Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong

Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được với các chủng vi khuẩn kiểm định .... Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số chủng vi khuẩn lactic

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS Trần Thị Thúy, người đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này

Em gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại bộ môn Công nghệ Sinh học- Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đã hết lòng tạo điều kiện, giúp đỡ em thực hiện các nghiên cứu của mình

Xin cảm ơn tới các anh, chị, các bạn sinh viên đang làm việc và học tập Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt quá trình làm đề tài này

Cuối cùng em xin được cảm ơn những người thân, bạn bè, đã quan tâm giúp

đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Đinh Thị Phương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của tác giả khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Đinh Thị Phương

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10

Bảng 3.2 Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic 25

Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ mật và sáp ong……… 26

Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được với các chủng vi khuẩn kiểm định 31

Bảng 3.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 33

Bảng 3.6 Động thái sinh trưởng của chủng LT31 36

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của môi trường tự nhiên đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng LT31 41

Bảng 3.8 Khả năng sinh trưởng của chủng LT31 trong các môi trường MRS có bổ sung dịch chiết bắp cải 42

DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Đồ thị chuẩn mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn/ml dịch nuôi và giá trị OD620 của chủng LT31 ….18

Hình 2.2 Đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa hàm lượng glucose trong dung dịch và giá trị OD540 20

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ sáp và mật ong 30

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ sáp và mật ong 30

Hình 3.5 Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mật và sáp ong 32

Hình 3.6 Hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của chủng LT31 33

Hình 3.7 Hoạt tính catalase 34

Hình 3.8 Khả năng sinh khí của chủng LT31 34

Hình 3.9 Khả năng quần tụ của chủng LT31 35

Hình 3.10 Động thái sinh trưởng của chủng LT31 37

Hình 3.11 Khả năng sống sót trong axit của chủng LT31 38

Hình 3.12 Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng LT31 39

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng LT31 40

Hình 3.14 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng LT31 41

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ………1

1 Lí do chọn đề tài……… 1

2 Mục đích nghiên cứu……… 1

3 Nội dung nghiên cứu……… 1

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu……… 2

5 Phương pháp nghiên cứu……… …… 2

6 Những đóng góp mới của đề tài……… 2

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…….……….……… 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn lactic 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic 4

1.1.3 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 4

1.1.4 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic 5

1.1.5 Sự phân bố của vi khuẩn lactic 6

1.2 Probiotics 7

1.2.1 Định nghĩa probiotics 7

1.2.2 Các loại VSV được dùng làm chế phẩm probiotics 7

1.2.3 Tác dụng của probiotics 9

1.2.4 Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics 10

1.2.5 Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics 10

1.3 Sáp ong và mật ong 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 14

2.1.1 Vi sinh vật 14

2.1.2 Máy móc thiết bị 14

2.1.3 Hoá chất 14

2.1.4 Môi trường 15

2.1.4.1 Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của

vi khuẩn lactic – Môi trường MRS 15

2.1.4.2 Môi trường nuôi cấy và giữ giống VSV kiểm định – MPA 15

2.1.4.3 Môi trường thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic………15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong 15

2.2.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn 16

2.2.2.1 Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đặt khối thạch 16

2.2.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch 17

2.2.3 Xác định số lượng tế bào vi khuẩn 17

2.2.4 Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD620 18

2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 19

2.2.5.1 Phát hiện hoạt tính catalase 19

2.2.5.2 Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose 19

2.2.5.3 Xác định lượng đường còn lại trong dịch nuôi cấy 19

2.2.5.4 Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp của Reniero và cộng sự (1992) 21

2.2.5.5 Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp của Kmet và cộng sự (1995) 21

2.2.5.6 Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu 22

2.2.5.7 Xác định khả năng sinh trưởng với mật lợn 22

2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 23

2.2.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 23

2.2.6.2 Ảnh hưởng của độ pH 23

2.2.6.3 Ảnh hưởng của các môi trường tự nhiên 23

2.2.7 Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol 24

2.2.8 Phương pháp thống kê và xử lí kết quả 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ mật ong, sáp ong 25

3.2 Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn 30

3.3 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31 33

3.4 Một số đặc tính probiotics của chủng vi khuẩn lactic LT31 35

3.4.1 Khả năng quần tụ của chủng LT31 35

3.4.2 Khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột 35

3.4.3 Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 36

3.4.4 Khả năng sống sót trong pH axit của chủng vi khuẩn lactic LT31 37

3.4.5 Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng vi khuẩn lactic LT31 38

3.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 39

3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 40

3.5.2 Ảnh hưởng của pH 40

3.5.3 Ảnh hưởng của môi trường tự nhiên 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Probiotics là chế phẩm vi sinh vật (VSV) sống, được bổ sung cho người và động vật nuôi để hỗ trợ việc tiêu hóa thức ăn và giảm rối loạn trong hệ đường ruột Bên cạnh đó, probiotics còn được biết đến với các công dụng như: đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B, cải thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch, ngăn chặn các chứng viêm nhiễm, giảm cholesterol, ức chế các vi khuẩn gây hại trong ruột Do các công dụng hữu ích trên mà probiotics được quan tâm nghiên cứu trên khắp thế giới Cho đến nay, rất nhiều nghiên cứu về probiotics đã và đang thu được những kết quả đáng kể trong thử nghiệm cũng như trong ứng dụng thực tiễn

Vi khuẩn lactic là một trong số những vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong các chế phẩm probiotics được sử dụng cho cả người và các loài vật nuôi (lợn,

gà, tôm, cua, cá,…)

Mật và sáp ong từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một bài thuốc dân gian để phòng trị nhiều bệnh, từ các bệnh đường hô hấp đến các bệnh đường tiêu hóa, nhiễm trùng da Một số nhóm nghiên cứu trên thế giới cũng đã báo cáo những phát hiện về khu hệ VSV có ích trong tổ ong, sáp và mật ong

Từ thực tiễn nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic làm chế phẩm

probiotics đã nêu trên, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và

nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ mật và sáp ong”

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics từ mật và sáp ong

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ mật ong và sáp ong

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn

3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn

3.4 Nghiên cứu một số đặc tính probiotics của chủng tuyển chọn

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường tới sinh trưởng của chủng

vi khuẩn lactic

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong thu được ở một số khu vực

phía bắc Việt Nam.

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp vi sinh học: phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong; các phương pháp quan sát, nghiên cứu đặc điểm sinh học và xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy; các phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và dinh dưỡng tới sinh trưởng và phát triển của VSV; các phương pháp bảo quản chủng giống VSV

5.2 Phương pháp hóa sinh: xác định hàm lượng đường sót, định lượng axit tổng số 5.3 Phương pháp toán xác xuất thống kê: xử lý các số liệu thu được bằng phần mềm Excel 2010, Word 2010

6 Những đóng góp mới của đề tài

Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics phân lập từ mật và sáp ong

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lactic

Nhóm vi khuẩn lactic được xác định bởi Orla Jensen (1919), bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men gluxit sinh năng lượng và tạo ra một lượng lớn axit lactic [5]

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được sử dụng để chế biến các loại thức ăn như sữa chua, nem chua, dưa và cà muối… Tuy nhiên, mãi đến năm 1780, một nhà hóa học người Thụy Điển mới tách được axit lactic từ sữa bò bị chua Năm 1857, L.Paster

đã chứng minh được sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm VSV đặc biệt (gọi là vi khuẩn lactic) trên sữa bò Năm 1878, Lister là người đầu tiên phân lập

thành công vi khuẩn lactic từ sữa chua và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là

Streptococus lactis

Từ đó đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau trong nhiều loại cơ chất, từ thực phẩm lên men chua đến các loại hoa quả

tự nhiên và cả trên niêm mạc của người và động vật [3]

1.1.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic

Căn cứ vào đặt điểm hình thái tế bào, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: Hình que và hình cầu

 Nhóm hình que có hình dạng tế bào thay đổi từ que ngắn (0.5 – 0.7 m) đến que dài (3 – 8 m) Các tế bào này có thể ở dạng đơn, đôi hay tạo thành chuỗi

(ngắn, dài tùy loài) Thuộc về nhóm này là các loài thuộc chi Lactobacillus,

Bifidobacterium

 Nhóm hình cầu có hình dạng tế bào biến đổi từ hình cầu đến hình ovan, đường kính khoảng 0.5 – 1 m Các tế bào cũng có thể ở dạng đơn, đôi, tạo tứ cầu hoặc tạo chuỗi ngắn hay chuỗi dài (tùy loài) Nhóm này gồm các loài thuộc chi

Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus [5]

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, nói chung là bất động,

không sinh nội bào tử, catalaza và nitrate reductaza âm

Vi khuẩn lactic lactic là các vi khuẩn hoá dị dưỡng hữu cơ Khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của chúng rất yếu, cho nên, chúng là những VSV khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, bazơ nucleic và vitamin… Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp các porphyrin (như Hem), bình thường chúng không có cytocrom Song, một số vi khuẩn lactic khi sinh trưởng trên các môi trường chứa máu có thể tạo thành các cytocrom và có thể tiến hành cả quá trình phosphoryl hoá trong chuỗi hô hấp Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy các porphyrin thì một số vi khuẩn lactic cũng có thể tổng hợp các sắc tố hemin tương

kiện của môi trường xung quanh

Một yếu tố môi trường có thể tham gia vào quá trình sống của vi khuẩn lactic dưới hình thức cản trở, ức chế hay tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đó

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các chủng vi khuẩn lactic khác nhau có giới hạn về nhiệt độ khác nhau Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic phát triển khá rộng, từ 5ºC – 55ºC, thường hoạt động tốt nhất ở vùng nhiệt độ 15ºC – 40ºC Nhóm ưa ấm hoạt động thích hợp trong khoảng 20ºC – 40ºC, nhóm ưa nhiệt thích hợp trong khoảng 40ºC – 45ºC Tuy nhiên cũng có những chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu được nhiệt độ rất cao

Buchta K (1983) tìm ra chủng L bulgaricus có khả năng hoạt động tối ưu ở nhiệt

độ 45ºC – 62ºC [16]

Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic sinh trưởng, phát triển và lên men cũng

là giới hạn nhiệt độ hoạt động của các enzyme nội bào Chính vì thế mà trong phạm

vi nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ càng tăng thì sự lên men lactic càng mạnh, thời gian lên men càng ngắn

* Ảnh hưởng của pH

Độ pH ban đầu của môi trường thích hợp cho lên men lactic là 5,8 – 7,3 (tùy loài) Trong quá trình lên men lactic, sự tích tụ các axit lactic trong giai đoạn đầu có tác dụng kích thích sinh trưởng của vi khuẩn lactic và ức chế các VSV khác, nhưng khi lượng axit lactic tiếp tục tăng sẽ làm cho pH của môi trường giảm xuống đến pH

3 – 4, dẫn đến ức chế cả vi khuẩn lactic, làm giảm tốc độ sinh trưởng, phát triển của chúng [3]

* Ảnh hưởng của nồng độ oxy

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi và vi hiếu khí Chúng thực hiện quá trình lên men lactic cả trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí Trong quá trình lên men lactic, sự có mặt của oxy phân tử không gây độc với vi khuẩn nhưng sự lên men diễn ra thuận lợi hơn trong điều kiện yếm khí

1.1.4 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hóa kị khí đường và tạo ra một lượng axit lactic lớn thông qua quá trình lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh hóa kị khí các hợp chất cacbonhydrat tạo năng lượng, axit lactic và một số sản phẩm khác với sự tham gia của nhóm vi khuẩn lactic [3], [5]

Tùy theo cách chuyển hóa các hợp chất cacbonhydrat mà quá trình lên men lactic có thể xảy ra theo phương thức lên men đồng hình, lên men dị hình hoặc kết hợp cả hai phương thức trên

 Lên men lactic đồng hình

Khi lên men đồng hình, vi khuẩn lactic phân giải cacbonhydrat theo con đường EMP (Embden – Meyerhof – Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90 – 98%) [6], do đó lên men lactic đồng hình rất có ý nghĩa trong công nghiệp sản xuất axit lactic

Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic đồng hình:

C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pv 2CH3-CHOH-COOH + 2ATP

Đại diện của nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình thường gặp là:

Lactococcus, lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, L.bulgaricus, Streptococcus thermophilus, S.cremoris, Sporolactobacillus inulinus, …

 Lên men lactic dị hình

Vi khuẩn lên men lactic dị hình do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và triozophosphate – izomerase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đường PP (Pentose phosphate) Sau đó, quá trình chuyển hóa triozophosphate thành axit lactic xảy ra tương tự như lên men đồng hình

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (khoảng 40%) còn có các sản phẩm khác như: axit axetic (10%), axit xuccinic và rượu ethylic (20%), còn lại là carbon dioxit (CO2)

Sự hình thành CO2 trong quá trình lên men lactic là đặc điểm khác biệt dễ nhận biết nhất giữa lên men lactic dị hình và lên men lactic đồng hình

Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men lactic dị hình được biểu diễn như sau:

2C6H12O6  2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + 2CO2 + H2O + Q

Glucose Axit lactic Axit axetic Rượu ethylic

Các vi khuẩn lactic lên men dị hình là: Leuconostoc mensenteroides,

L.cremoris, Lactobacillus brevis, L fermentum, L viridescens, Bifidobacterium bifidum, Leuconostoc, Weissella …

1.1.5 Sự phân bố của vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên Chúng có trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá, tôm, sữa … ; trong đất, phân, rác, xác động vật, thực vật Trên niêm mạc miệng, ruột của người, gia súc, gia cầm, người ta cũng phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có mặt nhiều nhất trong các loại thức ăn ủ chua

Vi khuẩn lactic lactic

lên men đồng hình

như: sữa chua, rau quả muối chua, thịt, cá muối chua … Ngoài ra, cũng có một số loài vi khuẩn lactic sống ký sinh trên thực vật, hút các chất trong biểu mô cây [22]

1.2 Probiotics

1.2.1 Định nghĩa probiotics

Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ “pro” có nghĩa là dành cho và “biosis” có nghĩa là sự sống Định nghĩa về probiotic đầu tiên được R.Fuller đưa ra vào năm 1989 Theo ông, probiotics là thành phần của thức ăn có cấu tạo từ những VSV sống và có tác động hữu ích lên vật chủ qua việc làm cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột của nó [17]

Ngày nay, probiotics được định nghĩa những VSV sống được bổ sung vào đường tiêu hóa của người và động vật làm tăng sức khỏe con người và động vật nuôi thông qua việc cải thiện vân bằng của khu hệ VSV đường ruột [17]

1.2.2 Các loại VSV được dùng làm chế phẩm probiotics

Các chế phẩm probiotics chứa một hoặc nhiều chủng VSV hữu ích Thông thường, chế phẩm này bao gồm một tổ hợp các chủng VSV có tính chất probiotics Điều này giúp chế phẩm khi được áp dụng sẽ tác động một cách đồng đều đến hệ VSV của vật chủ tránh việc gia tăng đột biến một chủng VSV trong hệ tiêu hóa

Vi khuẩn lactic là nhóm VSV được dùng phổ biến trong các chế phẩm probiotics cho người và động vật nuôi bởi chúng được xem là nhóm vi sinh vật an

toàn (GRAS), có khả năng tồn tại trong đường ruột, có tác dụng phục hồi và cân

bằng khu hệ vi sinh vật tự nhiên trong đường ruột, khống chế các bệnh đường ruột, làm tăng sức đề kháng cho vật nuôi Một số vi khuẩn lactic được sử dụng để làm

Bifidobacterium [17]

Vi khuẩn lactic được quan tâm nghiên cứu trong tạo chế phẩm probiotics là

do chúng có được những ưu điểm sau:

(*) Có khả năng ngăn cản được bệnh tiêu chảy Cơ chế chống tiêu chảy có thể được giải thích là do vi khuẩn laclic (1) tạo ra sự cân bằng cho khu hệ vi sinh vật đường ruột (2) cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi khu trú với các vi sinh vật gây bệnh (3) tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có tác dụng chống lại mầm bệnh VD các

chủng L casei, L acidophilus, và L bulgaricus có khả năng sản sinh ra các chất kháng

khuẩn như acidophilin, bulgarican có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh (4) tăng cường miễn dịch cho cơ thể vật nuôi, phòng chống được tiêu chảy

(**) Ngoài khả năng sinh axit lactic, làm giảm pH môi trường, vi khuẩn lactic còn sinh nhiều loại chất kháng khuẩn khác:

- Axit hữu cơ và ethanol: Các axit hữu cơ như axit lactic, axit formic, axit propionic…và ethanol là các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic Các sản phẩm này có tác dụng làm giảm pH môi trường đến mức có thể ức chế và tiêu diệt một số VSV gây bệnh

- Hydroperoxit (H2O2): Whater và cs (1951) đã chứng minh được

Lactobacilus lactic có khả năng tạo ra H2O2 nên chúng kháng được Staphylococcus

aureus

- Diacetyl: có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn Gram âm, nấm mốc, đặc

biêt là vi khuẩn gây bệnh lao (Micrococcus tubeculosis)

- Bacteriocin: là các phân tử protein mang điện tích dương, kích thước nhỏ (gồm 30 – 60 axit amin), trung tính, có điểm đẳng điện cao, có khả năng ức chế và tiêu diệt hầu hết các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh bacteriocin Nhiều loài vi khuẩn lactic được phát hiện có khả năng sinh bacteriocin [14]

(***) Khả năng quần tụ là khả năng quần hợp giữa các tế bào do phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên làm kết tủa kháng nguyên Khả năng quần tụ của

vi khuẩn lactic là do yếu tố APF quyết định APF (Aggregation Promoting Factor)

là phân tử protein phức tạp, trọng lượng phân tử 32 kda, được sinh ra trong quá trình sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic Chúng có thể liên kết các thành phần: axit lipoteichoic, axit teichoic của thành tế bào; làm thay đổi cấu trúc mạch bên α – D – Glucopyranosyl – (1,2) – D – Glucose, do đó thiết lập được cầu nối cho

giữa các tế bào vi khuẩn, làm các tế bào gắn kết và quần tụ [23]

Một số loài thuộc chi Bacillus cũng được phát hiện có tính chất probiotics và được ứng dụng làm chế phẩm probiotics Đó là các loài B subtilis và

B.Coagulans[17], [21], [26]

Nguồn VSV làm probiotics rất đa dạng, được phân lập từ đất, nước… nhưng nguồn quan trọng nhất chính là từ hệ tiêu hóa của động vật nuôi, vì các VSV này thích nghi được với hệ tiêu hóa cũng như khu hệ VSV của vật chủ

 Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh

 Tăng khả năng sản xuất axit béo bay hơi

 Tăng cường quá trình tổng hợp các vitamin nhóm B

 Tăng hấp thụ chất khoáng

 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh

 Giảm tỉ lệ còi cọc và làm tăng năng suất vật nuôi

 Giảm hàm lượng amoniac và ure trong chất thải

 Phòng bệnh tiêu chảy cho vật nuôi, làm giảm tỉ lệ nhiễm bệnh, rút ngắn thời gian bị bệnh, giảm tỉ lệ tái phát, giảm tỉ lệ chết…

1.2.4 Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics

Bảng 1.1 Các chỉ tiêu để lựa chọn VSV làm probiotics

4 Sản sinh ra các chất kháng khuẩn Cạnh tranh vị trí cƣ trú, dinh dƣỡng và

tiệu diệt các vi khuẩn gậy bệnh

ruột

Chiếm hữu các vị trí khác, cƣ trú và loại trừ các VSV khác ra khỏi vị trí bám

máy sấy phun

7 Chịu đƣợc các chất kháng khuẩn

có trong thức ăn

Có thể dùng với thức ăn trị bệnh có chất kháng sinh

8 Dễ nuôi cấy, có khả năng tồn tại

độc lập trong thời gian dài

Tạo điều kiện cho chế phẩm bảo quản trong thời gian dài

9 Sinh ra các enzyme hoặc các sản

phẩm cuối mà vật chủ có thể sử

dụng đƣợc

Tăng hiệu suất tiêu hóa của vật nuôi

10 An toàn không gây bệnh cho vật chủ

Trên thực tế khó có chủng VSV nào đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu trên vì thế khi

tuyển chọn phải dựa vào mục đích cụ thể Cân nhắc các tính chất của chủng để thu đƣợc các chủng theo mục đích phù hợp [9], [21]

1.2.5 Nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm probiotics

 Trên thế giới

Công trình nghiên cứu đầu tiên ứng dụng probiotics đƣợc tiến hành trên lợn

do Pollman và cs công bố năm 1959 mang tên “Giá trị dinh dƣỡng và phòng trị bệnh của việc cấy những chủng vi khuẩn lactic vào lợn con” Tiếp theo năm 1987,

Nielsen và Trine đã nghiên cứu “Tác dụng ngăn chặn bệnh colibacilosis ở lợn sau

cai sữa của 5 chủng Lactobacillus” cho kết quả rất khả quan trong việc ngăn chặn

bệnh colibacilosis và giúp tăng trọng cho vật nuôi

Tardani (1996) [25] và Zani (1998) [26] đã thí nghiệm chế phẩm B.cereus

trên lợn sau cai sữa thấy rằng tốc độ tăng trưởng, hệ số thức ăn và tỷ lệ tiêu chảy được cải thiện rất rõ

Năm 1998, Oh Tae – Kwang đã sử dụng probiotics từ Lactobacillus sp TSC

– 66 cho lợn [20] Kết quả cho thấy chế phẩm probiotics từ VSV sống này có tác dụng chống bệnh và kích thích sinh trưởng cho vật nuôi

Đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều nước sản xuất và ứng dụng rộng rãi chế phẩm probiotics không những cho động vật mà còn cả người Nhìn chung, tất

cả các công trình nghiên cứu đó chú trọng chủ yếu vào phòng, trị bệnh tiêu chảy và giúp tăng trọng ở động vật nuôi

 Ở Việt Nam

Probiotics được ứng dụng trong ngành chăm nuôi ở Việt Nam khá muộn, vào những năm cuối của thế kỷ 19 Tuy vậy trên thị trường hiện nay cũng đã xuất hiện ngày một nhiều các chế phẩm probiotics cho người và vật nuôi

Năm 1948, bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sử dụng canh trường B.subtilis để

điều trị tiêu chảy, đầy hơi và có tác dụng tốt [9] Đến năm 1979 bác sỹ Vũ Văn Ngữ

đã nghiên cứu và tạo chế phẩm colisubtyl có tác dụng giảm tiêu chảy ở lợn [11] Cùng thời gian đó xí nghiệp thuốc thú y trung ương đã chế tạo thành công chế phẩm

B.subtilis để chữa bệnh tiêu chảy và bệnh lợn con ỉa phân trắng

Lê Thanh Bình và cs (1999) (Viện Công nghệ sinh học) đã sản xuất thành

công chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus và

Enterococcus và tiến hành nuôi thử nghiệm trên gà Broiler, kết quả cho thấy: Ở

nhóm gà được ăn chế phẩm PRO99 có sự giảm đáng kể E.coli (mà sự có mặt của nó

gây tác động bất lợi cho dinh dưỡng, bệnh tật và năng suất vật nuôi), tác dụng tăng trọng của chế PRO99 tăng 11% so với đối chứng [2]

Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003) đã phân lập 789 chủng vi khuẩn lactic trong phân gà vừa thải ra, và sử dụng phương pháp nghiên cứu sinh học phân

tử đã xác định được hai chủng L agalis CH123 và L salavarius CH156 có những

tính chất probiotic như: có khả năng sinh trưởng được với 40% axit mật; sinh

trưởng được ở môi trường pH 4.0 và nồng độ NaCl 6.0% có hoạt tính kháng với

Salmonella, E.coli và có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong

1.3 Sáp ong và mật ong

Mật ong, sáp ong được con người dùng từ cách đây hàng ngàn năm Ở Việt Nam, người ta cũng đã biết dùng mật và sáp ong để tăng cường sức khỏe và phối hợp với nhiều vị thuốc khác để chữa trị những căn bệnh từ thông thường đến nguy hiểm

Theo như phân tích thì mật ong là sản phẩm tự nhiên rất bổ dưỡng với khoảng 75-80% đường (đường trong mật ong là fructose và glucose, loại đường được hấp thụ trực tiếp vào máu); mật ong cũng rất giàu chất khoáng: phốt pho, canxi, magiê…vài loại axit amin và enzyme…

Từ xa xưa, mật ong đã được sử dụng như là một loại thuốc kháng khuẩn, dùng để băng bó vết thương và điều trị những bệnh liên quan đến rối loạn chức năng cơ thể Trong mật ong có chứa chất bảo vệ các vết thương không bị nhiễm trùng Ðể giải thích cơ chế làm cho vết thương lành bệnh khi dùng mật ong có nhiều

ý kiến cho rằng: Thứ nhất, trong mật ong có mặt hai loại đường là glucose và fructose, hai loại đường này thường thu hút nước mạnh, mật ong sẽ hấp thụ nước ở vết thương, làm khô vùng thương tích, chính điều kiện này làm môi trường không thuận lợi cho các vi khuẩn và nấm phát triển (VSV thường phát triển mạnh trong một môi trường ẩm) Ðiều quan trọng thứ hai là mật ong có chứa một enzyme gọi là glucose oxidase, khi kết hợp với nước, sản xuất hydrogen peroxide, một chất có tính khử trùng cao Một nghiên cứu của trường Ðại Học Bonn (Ðức) đã xác nhận đặc

tính kháng khuẩn kỳ diệu của mật ong, như y học dân gian đã khẳng định Sáp ong

có rất nhiều tác dụng trong y dược học, điển hình như: (1) Làm giảm cholesterol trong máu và giảm đau; (2) chống viêm, chống loét (VD: viêm loét dạ dày, tiêu chảy…); (3) kháng nấm và kháng sinh tự nhiên; (4) điều hòa hệ miễn dịch, ức chế

và kích thích hệ miễn dịch [29]

Sáp ong có khả năng điều trị bỏng da hiệu quả, giúp làm mềm và giữ ẩm cho

da Trong công nghệ bào chế dược phẩm, sáp ong còn được sử dụng làm tá dược Trong công nghiệp, sáp ong là một chất nhũ hóa hiệu quả hay được sử dụng như là một loại hương liệu trong sản xuất xà phòng và nước hoa

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vi sinh vật

Vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu mật ong, sáp ong được thu từ các địa phương khác nhau ở miền bắc Việt Nam

Các chủng VSV kiểm định gồm: Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Salmonella typhimurium, Lactobacillus plantarium nhận từ phòng thí nghiệm Công

nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Các thiết bị để nuôi cấy và giữ giống: Tủ ấm (Binder, Đức), máy lắc ổn nhiệt, tủ lạnh sâu, tủ làm đá…

Các thiết bị nghiên cứu đặc điểm sinh học: kính hiển vi quang học (Olympus

CH – 2, Nhật), máy đo quang phổ tử ngoại (UV- vis, Nhật), máy li tâm (Sorvall, Mỹ), cân phân tích (Pracisa XT 320M, Thụy Sĩ) và các dụng cụ thông dụng khác của PTN

2.1.3 Hoá chất

Cao nấm men (Đức), Cao thịt (Merck, Đức), Pepton (Trung Quốc), Tween 80 (Đức), NaH2PO4 (Nhật), FeSO4.7H2O (Merck, Đức), NaOH (Merck, Đức), NaCl (Việt Nam), MgSO4.7H2O (Trung Quốc), Glucose (Việt Nam), CH3COONa (Trung Quốc), MnSO4.4H2O (Anh), CaCO3 (Việt Nam), (NH4)3C6H5O7 (Trung Quốc), Na2HPO4 (Nhật), NaOH (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), CaCO3 (Việt Nam), Thạch (Việt Nam)…

2.1.4 Môi trường

2.1.4.1 Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi

khuẩn lactic – Môi trường MRS

2.1.4.3 Môi trường thay thế nuôi cấy vi khuẩn lactic

Nghiền nhỏ 250g nguyên liệu hữu cơ (bắp cải, rau má, cải ngọt, hành) trong 1l nước, lọc lấy dịch trong, thu được 1l dịch chiết tự nhiên 25%

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong

Phân lập trực tiếp trên môi trường MRS có CaCO3

 Nguyên tắc

Dựa vào đặc tính sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic, làm tan CaCO3 trong môi trường phân lập MRS tạo nên vòng phân giải CaCO3 trong suốt xung quanh khuẩn lạc

 Tiến hành thí nghiệm

Nghiền nhuyễn mẫu, cân lấy 1g Sau đó pha loãng 1g mẫu này trong nước cất đã vô trùng để đạt độ pha loãng từ 10-1 đến 10-3 Dùng pipette lấy 100 mẫu ở

các độ pha loãng từ 10-1 đến 10-3 nhỏ lên bề mặt môi trường MRS trong hộp petri, gạt đều bằng que trang vô trùng Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng mẫu Để các hộp petri trong tủ ấm 37 trong 48h Quan sát và đếm các khuẩn lạc vi khuẩn có vòng phân giải CaCO3 Dựa vào sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn lactic mọc trên bề mặt môi trường trong hộp petri (kích thước, màu sắc và vòng phân giải CaCO3), tiến hành tách một số khuẩn lạc có hình thái khác nhau sang môi trường MRS thạch nghiêng, ủ trong tủ ấm 37 Sau 48 giờ nuôi cấy, chuyển các ống thạch nghiêng này vào trong tủ mát 4 - 10 để bảo quản cho các nghiên cứu tiếp theo [4], [7]

2.2.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn

 Nguyên tắc

Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế do vi khuẩn nghiên cứu sinh ra trong khối thạch môi trường nuôi cấy vào môi trường thạch có chứa VSV kiểm định Khu vực nào nào có chất ức chế khuếch tán đến, nơi đó VSV kiểm định không mọc được

và tạo thành vòng vô khuẩn

 Chuẩn bị VSV nghiên cứu và VSV kiểm định

Cấy các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu từ môi trường MRS thạch nghiêng sang môi trường MRS dịch thể, nuôi tĩnh qua đêm ở 37 Dùng pipette hút 200 dịch huyền phù vi khuẩn lactic nhỏ lên bề mặt môi trường MRS đặc trong hộp đĩa petri, gạt đều bằng que trang vô trùng Chuyển các hộp petri này vào tủ ấm 37 , nuôi từ 24 -36 giờ để vi khuẩn lactic mọc phủ kín bề mặt môi trường MRS trong đĩa petri

Dùng que cấy lấy các chủng vi sinh vật kiểm định từ môi trường MPA thạch nghiêng, hòa vào 100 dung dịch NaCl 0,9% trên bề mặt môi trường MPA đặc trong hộp petri, gạt đều bằng que trang vô trùng

2.2.2.1 Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đặt khối thạch

Dùng khoan nút chai có đường kính d=10mm khoan các khối thạch môi trường đã mọc các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu rồi đặt các khối thạch lên bề mặt môi trường MPA đặc trong hộp petri đã có gạt sẵn VSV kiểm định

Để các hộp đĩa petri này trong tủ mát 4 - 10 Sau 12 – 14 giờ chuyển các hộp petri này sang tủ ấm 37 cho VSV kiểm định mọc Kiểm tra vòng ức chế sau

24 giờ nuôi

Khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic với các vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng hiệu số D – d (mm) Trong đó, D là đường kính vòng ức chế, d là đường kính khối thạch (d = 10mm) Hiệu số càng lớn thì khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định càng mạnh và ngược lại [4], [7]

Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm

2.2.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch

Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 10mm) khoan các khối thạch trên đĩa petri chứa môi trường đặc MPA đã trang sẵn các VSV kiểm định, nhấc bỏ khối thạch để tạo thành các lỗ có đường kính 1cm Dùng micropipette nhỏ 100 dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào lỗ thạch (dịch nuôi đã được loại bỏ tế bào vi khuẩn lactic bằng li tâm và được chỉnh về pH trung tính bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N)

Để các hộp đĩa petri này trong tủ mát 4 - 10 Sau 12 – 14 giờ chuyển các hộp petri này sang tủ ấm 37 cho VSV kiểm định mọc Kiểm tra vòng ức chế sau

24 giờ nuôi [4], [7]

Khả năng đối kháng với các vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng hiệu

số D – d (mm); với D là đường kính vòng ức chế, d là đường kính khối thạch (d = 10mm) Hiệu số càng lớn thì khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định càng mạnh và ngược lại

Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm

2.2.3 Xác định số lượng tế bào vi khuẩn

Nhân giống chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu trong môi trường MRS dịch thể, sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh ở 30°C Hút 1 ml dịch nuôi vi khuẩn, pha loãng trong nước muối sinh lý đã vô trùng để dạt các độ pha loãng từ 10-1

đến 10-10 Dùng pipette lấy 100 μl mẫu ở các độ pha loãng từ 10-6 đến 10-10 nhỏ lên bề mặt môi trường MRS trong đĩa petri, gạt đều bằng que trang vô trùng Thí nghiệm lặp lặp 3

lần cho mỗi độ pha loãng mẫu Ủ các đĩa petri trên trong tủ ấm 30°C Sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc (CFU) trên mỗi đĩa petri [4]

Số lượng tế bào vi khuẩn lactic trong 1 ml dịch nuôi được tính theo phương pháp đếm CFU Đếm 3 đĩa của mỗi độ pha loãng ở thời điểm 48 giờ và kết quả (a)

là trung bình cộng của cả 3 lần đếm:

Trong đó: N: số tế bào vi khuẩn lactic trong 1 ml dịch nuôi

a: số CFU trên đĩa thạch MRS có độ pha loãng 10 -n

10 -n : độ pha loãng của dịch nuôi vi khuẩn lactic

2.2.4 Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn

trong dịch nuôi cấy với giá trị OD 620

Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic nghiên cứu (nuôi ở 30ºC, trong 48 giờ), pha loãng bằng môi trường MRS dịch thể đến các độ pha loãng khác nhau, tiến hành đo OD620 của các dịch pha loãng Đồng thời xác định số lượng tế bào trong các dịch pha loãng tương ứng (bằng phương pháp 2.2.3) Xây dựng đồ thị chuẩn (Hình 2.1) về mối tương quan giữa số lượng tế bào với OD620 đo được, từ đó xác định được hàm số thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD620 và số lượng tế bào

vi khuẩn trong dịch nuôi cấy

Hàm tương quan này là cơ sở để tính toán số lượng tế bào vi khuẩn trong các nghiên cứu tiếp theo dựa vào giá trị OD620

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn/ml dịch

nuôi và giá trị OD 620 của chủng LT31

y = 3.833x + 5.691 R² = 0.9954