Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh của dịch chiết từ loài tục đoạn (dipsacus japonicus miq )

Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn ..... Kết quả đinh tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn..

TỪ LOÀI TỤC ĐOẠN ( Dipsacus japonicus Miq. )

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Người hướng dẫn khoa học

TS TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Phương Liên người đã

hướng dẫn tận tình động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô phòng thí nghiêm Hoá sinh – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn các cán bộ Trung tâm chuyển giao công nghệ - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương

đã tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người luôn động viên, quan tâm, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần lớn nhất giúp tôi đạt được kết quả tốt khi thực hiện khoá luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Quách Thị Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khoá luận là do tôi thực hiên và không trùng lặp với bất cứ tác giả nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những nội dung đƣợc đề cập trong bản khoá luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Quách Thị Quỳnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) 3

1.1.1 Phân bố, sinh thái 3

1.1.2 Thành phần hoá học 4

1.1.3 Công dụng và liều dùng 4

1.2 Hợp chất thứ cấp trong thực vật 5

1.2.1 Alkaloid 5

1.2.1.1 Khái niệm 5

1.2.1.2 Cấu tạo 6

1.2.1.3 Phân loại 6

1.2.1.4 Tính chất của alkaloid 7

1.2.1.5 Tác dụng sinh học của alkaloid 8

1.2.2 Hợp chất tannin 8

1.2.2.1 Khái niệm 8

1.2.2.2 Cấu trúc hoá học 9

1.2.2.3 Phân loại 10

1.2.2.4 Tính chất của tannin 11

1.2.2.5 Ứng dụng của tannin 11

1.2.3 Glycoside 12

1.2.3.1 Khái niệm 12

1.2.3.2 Phân loại 13

1.2.3.3 Tính chất 13

1.2.3.4 Tác dụng sinh học 13

1.2.4 Flavonoid thực vật 14

1.2.4.1 Định nghĩa 14

1.2.4.2 Cấu trúc hoá học 14

1.2.4.3 Tính chất 15

1.2.4.4 Phân loại 15

1.2.4.5 Tác dụng sinh học 15

1.3 Những nghiên cứu về hợp chất thứ sinh trên thế giới 16

1.4 Vài nét về tình hình nghiên cứu các hợp chất thứ cấp ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Mẫu thực vật 20

2.1.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây Tục đoạn 21

2.2.2 Định tính một số nhóm chất thiên nhiên từ cây Tục đoạn 22

2.2.2.1 Định tính flavonoid 22

2.2.2.2 Định tính tannin 22

2.2.2.3 Định tính alkaloid 22

2.2.2.4 Định tính glycoside 23

2.2.2.5 Định tính polyphenol khác 23

2.2.3 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.2 Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn 26

3.3 Hàm lượng polyphenol tổng số trong cao dịch chiết các phân đoạn 28

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn galic 28

3.3.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau 29

KẾT LUẬN 30

KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo hoá học của tannin 9

Hình 1.2 Tannin thuỷ phân 10

Hình 1.3 Cấu tạo của gallocatechine 11

Hình 1.4 Cấu tạo của Catechine 11

Bảng 1.1 Một số nhóm Flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hàng ngày 14

Hình 1.5 Flavan (2- pheny chroman) 15

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất các chất tự nhiên từ cây Tục đoạn 25

Bảng 3.1 Khối lượng mẫu thu được khi chiết qua các phân đoạn 26

Bảng 3.2 Kết quả đinh tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết cây Tục đoạn 27

Bảng 3.3 Kết quả đường chuẩn galic 28

Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn acid galic 28

Bảng 3.4 Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết 29

Trên thế giới, từ rất lâu người ta đã nghiên cứu những đặc tính của những chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ thực vật để phục vụ cho lợi ích của con người, quá trình này phát triển từ những năm 1950 Có khoảng 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và có giá trị đối với đời sống Những hợp chất này bao gồm: phenolic, alkaloid, flavonoid… Và trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu về các hợp chất có nguồn gốc thực vật vẫn không ngừng phát triển và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể

Theo thống kê, thảm thực vật ở Việt Nam có trên 12000 loài thực vật trong đó có khoảng hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ con người Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ thực vật đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và phục vụ sức khoẻ con người Chúng được sử dụng làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm và mĩ phẩm, thuốc bảo vệ thực vật và đặc biệt là sản xuất thuốc

2

chữa bệnh Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thường và bệnh nan y Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm dùng trong chữa bệnh hiện nay hoặc đang thử cận lâm sàng có nguồn gốc tự nhiên

Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài đã được sử dụng Trong đó, Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) là một loài thảo dược có tác dụng chữa rất nhiều bệnh khác nhau: đau lưng, thấp khớp, động thai, đau bụng và đặc biệt là có tác dụng đáng kể lên việc chữa trị bệnh đái tháo đường Nó là nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, ít tác dụng phụ Hướng nghiên cứu về đặc tính của loài Tục đoạn vẫn chưa được quan tâm nhiều Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh của dịch chiết từ loài Tục đoạn

(Dipsacus japonicus Miq )”

2 Mục đích nghiên cứu

Mục đích nghiên cứu nhằm góp phần hiểu biết thêm về đặc tính sinh lý, hóa sinh và khả năng chữa bệnh của dịch chiết từ loài Tục đoạn, tạo cơ sở cho những hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như tìm hiểu tác dụng của các loại thảo dược sẵn có trong tự nhiên

3 Nội dung nghiên cứu

- Định tính, định lượng và tách một số phân đoạn chứa hoạt chất thiên nhiên từ loài Tục đoạn

- Nghiên cứu đặc tính hóa sinh của các phân đoạn dịch chiết từ loài

Tục đoạn

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.)

Tục đoạn tên khoa học là Dipsacus japonicus Miq thuộc họ Tục đoạn

Dipsacaceae, bộ Tục đoạn Dipsacales [6]

Cây thảo, cao 1.5 - 2m, có rễ mập, phân nhánh ít thân có cạnh và gai thưa Lá mọc đối, không cuống, có bẹ, hình mác, dài 4 - 10cm, rộng 5 - 6cm, mép khía răng cưa, những lá ở phần gốc và giữa thân chia thùy không đều, to dần về phía ngọn, thùy tận cùng rất to hình trứng, những lá phía trên nguyên hoặc có ít răng hình mác hẹp, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, hai mặt lá gần như cùng màu Cụm hoa hình đầu, mọc trên một cán dài phủ đầy lông Lá bắc có lông ở mép phía dưới Hoa màu trắng, 4 lá đài nhỏ bằng nhau hoặc gần bằng nhau, cánh hoa hơi thành hình phễu, 4 nhị, chỉ nhị hình chỉ, thò ra khỏi tràng hoa, nhẵn; bao dài 1mm Quả bế, dài 4 - 5mm, rộng 0.5 - 1mm, hơi hình 4 cạnh, nhẵn

1.1.1 Phân bố, sinh thái

Tục đoạn là cây ưa sáng, thường mọc lẫn trong các trảng cỏ ở đồi cây bụi, chân núi đá vôi, độ cao 1.300 - 1.600m Vốn là cây có nguồn gốc ở phía Bắc, thích nghi với điều kiện khí hậu ẩm mát quanh năm Vì vậy ở Việt Nam, Tục đoạn chỉ thấy mọc tự nhiên ở vùng núi cao, sát biên giới phía Bắc [6] Nhiệt độ trung bình năm ở đây từ 13.8 đến 15.30C, về mùa đông lạnh kéo dài,

có lúc xuống dưới 00C Tục đoạn là cây sống khoẻ, chịu được hạn, chua Cây phát triển tốt trên đất feralit núi cao giàu mùn, có pH hơi chua 5 - 6 Cây mọc

từ hạt quan sát được vào tháng 4 - 5, sinh trưởng nhanh trong mùa hè thu; mùa hoa quả tháng 7 - 11 Toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đông, phần gốc và củ dưới mặt đất có thể mọc lại vào mùa xuân năm sau Tái sinh

tự nhiên chủ yếu từ hạt

4

Ở Việt Nam, Tục đoạn phân bố chủ yếu ở các tỉnh Hà Giang (huyện Quản Bạ, Yên Minh, Đồng Văn, Mèo Vạc); Lai Châu (Phong Thổ, Sìn Hồ); Điện Biên (Tủa Chùa); Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát); Yên Bái (Mù Cang Chải) Năm 1978, Viện Dược liệu đưa giống từ Sa Pa trồng ở Trại dược liệu Trà My (Quảng Nam), nay có một quần thể nhỏ đã trở nên hoang dại hóa

Trên thế giới Tục đoạn có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản và có thể có ở

cả Ấn Độ

1.1.2 Thành phần hoá học

Bao gồm: tinh dầu, tannin, saponin

Rễ củ Tục đoạn có chứa một số chất là sucrose, b - sitosterol, akebia saponin D

Rễ củ chứa 1triterpen glycosid, 3 iridoid glycosid (swerosid, loganin,

cantleyosid) Ngoài ra, còn chứa 2 saponin là japondipsaponin E1 và E2 1.1.3 Công dụng và liều dùng

Tục đoạn có vị đắng, cay, tính ôn; quy vào các kinh can, thận; có tác dụng bổ gan thận, tục cân cốt (nối gân xương), hành huyết, chỉ huyết, an thai Trong Y học cổ truyền, Tục đoạn được dùng làm thuốc bổ, chữa đau lưng mỏi gối, té ngã sưng tấy, gãy xương, động thai, doạ sẩy thai, ít sữa sau khi đẻ, nam giới di tinh Được dùng dưới dạng thuốc sắc hay chế viên hoàn để uống, ngày

6 - 12 g

Một số bài thuốc có Tục đoạn và cách sử dụng:

- Thuốc bổ gan thận, chữa đau lưng mỏi gối: Tục đoạn, Ngưu tất, Đỗ trọng, Tang kí sinh, Câu kỉ tử, Đương quy, Hà thủ ô; sắc hoặc ngâm rượu uống

- Chữa động thai, doạ sẩy thai: Tục đoạn (tẩm rượu), Đỗ trọng (trích gừng), Táo nhục; chế viên, uống

5

- Chữa vết thương sưng tấy, gãy xương: Tục đoạn, Cốt toái bổ, Ngưu tất, Nhũ hương, Một dược, Tam thất, Đỗ trọng, Đương quy, Xuyên khung; sắc uống

- Chữa kinh nguyệt quá nhiều, kinh nhạt màu: Tục đoạn, Thục địa, Đương quy, Ngải diệp, Xuyên khung; sắc uống

1.2 Hợp chất thứ cấp trong thực vật

Ở thực vật có những chất đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc nên cơ thể, những chất đó được gọi là những hợp chất sơ cấp Gồm có các polysaccharide, đường, protein và chất béo Ngoài những chất đó ra, còn có những hợp chất khác có nồng độ ít hơn gọi là các hợp chất thứ cấp (hợp chất thứ sinh), gồm có alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, và được tìm thấy trong rất nhiều loài thực vật khác nhau, mỗi loài có một dẫn xuất khác nhau [8] Cho đến nay, người ta đã tìm thấy gần 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực vật khác nhau

và hàng năm một số lượng lớn các chất mới được phát hiện thêm Nguồn gốc của các chất thứ cấp là các điểm cuối cùng của quá trình biến dưỡng, với chức năng ít chuyên biệt [13]

Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỉ 20 [14] Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside

1.2.1 Alkaloid

1.2.1.1 Khái niệm

Alkaloid từ tiếng Ả rập là al - cali có nghĩa là kiềm Alkaloid là:

- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy cả trong một số loài động vật

6

- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh

- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa” cần thiết cho sự xác định của chúng

Chúng là một nhóm chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao

Hầu hết alkaloid base gần như không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, eter, các alcol dây carbon ngắn Một số alkaloid do có thêm nhóm phân cực như -OH, nên tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm (Morphin, Cephalin) Ngược lại với base, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và alcol, hầu như không tan trong dung môi hữu cơ Có một số ngoại lệ như Ephedrin, Colchixin, Ecgovonin các base của chúng tan được trong nước, đồng thời cũng khá tan trong dung môi hữu cơ, còn các muối của chúng thì ngược lại Alkaloid có N bậc 4 và N- oxid khác tan trong nước và trong kiềm, rất ít tan trong dung môi hữu cơ

Các muối của chúng có độ tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra chúng

 Tính chất hoá học

Alkaloid là các base yếu, do đó có đầy đủ tính chất hóa học của một base yếu Đa số làm xanh giấy quỳ tím Với acid thường tạo muối tan trong nước và kết tinh Tính kiềm phụ thuộc vào khả năng sẵn có của các cặp điện

tử đơn độc trên nguyên tử nitơ và kiểu khác (dị) vòng cùng các phần thay thế [4]

- Một số Alkaloid mang tính lưỡng tính, vừa có tính base yếu vừa có

tính acide yếu, ví dụ: Morphine

- Tính base giảm dần theo thứ tự muối amoni bậc 4, amin bậc 1, amin

bậc 2, amin bậc 3

8

- Muối của alkaloid rất bền, nhưng chúng bị phân hủy bởi tia sáng mặt

trời hoặc tia tử ngoại

- Phần đông alkaloid có vị đắng và có tính triền quang Chúng tạo tủa

với các dung dịch acid phosphotungstic, phosphomolipdic, picric…

Nhìn chung, alkaloid là những chất tương đối bền, nhưng một số ít chất thuộc dẫn xuất indol rất dễ bị phân hủy do ánh sáng hoặc tác nhân oxy hóa

Ngoài tính base, các alkaloid có phản ứng tương tự nhau như đối với một thuốc thử, gọi tên chung là các thuốc thử alkaloid

1.2.1.5 Tác dụng sinh học của alkaloid

Công dụng của alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloid [5]

- Kích thích thần kinh trung ương: strychnine, caffeine

- Ức chế thần kinh trung ương: morphin, codeine

- Kích thích thần kinh giao cảm: ephedrine

- Liệt giao cảm: yohimbin

- Kích thích phó giao cảm: pilocarpin

- Liệt phó giao cảm: atropine

- Gây tê: cocaine

Cấu trúc hoá học của tanin có nhiều nhóm OH phenol

Hình 1.1 Cấu tạo hoá học của tannin

10

1.2.2.3 Phân loại

Dựa vào cấu trúc hoá học, tannin được phân làm hai loại: tannin thuỷ

phân được và tannin không thuỷ phân được

 Tannin thuỷ phân được

Hay còn gọi là tannin pyrogallic vì sau khi bị thuỷ phân, những tannin thuộc nhóm này sẽ bị cắt ra thành một đường, thường là glucose và một acid, thường là acid gallic

Hình 1.2 Tannin thuỷ phân

11

 Tannin không thuỷ phân được

Hay còn gọi là tannin ngưng tụ Dưới tác dụng của acid hay enzyme, chúng dễ tạo thành tannin đỏ hoặc một sản phẩm trùng hợp gọi là phlobaphen rất ít tan trong nước Phlobaphen là đặc trưng của một số dược liệu như vỏ Canhkina, vỏ quế,…

Hình 1.3 Cấu tạo của

12

- Thuốc làm se niêm mạc ruột trị các chứng bệnh tiêu chảy

- Một liều lượng nhỏ tannin sẽ có tác dụng cầm máu, vô trùng

- Tannin là một chất kháng sinh hiệu quả, hiện nay người ta đang nghiên cứu nó làm chất chống ung thư và chất ức chế virus HIV

 Trong y học: Tannin là một hợp chất có khá nhiều ứng dụng trong điều trị bệnh:

- Do có tính tạo tủa với protein, khi tiếp xúc với niêm mạc, tổ chức da

bị tổn thương hay vết loét… tannin sẽ tạo một màng mỏng, làm máu đông lại, ngừng chảy nên ứng dụng làm thuốc đông máu và thuốc săn se da

- Tannin có tính kháng khuẩn, kháng virus, được dùng trong điều trị các bệnh viêm ruột, tiêu chảy

- Phối hợp với tính làm săn se, tannin còn được dùng để làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét hoặc chữa vết loét do người bệnh nằm lâu

- Tannin tạo kết tủa với các alcaloid và các muối kim loại nặng như chì, thuỷ ngân, kẽm

1.2.3 Glycoside

1.2.3.1 Khái niệm

Glycoside là hợp chất hữu cơ tạo thành do sự ngưng tụ giữa 1 phân tử đường với 1 phân tử hữu cơ khác, với điều kiện nhóm hydroxyl bán acetal của phần đường phải tham gia vào sự ngưng tụ Oligosaccharid hay polysaccharid

là Glycoside, được gọi là “Holosid” [4]

Glycoside: chất tạo thành do sự ngưng tụ giữa một phần là đường và một phần không phải là đường, được gọi là “heterosid”

Phần không đường được gọi là aglycon hoặc genin, có cấu trúc hóa học khác nhau, tác dụng sinh học phụ thuộc vào phần này

- Glycoside: Đường là Glucose → Glycoside

- Rhamnosid, Galactosid …