Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm Lào (Panax SP.) và sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis HA et grushv.) với một số loài khác nhau trong chi Panax

với một số loài Sâm khác trong chi Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS.. Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN

LƯU THỊ NHƯ

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA SÂM LÀO

(PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA

ET GRUSHV.) VỚI MỘT SỔ LOÀI KHÁC TRONG CHI

PANAX

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC

• • • • Chuyên ngành:Thực vật học

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG TS HÀ MINH TÂM

Hà Nội, 2013LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình làm khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của TS Nguyễn Thị Phương Trang và TS Hà Minh Tâm Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu tại viện.

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân trong và ngoài trường Nhân dịp này, tôi xin ưân trọng cảm ơn: Ban chủ nhiêm khoa Sinh

- KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên

Lưu Thị Như

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam

đoan:

Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi Panax ” là công trình

nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Phương Trang

và TS Hà Minh Tâm Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Sinh viên

Lưu Thị Như

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

tự)

(Đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại)

trong genome lục lạp)

ISSR Internal sinple sequence repeat (vùng giữa các đoạn trình tự lặp

lại đơn giản)

Simple Sequence Repeat (ưình tự các đoạn lặp đơn giản)

DANH LUC BẢNG

trang

và Panax vỉetnamensỉs với một số loài khác trong chi Panax trên cơ sở phân tích

trình tự vùng ITS- rDNA bằng phương pháp Maximum Parsimony

SSR

Bảng

1

MỞ ĐÀU

Lý do chọn đề tài:

Sâm ngọc linh {Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv 1985) được tìm thấy ở

Việt Nam và hiện đang được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố ở miền trung

Việt Nam (vĩ độ 14°15) ở độ cao trên 1800m so với mặt biển [18] Sâm ngọc linh

được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen

[16]

Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển khai, đặc biệt

từ năm 1985, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với các nhà khoa

học Ba Lan và Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp chất Saponin, trong

đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được

công bố Khi so sánh với các nhóm sâm trồng có giá trị trên thế giới như Nhâm

sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P quỉnqueỷolỉus) và Tam thất (pnotogỉnseng) thì

thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống với 3 loài trên nhưng hàm lượng

lại cao hơn rất nhiều Điều này càng khẳng định Sâm ngọc linh là một loài độc

đáo về thành phần hóa học [17], là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng cao

Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường cây thuốc xuất hiện một loại sâm (đặc

điểm hình thái gần giống Sâm ngọc linh) có nguồn gốc từ Lào, được làm giả Sâm

ngọc linh Do mẫu vật chúng tôi thu được mới chỉ là mẫu lá và củ nên chưa đủ cơ

sở hình thái để chứng minh mối quan hệ của chúng với Sâm ngọc linh, vì vậy, để

phân tích mối quan hệ di truyền của loài sâm này với Sâm ngọc linh của Việt

Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu ‘Thân tích mối quan hệ di ữuyền của

Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vỉetnamensỉs Ha et Grushv.) với một

số loài Sâm khác ữong chi Panax”

Điểm mới của đề tài

đề tài của tôi nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được công bố trong công

trình khoa học nào, đề tài được đăng trong hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học

các trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI

Mục đích của đề tài

Đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền của cây sâm có nguồn gốc từ Lào và

Sâm ngọc linh của Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen ITS, từ đó đánh giá

mối quan hệ di truyền của chúng với một số loài sâm khác trên thế giới

Nội dung nghiên cứu

- Giải trình tự gen ITS - rDNA

- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu thu

được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài trong chi

Panax.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ỷ nghĩa khoa học:

Góp phần bổ sung vốn kiến thức về đa dạng thực vật ở cấpđộ phân tử,

chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Sâm lào

Ỷ nghĩa thực tiễn:

Đánh giá sự sai khác về mặt di truyền giữa cây sâm có nguồn gốc từ

Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1Giới thiệu về chi Sâm {Panax)

Chi Nhâm sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

Toàn bộ chi Sâm {Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới

loài (thứ -var) [23] Sự phân bố của chi Panax L trên thế giới cho thấy chúng chỉ

xuất hiện ở bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc

Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài P quinquefolius và (P

đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài p ginseng và P japonica Trung tâm phân

bố của chi Panax L có thể từ vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía

Bắc của Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân

Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam) Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới

loài) mọc hoàn toàn tự nhiên Hai loài trồng là p notogỉnseng nhập tò Bắc Mỹ và

vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó)

Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm {Panax L.) của thế giới Ở Bắc

Mỹ hiện có 3 loài (P notoginseng; p quỉnqueỷolỉus và p trỉỷolỉatus) Giới hạn cuối

cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm ngọc linh (Panax Vieừiamensis) ở

miền trung của Việt Nam, tại 14°15 vĩ độ Bắc Chính vì vậy Sâm ngọc linh được

coi là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6]

Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ, sợ

rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều và nhiệt độ

cao, sợ gió nóng Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng là 20 - 28°c Candolle, 1830,

Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm cánh, bộ nhụy có 2

hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2

- 5 hạt Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số năm

sinh trưởng [20] Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình nghiên cứu

sau này (Wen và Zimmer, 1999; Choi và Wen, 2000) [34, 39]

Hình 1: Sâm Vỉệt Nam - Panax vietnamensis (nguồn: Wikipedia.org)

1.2 Sâm ngọc lỉnh

kình thái ■

Sâm ngọc linh là cây thân thảo, sống nhiều năm Thân rễ có đường kính

3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ, đôi khi ở một số cây phàn cuối thân rễ có củ

gần hình cầu, đường kính đến 5cm Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân

Thân cao từ 40cm - lOOcm, rỗng, Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6) Lá

kép chân vịt có 5 (ít khi 6,7) lá chét, lá dài 7 - 12cm (ít khi 15cm) Lá chét trên

cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14cm, rộng 3 - 5cm, đầu lá

thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng

cưa nhỏ đều Cụm hoa dài 25cm, gấp 1 5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường

mang tán đơn độc Tán hoa chính đường kính 2.5 - 4, có 50 - 120 hoa Hoa màu

vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4mm Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có

hai ô, hai vòi (chiếm 20%) Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên

đỉnh quả Quả một hạt hình thận, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7 - 1 0 mm rộng

4-6 mm [12, 15] (Hình 2)

Sinh thái:

Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ

ban ngày từ 20 - 25°c, ban đêm 15 - 18°c, Sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm

chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm

Công dụng:

Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể

dùng lá và rễ con

Sinh học:

Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông,

thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành Từ tháng 4 đến tháng 6, cây

nở hoa và kết quả Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9 Cuối tháng

10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại 1 vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu

giai đoạn ngủ đông đến tháng 12 Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa

đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm

tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng 1 lá) mới có thể khai thác,

khuyến cáo là trên 5 tuổi [18, 20] Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần

thân rễ của sâm

Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vườn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My,

tỉnh Quảng Nam)

1.2.2 Phân bổ tự nhiên của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis)

Cho đến nay, Sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên Trung

phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có (và quan trọng nhất) là núi Ngọc

Linh Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường

Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh, Trà

Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam)

Theo Hà Thị Dụng, cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang

Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là Sâm ngọc linh [13]

Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của nó thì Sâm ngọc linh đã có mặt

ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh

và Lang Biang) Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500m Điểm phát hiện có

Sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 - 2.200IĨ1 [6, 24]

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị và thành phần hoá học của cây Sâm ngọc lỉnh

a Tầm quan trọng và giá trị

Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài của

chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi của nền

y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như Nhâm sâm (Panax

Tam thất (P notogiseng) và Sâm ngọc linh (P vỉetnamensis Ha et Grushv.) Ở Việt

Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ

cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây

thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu,

dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường

như đau bụng, cầm máu vết thương [20, 24]

Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên cứu

của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi Panax thuộc 2 nhóm

chính:

Nhóm 1 gồm các loài hiện đã được phát triển ữồng trọt gồm: Nhâm sâm (Panax

mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát ữiển và chứa các Saponin có khung thuộc

nhóm dammaran

Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như p japónicas, p zingiberensis, p

Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [17]

Tuy nhiên, hàm lượng Saponin của Sâm ngọc linh so với các loài Panax

ữồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc

biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp

chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn

mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh với nhóm sâm trồng có giá tri trên

thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P quinquefolius) và Tam thất

(p notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói

trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều [16, 17]

b Thành phần hóa học

Từ năm 1974 - 1990 Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu Nhâm

sâm việt nam, so sánh với Nhâm sâm Triều Tiên {Panax ginseng), Nhâm sâm nhật

bản (Panax japonicus) và Nhâm sâm hoa kỳ (Panax quinquefollium) [17] Kết quả

có thể tóm tắt như sau:

Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax

ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng Chi tiết hơn nữa trong Panax

saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin của axit

oleanolic Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây nhâm sâm cho

thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và lượng nhóm

saponin damarane [17]

Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được 1 lượng lớn

majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất

này đã chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao

nhất có trong các loài chi Panax Ocotillol saponin đã trở thành 1 hợp chất cần chú

ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học cho các cây Panax vì nó có thể

ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis Sự có

mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho Sâm Việt Nam khác

với Nhâm sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong

Nhâm sâm ữiều tiên Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh Nhâm sâm

việt nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so với Nhâm sâm

khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhâm

sâm triều tiên [10]

Ngoài những saponin nói trên, trong Nhâm sâm việt nam còn chứa các

polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [15]

1.2.4 Hiện trạng của loàỉ Sâm ngọc linh ở Việt Nam

Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có khoảng 5 loài, trong

đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (p.notogineng) và Nhâm sâm (P.ginseng) [1]

Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là Sâm Vũ Diệp

(p.bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (p.stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt

Sâm ngọc linh (p.vietnamensis Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp của miền Trung

Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh

Kom Tum), Huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng

núi Ngọc Linh độ cao trên 1500m Tuy nhiên hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm

ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác kiệt quệ trong nhiều năm cộng với việc đốt

nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp Hiện tại Sâm ngọc linh đã

được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai

thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày

31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo

sách đỏ Việt Nam (2007), Sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI +

2b, c, e [3] Hiện nay Sâm ngọc linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt

Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà

Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng

khoảng lOhecta [18],

Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất trong việc xác định mối

quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự ADN, bởi vật liệu di truyền là duy nhất

cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi,

điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến ADN chiết

từ lá và củ đều mang cùng thông tin di truyền ADN chiết thì ổn định và có thể giữ

ở -20°c trong thời gian dài (khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời

gian trong phân tích Chỉ sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả, đây là một

thuận lợi trong việc phân tích mẫu có giới hạn [2, 9,21],

1.4 ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang

được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa

dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích

ADN Các chỉ thị AFLP (đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại), RFLP (đa

hình các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các ADN Khuếch đại ngẫu nhiên),

SSR (trình tự các đoạn lặp đơn giản), cpSSR (trình tự lặp đơn giản), gen mã hóa

18S - RNA, hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng các

đoạn ADN hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [23, 19] Với số lượng bản sao lớn

trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR với các cặp mồi thích hợp

Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu dữ

trên 70 triệu trình tự ADN với gần 90 tỷ nucleotit Đây là nguồn dữ liệu có giá trị

trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1) số liệu về

trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho

đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự

nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa

dạng di truyền, trong nghiên cứu di ữuyền quần thể (population genetics), vì nó

bộc lộ rõ các biến đổi di ưuyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa

cha mẹ và con cái ; (3) kết quả ADN cho phép xác định chính xác loài, quần thể

cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy

hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý, ; (4) kết quả nghiên cứu

ADN không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con

người gây ra

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là

công cụ hỗ ượ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới,

giải quyết mối nghi ngờ về vị ữí phân loại, đánh giá đầy đủ về tình trạng di ữuyền,

quan hệ chủng loại và mức độ tiến hóa của nhiều loài động thực vật và vi sinh

vật Các kết quả nghiên cứu ở mức độ ADN đã và đang góp phần đánh giá tính đa

dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp

lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công

tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và

phát triển Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước

tiếp cận Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN có tính thống nhất

cao mới được thực hiện tại Viện sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật cho một số loài

động vật quý hiếm, còn với thực vật thì hầu như chưa có Hơn nữa trong thực tế,

có nhiều loài tồn tại và phân bố biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen

rất lớn mà chưa được nghiên cứu

Một số cơ sở nghiên cứu như Viện công nghệ sinh học, Viện sinh thái và

Tài nguyên sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp, Bảo

tàng Thiên nhiên Việt Nam, đã thực hiện một số nghiên cứu về đa dạng di truyền

thực vật, trên các đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan ) [13, 14,

23] cây rừng (họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh, Giổi ) [8, 22] nhưng các nghiên

cứu chủ yếu tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể phục vụ cho

nghiên cứu bảo tồn, tiến hóa và tái tạo nguồn gen

Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di

truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều

kết quả có giá trị Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã thực hiện trên gen ty

thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số loài lan Hài, đã

phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng [14] Hay nhóm tác giả của đặng Tất Thế

(2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và

phát sinh chủng loại của một số loài thú, bó sát quý hiếm của Việt Nam [27]

Nguyễn Thúy Hạnh (2006) [13] Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã

dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây vạn tuế của Việt Nam

làm cơ sở cho công tác di truyền [22]

Tuy nhiên, nghiên cứu các ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp

phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn ít

1.4.2.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Retion) được Karry Mullis và cộng sự

mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng trong sinh

học phân tử Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào

đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10"3[ig) Kỹ thuật này có độ

nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tó, chuẩn

đoán bệnh, trong di truyền quần thể và phân tích pháp lý [29],

Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc nhân bản

số lượng lớn các đoạn ADN, có thể sử dụng PCR để tách dòng đặc hiệu, giúp phát

hiện đột biến, cho phép phân tích gen từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá

trình tiến hóa ở mức độ phân tử Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại

cách đây hành chục triệu năm [30]

1.4.2.2 Đọc trình tự nucleotide

Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp

Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination

method) là một phương pháp xác định trình tự ADN được Fredermination Sanger

phát ữiển vào năm 1975 [39]

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của

enzyme ADN - polymerase trong quá trình tổng hợp ADN Enzim ADN -

polymerase xúc tác quá trình gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp

ở vị trí 3’có chứa nhóm-OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm -OH ở vị trí

3’thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng của phương pháp là sử dụng các

loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một các ngẫu nhiên

Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch đơn có kích thước

khoảng 20 nucleotit

1.4.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền

Mỗi quan hệ di ưuyền của các loài được thể hiện bằng cây

phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến

hóa giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và

khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể

Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về

cấu ữúc ADN giữa các loài Các taxon được nối với nhau

trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền Trên cây có rễ

mỗi nút bên trong cây đại diện cho một loài tổ tiên

chung Giả định nút gần nhất với rễ là loài khởi điểm, các

nút còn lại được tỏa ra từ nút này được gọi là con cháu

Mỗi một nút được gọi là đơn vị phân loại, các nút trong

cây được gọi là các đơn vị phân loại giả thiết Độ dài

của cành cây mô phỏng thời gian tiến hóa Cây không rễ là

cây không có điểm khởi đầu, do đó nó không tái dựng lịch

sử tiến hóa của các loài Cây không rễ chỉ cho biết mối

quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại Có 4 phương pháp

tạo cây bao gồm: (1) phương pháp Neighbor - Joining (NJ),

(2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương pháp

Maximum Parsimony Khoảng cách di truyền giữa các loài

cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây [37,

38]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mầu lá và củ của Sâm thu được ở Lào (tạm gọi là Sâm lào - Panax sp.)

(Mầu Sâm lào do viện Dược liệu trung ương cung cấp (hình 3)