Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống

Ảnh hưởng của một số môi trường tự nhiên và môi trường bán tổng hợp đến sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 .... Ảnh hưởng của một số môi trường cải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

HOÀNG THỊ THANH MÙI

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU

VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

TS TRẦN THỊ THÚY

HÀ NỘI, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

HOÀNG THỊ THANH MÙI

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU

VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

TS TRẦN THỊ THÚY

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS Trần Thị Thúy

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cũng như truyền dạy những kinh nghiệm quý báu, người đã quan tâm và giúp đỡ em nhiệt thành trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung - Tổ trưởng bộ môn

Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN-Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, đã dạy cho em những bài học đầu tiên về Vi sinh, qua đó truyền cảm hứng cũng như niềm đam mê được thử sức với lĩnh vực này Em cảm ơn cô đã tạo điều kiện cho em có được môi trường làm việc tốt và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm CNSH - Vi sinh, khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại tổ bộ môn Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, động viên, cũng như những góp ý quý báu của các anh/chị và các bạn cùng làm việc trên phòng thí nghiệm

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người đã tiếp thêm niềm tin, yêu thương- mẹ và em trai - đã tư vấn, giúp đỡ con rất nhiều, cảm

ơn những người bạn thân đã động viên tôi trong suốt quá trình

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Hoàng Thị Thanh Mùi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với các tác giả khác

STT : Số thứ tự

VK : Vi khuẩn

VSV : Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic 6

Hình 1.2 Cấu trúc axit lactic 6

Hình 1.3 Hai loại đồng phân của axit lactic 7

Hình 2.4 Chuẩn độ bằng buret (a) và màu dung dịch sau chuẩn độ bằng dung dịch NaOH với sự có mặt của thuốc thử phnolphthalein (b) 15

Hình 2.5 Đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào/ml dịch nuôi

và OD600 của chủng T6 17

Hình 2.6 Đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào/ml dịch nuôi

và OD600 của chủng TH2 18

Hình 3.7 Phân lập vi khuẩn lactic trên đĩa Petri môi trường MRS 20

Hình 3.8 Kiểm tra hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn lactic TH2 (a) và

thí nghiệm đối chứng trên vi khuẩn E coli 28

Hình 3.9 Chủng TH2 và T6 được nuôi trong ống Durham sau 48 giờ 28

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 32

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và sinh axit tổng số của chủng T6 33

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MRS 12Bảng 2.2 Thành phần môi trường GYP 12Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 33 chủng vi khuẩn lactic 21Bảng 3.4 Sự sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp axit lactic của 10 chủng vi

khuẩn lactic tuyển chọn 25Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn

lactic tuyển chọn 26Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, phát triển và sinh axit

tổng số của chủng TH2 30Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, phát triển và sinh axit tổng

số của chủng T6 31Bảng 3.8 Ảnh hưởng của một số môi trường tự nhiên và môi trường bán tổng hợp

đến sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 34Bảng 3.9 Ảnh hưởng của một số môi trường cải tiến đến sinh trưởng, phát triển và

khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 36Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước chiết bắp cải và môi trường MRS đến sinh

trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 37

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

7 Những đóng góp mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vi khuẩn lactic 4

1.1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn lactic 4

1.1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4

1.1.3 Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic 5

1.2 Axit lactic 6

1.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 7

1.3.1 Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic 7

1.3.2 Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trường 8

1.3.3 Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt và thức ăn gia súc 9

1.3.4 Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học 10

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Vật liệu và thiết bị 11

2.1.1 Vi sinh vật 11

2.1.2 Máy móc, thiết bị 11

2.1.3 Hóa chất 11

2.1.4 Môi trường 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phương pháp làm mẫu phân lập 13

2.2.2 Phân lập vi khuẩn lactic 13

2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao 14

2.2.4 Xác định axit tổng số 14

2.2.5 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 15

2.2.5.1 Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn 15

2.2.5.2 Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 16

2.2.6 Bảo quản chủng giống 16

2.2.6.1 Bảo quản trên thạch nghiêng 16

2.2.6.2 Bảo quản trong dung dịch 30% glycerin 16

2.2.6.3 Phương pháp ria thuần chủng chủng giống 16

2.2.7 Phương pháp xây dựng đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD600 16

2.2.8 Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng được tuyển chọn 18

2.2.8.1 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 18

2.2.8.2 Phương pháp xác định khả năng sinh khí từ glucose 18

2.2.8.3 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa và môi trường nuôi cấy tới sự sinh trưởng, phát triển và sinh axit lactic 19

2.2.9 Phương pháp thống kê và xử lí kết quả CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao 20

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao 24

3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 25

3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 29

3.4.1.Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 29

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh

axit lactic của chủng TH2 và T6 323.5 Ảnh hưởng của một số môi trường thay thế lên khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 343.5.1 Ảnh hưởng của một số môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp lên sự

sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6………… 343.5.2 Ảnh hưởng của môi trường nước chiết giá đỗ và bắp cải cải tiến đến sinh

trưởng phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 và T6 353.5.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước chiết bắp cải trộn với MRS đến sinh trưởng, phát

triển và hiệu suất sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Vi khuẩn (VK) lactic là nhóm vi sinh vật (VSV) có lịch sử và ứng dụng lâu đời

VK lactic được xem là an toàn (GRAS - Generally recognised as safe) và là loại VSV thực phẩm (food grade)

Ứng dụng đầu tiên của VK lactic là trong ngành công nghiệp sản xuất axit lactic, một nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho nhiều ngành Axit lactic có tác dụng làm mềm và nở da (công nghiệp thuộc da), làm thuốc nhuộm (công nghiệp dệt), làm dung môi trong sơn (công nghiệp in ấn, sơn), làm tiền chất để tổng hợp chất dẻo sinh học PLA (poly lactic axit) và nhiều ứng dụng khác

Chất dẻo sinh học có thể phân hủy đang là xu hướng nghiên cứu và phát triển hiện nay Các loại nhựa sinh học đang dần thay thế các loại nhựa có nguồn gốc dầu

mỏ PLA là sản phẩm nhựa trong suốt, phân hủy sinh học, được tổng hợp từ axit lactic Đây là nguồn nguyên liệu mới thân thiện với môi trường

Axit lactic có mặt trong hoa quả, các sản phẩm lên men lactic, nước giải khát, ngoài tạo hương còn kích thích sự tiết dịch vị, tăng nhu động ruột, thúc đẩy quá trình tiêu hóa Axit lactic giảm mùi thực phẩm và độ ngấy sau bữa ăn nhiều năng lượng Axit lactic giúp hòa tan các vitamin, khoáng chất Muối lactate với các nguyên tố vi lượng cũng thường được dùng làm dược phẩm, bổ sung cho cơ thể dưới dạng dễ hấp thu Loại muối này còn được dùng trong công nghệ bảo quản thực phẩm: giò lụa, chả, xúc xích, mì sợi… thay cho hàn the

Với liều lượng phù hợp trong các sản phẩm đưỡng da, axit lactic có tác dụng làm cho da mềm, mịn (giữ ẩm và trẻ hóa làn da), làm trắng da (do tính tẩy nhẹ của axit hữu cơ, trung hòa độ nhờn), đồng thời ngăn chặn sự xâm nhập của VK gây viêm nhiễm Axit lactic tạo môi trường toan, ức chế các VSV khác Ở người, động vật, axit lactic có mặt ở ruột, âm đạo Các sản phẩm lên men lactic cũng làm tăng cường miễn dịch đường ruột, giảm cholesterol, chống các tác nhân gây ung thư Việt Nam từ xa xưa đã có rất nhiều sản phẩm lên men truyền thống độc đáo và

có giá trị thực tiễn cao Do khả năng sinh nhiều loại chất ức chế VSV (axit lactic,

diacetyl, bacteriocin…), lên men lactic đã trở thành một giải pháp bảo quản thực phẩm hữu hiệu trong dân gian dưới các hình thức: muối dưa, muối cà, sản xuất nem chua, tôm chua, Đây là nguồn VSV sinh axit lactic an toàn, cho axit lactic cao, dễ sản xuất, giá thành rẻ, tận dụng được nguồn nguyên liệu tự nhiên Việc tuyển chọn những chủng VK lactic từ các sản phẩm lên men truyền thống có khả năng sinh axit lactic cao là một hướng nghiên cứu có triển vọng, phù hợp với công nghệ chế biến thực phẩm an toàn hiện nay

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã chọn thực hiện đề tài: “Phân lập,

tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống”

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao

từ thực phẩm lên men truyền thống để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các chủng sinh axit lactic cao

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao

3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6

3.5 Ảnh hưởng của một số môi trường thay thế lên khả năng sinh trưởng, phát triển

và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

VK lactic được phân lập và tuyển chọn từ thực phẩm lên men truyền thống

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp vi sinh học

Phân lập VK lactic; làm tiêu bản, quan sát hình thái VK dưới kính hiển vi, nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng VK tuyển chọn; xác định số lượng tế bào VK trong dịch nuôi; bảo quản chủng giống

VSV

5.2 Phương pháp hóa sinh

Chuẩn độ, xác định hàm lượng axit lactic trong dịch lên men

5.3 Phương pháp thống kê xác suất

Phân tích và thống kê các số liệu thu được theo excel 2007

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

7 Những đóng góp mới của đề tài

Tuyển chọn được 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm cũng như y học và dinh dưỡng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lactic

1.1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn lactic

Con người từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, phomát, muối dưa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng như tăng hương vị cho sản phẩm Cho đến những năm 80 của thế kỉ 18, VK lactic mới được giới khoa học phát hiện và bắt đầu chú ý nghiên cứu

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua gọi là “axit sữa”… Nhưng mãi đến năm

1857, Louis Pasteur mới chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm VK đặc biệt là VK lactic [7]

Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là

Bacterium lactic (nay gọi là Streptococus lactic) [7]

Đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại VK lactic từ nhiều nguồn cơ chất khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động thực vật, trong các sản phẩm muối chua [15]… thậm chí trong niêm mạc đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật [22], [24] Ngoài ra, một số loài VK lactic sống kí sinh trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [23], [24]

1.1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

VK lactic là tên gọi chung của những VK sinh axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa cacbonhydrat [7] Do đặc tính chung này, các VK lactic

được xếp chung vào họ Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt

hình thái (bao gồm cả các VK dạng que ngắn, que dài, lẫn các VK hình cầu) [1]

VK lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh axit lactic từ các loại đường khác nhau, đặc biệt là đường lactose Hầu hết các VSV sinh axit lactic đều thuộc về họ

Lactobacteriaceae và được xếp vào 13 chi: Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Lactococcus, Melissococcus, Oenococus, Tetragenococcus,

Vagococcus, Weissella, Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc

[24] Chúng có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dương, không di động, không sinh nội bào tử Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ VK lactic có khả năng sinh nội bào tử VK lactic không khử nitrate, phản ứng catalase âm tính, kỵ khí tùy nghi, một vài loài kị khí bắt buộc sống trong

hệ tiêu hóa của con người

VK lactic là những VK đa khuyết dưỡng Để sinh trưởng bình thường ngoài nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần dưới dạng các axit amin, một số vitamin, nhiều yếu tố sinh trưởng và khoáng vi lượng khác nhau… Chúng không thể phát triển được trong môi trường đơn giản chỉ gồm có đường glucose và các khoáng chất Vì thế, người ta thường phải bổ sung vào môi trường một số dịch chiết giàu dinh dưỡng như: cao nấm men, cao thịt, các loại nước chiết rau, củ, quả…

VK lactic được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên: dưới da, trong hệ tiêu hóa, trên bề mặt hoa quả và đặc biệt là các sản phẩm lên men truyền thống…

1.1.3 Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic

Có hai kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình Lên men lactic đồng hình tạo ra axit lactic là sản phẩm trao đổi chất chính (chiếm > 90%) Trong khi đó, lên men lactic dị hình ngoài tạo ra axit lactic (50-60% lượng sản phẩm trao đổi chất) còn tạo ra ethanol, axit acetic, glycerol và một số hợp chất khác Do vậy, lên men lactic đồng hình có ý nghĩa về mặt ứng dụng trong công nghiệp sản xuất axit lactic [4]

Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic 1.2 Axit lactic

Axit lactic là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ, tan trong nước và cồn Công thức hóa học của axit lactic là CH3CHOHCOOH (Hình 1.2 [25]) Đây là axit alpha hydroxy (AHA), trong dung dịch, nó có thể mất một proton từ nhóm axit tạo ra ion lactate CH3CHOHCOO- Khối lượng phân tử của axit lactic là 90,08g Nhiệt độ sôi

là 1220C, điểm tan 10C

Hình 1.2 Cấu trúc axit lactic

Axit lactic còn có tên gọi khác là 1- hydroxyethanol cacboxylic hay axit 2 - hydroxypropanoic Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - axit lactic và L - axit lactic Hai đồng

phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, nhưng chỉ khác là khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau

Loại L - axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn etylic, eter, không tan trong CHCl3 Nhiệt độ nóng chảy là 280C, góc quay cực ở 150 là 2,670

Loại D - axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn Nhiệt độ nóng chảy là

280C, nhiệt độ sôi là 1030C, góc quay cực ở 150 là -2,260

Nếu D - axit lactic và L - axit lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50 : 50 người ta gọi là hỗn hợp Raxemic Hỗn hợp này được kí hiệu là DL - axit lactic Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lí tưởng này mà chỉ

có khi tiến hành tổng hợp hữu cơ DL - axit lactic là dịch lỏng dạng siro, có khả năng tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 16,70C, nhiệt độ sôi 1220C [9]

Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, VK lactic sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) lactic Ở người, cả 2 loại đồng phân này đều được hấp thu trong đường ruột

Hình 1 3 Hai loại đồng phân của axit lactic 1.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

VK lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, y dược, và nhiều nhất là trong chế biến và bảo quản thực phẩm Trong những năm gần đây, VK lactic được quan tâm nghiên cứu như là nguồn VSV hữu ích bổ sung vào chế phẩm probiotics cho người và vật nuôi

1.3.1 Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic

Năm 1881, con người đã bắt đầu ứng dụng VK lactic để sản xuất axit lactic

trên quy mô công nghiệp Lên men lactic là quá trình trao đổi chất và năng lượng chủ yếu của nhiều nhóm VK lactic Quá trình lên men này chuyển hóa đường lactose hoặc glucose, galactose thành nguồn năng lượng ATP phục vụ cho mọi hoạt động sống của VK lactic Axit lactic là sản phẩm phụ của quá trình lên men, được

VK tiết ra bên ngoài tế bào [1]

Axit lactic được con người sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bởi những

ưu điểm sau:

- Tăng cường khả năng tiêu hóa protein sữa

- Kích thích sự tiết dịch vị

- Tăng nhanh cử động đầy thức ăn đi xuống dạ dày

- Ức chế sinh trưởng, phát triển của một số VSV gây bệnh trong đường tiêu hóa

- Là nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp tế bào khi cần thiết

Chính những ưu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng VK lactic trong công nghiệp chế biến sữa, phomat, xúc xích, dưa chua; thịt,

tôm, cá muối chua; trong ủ chua thức ăn xanh; làm probiotics

Axit lactic được sử dụng trong công nghiệp thuộc da (làm mềm và làm nở da), trong công nghiệp dệt (làm thuốc nhuộm), trong công nghiệp mỹ phẩm (làm nguyên liệu tạo các sản phẩm dưỡng tóc, giảm sự lão hóa của tóc), trong in ấn, sơn và chế tạo chất dẻo

Muối lactate với các nguyên tố khoáng thường được dùng làm dược phẩm nhằm bổ sung cho cơ thể dưới dạng dễ hấp thụ: lactate sắt được dùng để bổ sung sắt cho những bệnh nhân thiếu máu; lactate canxi bổ sung canxi cho những bệnh nhân loãng xương…

Ngoài ra, axit lactic còn được dùng để làm hạ pH đường ruột xuống 4 - 5 Do

đó, ức chế sự phát triển của VSV gây thối và E coli (loại VSV thích nghi ở pH 6 - 7)

1.3.2 Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trường

VK lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium - loại nấm gây bệnh điển hình trong đất Nấm Fusarium khi phát triển quanh vùng rễ cây sẽ làm cây yếu

đi tạo điều kiên cho các bệnh cơ hội gây bệnh cho cây trồng [2]

Chế phẩm EM (Effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu, bao gồm 80 chủng VSV trong đó có sự góp phần của VK lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [2]

1.3.3 Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt

và thức ăn gia súc

VK lactic là những VSV có nhiều đặc tính tốt như: sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau, có khả năng sinh axit và nhiều chất ức chế khác nhau, phát triển được ở nhiệt độ khá rộng và chịu mặn nên chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm

Quá trình lên men lactic của VSV sinh ra các axit hữu cơ (axit lactic, axit acetic ) do đó làm giảm pH môi trường Dưới tác động của pH thấp, hầu hết các

VSV gây bệnh, gây hỏng thối thực phẩm như E coli, Pseudomonas sp., Sarcina sp.,

Samonella sp., B cereus, P vulgaris, B mensenterium, Clostridium hay Archromobacter … [10], [12] đều bị tiêu diệt Bacteriocin là một phát hiện có giá trị

trong bảo quản thực phẩm nói chung, trong thực phẩm lên men nói riêng Bacteriocin là những peptide hay protein, được tổng hợp ở riboxom của VK có khả năng ức chế các VSV có quan hệ về chủng loài gần với chủng sinh ra bacteriocin Sữa chua là sản phẩm sữa lên men lactic nhờ một hoặc vài chủng VK lactic

khác nhau Hai chủng: Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus là

hai chủng VK lactic thường được sử dụng trong lên men sữa chua

Sử dụng lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, quả, thịt, cá, sữa là một phương pháp bảo quản thực phẩm phổ biến hiện nay Lên men lactic không những giúp kéo dài thời gian bảo quản các sản phẩm thực phẩm để cung cấp cho người tiêu dùng ở những khu vực xa xôi, khi thời tiết xấu, khan hiếm rau tươi, lúc giáp vụ,… mà còn tạo ra sự đa dạng về sản phẩm thực phẩm với màu sắc, độ rắn chắc và hương vị mong muốn như: phomát, xúc xích, nem chua [3]

Lên men lactic được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các thực phẩm muối chua truyền thống như: nem chua, tôm chua, thịt chua, rau quả muối chua… ở khắp nơi

trên thế giới Từ các sản phẩm đặc trưng như kim chi Hàn Quốc, nem chua Việt Nam, nham của Thái Lan đến các sản phẩm rau quả muối chua như cải bắp Sauerkraut của Đức, rau dưa muối chua vùng Đông Nam Á… [11], [19] Đây là loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc

Ngoài ra, lên men lactic còn được sử dụng để ủ chua thức ăn xanh cho gia súc,

dự trữ một nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc trong suốt mùa khô, mùa đông lạnh

1.3.4 Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học

Gần đây, người ta đã phát hiện một vai trò lớn của VK lactic đối với sức khỏe con người cũng như các động vật nuôi Một số VK lactic sinh “kháng sinh” được sử dụng làm chế phẩm “men tiêu hóa sống” probiotics để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng hệ VSV đường ruột Trong đó, nổi bật là

Lacidophilus, khi được bổ sung vào đường tiêu hóa, chúng phát triển tại ruột già, ức

chế một số VK gây bệnh đường ruột Nhờ vào khả năng sinh axit lactic và

bacteriocin trong đường ruột, Lactobacillus cải thiện được tình trạng tiêu chảy, tăng

nhu động ruột, chữa được chứng táo bón

Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị các

bệnh rối loạn và viêm nhiễm, bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bướu, làm hạ cholesterol trong máu, đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện được tình trạng không sử dụng được lactose

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị

2.1.1 Vi sinh vật

Các chủng VK lactic phân lập từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống như: nem chua, tôm chua, thịt chua, dưa cải muối chua, bắp cải muối chua… tự chế biến theo cách thức truyền thống

VSV đối chứng: E coli

2.1.2 Máy móc, thiết bị

- Các thiết bị để khử trùng, vô trùng: Tủ cấy (Sanyo, Nhật), nồi khử trùng (Melag autoclave 23, Đức), tủ sấy (Ketong, Trung Quốc), lò vi sóng (M907, Thụy Điển), máy cất nước (Trung Quốc), bể siêu âm (Đức)…

- Các thiết bị để nuôi cấy và giữ giống: Tủ ấm (Thermosi SR 3000, Bỉ), máy lắc ổn nhiệt (Gallen Kamp, Anh), tủ lạnh (Sanyo, Nhật), tủ lạnh sâu (Sanyo ultra low, Nhật)…

- Các thiết bị để nghiên cứu đặc điểm hình thái và số lượng tế bào: kính hiển

Thành phần hữu cơ: Cao nấm men (Difco - Mỹ); Cao thịt (Himedia- Ấn Độ);

Pepton (Nhật); Thạch và Glucose (Công ty vật tư khoa học kĩ thuật, Việt Nam); (NH4)3C6H5O7 và,CH3COONa (Peking’s reagent, Trung Quốc)

Thành phần vô cơ: CaCO3; NaCl (Việt Nam); NaOH (AR, Trung Quốc); MgSO4.7H2O (BDH, Anh); MnSO4 (Trung Quốc); NaH2PO4 (Kanto, Nhật), FeSO4 7H2O

Ngoài ra: Tím gentian (Việt Nam), Safranin O (Anh), Tween 80 (Guang Zhou, Trung Quốc)…

2.1.4 Môi trường

2.1.4.1 Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu vi khuẩn lactic

(môi trường MRS có CaCO 3 )

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MRS

Môi trường đặc (g/l)

Thành phần của 100ml dung dịch muối (w/v) là:

MgSO4 7 H2O: 4,0g; NaCl: 0,2g; MnSO4 4H2O: 2,0 g; FeSO4 7H2O: 0,2g

Môi trường Giá - đường (g/l): Dịch chiết giá đỗ 25 % bổ sung thêm 20g glucose

Môi trường Bắp cải - pepton (g/l): Dịch chiết bắp cải 25 % bổ sung thêm 10g pepton

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp làm mẫu phân lập

Các mẫu phân lập là những mẫu muối chua tự làm dựa trên các công thức truyền thống, không chứa chất bảo quản Nguyên liệu được lựa chọn là nguyên liệu sạch từ các sản phẩm hữu cơ: thịt lợn sạch, bì lợn sạch, các loại rau hữu cơ, tôm nước ngọt…

2.2.2 Phân lập vi khuẩn lactic

Phân lập trực tiếp trên môi trường MRS có CaCO3 theo phương pháp của Koch Nghiền nhuyễn mẫu, trộn đều và cân lấy 1g Sau đó, hòa tan 1g mẫu này trong nước cất đã vô trùng để đạt độ pha loãng từ 10-1

đến 10-8 Dùng pipet lấy 100μl ở độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8 nhỏ lên bề mặt môi trường MRS trong hộp Petri, gạt đều bằng que trang vô trùng Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng mẫu

Để các hộp Petri trong tủ ấm 300

C

Đếm số khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 ở các thời điểm 12, 24, 36 giờ nuôi cấy Số lượng tế bào VK lactic trong 1g mẫu được tính theo phương pháp đếm CFU (Colonies forming unit - đơn vị hình thành khuẩn lạc) Đếm 3 đĩa của mỗi độ pha loãng ở thời điểm 36 giờ và kết quả (a) là trung bình cộng của cả 3 lần đếm:

N= a.1000/v Df

Trong đó:

N: Tổng số CFU của vi khuẩn lactic trong 1g mẫu.(tế bào/ml) a: Số CFU tạo vòng phân giải CaCO 3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng Df (10 -n )

v: Thể tích mẫu hút để trang lên đĩa thạch

Sau khi đếm, dựa vào sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc của VK lactic mọc trên bề mặt môi trường trong đĩa Petri (kích thước, màu sắc, vòng phân giải CaCO3), tiến hành tách một số khuẩn lạc ra khỏi môi trường phân lập và nuôi cấy trên thạch nghiêng (môi trường MRS) trong tủ ấm 300C Sau 24 giờ nuôi cấy, chuyển các ống thạch nghiêng này vào giữ trong tủ lạnh 40C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo [12]

Để tiện lợi cho việc tuyển chọn, chúng tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạc được tách ra

như trên là một chủng VK lactic

2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao

Khả năng sinh axit của chủng nghiên cứu khi nuôi trong môi trường MRS dịch thể ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau được xác định bằng sự giảm pH của dịch nuôi cấy so với pH ban đầu của môi trường Độ pH được xác định bằng máy đo pH (pH mettle delta 320) [12]

Chủng nào có pH cuối thấp (pH < 4) sẽ được tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh axit tổng số bằng phương pháp chuẩn độ axit lactic với dung dịch NaOH 1% Sau đó chọn ra khoảng 10 chủng có axit tổng số cao và sinh trưởng tốt để nuôi cấy tĩnh ở 30ºC với OD600 ban đầu là 0,1 và chọn ra 1 - 2 chủng sinh axit tổng số cao nhất dựa vào để tiếp tục nghiên cứu

2.2.4 Xác định axit tổng số

Xác định axit tổng số theo Therner:

Một độ Therner tương đương 1 ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100ml nguyên liệu Nguyên tắc: axit tổng được đo bằng cách chuẩn độ 100ml mẫu dịch lên men bằng dung dịch NaOH 0,1N Trước khi chuẩn độ, thêm 2 - 3 giọt phenolphthalein

1% vào dung dịch mẫu thí nghiệm để làm chất chỉ thị Kết quả % axit lactic được tính theo công thức:

Trong đó: M: Khối lượng phân tử axit lactic (g) 90: trọng lượng phân tử lactic (g) D: Độ pha loãng

Cách tiến hành:

Bổ sung 10ml mẫu vào 90ml nước cất

Thêm 2-3 giọt phenolphthalein 1% làm chất chỉ thị Sử dụng buret chứa 25ml dung dịch NaOH 0,1M để chuẩn độ (Hình 2.4 và Hình 2.5) cho đến khi dung dịch mẫu xuất hiện mầu hồng không đổi Xác định VNaOH 0,1N đã sử dụng để chuẩn độ

(a) (b)

Hình 2.4 Chuẩn độ bằng buret (a) và màu dung dịch sau chuẩn độ bằng dung

dịch NaOH với sự có mặt của thuốc thử phenolphthalein (b)

2.2.5 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn

2.2.5.1 Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn

Nhỏ một giọt thuốc nhuộm Xanh metylen hoặc Fuchsin kiềm lên tiêu bản VK (đã cố định mẫu VK lactic), nhuộm trong 30 giây đến 1 phút Sau đó rửa nước, thấm khô và soi kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000X

Kết quả soi tiêu bản nhuộm đơn cho phép xác định được hình dạng tế bào VK (hình thái tế bào) Dựa vào sự đồng nhất của các tế bào trên tiêu bản để xác định