng hợp

chất cần tách mà dung môi rửa giải là: (I) hon hop MeOH ~ H;O (1:1) hay (II)

MeOH Mẫu cần tách được hòa tan trong lượng tối thiểu dung môi rửa giải, lọc mẫu

nếu can Nap mẫu lên cột và rửa giải với dung môi Hứng mỗi phân đoạn 15 ml

Kiểm tra các phân đoạn hứng bằng TLC và HPLC tới khi không còn chất tách trong

Xác định sơ bộ các chất chiết được bằng các phản ứng màu của flavonoid (là các

flavonoid hay phenolic) Đo phổ UV, IR, MS, NMR các hợp chất

= Do phé MS: Mau pha trong CHạOH đo bing may BRUKER — Daltronics,

Esquire 3000 plus lon héa mau bing phuong php ESI, kiéu positive hay negative

N

buồng ion héa 350°C, phun mau véi khí nitrogen 30 L/phút, bay hơi dung

môi với khí khô nitrogen 10 L/phút, khoảng quết từ 100 ~ 1200 z⁄z Phổ HR EIMS

của (Ju) cũng được đo với điều kiện tương tự và mẫu tiêm tốc độ 0,5 wiL/phút, dùng

ội chuẩn là polypropylene glycol 725

"_ Phổ”H & ”C NMR: pha các mẫu trong CDạOD, lọc qua màng 0,45um, đo

trên máy BRUKER Avance 300MHz (H) ~ 75 MHz (°C)

2.3.3 Định lượng một số hợp chất phenolic glycosid bằng HPLC

2.3.3.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu chiết

"Xác định phương pháp xử lý mẫu gồm các bước sau:

~ Khảo sát lượng mẫu dùng cho kết quả nằm trong khoảng chấp nhận được

- Khảo sát dung môi chiết MeOH ~ H;O, MeCN - HzO và lượng dung mi

- Khảo sát phương pháp chiết: soxhlet, siêu âm, số lần chiết và thời gian

chiết cho mỗi lần

tra sự chiết kiệt các chất trong mẫu bằng HPLC Dịch chiết sau lần chiết cuối phải hầu như không còn pic của các chất cần định lượng

2.3.3.2 Xây dựng phương pháp Dựa trên các tài liệu tham khảo [66], [103], [19] phương pháp xây dựng gồm các bước sau:

- _ Lựa chọn pha tĩnh - cột trên các e6t dong PHENOMENEX RP 18 gdm Hypersyl, Hydro, Synergy, Polar, Zorbax C ~ 18 và cột PLRP ~ S300

- _ Khảo sát pha động về thành phần, tỷ lệ và chương trình Đã khảo sát hệ dung môi MeCN - H;O, MeOH ~ H;O với các nồng độ TFA từ 0,I- 0,005%

- _ Khảo sát nhiệt độ én định cột từ 25 ~ 50°C

~ _ Khảo sắt tốc độ đồng từ 0,1 ~ 1,0 ml/ phút

- Khảo sát bước sóng phát hiện quét phổ các chất cần định lượng từ 200 -

450 nm, chọn bước sóng có hấp thu cao nhất chung cho tất cả các chất Bang 2.6 Chương trình dung môi định lượng các hợp chất phenolic trong chè vằng

glycosid trong chè vằng với các điều kiện sắc ký như sau: máy Hewlett Packard HP

~1050 với PDA detector, bom tứ cấp, autosampler Điêu kiện tách tối tru thu được

trên cột PLR~S 300 A (Sum, 250 x 4,6 mmm) với pha động MeCN 0,005% TFA (A)-

HạO 0,005% TEA (B) với chế độ rửa giải gradient (Bảng 2.6) Tắc độ dòng 0,3 ml /

phút, nhiệt độ cột 4C Phát hiện tại bước sóng 360 nm Thể tích tiêm mẫu 10 uL

2.3.3.3 Tham định phương pháp

Phương pháp xây dựng được tiến hành tiếp các bước thẩm định sau

~_ Tính chọn lọc: so sánh giữa các mẫu trắng chuẩn và thử

~ _ Tính thích hợp của hệ thống sắc ký trên mẫu hỗn hợp chuẩn, phân tích độ

lệch chuẩn tương đối RSD của các thông số: thời gian di chuyển, diện

tích pic và số đĩa lý thuyết

~_ Xác định khoảng tuyến tính và hệ số tương quan giữa nồng độ chất cần

định lượng với diện tích đỉnh tương ứng trên một loạt mẫu hỗn hợp chuẩn

~ Xác định LOD và LOQ của từng chất trên mẫu hỗn hợp chuẩn

~_ Xác định độ chính xác trên mẫu thử bằng cách xác định độ lặp lại trong

từng ngày (n = 5) và giữa các ngày (n = 3)

~_ Xác định độ đúng trên mẫu thử bằng phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức

nông độ khác nhau

Ham lượng các chất trong từng mẫu được tính theo phần mềm Chemstation của HP

1050 và xử lý thống kê trên phần mềm Excel 5.0

2.3.3.4 Áp dụng phương pháp

Tiến hành định lượng các mẫu chè vằng theo phương pháp HPLC đã xây dựng Cân

chính xác khoảng 0,2 - 0,25g chè vằng trong mỗi mẫu thử

2.3.4 Định lượng hợp chất phenolic trong chè vằng bằng CE

2.3.4.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Dựa theo kết quả xử lý mẫu từ phương pháp định lượng bằng HPLC và điều chỉnh

cho phù hợp với điều kiện điện di

- Khao sat dung môi và tỷ lệ Đã khảo sát các dung môi MeOH, MeCN, isopropanol với các tỷ lệ 5, 10, 15, 20%

~ _ Khảo sắt nhiệt độ ỗn định mao quan tir 25 — 40°C

~ _ Khảo sắt điện thế điện di từ 15 ~ 25 kV

-_ Khảo sát bước sóng phát hiện quét phô các chất cần định lượng từ 200 —

450 nm, chọn bước sóng có hấp thu cao nhất chung cho tất cả các chất

Kết quả thực nghiệm đã xác định quy trình điện di các flavonoid va phenylethanoid

glycosid trong chè vằng như sau:

Điều kiện điện đi: Mao quản silica gel Unbehandelte FS ~ Kapillax, id 50 pm, 1 = 63,5 em, lạ= 55 em Dung dịch điện di nền: đệm phosphat 10 mM (Na;HPO, 10

mM, KH;PO; 10 mM) - natri tetraborat 50 mM, MeOH 15%, ở pH 9,16 với nhiệt độ

mao quản 25°C, điện thế 20 kV; Điều kiện tiêm mẫu: áp suất 50 mbar trong 5 giây

Phát hiện tại bước sóng 360 nm Thời gian điện di 30 phút một lần

“Trong kỹ thuật điện di, việc ổn định mao quản có ảnh hưởng lớn đến độ chính xác

ại của phương pháp Do đó cần xác đỉnh rõ điều kiện hoạt hóa và rửa nao

quản để thu được kết quả én định

Điều kiện hoạt hóa mao quản: Mao quản lần đầu sử dụng được hoạt hóa bằng cách

rửa lần lượt với dung dich NaOH 0,1 N, NaOH 0,01 N và nước cắt trong 15 phút cho mỗi loại dung dịch [107] Sau đó điện di dung dịch điện ly nền (không tiêm mẫu) trong 15 phút

"Râa mao quản giữa các lần điện di: Sau mỗi lần điện di, mao quản đều được rửa

với MeOH 5 phút và nước cắt 4 phút (post condidon) Trước khi điện di mẫu mao

quản được rửa với NaOH 0,01 N 5 phút, nước cất 4 phút rồi chạy ổn định trong

dung dịch điện ly nền 5 phút nữa trước khi tiêm mẫu (pre condition) [70], [109] Tat

cả các dung dịch mẫu, đệm, nước rửa, NaOH 0,I N, NaOH 0,01 N, MeOH đều

được lọc qua màng lọc milipore 0,22 um hàng ngày trước khi điện di [129]

2.3.4.3 Thắm định phương pháp

Trước khi tiền hành điện di định lượng các chất trong mẫu thử, cần tiền hành điện di

định tính xác định vị trí pic của từng chất phân tích và nội chuẩn bằng phương pháp

thêm chuẩn Đầu tiên điện di mẫu thử, sau đó lần lượt thêm từng chất chuẩn và điện

di mẫu thử thêm chuẩn So sánh điện di đồ của mẫu thử với các mẫu thử có thêm

chuẩn sẽ thật sự tăng rõ rệt của từng pic (diện tích và chiều cao) ở các mẫu thử có

thêm chuẩn

Phương pháp xây dựng được tiến hành tiếp các bước thấm định sau:

-_ Tính chọn lọc: so sánh giữa các mẫu trắng chuẩn và thử

-_ Tính thích hợp của hệ thống điện di trên mẫu hỗn hợp chuẩn, phân tích

sai số tương đối RSD của các thông số: thời gian di chuyển, diện tích pic

đã hiệu chỉnh (CorrA), số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối

-_ Xác định khoảng tuyến tính và hệ số tương quan giữa nồng độ của chất

cần định lượng với tỷ lệ của diện tích đỉnh tương ứng đã hiệu chỉnh với

diện tích đỉnh đã hiệu chỉnh của nội chuẩn, trên một loạt hỗn hợp chuẩn

-_ Xác định LOD và LOQ của từng chất trên mẫu hỗn hợp chuẩn

~_ Xác định độ chính xác trên mẫu thử bằng cách xác định độ lặp lại trong

từng ngày (n = 5) và giữa các ngày (n = 3)

-_ Xác định độ đúng trên mẫu thử bằng phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức

nông độ khác nhau

Tính hàm lượng các chất trong mẫu và xử lý thống kê trên phần mềm Excel 5.0

2.3.4.4 Áp dụng phương pháp

Tiến hành định lượng các mẫu chè ving theo phương pháp HPLC đã xây dựng Cân

chính xác khoảng 0,1 — 0,2 g chè ving trong mdi mau thir

2.3.5 Phân tích số liệu thực nghiệm

Tính các số liệu như giá trị trung bình, độ lệch chuẩn,

khoảng tin cậy, phương trình hồi qui và

phần mềm Excel 5.0 [126] Đánh giá phương trình hồi quy, độ chính xác hàm lượng giữa các ngày của 2 phương pháp bằng test E, test T [7], [8]

CHƯƠNG 3: KET QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 CHIẾT CÁC HỢP CHÁT PHENOLIC TRONG CHÈ

VANG LAM CHUAN DOI CHIEU

3.1.1 Chiết xuất các hợp chất phenolic trong chè vằng

3.1.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học cây chè vằng

'Do chưa có flavonoid tỉnh khiết nào từ cây chè vằng được công bố, nên thực hiện đề

tài theo hướng chiết xuất các hợp chất phenolic làm các chất chuẩn đối chiếu trong,

phần định lượng Do đó trước tiên cần xác định sơ bộ thành phần hóa học mẫu chè

Nhóm hợp chất “Thuốc thử Phản ứng dương tính Kết quả

erpen TT Lierbermann | DS nau đến tm, lớp dung _

— Burchard địch trên có mầu xanh lục Valse—Mayer |Tủatắng vàngngà

Alkaloid Bertrand 'Tủa trắng +

Dragendorff Tủa đỏ cam Anthragiycosid KOH 10% DD kigm có màu hồng -đỏ +

DD gelatin mudi tủa bông (tanin)

Lắc đứ với nước _| Bọt bền trong 15 phút

Polyuronic Pha véicdn 96% | Tủabôngtrắng-vàngnu | +++

+: rõ ++: rõ hơn +++: rất rõ

Bột chè vằng (10 g) được chiết và làm các phản ứng màu chuyên biệt để xác định sơ

bộ các chất có trong đó (Bảng 3.7) Kết quả cho thấy chè vằng có chứa I1 nhóm hợp chất gồm: flavonoid, terpenoid, saponin, alcaloid, anthraglycosid, tanin, Kết

đã tham khảo [9], [15], [87] và có phần khác biệt là

sự có mặt của nhém anthraglycosid

quả trên phù hợp với

3.1.1.2 Chiết xuất các hợp chất phenolic trong chè vằng Các hợp chất phenolic từ cành lá chè vằng được chiết theo sơ đồ hình 3.11 thu cao

1, cao 2 và cao 3

Bột chè vằng

'EIOH 80%, để lạnh, lọc loại tạp Cô

đặc

Kiểm tra các cao thu được bằng phản ứng với FeCl;, cho kết quả dịch phản ứng của

cao 2 có màu xanh đậm nhất, tức cao 2 chứa nhiều hợp chất phenolic nhất Tiếp tục

phân lập cao 2 qua một loạt các phương pháp sắc ký theo sơ đồ hình 3.12 thu được

Hình 3.12 Sơ đồ phân lập các hợp chắt phenolic glycosid từ cành lá chè vằng

3.1.2 Định tính và kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất J,- J,,

3.1.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học

Các hợp chất tỉnh khiết Ju, Ja, J3, Ja; Js, Je: Ins Jy Joy Sno vài

ứng hóa học đặc trưng của nhóm flavonoid Kết quả cho thấy các hợp chất Js, Js,

Jạ Js Jịo là những Flavonoid, các hợp chất còn lại Jt, Jay Iss Je J; và Jn là những

hợp chất phenolic, nhưng không phải là flavonoid (Bảng 3.8)

được làm các phản

Bảng 3.8 Kết quá phản ứng màu định tính các hợp chất phenolic trong chè vằng

NaOH | FeCl2% | AIC5% ¡Cyanidinj NF281% [UV 365mm

Ji | Vângnhạt Xanhrêu | Vàngsáng = Vàng | Vang xan

Jn | Tang man | Xanhréu | Vangséng | Đỏ Vàng | Vàngxanh

Js | Tăngmầu| Xanhrêu | Vàngsáng | Đỏ Vàng | Vàngxanh

Já | Vàng nhạt| Xanhrêu | Vàng sang - Vàng | Vàngxanh

Js | Vàng nhạt| Xanhrêu | Vàng sáng - Vàng | Vàngxanh J« | Vàng nhạt| Xanhrêu | Vàng sáng - Vàng | Vàngxanh

dạ | Vàng nhạt| Xanhrêu | Vàng sáng - Vàng | Vàngxanh

Ja | Tăngmàu| Xanhrêu | Vàngsáng | Đỏ Vàng | Vàngxanh

Js | Tăngmàu| Xanhrêu | Vàngsáng | Đỏ Vàng | Vàngxanh

đo | Tăng màu | Xanhrêu | Vàngsáng | Đỏ Vàng | Vàngxanh

Ju | Vàng nhạt | Xanhrêu | Vàng sáng - Vàng | Vàngxanh

3.1.2.2 Kiểm tra trên TLC

Các hợp chất tỉnh khiết Jạ, J›, Js Jar

đe Jạ; Je Jịa và Jịy được kiểm tra độ

tỉnh sạch bằng TLC và HPLC với các điều kiện tương ứng đã nêu trước khi ghi phd MS va NMR

Sử dụng bản mỏng DC-Alufolien Kieselgel 60 Fos, (Merck) với hệ dung

môi(J):EIOAe-acid formic~acid acetic

— HO (13,5-0,8-1,5-2,5) Hiện vết bằng thuốc thử NP/PEG No 28 1% /

MeOH hay AICI33% va soi UV 254 &

Kết quả: Trên sắc đồ TLC cho thấy các vết J¡ Jz, Ja; J« J›, Js, Jụo; Jịy khá tỉnh sạch,

chỉ có J; vẫn còn I vết tạp nhỏ đi kèm cần được tỉnh chế tiếp

Hai hợp chất Js và Js do lượng chất thu được quá ít nên không có hình ảnh TLC

3.1.2.3 Kiểm tra trên HPLC

Sau khi kiểm tra trén TLC, cdc hop chat Ju, Ja, Iss Jas Is Ios In Ise Joy Tao VAT tiếp

tục được kiểm tra bằng HPLC phát hiện pic ở 210 nm và 360 nm, với các đi:

đã nêu ở phần 2.3.2 I thu kết quả như hình 3.14 — 3.16

Trên sắc đồ 3D từ 200 600 nm, các hợp chất Ji, J2, Ja, Je, Jr, Jo, Jo va Jus chi cho

một pìc duy nhất, tức khá tỉnh sạch Riêng ba hợp chất J;, Js, Js van con lan it tap vi

còn các pic nhỏ đi kèm Với J; và J; tuy sắc ký riêng từng chất nhưng có thời gian

lưu liền sát nhau (tạ Js là 14,32 phút và tạ J; là 14,41 phút) So sánh với sắc đồ của

cao 2 ban đầu cũng không phát hiện được các pic tương ứng với 3 hợp chit Js, Jn

JJs do hàm lượng của chúng trong dịch toàn phần quá thấp ở dạng vết không đủ để

thành pic

* Céc flavonoid: J, cho mot pic với tạạ: 19,08 phút, J¿ cho pic chính có tạ:

21,69 phút và một số pic tạp rất nhỏ, Js cho pic chính với tạạ: 18,06 phút và một số pic tạp rất nhỏ, Jạ cho một pic tạo: 24.04 phút, Jạ cho một pic có tạịg:

20,6 phút (Hình 3.14) Phổ UV của các pic này có hình dạng đặc trưng của

Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC và phổ UV của các hợp chắt dụ, Ja, Js, dạ Jr, Jet

*_ Các chất phenolic: J, cho một pic với tạ: 19,42 phút, J cho pic chính tay: 22,36 phút, J„ cho một pic chính có tạs:16,71 phút và một số pic tạp nhỏ, J„ cho một pic tạø: 31,50 phút, Jy cho một pic có tạ;: 16,84 phút và Jụ cho một

40,84 phút, (Hình 3.15) Phổ UV của các chất này cũng tương tự

pc Có tri

nhau về hình dạng chung.

Hình 3.16 Sắc ký đồ HPLC của các hợp chất dh, da, ds dạ, de, Jr, Jo, sto, Jr và

dịch chiết MeOH toàn phần (360 nm)

= Dich chiét MeOH toàn phần của chè vằng cho 11 pic với các thời gian lưu

nhur sau: pic 1 tạ= 16,84 phút; pic 2 tạ = 19,08 phút; pic 3 t= 19,42 phút; pic

4 ty= 20,04 phút; pic 5 tạ = 20,6 phút; pic 6 tạ = 21,69 phút; pic 7 tạ= 22,36

phút; pic 8 tạ = 31,50 phút; pic 9 tạ = 33,1 phút; pic 10 tạ = 34.65 phút và pic

11 tự = 40,84 phút

§o sánh thời gian lưu của từng chất J¿ — J trên sắc ký đồ riêng biệt của chúng với thời gian lưu của các chất đó trên sắc ký đồ dịch chiết MeOH toàn phẩn trong cùng điều kiện sắc ký, phát hiện tại 210 và 360 nm, cho thấy có 9/11 hợp chất chiết được

có pic tương ứng trên sắc đồ dịch chiết MeOH toàn phần (Hình 3.16) Hai hợp chất J; và Js vẫn không thấy pic tương ứng trên sắc ký đồ dịch chiết MeOH toàn phần có thể do hàm lượng của chúng trong mẫu quá thấp Hai pic trên sắc đồ dịch chiết

MeOH toàn phần chưa xác định là pic 9 tạ = 33,1 phút; pic 10 tạ = 34,65 phút

Do lượng mẫu thu được quá ít và chưa tinh khiết nên hai hợp chất J; và J sẽ được

nghiên cứu tiếp ở các đề tài sau khi có điều

3.1.3 Định tính các chắt phenolic trong chè vằng bằng LC - MS

3.1.3.1 Phỗ MS của các chất dị- dị Bang 3.9 Thời gian lưu (HPLC), dữ liệu phổ UV và MS của các hợp chất J; - Jn

* Phổ UV lấy từ quá trình sắc ký HPLC do lượng chất tinh khiết quá ít

Từng hợp chất J¡ — Jạ được hòa trong MeOH và đo phổ MS Kết quả thu được thể

hiện trong bảng 3.9 và đặc

J¿ có thể là hai đồng phân có cùng khối lượng phân tử

ệt Jụ; J¿ có các mảnh ion m⁄£ bằng nhau Như vậy J¡ và

Các hợp chất J, Ja, Js; Js, Juo đều cho kết quả dương tính với các phản ứng của

flavonoid Điều này phù hợp với phố UV của chúng có hình dạng đặc trưng của

nhém flavonoid

Cac hgp chat Ji, Se Js Ics Irs Jus Voi FeCl; 2% cho màu xanh rêu, với AICl; 5%

cho màu vàng sáng; tăng màu với NaOH nhưng không cho phản ứng cyanidin va

phổ UV của chúng có cùng hình dạng (2 vai và 2 cực đại hắp thụ) Các đặc tính này

cho thấy chúng là các chất phenolic và có thể có khung cấu trúc tương tự nhau

(cùng loại nhóm chất)

3.1.3.2 Định tính các chất bằng LC - MS

'Việc định tính các hợp chất trên sắc đồ HPLC đã được thử nghiệm bằng LC ~ PDA

— MS véi hg théng may Hewlett Packard HP — 1100 autosampler, detector PDA va

MS, cét PLRP S 300 A (5 um, 250 x 4,6 mm); Điều pha động như đã mô tả

trong bảng 2.6 Mẫu thử là dịch chiết MeOH chè vằng Detector PDA phát hi

ệt độ buồng ion hóa 350°C và

phun 30 L/min (nitrogen), khí làm bay hơi dung môi 10 Limin (nitrogen)

360 nm va ESI MS kiéu positive hay negative, nhỉ

Dit cdc SIM (selective ion monitoring) theo khéi lượng phân tử M của từng hợp

chat tinh khiết, đã được xác định trong phan 3.1.3.1 6 trén, dé định tính chúng trong

dịch chiết MeOH toàn phần của chè vằng bằng kỹ thuật LC-MS Các sắc đồ LC-

MS theo SIM cho các pic được so sánh với sắc đồ HPLC của dịch chiết MeOH chè

vằng toàn phần phát hiện tại 360 nm (Hình 3.17) Kết quả thu được như sau:

= Voi SIM 623,3 m⁄¿ sắc ký đồ LC - MS cho 2 pic có tạ tương ứng với pic của

J¿ và J„ phù hợp với phố MS của J¡ & J„ có các mảnh ion có m⁄z bằng nhau

»_ Với SIM 610,8 m/z sic ky 46 LC — MS cho 1 pic có tạ tương ứng với pic J;

»_ Với SIM 594,8 m/¿ sắc ký đồ LC - MS cho l pic có tg tương ứng với pic Ja

»_ Với SIM 1009,5 m⁄z sắc ký đồ LC MS cho 1 pic có tx tương ứng với pic Je

= Voi SIM 774,1 m/z sic ky d6 LC — MS cho | pic cé tg tong img véi pic Jy

Với SIM 48,7 m/z sic ky 46 LC — MS cho 1 pic có tạ tương ứng với pic Jạ

= Véi SIM 464,4 m/z sic ky 43 LC — MS cho l pic có tạ tương ứng với pic Ji

= Vi SIM 789,6 m/z sic ky 46 LC — MS cho | pic c6 tg trong tmg voi pic Jur

Nhu vậy mỗi pic trong sic 46 HPLC thé hién cho tig hop chat Jy, Jos Iss Jas Ios Is

Is, Juo, Jun va chting là các hợp chất vốn có trong chè vằng

Hai hợp chất Jạ và J có một số đặc tính lý hóa giống nhau: cùng dương tính với

các phản ứng FeCl; 2%, AlCl; 5%, NF 28/MeOH, tăng màu với NaOH, cùng âm

tính với thuốc thử Cyanidin, có cùng dạng phổ UV và các cực đại hấp thụ và điểm nổi bật nhất là trong phổ MS, chúng c6 cing m/z 623,1 [M-H] (negative) va m/z

646,9 [M+Na]” (positive) Tất cả những điểm nêu trên cho thấy J¡ và J¿ có thể là

hai đồng phân vị trí của nhau.

3.2 XÁC ĐỊNH CÁU TRÚC CÁC HỢP CHÁT PHENOLIC

BANG PHO MS- NMR

Theo quy định của ICH A6Q các chất chuẩn đối chiếu chiết từ dược liệu cần phải

được xác định cấu trúc bằng phổ MS và NMR Cac hop chat Ji, Ja, Js, Ja Jes In Jo,

Ju va Ju can duge xác định cấu trúc hóa học — đây là tiêu chuẩn đầu tiên để một

hợp chất tự nhiên được dùng làm chuẩn đối chiếu hóa học Từ phần định tính bằng

phản ứng hóa học cho thấy trong I1 hợp chất phenolic đã chiết tách có 5 hợp chất

flavonoid và 6 hợp chất phenolic không phải flavonoid

3.2.1 Xác định cầu trúc các flavonoid

= J, thu duge 6 dang bét tinh thé hinh kim, mau vàng va phd UV-Vis c6 2 cuc

đại hấp thụ 24C” tại 257 nm và 354 nm Phổ IR của J; (PI 5.1) có các số sóng

3386,8 br (OH), 2908,5 (C=CH), 1654,8 (C=O), 1598,9 (C=O), 1506.3, 1361,7 (OH

J; có [M-HỊ” 608,9 m/z (PI 5.2) và [M+Na]* 632,9 HO Ô 4 {> a

m/z (Bing 3.9) phù hợp với công thức nguyên

"H-NMR cia Jz véi phd 'H-NMR cia rutin [105] HWey_of HO

cho kết quả hoàn toàn tương đồng (PI 5.4) 46 by Je Ruin

Hình 3.18 Cáu trúc hóa hoc cia hop chét Je rutin

= Jo: bot tinh thé hinh kim, màu vàng cam, phổ UV-Vis có cực đại hấp thụ

XS tại 260 và 360 nm Phổ ESI MS của J; có [M-HƑ

o^ vo 447,4 m/z (PL 10.1) và [M+Na]* 470,8 m/c (Bảng 3.9) Gì I (>) ‘OH

Hình 3.19 Cắu trúc hóa học của hợp chắt dạ astrgalin

*_ J¡ạ: bột tỉnh thể hình kim, màu vàng cam đậm và phổ UV-Vis có 2 cực đại

66 [MY 463,8 m/z (PI 11.1) va [M+Nal* 4868 m/z (PL go o

11.2) phù hợp với công thức nguyên C;¡HzxO¿; (M = Kì I €2 = 464.38) So sánh các dữ liệu phổ 'H NMR và '%C OH O

NMR cia Jio (PI 11.3 va 11.4) véi phd 'H NMR và

SC NMR cia isoquercitrin [72], [105] cho két qué 10 soquercittin

hoàn toàn phù hợp (PI 11.5)

Hình 3.20 Cáu trúc hóa học của hợp chat Ji isoquercitrin

= Js thu duge 6 dang bét tỉnh thể hình kim, màu vàng cam và phổ UV-Vis có 2

cực đại hấp thy 24 tai 265 và 345 nm Phổ ESI MS của J; có [M+H]* 594,9 m/z (PL 6) và [M+Na]* 616,9 m⁄z (Bảng 3.9), phù hợp

oH với công thức phân tử C;;H„O¡s (M = 594,16) So

HO,

sánh phổ MS của J; với phổ MS của kaempferol 3- oak

O-rutinosid [106] cho kết quả hoàn toàn phù hợp

Vì lượng J; tỉnh khiết thu được ít nên chưa đo phổ Her of HO OH

NMR Dựa vào phổ MS, UV và các phản ứng màu a Sa

dự đoán J; là kaempferol - rutinosid 38 Keempterol sutinosid Hinh 3.21 Cấu trúc hóa học của các hợp chắt Js kaempferol — rutinosid 3.2.2 Xác định cấu trúc các chất phenolic

= J, thu được ở dạng bột vô định hình, màu vàng rất nhạt Phổ UV 242;

245(sh), 285 (sh), 220, 330 nm; FTIR: 3385 br (OH), 2933 (C=CH), 1697 (C=O),

1631 (ester C=O), 1604 (ester C=O), 1522, 1447 (CH), 1370, 1283, 1159, 1116,

1035, 811 cm” (PI 4.1) Phổ ESI MS của J¡ có [M-H] 623,1 m⁄2 (PI 4.2) va

[M+Na]* 646,9 m/z (P1 4.3) phù hợp với công thức phân từ CzyHxO¡s (M = 624.21)

Phổ '*C NMR (PI 4.5) của J¡ cho 29 vạch là số carbon có trong J¡ Từ những dữ

liệu trên cho thấy J¿ rất phù hợp với cấu trúc của verbascosid (Hình 3.22) So sánh

các dữ liệu phổ 'H NMR (PI 4.4) và '%C NMR của J, (PI 4.5) voi pho 'H va °C

NMR cita verbascosid [44], [127] cho kết quả hoàn toàn trùng khớp (PI 4.6)

Hình 3.22 Công thức cấu tạo của d; verbascosid

*_ J¿ bột vô định hình, màu vàng nhạt, phd UV 24S": 245 (sh), 288 (sh), 220,

330 nm; J¿ cũng có ESI MS có [M-H] 623,1 m/z (PI 7.1) và [M+Na]" 646,9 mức

(PL 7.2) phù hợp với công thức nguyên C„yH;,O,; (M = 624,21) giống như J¡;

HO On

Hình 3.23 Công thức cầu tạo cia dy isoverbascosid

Dữ liệu phổ 'H NMR của J¿ (PI 7.3) cũng tương tự J¿ nhưng có sự khác biệt cơ bản

về độ chuyển dịch hóa học giữa H, và H, của glucose so với J¡ (H-4° của J¡ ở 8

4,92 ppm; cia Ja @ ồ 3,42 ppm và H-6' của J¡ ở 8 3,61 — 3,45 ppm; của Ja ở ô 4,37

ˆH NMR của J¿ với phổ 'H NMR của

quả hoàn toàn trùng khớp (PI 7.4) Từ những dữ

~ 45 pm) So sánh các dữ liệu pl isoverbascosid [44], [127] cho

liệu trên cho thấy Ja rất phù hợp với cấu trúc của isoverbascosid Như vậy J¡ và J4

là hai đồng phân vị trí

= Je: bot vO dinh hình, màu vàng nhạt, phd UV 22": 240 (sh), 290 (sh), 225,

330 nm Phé ESI MS kiéu negative c6 (M-HJ 1009 m/z (PI 8.1) va kiéu positive có

[M+NaJ* 1033,2 m/z (PI 8.2) phù hợp với công thức nguyên CạHsO;s (M =

1010,33) Phổ ''C NMR của J, (PI 8.4) có 46 vạch tương ứng với 46 carbon So sánh các dữ liệu phổ NMR ( H và '°C) của J« (PI 8.3 và 8.4) voi pho NMR ('H và ,3C) của isooleoverbascosid [111] cho kết quả hoàn toàn trùng khớp (PI 8.6)

Isooleoverbascosid (J8) Hình 3.24 Công thức câu tạo của d isooleoverbascosid