Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC tạo ra từ vi khuẩn glouconacetobacter

Khi được nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp màng, trong đó có bản chất là cellulose liên kết với các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Phương Phú Công và PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Khoa Sinh - KTNN, phòng thí nghiệm Vi sinh vật, cùng các thầy cô trong tổ

bộ môn Vi sinh vật đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin cảm ơn sự giúp đỡ quam tâm động viên của bạn bè, gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Thanh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các căn cứ, số liệu nghiên cứu trong khóa luận là trung thực Tất cả những số liệu đều thu

từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt

Đề tài này không trùng hợp với các công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Thanh

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo

Frateur

Bảng 2.1 Các bước xử lý màng BC sau lên men

Bảng 3.1 Đặc điểm của màng BC sau khi xử lý

Bảng 3.2 Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật đối với màng BC đóng gói

thủ công

Bảng 3.3 Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật với màng BC đóng gói bằng

máy hút chân không

Bảng 3.4 Khả năng thấm hút nước muối sinh lý của màng BC

Bảng 3.5 Khả năng thấm hút Berberin clorid 0,1% của màng BC

Bảng 3.6 Khả năng thấm hút nước sắc lá sim của màng BC

Bảng 3.7 Khả năng thấm hút tinh dầu nghệ của màng BC

Bảng 3.8 Các bước xử lý màng BC

Đồ thị 3.1 Biểu diễn khả năng thấm hút các chất phụ gia của màng BC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sợi cellulose của màng BC

Hình 1.2 Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose

Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter

Hình 3.2 Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng

Hình 3.3 Nhân giống giống Gluconacetobacter cấp 1

Hình 3.4 Lên men tĩnh trong 5 ngày

Hình 3.5 Màng BC sau 5 ngày lên men

Hình 3.6 Màng BC sau khi xử lý

Hình 3.7 Túi nilon thông thường

Hình 3.8 Đóng gói màng BC trên ngọn lửa đèn cồn

Hình 3.9 Chế phẩm màng BC đóng gói thủ công

Hình 3.10 Nấm mốc xuất hiện trên bề mặt màng

Hình 3.11 Máy chân không và túi hút chân không

Hình 3.12 Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa của đề tài 2

5 Điểm mới của đề tài 2

NỘI DUNG 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconancetobacter trong sinh giới 3

1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới 3

1.1.2 Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter 3

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, tế bào học 3

1.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 4

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 5

1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 6

1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 6

1.2.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật 7

1.2.3 Hàm lượng ethanol trong dịch lên men 8

1.3 Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 8

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose 8

1.3.2 Một số tính chất của màng bacterial cellulose 9

1.3.3 Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose 10

1.4 Ứng dụng màng BC từ Acetobacter xylinum trong điều trị bỏng ở Việt Nam và trên thế giới 13

1.4.1 Trên thế giới 13

1.4.2 Ở Việt Nam 14

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 16

2.1.3 Hóa chất 16

2.1.4 Môi trường 17

2.1.4.1 Môi trường giữ giống (MT1) 17

2.1.4.2 Môi trường nhân giống (MT2) 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 17

2.2.1.1 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng 17

2.2.1.2 Phương pháp hoạt hóa giống 17

2.2.1.3 Phương pháp lên men tạo màng 18

2.2.1.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép 18

2.2.2 Phương pháp vật lý 19

2.2.3 Phương pháp xử lý màng BC từ Gluconacetobacter 19

2.2.4 Phương thức đóng gói màng BC 20

2.2.4.1 Đóng gói bằng phương pháp thủ công 20

2.2.4.2 Đóng gói bằng máy hút chân không 21

2.2.5 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Lên men và thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BNH 2 trên quy mô phòng thí nghiệm 22

3.1.1 Lên men tạo màng 22

3.1.2 Xử lý màng sau lên men 26

3.2 Lựa chọn phương thức đóng gói màng BC 27

3.2.1 Đóng gói bằng phương pháp thủ công 27

3.2.2 Đóng gói bằng máy hút chân không 29

3.3 Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC và hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm 31

3.3.1 Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC khi đóng gói 32

3.3.1.1 Khả năng thấm hút nước muối sinh lý của màng BC 32

3.3.1.2 Khả năng thấm hút Berberin clorid 0,1% của màng BC 33

3.3.1.3 Khả năng thấm hút nước sắc lá sim của màng BC 33

3.3.1.4 Khả năng thấm hút tinh dầu nghệ của màng BC 34

3.3.2 Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Gluconacetobacter được đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng sinh

màng Bacteria cellulose và được ứng dụng khá nhiều trong thực tiễn Đây là loài vi khuẩn Gram âm, sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử Khi được nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp màng, trong đó có bản chất là cellulose liên kết với các tế bào vi

khuẩn Gluconacetobacter Màng này được gọi là Bacteria cellulose (màng

BC) Cellulose trong màng vi khuẩn có một số đặc tính quý như: Độ dẻo dai,

độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi Nhờ những đặc tính đó mà hiện nay màng BC được xem như là một nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng, nó đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỷ XIX và được ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như : Trong công nghiệp sản xuất giấy màng BC được dùng để sản xuất điện tử chất lượng cao, trong công nghệ môi trường đã được sử dụng màng BC làm màng phân tách để xử lý nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998) Ngoài ra, màng

BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989) Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn

Gluconacetobacter nuôi trên môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất

thạch dừa Trong lĩnh vực mỹ phẩm và dược phẩm, lợi dụng những đặc tính quý báu của màng BC như thông thoáng, kháng khuẩn, tính tương đồng về cấu trúc với sợi collagen trong da nên màng BC được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng làm mặt nạ dưỡng da, da nhân tạo, dùng trong điều trị bỏng

và tổn thương da Tuy nhiên màng BC trong quá trình đến tay người sử dụng thường bị giảm chất lượng hoặc bị nhiễm một số loại nấm mốc và vi khuẩn không mong muốn do đó công việc đóng gói màng là một khâu rất quan trọng trước khi được đem ra sử dụng, mặt khác màng BC sau khi lên men và được

xử lý thì cần tiến hành bảo quản ngay để giữ được các đặc tính quan trọng và không làm biến đổi tính chất của màng BC vì vậy việc đóng gói để bảo quản màng BC càng trở nên cấp thiết

Từ những thực tiễn trên và mong muốn tìm hiểu thêm về vi khuẩn

Gluconacetobacter, quá trình tạo màng, cũng như nhiều ứng dụng hữu ích của

màng BC vì vậy tôi chọn đề tài: “ Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter”

2 Mục đích nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC tạo ra từ vi khuẩn

Gluconacetobacter BNH 2 trên quy mô phòng thí nghiệm và tạo cơ sở tiền đề

cho các nghiên cứu đóng gói màng BC trên quy mô công nghiệp

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Lên men và thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BNH 2

trên quy mô phòng thí nghiệm

3.2 Lựa chọn phương thức đóng gói màng BC

3.3 Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC và hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa lý luận của đề tài

Đề xuất phương pháp xử lý màng BC, lựa chọn được các phương thức đóng gói màng hiệu quả trên quy mô phòng thí nghiệm

4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Tạo cơ sở tiền đề cho các nghiên cứu đóng gói và bảo quản màng trên

quy mô công nghiệp

5 Điểm mới của đề tài

Tiến hành ngâm màng BC đã qua xử lý với một số dịch chiết thực vật có tác dụng trong việc chữa lành vết thương trước khi tiến hành đóng gói thành chế phẩm màng BC

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới

1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như Rothenback

1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur

1950 Thuật ngữ “Gluconacetobacte” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận

thấy các thành phần Ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn sinh acetic khác nhau

Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes [12]

Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn

Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau Vì vậy,

cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này

1.1.2 Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái, tế bào học

Gluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước

khoảng 2µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày Váng có chứa hemicellulose khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), và bắt màu hồng khi

nhuộm fucshin Gluconacetobacter có thể tích lũy 4,5% acid acetic trong môi

trường Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [12] Chúng có thể sống chung với nấm men trong một

số loại nước giải khát dân gian làm bằng nước chè và đường loãng, pH thích hợp là 5,4 - 6,2, nhiệt độ thích hợp từ 25- 300C, còn gọi là “Thủy hoài sâm”, ở Nga người ta gọi đó “nấm chè”, ở Trung Quốc có tên là “hải bảo”, “vị bảo”, người Pháp gọi là “Champiognon De Lougue Vie - nấm trường sinh”

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí

bắt buộc, hóa dị dưỡng Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất

Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng [1] vi khuẩn Gluconacetobacter có bao

nhầy cấu tạo bởi cellulose Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là các polysacarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có các polypeptit, protein Bao nhầy có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể Theo tác giả Sokolnicki và cs [24] độ dai và chắc của màng cellulose do

vi khuẩn sinh ra có liên quan đến hình dạng của tế bào vi khuẩn Nếu độ dài (chiều dài của tế bào) càng cao thì tính bền vững của màng cellulosedo vi khuẩn đó tổng hợp càng lớn Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về mối liên hệ giữa hình dáng kích thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng những dòng tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước tốt hơn và

có độ dai chắc hơn, còn những dòng Gluconacetobacter có hình dạng tròn dài

thì màng BC có khả năng chịu lực thấp hơn [6]

1.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành

khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi

trường Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể ở

điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose, đó là

tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào sảy

ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [4], [18]

Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng sợi nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

* Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25- 35oC, pH = 4- 6 Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter sinh trưởng và tạo màng Gluconacetobacter có khả năng

chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic và môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

* Đặc điểm sinh hóa

Năm 1950, Fruteur [23] đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O;

hoạt tính catalase; Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadaceae, lớp Schizomycetes Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bảng dưới đây:

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

theo Frateur

quả

Chuyển hóa môi trường chứa Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

+

dihydroxyaceton

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa

+

1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter

1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô

cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: Thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật

Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hóa thành loại hợp chất có màu tối khó hấp thụ Trong môi trường kiềm sau khi khử trùng, đường còn dễ

bị chuyển hóa là biến đổi pH môi trường Để tránh hiện tượng này khi khử

trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở

1100C trong 30 phút Từ các loại đường đơn rất phổ biến tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal) Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi

khuẩn thường dùng đường 0,5 - 0,2% đường Gluconacetobacter sinh trưởng

chính trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol Có thể sinh trưởng trong môi trường chỉ có D - mantolse

Các hợp chất hữu cơ chứa cả nitơ (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch ) có thể vừa được sử dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật

1.2.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là môi trường do Hestrin và Schramm thiết lập , có chứa cao nấm men và peptone là nguồn nitơ hữu cơ, (NH4)2SO4 là nguồn nitơ vô cơ

Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4

+

thì sau khi chúng đồng hóa NH4+

trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường Muối amoni của các acid hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn

Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,

xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết

NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật Vi sinh vật không

có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật

1.2.3 Hàm lượng ethanol trong dịch lên men

Ethanol được sử dụng như một cơ chất Hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 2 - 10% V Hàm lượng cao hơn sẽ làm tăng năng suất lên men Theo Hong - Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - 1% tốt nhất là 0,6% Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luân giữ ở

3 – 3,5% Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10% V Để tránh hiện tượng oxy hóa hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate Ngoài việc oxy hóa ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hóa các rượu thành các acid tương ứng

1.3 Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose

Màng sinh học bacterial cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose mạch thẳng, được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như :

Gluconacetobacter Màng này có bản chất là cellulose được liên kết với các tế

bào vi khuẩn, màng mày vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với cellulose thực vật, nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền

cơ học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa lớn Nhờ những đặc tính độc đáo mà trên mà màng BC được xem là nguồn polymer sinh học lớn

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose mạch thẳng Nó có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của nó khác xa nhau Chuỗi polymer β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm Nhưng sợi nhỏ kết tinh lại tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó sợi và cuối cùng tạo dải lớn Những dải lớn từ

tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng

liên kết hiđro hoăc Van Der Waals tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng [8], [19] Hình 1.1 và hình 1.2 là hình ảnh so sánh sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose của thực vật

Hình 1.1 Sợi cellulose của màng BC Hình 1.2 Sợi cellulose của thực vật

1.3.2 Một số tính chất của màng bacterial cellulose

Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của BC như độ cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối lên tính chất của BC [21] Các mảnh BC có độ cứng là 3,68 kg/cm2 Độ cứng của các miếng BC giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch đường và độ cứng tăng lên khi được nhúng bằng dung dịch muối

Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:

Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao

Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp

Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose

vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy

Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose

(kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose

Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vì vậy cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai [8], [18]

1.3.3 Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose

Quá trình tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [5], [6]

Theo tác giả Alina Krystynowics và cs có 4 enzyme tham gia xúc tác

tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter : Glucokinase,

Phosphoglucomutase, Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS) Trong đó UGP à enzyme có vai trò quan trọng nhất

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển sang glucose thành glucose-6-phosphate Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose-6- phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isome hóa Glucose-1-phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-glucose Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được hóa thành cellulose và celluose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase Enzyme này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP

Một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đường

fructose hiệu quả hơn Hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyển hóa thành fructose-bi-phosphate nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate Gluctose-1-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose [20]

Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan Trong đó các chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi [17]

Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose

Ý nghĩa của quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Gluconacetobacter

Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter không di động

do chúng nằm bên trong lớp màng cellulose Điều này làm cản trở nghiên cứu

về quá trình chuyển hóa, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào

Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung

quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận

lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter Màng

cellulose có khả năng giữ nước nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử ngoại) Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm ẩm độ, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại Các vi khuẩn

Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao

Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng

khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi

BC sống sót sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào giảm chỉ còn khoảng 3% [8]

Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn

ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí Chính mạng lưới này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose [18] Trong môi trường tự nhiên,

đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp

vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điển hình

Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose được tổng hợp bởi

Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật

này bị thiếu dinh dưỡng Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo gluconase hay endo glucanase Các enzyme exo gluconase hay endo gluconase phân hủy cellulose được phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một vài

chủng Gluconacetobacter sản xuất cellulose [18]

1.4 Ứng dụng màng BC từ Acetobacter xylinum trong điều trị bỏng ở

Việt Nam và trên thế giới

1.4.1 Trên thế giới

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum và những ứng

dụng của nó được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown (1989), dùng màng BC làm môi tường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào Brown (1989), Jonas và Farad (1998), dùng màng như một chất để biến đổi độ nhớt, để làm

ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm [23], [24] Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy

trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Cùng tác giả: Hamlyn (1997), Ciechanska (2004), Legeza và cs (2004), Wan (2005), Czaja và cs (2006) sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng

đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản

quyền về làm màng BC từ Acetobacter xylinum dùng trị bỏng Các tác giả

Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [24]

1.4.2 Ở Việt Nam

Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng càng được cải tiến Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng Từ năm 2000, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cs đã có một số công trình nghiên cứu về màng BC và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở

để chế tạo màng sinh học dùng trong điều trị bỏng ở Việt Nam [18]

Năm 2006, bộ môn Vi sinh- ký sinh, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men

Mới đây có nhóm nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung và cs cũng đang bước đầu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng trên thỏ [12]

Trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi không sử dụng dầu mù u mà thay thế vào đó là chúng tôi sử dụng các loại thuốc trị bỏng khác như: Becberin clorid 0,1%, nước muối sinh lý Ngoài ra chúng tôi còn ngâm với dịch chiết của một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên được dùng trong điều trị bỏng phải kể đến như là:

Nước sắc cây cỏ lào (Eupatorium odoratum Linn), cây diếp cá (Houttunynia cordata), dung dịch vàng đắng (Coscinum fenestratum) có tác

dụng làm sạch vết thương, chống nhiễm khuẩn

Nước sắc lá sim (Rhodomyrtus tomentosa) có tác dụng làm se khô vết

thương, chống nhiễm khuẩn

Tinh dầu nghệ (Rhizoma curcumae longa) chiết suất từ nghệ tươi có tác

dụng tốt đến sự tái tạo tế bào da, làm cho da chóng lành, ít để lại sẹo

Đặc biệt chúng tôi đã xây dựng và lựa chọn phương thức đóng gói, bảo

quản màng BC tạo ra từ chủng Gluconacetobacter, tìm ra vật liệu đóng gói và

chất bảo quản phù hợp, vừa với giá thành, bảo quản được màng BC trong một thời gian dài và nâng cao được tác dụng điều trị bỏng của màng

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu chủng Gluconacetobacter BHN 2 được nhận từ

phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư Phạm

Box cấy vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkamp (Anh)

Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl - 10ml

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.3 Hóa chất

Nguồn đường: Ethanol, glucose, fructose, sacrose, mannose, lactose,

manitol, sorbitol, dihyroxyaceton, acid acetic

Nguồn nitơ: Cao thịt, cao men, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2

Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH

Một số loại thuốc nhuộm: dung dịch lugol, dung dịch fucshin, tím gentian

Nước dừa, agar

2.2.1.1 Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập được xác định là vi khuẩn

Gluconacetobacter BNH 2 được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 300C Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4o

C dùng cho các nghiêng cứu tiếp theo Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần

2.2.1.2 Phương pháp hoạt hóa giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật