Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh dược của dịch chiết từ thân cây ngũ gia bì

Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì Bảng 3.3.. Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp ch

TỪ THÂN CÂY NGŨ GIA BÌ

(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.)MERR)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Người hướng dẫn khoa học

ThS PHÍ THỊ BÍCH NGỌC

HÀ NỘI , 2014

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn

Ths Phí Thị Bích Ngọc và TS Trần Thị Phương Liên, những người

đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành

đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Trung tâm Hỗ trợ thiết bị và Chuyển giao công nghệ - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, các anh chị cao học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè, là những người luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần lớn nhất giúp tôi vượt qua khó khăn để có được ngày hôm nay

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Phương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận là do tôi thực hiện và không trùng lặp với bất cứ tác giả nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những nội dung được đề cập trong bản khóa luận này

Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Phương

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành châu Âu và châu Á

Bảng 2.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng

Bảng 2.2 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn

dịch chiết thân cây Ngũ gia bì(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr)

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì

Bảng 3.2 Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn

dịch chiết thân cây Ngũ gia bì

Bảng 3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

Bảng 3.4 Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân

cây Ngũ gia bì

Bảng 3.5 Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống

Bảng 3.6 Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Lá và thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr)

Hình 2.2 Chuột nhắt trắng chủng Swiss

Hình 3.1 Quy trình chiết suất các chất tự nhiên từ thân cây Ngũ gia bì

Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn acid gallic

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ

dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm Hình 3.5 Biểu đồ so sánh khối lượng của các lô chuột đái tháo đường trước

và sau khi điều trị

Hình 3.6 Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và

sau khi tiêm 72 giờ

Hình 3.7 Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trước và sau 14

ngày điều trị

Hình 3.8 Biểu đồ một số chỉ số lipid chuột đái tháo đường trước và sau điều

trị bằng thân cây Ngũ gia bì

MỤC LỤC

MỤC LỤC 7

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây Ngũ gia bì 4

1.1.1 Phân loại, mô tả 4

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Thành phần hoá học 4

1.1.4 Công dụng 5

1.2 Giới thiệu một số hợp chất tự nhiên từ thực vật 5

1.2.1 Các hợp chất thứ sinh và các chất có hoạt tính sinh học 5

1.2.2 Flavonoid thực vật 6

1.2.1.1 Cấu tạo hóa học 6

1.2.1.2 Hoạt tính sinh học 7

1.2.2 Hợp chất phenolic 7

1.2.2.1 Cấu tạo hóa học 7

1.2.2.2 Hoạt tính sinh học 8

1.2.3 Alkaloid thực vật 8

1.2.3.1 Cấu tạo hóa học 8

1.2.3.2 Hoạt tính sinh học 9

1.2.4 Tannin thực vật 9

1.2.4.1 Cấu trúc hóa học 9

1.2.4.2 Hoạt tính sinh học 9

1.2.5 Hợp chất coumarin 10

1.3 Bệnh béo phì 10

1.3.1 Thực trạng béo phì trên thế giới và ở Việt Nam 11

1.3.2 Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì 11

1.4 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus) 12

1.4.1 Khái niệm và phân loại 12

1.4.2 Thực trạng ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam 13

1.4.3 Tác hại và biến chứng 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Mẫu thực vật 14

2.1.2 Mẫu động vật 14

2.1.3 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 15

2.1.3.1 Hóa chất 15

2.1.3.2 Dụng cụ thí nghiệm 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp tách chiết nghiên cứu 16

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì 16

2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên 16

2.2.2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau 18 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm 19

2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50 19

2.2.3.2 Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm 19

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) 20

2.2.4.1 Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 20

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịchchiết 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì 22

3.2 Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân

đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì 23

3.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ gia bì 23

3.2.2 Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết 25

3.2.2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic 25

3.2.2.2 Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số 26

3.3 Kết quả xác định liều độc cấp 27

3.4 Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm 27

3.5 Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì lên chuột béo phì thực nghiệm 32

3.6 Tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột đái tháo đường type 2 33

3.6.1 Kết quả tạo mô hình chuột đái tháo đường type 2 thực nghiệm 33

3.6.2 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì đến nồng độ glucose huyết lúc đói của chuột ĐTĐ 36

3.7 Tác dụng đến chuyển hóa lipid của thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 39

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Theo ước tính của WHO trên thế giới có hơn 346 triệu người mắc đái tháo đường Từ nay tới năm 2030 con số này có khả năng tăng gấp đôi nếu không

có biện pháp can thiệp Gần 80% các trường hợp tử vong do đái tháo đường là

ở các quốc gia thu nhập thấp và trung bình

Ở Việt Nam Bệnh viện Nội tiết Trung ương đã công bố kết quả nghiên cứu bệnh viện thực hiện trong năm 2012 Theo đó, trong hơn 11.000 ngườituổi 30-69 tại 6 vùng sinh thái gồm: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam

Bộ đã tham gia nghiên cứu, số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường chiếm khoảng 6%

Đáng nói, số người mắc tiểu đường có xu hướng tăng nhanh nhưng số người phát hiện bệnh lại rất thấp Theo kết quả nghiên cứu này, tỷ lệ người bệnh tiểu đường trong cộng đồng không được phát hiện ở nước ta là gần 64% Kiến thức chung về bệnh của người dân cũng rất thiếu Gần 76% số người được hỏi có kiến thức rất thấp về chẩn đoán và biến chứng của bệnh, chỉ có 0,5% có kiến thức tốt

Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật

đã không ngừng phát triển và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể Trên thế giới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục

vụ lợi ích của con người Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học

2

ở thực vật phát triển từ những năm 1950 Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống Những hợp chất như: alkaloid, terpenoid, phenolic được biết đến như là các hợp chất thứ cấp, chúng được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt Chẳng hạn, một số hỗn hợp phức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được

Trong lịch sử Y học từ 1550 năm trước công nguyên, con người đã biết dùng cây cỏ để chữa ĐTĐ Nhiều loại thảo dược đã chứng tỏ có tác dụng rất tốt trong việc điều trị ĐTĐ như: mướp đắng, sinh địa, hoàng kỳ, huyền sâm,

cỏ ngọt, chè xanh, khoai lang,…Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt

Cây Ngũ gia bì thuộc họ Ngũ gia bì mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, hay gặp nhất là ở Lạng Sơn, Cao Bằng,Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên… được dùng để chữa nhiều bệnh Tuy nhiên việc nghiên cứu đặc tính hóa sinh, y dược của các hoạt chất thiên nhiên từ đối tượng này chưa được nghiên cứu một cách thỏa đáng Chính vì vậy chúng tôi tiến hành

đề tài : "Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh dược của dịch chiết từ thân

cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) "

2 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong thân cây Ngũ

gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) bằng các phương pháp tách

chiết, định tính, định lượng

2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau

3

2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và chống rối loạn trao đổi lipid của

các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì (Acanthopanax trifoliatus gatus

(L.) Merr) trên mô hình chuột BP và ĐTĐ type II

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Ngũ gia bì

1.1.1 Phân loại, mô tả

Ngũ gia bì là một cây nhỏ, rất nhiều gai, cao chừng 2-3 m Lá mọc so

le, kép chân vịt có từ 3-5 lá chét, phiến lá chét có hình bầu dục hay hơi thuôn dài, phía cuống hơi thót lại, đầu nhọn, mỏng, mép có răng cưa to, cuống lá dài

từ 4-7 cm Hoa mọc khác gốc thành hình tán ở đầu cành Ðầu mùa hạ ra hoa nhỏ màu vàng xanh Quả mọng, hình cầu, đường kính chừng 2.5 mm, khi chín

có màu đen [10]

1.1.2 Phân bố

Ngũ gia bì mọc hoang ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta, hay gặp nhất là ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Sapa (Lào Cai), Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang Có mọc ở Trung Quốc (Quảng Châu, Tứ Xuyên) [10]

Thường đào cây vào mùa hạ hay mùa thu, lấy rễ, bỏ gỗ, lấy vỏ, phơi khô là được Khi dùng để sống hoặc sao vàng sắc uống

Vị thuốc thường là những cuộn ống nhỏ, dài ngắn không đều, dày chừng 1mm, vỏ ngoài màu vàng nâu nhạt, hơi bóng, có những nếp nhăn, bì khổng dài, mặt trong màu xám trắng, dai, mặt phẳng, có nhiều điểm vàng nâu Mùi không rõ

1.1.3 Thành phần hoá học

Tác giả Phạm Thanh Huyền đã xác định được thành phần hóa học chủ yếu của cây Ngũ gia bì bao gồm : saponin, alkaloid, coumarin, phytosterol, chất béo, tinh dầu, acid hữu cơ, tanin, acid uronic và đường khử tự do 6

Từ thân và lá cây Ngũ gia bì, Phan Văn Kiệm và cộng sự đã phân lập được taraxerol, taraxeryl axetat, axit ent-pimara- 8(14), 15-dien-19-oic, axit ent-kaur-16-en-19-oic và (2R, 3R) -2,3-di-(3,4- metylendioxibenzyl)-

ôn vào 2 kinh can và thận 10

1.2 Giới thiệu một số hợp chất tự nhiên từ thực vật

1.2.1 Các hợp chất thứ sinh và các chất có hoạt tính sinh học

Quá trình trao đổi chất của sinh vật bao gồm sự tạo thành các hợp chất

sơ cấp và thứ cấp (còn gọi là các hợp chất thứ sinh)

Hợp chất sơ cấp được tạo thành là sản phẩm của quá trình đồng hóa và

dị hóa, có vai trò quan trọng đối với cơ thể sống Nó bao gồm những chất thiết yếu cho sự sống như các axit amin, các axit nucleic, carbohidrat, lipid,… Chúng là trung tâm của quá trình trao đổi chất, sinh trưởng và phát triển của sinh vật

Các hợp chất thứ cấp (hợp chất thứ sinh) được tạo thành từ các hợp chất sơ cấp và các chất trao đổi trung gian của chu trình đường phân, chu trình pentose- phosphate, chu trình acid citric,… Khác với các chất trao đổi bậc nhất, hợp chất thực vật thứ sinh không phải là yếu tố đặc biệt cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển, quang hợp và sinh sản Chúng được tạo

ra trong những tế bào chuyên biệt với vai trò điều hòa mối quan hệ qua lại giữa các tế bào trong cơ thể Đồng thời chúng là các hợp chất phòng thủ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm thực vật từ môi trường xung quanh

Người ta tiến hành phân loại các hợp chất thứ sinh dựa trên nhiều tiêu chuẩn khác nhau Dựa vào bản chất hóa học chia hợp chất thứ sinh thành các

6

hợp chất flavonoid, phenolic, alkaloid, coumarine, glycoside,… dựa vào lịch

sử phát hiện và sử dụng, các hợp chất thứ sinh được chia làm 4 nhóm chính: + Terpen (gồm isoprenoid, terpenoid, carotenoid,…)

+ Glycosid

+ Các phenylpropanoid (gồm flavonoid, tannin, lignin,…)

+ Các hợp chất chứa nitơ (gồm alkaloid, hợp chất dị vòng thơm,…)

Hiện nay nhiều hợp chất thứ sinh đã được tách chiết và sử dụng để phòng tránh và điều trị một số bệnh thông thường và cả những bệnh hiểm nghèo ở người Phổ biến nhất là các hợp chất flavonoid, phenolic và alkaloid Chúng được bào chế thành các dạng dược liệu hay được bổ sung vào thực phẩm nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng và tăng cường khả năng phòng ngừa bệnh tật

1.2.2 Flavonoid thực vật

Trong số các polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính sinh – dược học có giá trị [5]

1.2.1.1 Cấu tạo hóa học

Flavonoid thuộc nhóm phenol, là dẫn xuất của 2 – phenyl chroman (flavan) Đó là những hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B với một

dị vòng pyran C tạo thành khung carbon C6 – C3 – C6, trong đó vòng A kết hợp với vòng C tạo thành khung chroman

9

1 0 8

7

flavonoid thành các nhóm phụ sau: flavon, flavonol, flavanon, chalcon và auron, antoxyanidin, leucoantoxyanidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid, neoflavonoid Flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do gọi là aglycon và dạng liên kết với đường là glycoside Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon tương ứng

1.2.1.2 Hoạt tính sinh học

Tác dụng chống oxy hóa (antioxydant): flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động Flavonoid có khả năng điều hòa hoạt độ enzyme do khả năng liên kết với nhóm amin trong phân tử protein, làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme do đó tạo hiệu ứng điều hòa dị lập thể

Flavonoid có tính kháng khuẩn, kháng virus, tăng khả năng đề kháng của cơ thể do kích thích lympho bào, tăng sản xuất interferon, ức chế hiện tượng thoát bọng (digramilation)

Flavonoid có hoạt tính của vitamin PP, làm tăng tính bền và đàn hồi của thành mạch, giảm sức thấm của mao mạch

Flavonoid có tác dụng chống ung thư do kìm hãm các enzyme oxy hóa khử, quá trình đường phân và hô hấp, kìm hãm phân bào, phá vỡ cân bằng trong các quá trình trao đổi chất của tế bào ung thư [4]

Ngoài ra, flavonoid còn có tác dụng giảm béo phì và lipd máu, hạ glucose huyết

1.2.2 Hợp chất phenolic

1.2.2.1 Cấu tạo hóa học

Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật Trong phân tử có vòng thơm (benzen) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp với vòng benzen Dựa vào thành phần và cấu trúc chia, người ta chia hợp chất phenolic thành ba nhóm chính là: nhóm hợp

Các phenolic tham gia vào quá trình hô hấp của thực vật với vai trò như một chất vận chuyển hydro Các polyphenol có thể hình thành liên kết hydro với protein và enzyme, dẫn đến thay đổi hoạt động của các enzyme bị tác động tương tự như hiệu ứng điều hòa dị lập thể

Tác dụng mạnh lên quá trình sinh trưởng của thực vật, là chất hoạt hóa IAA- oxydase và tham gia vào quá trình sinh tổng hợp của enzyme này Hợp chất phenolic có tính kháng khuẩn

1.2.3 Alkaloid thực vật

1.2.3.1 Cấu tạo hóa học

Alkaloid là nhóm các hợp chất hữu cơ có cấu trúc phức tập chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có đặc tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật

Alkaloid thường không màu, không mùi, có vị đắng Một số alkaloid

có màu vàng như berberin, palmitin

N

N N

N

C H3

C H3C

O H

O H

9

1.2.3.2 Hoạt tính sinh học

Alkaloid được hình thành từ các sản phẩm của quá trình trao đổi chất

ở thực vật nên nó có hoạt tính sinh học như một chất dự trữ cho tổng hợp protein, chất bảo vệ cây, tham gia vào chuyển hóa hydro ở các mức độ khác nhau

Alkaloid được sử dụng nhiều trong công nghiệp dược, có rất nhiều thuốc chữa bệnh được sử dụng trong y học là các alkaloid tự nhiên hoặc nhân tạo như morphine, caffein, nicotin, cocain, …

1.2.4 Tannin thực vật

1.2.4.1 Cấu trúc hóa học

Tannin là hợp chất phenol có trọng lượng phân tử cao, có chứa nhóm chức hydroxyl và các nhóm chức khác (như carboxyl), có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện đặc biệt

Tannin được cấu tạo dựa trên gallic acid và tanic acid Tannin được chia làm hai nhóm chính là tannin thủy phân và tannin ngưng tụ

Tannin thường là hợp chất vô định hình hoặc tinh thể, không màu, có tính quang học, vị chát Tannin tan trong nước tạo dung dịch keo và độ hòa tan thay đổi tùy thuộc mức độ polymer hóa Chúng tan tốt trong ethanol, acetone

1.2.4.2 Hoạt tính sinh học

Tannin là chất cầm rửa do có tác dụng giảm sự bài tiết trong ống tiêu hóa, kết tủa protein tạo thành một màng che niêm mạc Tannin chữa ngộ độc kim loại nặng và alkaloid do có khả năng tạo kết tủa với chúng

Tannin có tác dụng chống ung thư do có khả năng kết hợp với các chất gây ung thư Ở nồng độ cao, tannin ức chế hoạt động của các enzyme nhưng lại kích hoạt enzyme ở nồng độ thấp

10

Tannin có tác dụng ức chế và diệt khuẩn, tác dụng cầm máu do làm

se hệ mao mạch hay tác dụng làm giảm đau tại chỗ do làm giảm tác dụng ở đầu dây thần kinh trung ương

1.2.5 Hợp chất coumarin

Coumarin là dẫn xuất của α-purine có cấu trúc C6 – C3 dị vòng chứa oxy Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm Tính chất hóa học đặc trưng là dễ dàng kết hợp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước

Hiện nay có hơn 1500 hợp chất coumarin khác nhau được biết đến khi nghiên cứu 800 loài thực vật Ta cũng dễ dàng tìm thấy coumarin trong tất cả các bộ phận khác nhau của cây như: áo hạt, quả, hoa, rễ,… Coumarin cũng có vai trò là một nhóm chất phòng thủ hóa học hữu hiệu chống lại vi khuẩn và tác nhân có hại của môi trường Tuy nhiên cho tới nay con đường tổng hợp coumarin vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ

Coumarin được ứng dụng nhiều trong cuộc sống như làm nước hoa, hương liệu, làm chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong Y học, dẫn xuất của coumarin có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, ngăn cản đột quỵ

1.3 Bệnh béo phì

Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (Obersity) là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một số vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe Tổ chức này dùng chỉ số khối cơ thể BMI (Body Mass Index) để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt mỡ của mỗi người Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức sau:

Trong đó: W: Khối lượng (kg)

H: Chiều cao (m)

1.3.1 Thực trạng béo phì trên thế giới và ở Việt Nam

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay số người béo phì đã lên tới 1,7 tỉ người [3], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn gặp ở các quốc gia đang phát triển

Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn của người châu Á, số người thừa cân béo phì cũng tăng theo thời gian Năm 1991 theo điều tra của Lê Huy Liệu và cộng sự thì tỉ lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung tại Hà Nội nói chung là 1,1% Đến năm 2000 con số này đã là 2,62% tăng gấp 2,5 lần trong vòng 10 năm [3]

1.3.2 Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì

Người béo phì có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với người thường do nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu như:

* Bệnh tim mạch: do mỡ tạng làm tim khó co bóp và mỡ máu làm xơ cứng mạch vành và các mạch máu khác gây nhồi máu cơ tim, tăng huyết áp

12

* Rối loạn lipid máu: tình trạng này rất hay gặp ở người béo bụng và có biểu hiện đặc trưng là tăng triglycerid và lipid có hại (LDL-c), giảm lipid có lợi (HDL-c)

* Tiểu đường: béo phì toàn thân có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2

* Đột quỵ: những người có BMI > 30 dễ bị tử vong do bệnh liên quan đến mạch máu não

* Ngoài ra béo phì còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác: xấu đi tình trạng rối loạn tiền mãn kinh ở phụ nữ, suy giảm chức năng hô hấp, rối loạn hoạt động cơ xương, ung thư, sỏi mật và các vấn đề bệnh lý tâm thần khác [3], [8]

1.4 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus)

1.4.1 Khái niệm và phân loại

Đái tháo đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoocmon insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao

Theo phân loại của WHO năm 1999, thì bệnh đái tháo đường có những

thể loại sau:

* Bệnh đái tháo đường type 1do tế bào  bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt insulin tuyệt đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn) Đái tháo đường type 1 chiểm tỷ lệ khoảng 5-10% bệnh đái tháo đường thế giới

* Bệnh đái tháo đường type 2 là do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo suy giảm chức năng tế bào  hoặc do suy giảm chức năng tế bào  kèm theo kháng insulin của cơ quan đích Tùy trường hợp cụ thể mà một trong hai trường hợp trên nổi trội hoặc cả hai Đái tháo đường type 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90% đái tháo đường trên thế giới

13

1.4.2 Thực trạng ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam

Bệnh Đái tháo đường (ĐTĐ) đang gia tăng nhanh chóng trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam

Năm 1994, trên thế giới có 110 triệu người mắc, năm 1995 con số này

đã là 135 triệu người (4% dân số) Ước tính đến năm 2010 số người mắc ĐTĐ

sẽ lên đến 221 triệu và năm 2050 là 300 triệu Ở Việt Nam, vào những năm đầu thập kỷ 90, tỷ lệ ĐTĐ ở Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí Minh tương ứng là 1,2%, 0,96% và 2,52%, nhưng vào năm 2001 khu vực thành thị của 4 thành phố lớn đã là 4,0%

Theo WHO, năm 2000 toàn thế giới có khoảng 151 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và dự đoán đến năm 2025 con số mắc bệnh sẽ tăng đến 300-330 triệu, chiếm 5,4% dân số toàn cầu Đáng chú ý là bệnh có xu hướng gia tăng mạnh tại các quốc gia đang phát triển ở châu Phi, châu Mỹ La Tinh và châu Á, đặc biệt ở độ tuổi lao động [2]

Ở Việt Nam, theo thống kê của Bệnh viện Nội tiết, số người mắc bệnh đái tháo đường ở nước ta chiếm khoảng 5% dân số (khoảng 4,5 triệu người), riêng ở các thành phố lớn như Hà Nội, Hải Phòng, Hồ Chí Minh, tỷ lệ này chiếm khoảng 7% và con số này vẫn không ngừng tăng lên với tốc độ nhanh nhất thế giới [2]

1.4.3 Tác hại và biến chứng

ĐTĐ không chỉ có tính chất là một bệnh mãn tính, ĐTĐ còn kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm như các bệnh về thận dẫn đến suy thận, bệnh về mắt dẫn đến mù lòa, tổn thương hệ thần kinh và đặc biệt là các biến chứng về mạch máu (xơ vữa động mạch) có thể dẫn đến tử vong như bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não [15], [13], [4], [11]

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Thân cây Ngũ gia Bì (Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) được

thu thập ở Lai Châu Mẫu cây Ngũ gia bì được giám định bởi Bộ môn Thực vật học - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Hình 2.1 Lá và thân cây Ngũ gia bì

(Acanthopanax trifoliatus gatus (L.) Merr) 2.1.2 Mẫu động vật

Chuột bạch chủng Swiss nặng từ 14-17g được nuôi béo phì và gây đái tháo đường type II do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 22-250

C với chu kì sáng 12h và tối 12h

uy tín: Probalo, Sigma, Merck,…

2.1.3.2 Dụng cụ thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng trong quá trình tiến hành đề tài gồm có: bộ máy Soxhlet chiết mẫu của Đức, tủ sấy, phễu chiết, phễu lọc, máy cô quay chân không RE 400 Yamato, máy li tâm eppendorf, máy li tâm lạnh, máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa Olympus, máy đo đường huyết tự động, cân kĩ thuật, micropipet, máy đo quang phổ,…

16

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết nghiên cứu

Từ 3000g thân cây Ngũ gia bì đã sấy khô được ngâm trong ethanol 90% , loại dung môi dưới áp suất giảm thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số là 150g

Tiếp tục ngâm mẫu (sau khi đã ngâm với ethanol) với n-hexan trong vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô loại dung môi thu được 50.2 g dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh

Tiếp tục ngâm mẫu (sau khi đã ngâm với n- hexan) với ethylacetate trong vòng 10 ngày sau đó thu dịch chiết và cô loại dung môi thu được 42.5g dạng cao và bảo quản trong tủ lạnh

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì

2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên

Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt ở bảng 2.1

17

Bảng 2.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng Nhóm hợp

chất

Phản ứng

Thuốc

Flavonoid

Shinoda Mg/HCl

Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ

sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn

xuất hydro của chúng

Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính Dung

dịch kiềm

NaOH 10%

Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất

hiện màu vàng cam

Acid sulfuric

H2SO4

10%

Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự

có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon

18

VansMayer

Hỗn hợp HgCl2+

Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng

đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp

2.2.2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong

mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm có màu xanh lam So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ= 765 nm, dùng chất chuẩn

là acid gallic

Các bước tiến hành như sau:

Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất:

* Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O

bảo quản lạnh Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5 mg/ml

Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml

* Dung dịch mẫu cần định lượng

Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic: