Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có nguồn gốc từ Nam Mỹ được trồng rộng rãi trên khắp đất nước Việt Nam cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao. Hạt lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người do có chứa 27,5% protein, 44,5% lipit, 15,5% glucid, các nguyên tố vi lượng (kali, phospho, magie, mangan, sắt, natri, kẽm, đồng), các vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, folat), các axit amin [11]. Do có giá trị dinh dưỡng cao, từ lâu loài người đã sử dụng lạc như một nguồn thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp dầu, magarin, kẹo bánh, nước chấm... Việt Nam có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, trong đó có nhiều loài sinh độc tố vi nấm. Trong khi lạc là cơ chất thích hợp đối với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin, chất được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC) phân loại thuộc nhóm có độc tính cao gây ung thư [23]. Do đó, việc nghiên cứu các giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm aflatoxin trong lạc và sản phẩm từ lạc là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Trên thế giới đã có các nghiên cứu về giải pháp nhằm hạn chế sự phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin và biện pháp làm giảm hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm. Đối với lạc sau thu hoạch, một số nghiên cứu có dùng hóa chất, hoạt chất từ thực vật hoặc vi sinh vật, tuy nhiên, các biện pháp này còn hạn chế do ảnh hưởng đến cảm quan và an toàn thực phẩm của lạc. Lạc trong quá trình bảo quản vẫn tiếp tục hô hấp, sinh hơi nước tạo môi trường ẩm thuận lợi cho nấm mốc phát triển, trong đó có nấm sinh độc tố aflatoxin. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin” với mục tiêu của đề tài là: 1. Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản. 2. Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN TÌNH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN TÌNH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :

1 ThS Lê Thị Phương Thảo

2 ThS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện :

Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia

HÀ NỘI 2015

Phương Thảo, ThS Đặng Thị Ngọc Lan đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quátrình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độcchất – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viênViện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôitrong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài

Tôi gửi lời cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìudắt và truyền thụ kiến thức cho tôi trong năm năm học vừa qua Cảm ơn bạn bè thânthiết luôn sát cánh, nhiệt tình chia sẻ giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập và thực hiệnkhóa luận

Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho bố mẹ nhữngngười đã chăm sóc, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Xuân Tình

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

1.1.1 Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin 2

1.1.2 Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin 3

1.1.3 Độc tính aflatoxin 4

1.1.4 Một số phương pháp xác định aflatoxin 7

1.2 Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm aflatoxin

1.2.1 Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam 9

1.2.2 Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam 10

1.2.3 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc 11

1.3.1 Thế giới 11

1.3.2 Việt Nam 13

1.4 Công nghệ bảo quản 13

1.4.1 Bảo quản bằng bao bì 13

1.4.2 Bảo quản bằng điều biến khí quyển 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 16

2.1.2 Hóa chất, thuốc thử 17

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp bảo quản 20

2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm 20

Chương III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản……… ……24

3.1.1 Xác định độ ẩm của lạc nhân trước khi bảo quản 24

3.1.2 Mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin 25

3.2 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các

3.2.1 Sự thay đổi độ ẩm 25

3.2.2 Xác định hàm lượng AF 30

3.3.1 Về việc lựa chọn lạc nhân trước khi bảo quản 33

3.3.2 Về chất liệu bảo quản lạc nhân 34

3.3.3 Về thay đổi điều kiện môi trường bảo quản lạc nhân 34

3.3.4 So sánh phương pháp bảo quản truyền thống với phương pháp mới 35

A favus Aspergillus flavus

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thônBYT Bộ Y Tế

DON Deoxynivalenol

ELISA Enzyme-linked immunosorbent

assayFBs Fumonisins

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid

chromatographyIARC Cơ quan Nghiên cứu Ung thư

The International Crops Research Institute for the Semi-Arid-

TropicsKPH Không phát hiện

KQĐ Không quy định

LC Sắc ký lỏng Liquid chromatography

ML Giới hạn tối đa Maximum limit

MS Khối phổ Mass spectrometry

NIV Nivalenol

OTA Ochratoxin A

PAT Patulin

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography

UHPLC-MS/ Sắc ký siêu hiệu năng hai lần

UV Detector tử ngoại Ultra violet

ZEA Zeralenone

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của aflatoxin 4Bảng 1.2 Phân loại mycotoxin chính của IARC 6Bảng 1.3 Sản lượng lạc của Việt Nam 10Bảng 1.4 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ) 11Bảng 2.1 Đóng gói lạc với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển

Bảng 2.2 Mã hóa mẫu lạc nhân trong các điều kiện bảo quản 19Bảng 2.3 Phương pháp kiểm nghiệm lạc nhân 20Bảng 2.4 Chương trình gradient phân tích aflatoxin 22Bảng 2.5 Điều kiện khối phổ thiết bị MS ABI 5500 QQQ 23Bảng 3.1 Độ ẩm của mẫu lạc nhân trước khi bảo quản 24Bảng 3.2 Độ ẩm của lạc nhân sau 1 tháng bảo quản 25Bảng 3.3 Độ ẩm của lạc nhân sau 2 tháng bảo quản 26Bảng 3.4 Độ ẩm của lạc nhân sau 3 tháng bảo quản 26Bảng 3.5 Độ ẩm của lạc nhân sau 4 tháng bảo quản 27Bảng 3.6 Độ ẩm của lạc nhân trong suốt quá trình bảo quản 27Bảng 3.7 Sự biến thiên độ ẩm của lạc nhân ở điều kiện bảo quản khác

nhau giữa các tháng 27Bảng 3.8 Kết quả aflatoxin trong các mẫu lạc nhân 30Bảng 3.9 So sánh phương pháp bảo quản lạc nhân 35Bảng 4.1 Hàm lượng AF trong lạc nhân bảo quản bằng các giải pháp 37

Hình 1.1 So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A.

flavus và A parasiticus Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản

xuất aflatoxin ( -) 3Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số aflatoxin 4Hình 1.3 Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu

Hình 3.1 Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân đã được lựa chọn và lạc nhân

chưa được chọn lựa cùng bảo quản trong bao đay 28Hình 3.2 Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân trong các điều kiện bảo quản

khác nhau tại các thời điểm khác nhau 29Hình 3.3 Hàm lượng AF trong các mẫu lạc nhân 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có nguồn gốc từNam Mỹ được trồng rộng rãi trên khắp đất nước Việt Nam cho năng suất và hiệuquả kinh tế cao Hạt lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 kcal/100g), bổ sungđạm và chất béo quan trọng cho con người do có chứa 27,5% protein, 44,5% lipit,15,5% glucid, các nguyên tố vi lượng (kali, phospho, magie, mangan, sắt, natri,kẽm, đồng), các vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, folat), các axit amin [11] Do có giátrị dinh dưỡng cao, từ lâu loài người đã sử dụng lạc như một nguồn thực phẩm vànguyên liệu cho công nghiệp dầu, magarin, kẹo bánh, nước chấm

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốcphát triển, trong đó có nhiều loài sinh độc tố vi nấm Trong khi lạc là cơ chất thíchhợp đối với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin, chất được Cơ quan Nghiên cứu Ung thưquốc tế (IARC) phân loại thuộc nhóm có độc tính cao gây ung thư [23] Do đó, việcnghiên cứu các giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm aflatoxintrong lạc và sản phẩm từ lạc là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao nhằm bảo vệsức khỏe người tiêu dùng

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về giải pháp nhằm hạn chế sự phát triểncủa nấm mốc sinh aflatoxin và biện pháp làm giảm hàm lượng aflatoxin trong thựcphẩm Đối với lạc sau thu hoạch, một số nghiên cứu có dùng hóa chất, hoạt chất từthực vật hoặc vi sinh vật, tuy nhiên, các biện pháp này còn hạn chế do ảnh hưởngđến cảm quan và an toàn thực phẩm của lạc Lạc trong quá trình bảo quản vẫn tiếptục hô hấp, sinh hơi nước tạo môi trường ẩm thuận lợi cho nấm mốc phát triển,trong đó có nấm sinh độc tố aflatoxin Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố

vi nấm aflatoxin” với mục tiêu của đề tài là:

1 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản.

2 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin

Khái niệm về mycotoxin được đặt ra vào năm 1962 sau hậu quả của một dịchbệnh tại trại chăn nuôi gần London, Anh Gần 10 vạn con gà tây bị chế một cách bí

ẩn, người ta gọi đó là bệnh X ở gà Các nhà khoa học cho rằng dịch bệnh này có

liên quan đến chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ nấm Aspergillus flavus có trong

lạc, một nguồn thức ăn của gà

Mycotoxin là chất chuyển hóa thứ cấp của một số loại nấm mốc có khả nănggây bệnh hoặc chết ở người và động vật qua các con đường tiêu hóa, hô hấp hoặctiếp xúc Đặc trưng của bệnh này bao gồm:

-Tính không truyền nhiễm

-Điều trị bằng kháng sinh không hoặc có rất ít tác dụng

-Dịch bệnh thường theo mùa và có liên quan tới một thực phẩm cụ thể mà khikiểm tra cho thấy có dấu hiệu hoạt động của nấm [23]

Theo số liệu thống kê của tổ chức Nông lương thế giới (FAO), ước tính cókhoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxins sản sinh chủ yếu bởi chi

nấm Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium và Claviceps [23] Trong số các

độc tố vi nấm, aflatoxin được xem như độc tố chính được phát hiện sớm nhất vàđược nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện

1.1.1 Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin

Các điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm và phát triển aflatoxin bởi loài A.

flavus và A parasitcus qua khảo sát trong ống nghiệm được thể hiện trong hình 1

Hình 1.1: So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A.

flavus và A parasiticus Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản xuất aflatoxin ( -)

Theo đó, điều kiện tối ưu có sản xuất aflatoxin bởi hai loài này là 33ºC vàhoạt độ nước là 0,99, trong khi điều kiện tối ưu cho tăng trưởng và phát triển là35ºC và hoạt độ nước là 0,95 [26]

Aflatoxin có thể phát triển trong các sản phẩm nông nghiệp ở cả giai đoạntrước và sau thu hoạch nhưng việc ô nhiễm với hàm lượng cao thường liên quan tới

hư hỏng sau thu hoạch, bảo quản ở điều kiện độ ẩm và nhiệt độ cao làm cho nấmmốc phát triển nhanh Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm aflatoxin cao nhất

là ngô, lac và hạt bông [26]

1.1.2 Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin

 Cấu tạo

Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu B1, B2, G1,G2 Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng dưới tia cực tím

(màu xanh – Blue hay màu xanh lá cây – Green) và chuyển động tương đối củachúng trong sắc ký lớp mỏng AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìmthấy trong sữa, thận và gan động vật

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của một số aflatoxin

hấp thu qua niêm mạc ruột: khuếch tán, hòa tan trong lipid và vận chuyển nhờprotein mang Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ liên kết vớicác tế bào máu hoặc protein huyết tương Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạchcửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở gan Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp làmrối loạn hoạt động bình thường của tế bào

AFB1 được chuyển hóa chủ yếu qua gan tạo thành AFB1-8,9-exo-epoxide và8,9-endo-epoxide Exo-epoxide liên kết với AND thành sản phẩm cộng 8,9-dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroxy AFB1 (AFB1-N7-gua) chiếm ưu thế AFB1-N7-gua có thể được chuyển thành 2 thương tổn thứ cấp là vị trí apurinic và 1 vòng ổnđịnh hơn được mở từ sản phẩm cộng AFB1-FAPY; sau này trong invivo sẽ xuấthiện bền vững hơn AFB1-N7-gua Tại gan, aflatoxin được chuyển hóa bởi nhómenzyme Cytochrome P450 chủ yếu là CYP3A4, 3A5, 3A7, 1A2

AFM1 là dẫn xuất hydroxyl hóa bậc một của AFB1 được tạo thành trong ganqua enzyme chuyển hóa cytochrome P450 Động vật có vú ăn thức ăn bị nhiễmAFB1 bài tiết một lượng chất chuyển hóa được hydroxyl hóa ở vị trí số 4 thànhAFM1 vào trong sữa [23]

 Độc tính

Aflatoxin có thể gây ngộ độc cấp tính, xảy ra khi AF xâm nhập vào cơ thể quađường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn Điều này diễn ra ở một vàinước đang phát triển ví dụ như ở Kenya năm 2004 đã xảy ra sự bùng nổ nghiêmtrọng độc tính cấp của độc tố afatoxin với 317 ca được phát hiện trong đó 125 ca tửvong (chiếm 39.4%) Trong ca này, ngô được cung cấp cho người sử dụng bị nhiễmaflatoxin nồng độ dao động từ 20 đến 8000µg/kg Độc tính cấp trên người đặc trưngbởi tình trạng nôn, đau bụng, phù phổi hoặc não, gan nhiễm mỡ các triệu chứngkhác bao gồm chán ăn, trầm cảm, vàng da, tiêu chảy và nhạy cảm với ánh sáng [23].Tuy nhiên, AF gây ra ngộ độc mãn tính nguy hiểm hơn, ngay ở liều lượngthấp khi tiếp xúc trong thời gian dài Các aflatoxin được IARC xếp vào nhóm 1(bảng 1.2) Mặt khác, có bằng chứng đầy đủ trên động vật thử nghiệm về khả nănggây ung thư của AFM1 (tiềm năng gây ung thư ước tính thấp hơn xấp xỉ 10 lần so

với AFB1), đang được xếp vào nhóm có khả năng gây ung thư cho người (nhóm2B) [23].

Bảng 1.2 Phân loại mycotoxin chính của IARC

Thứ tự xếp loại IARC Mycotoxin

1 AF

2A

-2B AFM1, FBs, OTA, sterigmatocystin

3 DON, NIV, PAT, T-2/H-2, ZEA, citrinin, fusarenon-X

-Đối với con người, sự tiêu thụ lâu dài thực phẩm bị nhiễm aflatoxin có liênquan đến các bệnh khác nhau sau [23]:

- Ung thư gan Có bằng chứng chứng minh sự kết hợp giữa tác động của AF

và bệnh viêm gan virus B và/hoặc C là nguyên nhân gây ra ung thư tế bào biểu môgan

- Ảnh hưởng đến chức năng sinh sản Aflatoxin gây ảnh hưởng xấu lên chứcnăng sinh sản của nam giới, là nguyên nhân của chứng tinh hoàn chậm phát triển,thoái hóa tinh hoàn, giảm lượng tinh trùng, thay đổi hình thái, giảm kích thước vàtrọng lượng tinh hoàn, khả năng phân bào giảm, giảm tỷ lệ phần trăm tinh trùngsống sót, tinh trùng bất thường gia tăng, sự thoái hóa của tế bào biểu mô, và giảmnồng độ testosterone trong huyết tương

- Tác động lên hệ thống miễn dịch Aflatoxin hoạt động như những khángnguyên, làm suy giảm khả năng chống nhiễm trùng thứ phát do nấm, ký sinh trùng

và vi khuẩn gây ra Hoạt động của tế bào lympho B hoặc T bị suy giảm, chức năngthực bào của đại thực bào và bạch cầu trung tính bị suy yếu Sự tổng hợp cáccytokines chống nhiễm trùng bị thay đổi, tế bào trung gian ly giải NK bị ức chế,kích hoạt gây ra các nhiễm trùng mãn tính, giảm khả năng miễn dịch khi tiêm chủngvaccin và làm giảm chức năng miễn dịch trong động vật đang phát triển

- Bệnh lý não với thoái hóa mỡ của nội tạng gần giống với hội chứng Reye.Vai trò của aflatoxin trong sự phát triển của hội chứng Reye (thoái hóa mỡ, gan vàthận to ra và nhợt nhạt, phù nề, và đột quỵ) chưa bao giờ được chứng minh mộtcách rõ ràng mặc dù aflatoxin được phát hiện là thường có trong gan của những đứa

trẻ bị chết bởi chứng bệnh này và do đó vấn đề này vẫn còn đang được thảo luậnthêm.

- Xơ hóa nhu mô phổi Người ta cho rằng aflatoxin qua đường hô hấp có thểgây nguy hiểm

1.1.4 Một số phương pháp xác định aflatoxin.

1.1.4.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Shi Chun Pei, Yuan Yuan Zhang, Sergei A Eremin, Won Jong Lee (2009)[24] cũng đã dùng phương pháp cạnh tranh gián tiếp ELISA, sử dụng kháng thể đơndòng để đo AFM1 trong sữa và sản phẩm của sữa Giới hạn phát hiện nồng độ củaAFM1 là 0,04 ng/ml Mức độ nhiễm AFM1 được đo trong 12 mẫu sữa nguyên liệu,

15 mẫu sữa bột, 104 mẫu sữa nước và bốn mẫu phomat được lấy từ các siêu thịkhác nhau ở Đông Bắc của Trung Quốc

Kỹ thuật này có ưu điểm: nhanh, đơn giản, tiết kiệm dung môi, đặc hiệu vàkhá nhạy cảm nhưng dễ cho kết quả dương tính và âm tính giả Phân tích ELISAthuận tiện cho việc xác định đồng thời các chất ô nhiễm trong một số lượng lớn cácmẫu với chi phí thấp và thời gian ngắn Tuy nhiên, nó không thích hợp để địnhlượng các chất ô nhiễm vì nó có thể bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng của nhiều mẫu và cókhả năng để đánh giá quá cao các chất gây ô nhiễm ở nồng độ rất thấp

1.1.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Jorg Stroka, Robert van Otterdijk, Elke ANKLAM (2000) [17] đã sử dụngphương pháp TLC một chiều để xác định AF trong các loại thực phẩm khác nhaubằng việc sử dụng dung môi clo Sử dụng cột ái lực miễn dịch để làm sạch sau khiđược chiết với methanol Các giới hạn định lượng được tìm thấy là thấp hơn so vớigiới hạn quy định hiện hành về kiểm soát AF bên ngoài và trong cộng đồng ChâuÂu

Phương pháp TLC là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần đầu

tư lớn Nó thay thế cho phương pháp HPLC hiện đại nếu không có thiết bị HPLC,tuy nhiên không thể phát hiện và xác định được AF khi ở nồng độ thấp

1.1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

TCVN [5, 6] và nhiều tác giả trên thế giới sử dụng HPLC có dẫn xuất sau cột

và làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch hoặc làm sạch bằng chiết pha rắn với detectorhuỳnh quang và detector UV để xác định các mycotoxin trong các loại ngũ cốc khácnhau Cụ thể:

TCVN 7930:2008 [5] Thực phẩm Xác định AFB1 và AF tổng trong ngũ cốc,quả có vỏ và sản phẩm của chúng

Theo Zhaohui Fu, Xueiang Huang, Shungeng Min (2008) [29] đã phát triểnphương pháp sử dụng HPLC với detector UV để xác định aflatoxin B1, B2, G1, G2trong ngô và lạc Trong phương pháp này, aflatoxin được chiết với hỗn hợp củaacetonitril trong H20 (86:14) và sau đó làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch

Phương pháp HPLC là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chấthữu cơ Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy không cao khi sử dụng detector UV,còn khi sử dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ

có thể nhận biệt chất phân tích thông qua thời gian lưu Đối với những nền mẫuphức tạp như thực phẩm, rất khó có thể khẳng định chất cần phân tích bằng phươngpháp này

1.1.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (Phụ lục 2)

Nhóm tác giả L.C Huang [19] đã nghiên cứu xác định một nhóm các chấtAFM1, OTA, zearalanone và α-zearalenol trong sữa bằng phương pháp UHPLC-MS/MS Mẫu sữa được làm sạch bằng cột chiết pha rắn Oasis HLB Giới hạn địnhlượng của các mycotoxins nằm trong khoảng 0,003 – 0,015 µg/kg Hệ số tươngquan cao (R2≥0,996) thu được trong khoảng nồng độ mycotoxin 0,01 – 1,00 µg/kgvới độ thu hồi cao (87,0 – 109 %), độ lặp lại (3,4 – 9,9%) và độ tái lập phòng thínghiệm tốt (4,0 – 9,9%) ở mức nồng độ 0,025; 0,1; 0,5 µg/kg Tỷ lệ phát hiện mẫudương tính là 16,7% đến 96,7% trong sữa nguyên liệu, sữa lỏng và sữa bột thu thập

từ các trang trại và siêu thị ở Beijing

Baifen Huang, Zheng Han, Zengxuan Cai, Youngjiang Wu, Yiping Ren(2010) [12] sử dụng phương pháp UHPLC-MS/MS để xác định đồng thời các độc

tố aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 trong lạc và các sản phẩm của chúng Mẫu

được chiết xuất bằng dung dịch acetonitril 84% và làm sạch bằng cách qua cột chiếtpha rắn Các hợp chất tách ra đã được phát hiện với khối phổ tứ cực 2 lần WaterMICROMASS Quattro Ultima Phương pháp này có độ tuyến tính R2≥0,9990, độthu hồi trung bình (74,7 – 86,8%) và độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối ≤10,9%) Nó đã được chứng minh là một phương pháp thích hợp để xác định đồngthời sáu AF trong lạcd và các sản phẩm của chúng

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hai lầnkhối phổ, là một kỹ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây Phươngpháp này có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gianphân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau

mà phương pháp sắc kí lỏng thông thường không làm được

Với những ưu điểm của phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ chúng tôi

đã chọn để phân tích độc tố aflatoxin trong lạc nhân để đánh giá một số biện phápbảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm AF

1.2. Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam

1.2.1 Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam

 Sản xuất

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam, diện tích gieo trồng lạc tínhđến ngày 15 tháng 3 năm 2015 đạt 127,3 nghìn hecta đạt 100,5% so với cùng kỳnăm ngoái [8] Điều kiện thuận lợi và những cải thiện về giống sẽ góp phần thúcđẩy năng suất và sản lượng lạc Tổ chức USDA dự kiến sản lượng lạc năm 2015 củaViệt Nam sẽ tăng lên 550 nghìn tấn Khu vực trồng lạc chủ yếu tập trung ở bờ biểnBắc Trung Bộ, khu vực miền núi và trung du Bắc Bộ, và Duyên hải Nam Trung Bộ

Bảng 1.3 Sản lượng lạc của Việt Nam

Năm 2011 2012 2013 2014* 2015*Diện tích trồng trọt (nghìn héc-ta) 223,8 219,3 216,3 230 240Sản lượng (tấn/héc-ta) 2,09 2,14 2,28 2.3 2,29Tổng sản lượng (nghìn tấn) 468,7 468,4 492,6 530 550Nguồn : Tổng cục thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo của USDA

 Tiêu thụ

Tổ chức USDA ước tính tại Việt Nam, lượng lạc được tiêu thụ trong nướcnăm 2013 là 710 nghìn tấn Đến niên vụ 2013/2014 và 2014/2015 các con số nàylần lượt là 740 và 770 nghìn tấn Phần lớn lạc được sản xuất trong nước còn lạcnhập khẩu chủ yếu cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn nhẹ và bánh kẹo cònmột lượng nhỏ dành cho tiêu dùng của hộ gia đình hoặc ép lấy dầu hoặc xuất khẩu[1]

1.2.2 Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam

Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về mycotoxin trong thực phẩm và biệnpháp giảm nguy cơ ô nhiễm mycotoxin Trong số các đề tài công bố gần đây như:Virmani đã tiến hành nghiên cứu ở 7 vùng sinh thái của Việt Nam và đánh giámối liên quan của nguy cơ nhiễm aflatoxin tại các vùng sinh thái tại 3 giai đoạn(1) Giai đoạn sinh trưởng và phát triển

(2) Giai đoạn thu hoạch và làm khô

1.2.3 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc

Bảng 1.4 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ) [4] Tên thực phẩm ML (µg/kg)

AFB1 Aflatoxin AFM1

tổng sốLạc và các loại hạt có dầu khác sử dụng làm

thực phẩm hoặc làm thành phần nguyên

liệu của thực phẩm (không bao gồm lạc và

các loại hạt có dầu khác sử dụng để sản

xuất dầu thực vật)

Phải sơ chế trước khi sử dụng 8 15 KQĐ

Sử dụng trực tiếp không cần sơ chế 2 4 KQĐ

1.3. Một số nghiên cứu bảo quản lạc nhằm giảm nhiễm aflatoxin

1.3.1 Thế giới

Viện nghiên cứu quốc tế cây lương thực bán khô hạn (ICRISAT) đã ban hànhmột quy trình tổng hợp nhằm quản lý nhiễm aflatoxin trong lạc trước và sau thuhoạch

Hình 1.3: Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu hoạch [14]Trên thế giới đã có các nghiên cứu về các giải pháp nhằm hạn chế sự pháttriển của nấm mốc sinh AF và biện pháp làm giảm hàm lượng AF trong lạc sau thuhoạch như:

 Phân loại

Bước đầu tiên trong bảo quản lạc sau thu hoạch là sàng lọc để loại bỏ nhữnghạt có nguy cơ bị nhiễm độc tố vi nấm Theo báo cáo của Dorner, lạc bị nhiễm AFthường bị đổi màu, bằng cách sử dụng kỹ thuật phân loại màu điện tử (ECS) có thểlàm giảm 70% khả năng nhiễm AF [16]

 Kiểm soát sinh học

Chủng Bacillus megaterium phân lập ở vùng biển Hoàng Hải phía Đông

Trung Quốc được đánh giá là có khả năng kiểm soát quá trình phân hủy của hạt lạc

gây ra bởi A flavus trong thử nghiệm in vitro và in vivo Theo đó, dịch tế bào vi

Lựa chọn kiểm soát

Thời vụ, cải tạo đất

Kỹ thuật thu hoạch và sau

thu hoạch

Làm khô và lưu trữ

Chuyển giao công nghệ và vấn đề xã hội

Nghiên cứu và theo dõi khu vực Nhận thức cộng đồng Tác động thương mại Hội đồng tư vấn

Tư vấn cho ngành công nghiệp

Đào tạo

Đánh giá/ Thực thi cấp khu vực

Đề ra biện pháp với từng khu vực và xúc tiến thực hiện

Quản lý trước và sau thu hoạch

khuẩn này làm giảm quá trình sinh tổng hợp của AF và sự biểu hiện của gen afIR vàafIS (p<0,01) [22]

 Phương pháp hóa học

Nghiên cứu của Passone và cộng sự cho thấy lạc được xử lý bằng hỗn hợp cácchất Butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT) và propyl

paraben (PP) giảm đáng kể lượng nấm sinh độc tố A flavus (p<0,001) [20].

 Đóng gói điều biến khí quyển

Nghiên cứu của Hagit Navarro và cộng sự cho thấy lạc được đóng kín trongđiều kiện kiểm soát khí quyển 99% CO2 với độ ẩm 7% và 8% bảo quản được chấtlượng tốt nhất với số bào tử nấm thấp (≤9,7 ×101CFU/g) [15]

1.3.2 Việt Nam

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hiền Trang (2012) về việc sử dụng chế phẩm

sinh học Trichoderma để hạn chế nấm mốc vàng A flavus cho thấy có kết quả hàm

lượng AF trong các mẫu nghiên cứu thấp hơn ngưỡng cho phép [10]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Thắng (2011) về ảnh hưởng của công

nghệ sau thu hoạch tới sự phát triển của nấm mốc A flavus và khả năng sinh độc tố

aflatoxin ở lạc cho thấy lạc phơi nắng bảo quản an toàn hơn lạc sấy, lạc có độ ẩm10-12% bảo quản tốt hơn so với lạc có độ ẩm 14-16%; Lạc bảo quản mát sau 6tháng có hàm lượng AF thấp hơn lạc bảo quản thường, lạc bảo quản bao hai lớp cóhàm lượng AF nhiễm cao hơn lạc bảo quản bằng bồ cót và bao dứa ở cùng điều kiện[9]

1.4. Công nghệ bảo quản

1.4.1 Bảo quản bằng bao bì

Bao bì chứa đựng thực phẩm không chỉ có chức năng vận chuyển, chứa đựng

mà còn là phương tiện quan trọng để giữ gìn nguyên vẹn số lượng và chất lượng sảnphẩm Bao bì chứa đựng có thể giúp sản phẩm kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm,duy trì chất lượng và an toàn thực phẩm, chống lại các yếu tác động môi trường, cácnguy cơ ô nhiễm hoá học, vật lý và sinh học Bao bì chứa đựng thực phẩm có thể cónguồn gốc nguyên liệu từ thuỷ tinh, kim loại, nhựa, Trong bảo quản lạc các dụng

cụ và vật liệu chứa đựng thông thường đối với hộ dân là bao tải, bao nilon, bao tảilót nilon hoặc với các hộ gia đình chứa ít lạc thì đựng trong chum, vại, lọ

 Màng bao PE

- Là chất trùng hợp của Etylen, được sản xuất đầu tiên ở Anh – 1933 (sử dụngrộng rãi trong lĩnh vực bao gói vào những năm 50) và sử dụng nhiều nhất trong lĩnhvực bao gói

- Mạch phân tử không có cực, không có nhóm thế nên độ bền cơ học kém,nhưng chịu được nhiệt độ thấp, không độc

- Do PE có khoảng mềm dẻo rộng, đồng thời ở nhiệt độ cao bị nóng chảychậm nên khi làm kín bằng phương pháp hàn nóng tạo ra mối ghép khá bền và kín

- PE chịu được tác động của axit hữu cơ, vô cơ (trừ loại đậm đặc khả năngoxy hóa cao), các bazơ mạnh, cồn dưới 70º , không chịu Cl2, Br2 và I2 bị hấp thụ, ítchịu cácdầu, hydrocarbon, xăng, bị phồng trong môi trương toluen,cacbontetraclorit

- PE thấm khí (O2, CO2, SO2), thấm mùi, nhưng ít thấm hơi nước

- Khả năng bám dính các vật liệu trên bề mặt kém, do đó màng PE thườngphải được xử lý bề mặt trước khi in (bằng các tác nhân oxy hoá hoặc hồ quang)

 Màng bao PP (polypropylen)

- Là sản phẩm của phản ứng trùng hợp propylen tạo polymer có tính bền cơhọc cao, khá cứng vững, không mềm dẻo như PE, không bị kéo giãn dài do đó đượcchế tạo thành sợi Đặc biệt khả năng bị xé rách dễ dàng khi có một vết cắt hoặc mộtvết thủng nhỏ

- Trong suốt, độ bền cơ học cao cho khả năng in ấn rõ nét

- Chịu được nhiệt độ cao hơn 100ºC

- Có tính chống thấm O2, hơi nước, dầu mỡ và các khí khác

Nghiên cứu của Mutegi C.K về ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến chấtlượng và sự ô nhiễm aflatoxin trong lạc ở Kenya cho thấy lạc bảo quản sau 6 thángtrong bao đay bị nhiễm aflatoxin thấp hơn lạc bảo quản trong bao polyethylen vàpolypropylene [13] Trong nghiên cứu này, đề tài dùng bao đay bảo quản như mẫu

chứng, còn loại bao bì túi PP được sử dụng để thay đổi môi trường khí quyển trongbao gói.

1.4.2 Bảo quản bằng điều biến khí quyển

Đóng gói trong môi trường khí điều biến (MAP – Modified AtmospherePackaging) là kỹ thuật mà thực phẩm chứa trong một bao gói có khí quyển trongbao gói đó đã thay đổi hoặc thay thế các thành phần: cacbon dioxit, ôxy, nitơ, hơinước và các khí lượng vết Quá trình này hạn chế hoạt động của vi sinh vật cũngnhư sinh hóa Sự điều biến này được thực hiện bằng cách bơm khí vào bao gói -không khí thoát ra và thay thế bằng hỗn hợp khí đã được kiểm soát

Việc biến đổi khí quyển có thể đạt được bằng cách chủ động hoặc bị động.Biến đổi chủ động liên quan đến việc thay thế hỗn hợp khí thích hợp và kiểm soátđược Biến đổi bị động xảy ra như kết quả của quá trình hô hấp thực phẩm và/ hoặc

sự trao đổi chất của vi sinh vật gắn liền với thực phẩm Cấu trúc của bao bì thường

là màng bao phức hợp và do đó sự thấm khí qua màng phụ thuộc vào bản chất củamàng và nhiệt độ bảo quản, đồng thời ảnh hưởng bởi thành phần của khí quyển tạonên

Trong quá trình bảo quản lạc quá trình hô hấp vẫn tiếp tục xảy ra và sinh hơinước nhờ sự có mặt của ôxy, do đó ở điều kiện môi trường không khí thông thườngchính quá trình hô hấp làm tăng nhiệt độ, độ ẩm của lạc và là điều kiện thuận lợicho nấm mốc phát triển Do vậy đề tài lựu chọn các biện pháp bảo quản đóng túi:hút chân không, thay đổi môi trường khí bằng khí nitơ

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ

- Bao bì: bao đay, túi PP

- Máy đóng gói với môi trường không khí, khí N2, máy đóng túi hút chânkhông

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL củaShimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: Bộ phận bơmdung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS

- Cột sắc ký InerSustain C18 (150mm×4,6mm, 5µm) và tiền cột

- Cột SPE - Si

- Cân phân tích Metter Toledo (thang đọc tới 0,1mg và 0,01mg)

- Cân kỹ thuật XT1200c chính xác 0,01g

- Máy cô quay chân không (Eyala)

- Bộ chiết pha rắn (Sulpelco)

- Bộ thổi khô (OA-Sys)

- Máy lắc ngang IKA MLBN001

- Máy rung siêu âm

- Dụng cụ thủy tinh: Phễu chiết 500mL, bình định mức 1000 mL, cốc có mỏ,ống đong 100 mL, ống nghiệm thủy tinh có nắp 6 ml, bình nón 250 mL và 100

mL, bình cô quay 100 mL và 250 mL, bình nút mài 500 mL, vial loại 1,8 mL

có nắp đậy

- Phễu, giấy lọc, màng lọc cỡ 0,45µm

- Pipet 1, 2, 5, 10, 50 mL; pipet pasteur, micropipet 20 - 200 µL, 100-1000

µL và đầu côn tương ứng

- Tủ sấy CE3G-2-Shellab TS04

- Chén cân sứ có nắp đậy, kẹp gắp

- Bình hút ẩm

- Máy đồng nhất mẫu Phillip, dụng cụ cắt mẫu.

n Dung môi loại tinh khiết phân tích: cloroform (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorua (Trung quốc)

- Nước cất 2 lần: loại tinh khiết phân tích

- Hỗn hợp cloroform:acetone (90:10): Dùng pipet 10mL00 hút chính xác10,00mL acetone vào bình định mức 100mL và định mức tới vạch bằngcloroform

- Hỗn hợp methanol:nước (85:15): 850 mL methanol vào bình định mức

1000 mL, thêm nước vào đến vạch định mức, lắc đều

- Dung dịch muối NaCl 1%: Cân chính xác 10,00 g muối natriclorua bằngcân kỹ thuật Thêm một ít nước cất vào để hòa tan trước, chuyển vào bình địnhmức 1000 mL Thêm nước tới vạch, rung siêu âm bằng máy rung siêu âm chohòa tan hoàn toàn

- Pha động của LC-MS/MS amoniacetat 10mM: Cân 0,77 g amoniacetat, hòatan trong nước cất và định mức thành 1000 mL bằng nước cất Lọc qua mànglọc dung môi và rung loại khí

2.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lạc nhân đã được làm khô thu hoạch vào khoảng tháng 6 năm 2014 tại tỉnhBắc Giang

- Bao bì sử dụng đóng gói: bao đay, bao PP

- Khí dùng trong đóng gói: Không khí thường, khí N2

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản

- Lạc nhân thu mua tại Bắc Giang được chọn chất lượng đồng đều.

- Mẫu lạc ban đầu được đem đi kiểm tra độ ẩm và hàm lượng aflatoxin tronglạc với số lượng 10 mẫu lạc nhân lấy ngẫu nhiên từ lô lạc thu về

- Kiểm tra độ ẩm và tình trạng nhiễm aflatoxin

- Mẫu lạc kiểm tra có nhiễm aflatoxin sẽ được loại khỏi thí nghiệm

 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong cácmẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp

- Mẫu chứng 1 là mẫu lạc nhân ban đầu mua về chưa được lựa chọn, loại tạp

và loại lạc có chất lượng kém đựng trong bao đay

- Mẫu thí nghiệm 1 là mẫu đựng trong bao đay chứa lạc nhân đã được lựachọn, loại tạp, loại những hạt có chất lượng kém (hạt mốc, hạt lép, hạt nảymầm, hạt vỡ, hạt biến màu)

- Mẫu kiểm soát đựng trong bao bì túi PP được đóng trong các điều kiện khácnhau: không khí thường, hút chân không, thay toàn bộ không khí bằng khíNitơ

- Cách thức đóng gói và lấy mẫu kiểm tra:

 đối với bao đay mỗi loại lạc sẽ được đóng trong bao đay 25kg gậpmép, khâu chéo so le; bảo quản mẫu ở điều kiện nhiệt độ thường trong

tủ đựng mẫu; mỗi lần lấy mẫu sẽ mở chỗ đường khâu để lấy bao mẫutại bên trên bao, ở giữa và đáy bao sau đó lại khâu lại để cho lần kiểmtra sau

 Đối với túi PP có kích thước 20cm×30cm, mỗi túi đóng trong túi 1kg,hàng tháng mỗi lần kiểm tra lấy 3 túi ngẫu nhiên/ 1 mẫu trong số cáctúi để kiểm tra

- Chỉ tiêu kiểm tra: độ ẩm và hàm lượng aflatoxin

- Thời gian kiểm tra: t0 – thời điểm ngay trước khi bảo quản; t1- bảo quản sau 1tháng; t2 – bảo quản 2 tháng; t3 – bảo quản 3 tháng; t4 – bảo quản 4 tháng

- Kế hoạch đóng gói với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển của mỗiloại lạc thể hiện trong bảng sau:

Bảng 2.1 Đóng gói lạc với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển thay đổi Môi trường

chọn) x x x x 0 0 0 0 0 0 0 0Túi PP x x x x x x x x x x x xGhi chú:

Tại thời điểm t0: 10 mẫu lạc nhân được lấy để kiểm tra độ ẩm và hàm lượngaflatoxin

Tại các thời điểm t1, t2, t3, t4 sẽ kiểm tra bằng cách lấy ngẫu nhiên 3 túi mỗi loại để

đi kiểm tra và lấy giá trị trung bình của kết quả kiểm tra

Tổng số mẫu mỗi loại lạc kiểm tra trong suốt quá trình thực nghiệm là: 10 +4×5=30

Mẫu lạc được mã hoá trong bảng dưới đây:

Bảng 2.2 Mã hóa mẫu lạc nhân trong các điều kiện bảo quản

Đ13

Đ14Bao đay 2 Đ2

1

Đ22

Đ23

Đ24Túi PP PP

1

PP2

PP3

PP4

PCK1

PCK2

PCK3

PCK4

PN1

PN2

PN

3 PN4

- Mẫu Đ11 là mẫu lạc không loại tạp, đóng gói và bảo quản bằng bao đaykiểm tra sau bảo quản 1 tháng

- Mẫu Đ21 là mẫu lạc được chọn lựa, đóng gói và bảo quản bằng bao đaykiểm tra sau bảo quản 1 tháng.

- PP1 là mẫu lạc được bảo quản bằng túi PP ở điều kiện không khí thườngsau 1 tháng bảo quản

- PCK1 là mẫu lạc được bảo quản bằng túi PP hút chân không sau 1 thángbảo quản

- PN1 là mẫu lạc được bảo quản bằng túi PP trong môi trường khí nitơ sau 1tháng bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bảo quản

- Phương pháp truyền thống (TT): lạc nhân đựng trong bao đay ở điều kiệnnhiệt độ và không khí thường

- Phương pháp mới: Mẫu lạc nhân được đựng trong các loại bao bì: túi PP,đóng gói bằng máy đóng gói với môi trường không khí thông thường, N2, các mẫuhút chân không được đóng gói bằng máy đóng túi hút chân không

2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm

Bảng 2.3 Phương pháp kiểm nghiệm lạc nhân

TT Chỉ tiêu Phương pháp thử Yêu cầu

kỹ thuật Tài liệu tham chiếu

≤ 8 µg/kg QCVN 8-1:2011/BYT [4]

3 Hàm lượng

AF tổng số

Phương pháp nội bộ của Viện, thiết bị LC-MS/MS [5, 21]

≤ 15 µg/kg QCVN 8-1:2011/BYT [4]

2.3.2.1 Độ ẩm

 Chuẩn bị mẫu: 15,00g hạt lạc được cắt ngang hạt lạc thành những lát có độdày <2mm, cho vào bình tam giác có nút đậy kín Cân khoảng 5,00g mẫu vào trong

chén cân có nắp rồi sấy khô đã biết trước khối lượng (m 1), xác định khối lượng chén

cân và mẫu (m 2) Cho mẫu đều lên bề mặt chén cân, mở nắp, sấy ở nhiệt độ 102o

C-107oC trong 5h Sau đó dùng kẹp gắp chén cân chứa mẫu đậy nắp, làm nguội trongbình hút ẩm trong 30 phút Cân và ghi khối lượng chính xác đến 0,001g Tiếp tục

sấy mẫu 45 phút, làm nguội cân lần 2 (m 3) Sai lệch giữa hai lần cân không quá0,001g

 Độ ẩm của lạc nhân (X) tính bằng % theo công thức:

X

Trong đó:

m1 khối lượng của chén cân (g)

m2 khối lượng của chén cân và mẫu trước khi sấy (g)

m3 khối lượng của chén cân và mẫu sau khi sấy (g)

2.3.2.2 Xác định hàm lượng aflatoxin trong lạc nhân

Mẫu lạc nhân được xác định hàm lượng aflatoxin (B1, B2, G1, G2) bằng sắc

ký lỏng khối phổ LC-MS/MS theo phương pháp nội bộ

Nguyên lý: Mẫu được chiết bằng cloroform và làm sạch trên cột chiết pha rắn

Si Aflatoxin được tách và định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ sử dụngcột pha đảo C18

Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu rắn được xay nhỏ, trộn đều: Cân chính xác

khoảng 10-20g trên cân phân tích vào bình nón 250mL

Chiết aflatoxin trong các sản phẩm nhiều chất béo: Thêm 100mL hỗn hợpmethanol : nước (85:15) vào mẫu đã được chuẩn bị ở trên, lắc đều Hỗn hợp đượclắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút trên máy lắc ngang Sau đó được lọc qua giấy lọc Lấy 40mL dịch lọc ở trên cho vào phễu chiết 500mL, thêm 40mL dung dịchNaCl 1%, sau đó thêm 25mL n-hexan vào và lắc đều để chiết loại chất béo Để yênđến khi phân lớp rồi lấy lớp dưới vào phễu chiết khác, lớp phía trên loại bỏ Lớpdưới được thêm 25mL cloroform vào và lắc đều để chiết aflatoxin, để lắng đến khiphân lớp Lấy lớp dưới, lớp trên được chiết lặp lại lần 2 với 25mL cloroform Dịch

của 2 lần chiết được gộp vào bình cất quay 100mL Sau đó được cô quay bằng máy

cô quay chân không ở 40ºC đến cạn, hòa cặn bằng khoảng 10mL diclomethan Làm sạch trên cột SPE-Si Cột được hoạt hóa bằng 3mL n-hexan, 3mLdiclomethan Mẫu được nạp qua cột với tốc độ 1 – 2 mL/phút Sau đó được rửa rạpvới 3mL n-hexan, 3mL diclomethan Chất phân tích được rửa giải ra bằng 6mL hỗnhợp cloroform – acetone (90:10) vào ống nghiệm thủy tinh

Dịch rửa giải được thổi khô đến cạn và hòa cặn bằng 1mL methanol và đượcbơm vào hệ thống LC-MS/MS

Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC): Lặp tương tự các bước như trên nhưng có thêmchuẩn aflatoxin (150ng/mL) vào mẫu trước khi chiết mẫu để xác định độ thu hồi vàloại bỏ sai số trong quá trình thực hiện thao tác

Điều kiện chạy máy sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS):

- Cột sắc ký pha đảo InertSustain C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 µm)

- Pha động: chạy theo chương trình gradient như sau:

Bảng 2.4 Chương trình gradient phân tích aflatoxin

Thời gian( phút) Tỷ lệ % MeOH Tỷlệ % Amoniacetat 10 mM

- Điều kiện khối phổ: Bảng sau mô tả điều kiện chạy đối với thiết bị MS ABI

5500 QQQ Các điều kiện khối phổ có thể khác nhau đối với các thiết bị khối phổkhác nhau, cần thực hiện tối ưu điều kiện bằng chất chuẩn aflatoxin

Bảng 2.5 Điều kiện khối phổ thiết bị MS ABI 5500 QQQ

Nguồn ion hóa Electrospray (ESI)

Năng lượng bắn phá CE = 30 eV

Ion chọn lọc

B1 : 313 –> 241, CE=41 –>269 , CE=37B2 : 315 –>259 , CE=35 –>287 , CE=43G2 : 331 ->245 , CE=39 ->285 , CE=33G1 : 329 ->243 , CE47 ->215 , CE=41

Tính toán kết quả

Với mẫu dương tính, căn cứ vào sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ,căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau

X = V x K x C m /m

Trong đó: V Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy HPLC (ml)

Cm:Nồng độ Aflatoxin trong dịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/ml) m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)

X: hàm lượng Aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g)

K: Hệ số pha loãng (nếu có)