Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào escherichiacoli và bacillus subtilis

DANH MỤC CÁC HÌN HHình 2 Cấu trúc xoắn α và gấp nếp β của keratin 4 Hình 3 Cấu tạo phân tử của keratinase 6 Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và B.subtilis 2 Hình 8

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

KERATINASE TRONG TẾ BÀO

ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO

ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420122

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn chính: TS Nguyễn Huy Hoàng

Người hướng dẫn phụ: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – Năm 2014

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Keratin 3

1.2 Keratinase 5

1.3.Một số chủng biểu hiện 8

1.3.1 Chủng chủ E coli 8

1.3.2 Chủng chủ Bacillus subtilis 10

1.4 Ứng dụng của keratinase 11

1.4.2 Ứng dụng trong công nghiệp 13

1.4.3 Đối với môi trường sinh thái 13

1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học 13

1.5 Tình hình nghiên cứu 14

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16

Phần II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Nguyên liệu 18

2.2.Phương pháp 20

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 21

2.2.2.Phản ứng PCR 22

2.2.3 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 23

2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 23

2.2.5 Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE) 24

2.2.6 Thiết kế vector biểu hiện trong E Coli 25

2.2.7 Biến nạp vào tế bào E.coli 25

2.2.8 Biểu hiện keratinase tái tổ hợp trong E.coli BL21 (DE3) 26

2.2.9 Tổ hợp gen ker bằng phương pháp Megaprimer 27

2.2.10 Thiết kế vector biểu hiện keratinase trong B.subtilis 168M 29

2.2.11 Biến nạp vector mang gen keratinase tái tổ hợp trong B.subtilis 168M 29

2.2.12 Biểu hiện keratinase tái hợp trong B.subtilis 168M 30

2.2.13 Thử hoạt tính keratinase 30

Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả tách ADN tổng số 32

3.2 Nhân gen keratinase bằng PCR 32

3.3 Biểu hiện gen keratinase trong E.coli 34

3.3.1 Tách dòng gen KerE trong vector pJET1.2 để biểu hiện trong E.coli 34

3.3.2 Kết quả phân tích trình tự gen 35

3.3.3 Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli 36

3.3.4 Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL21 38

3.4 Biểu hiện gen kerB trong tế bào B.subtilis 168M 40

3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer 40

3.4.2 Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli TOP10F’ 41

3.4.3 Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis 42

3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M 44

3.5 Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168M 46

Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

MỞ ĐẦU 4

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .7

1.1 Keratin

7

1.2 Keratinase 9

1.3 Chủng biểu hiện 13

1.3.1 Chủng chủ E coli 13

1.3.2 Chủng chủ Bacillus subtilis 14

1.4 Ứng dụng của keratinase 16

1.4.1 Ứng dụng trong nông nghiệp 16

1.4.2 Ứng dụng trong công nghiệp 18

1.4.3 Đối với môi trường sinh thái 19

1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học 19

1.5 Tình hình nghiên cứu 20

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 23

Phần II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Nguyên liệu 25

2.1.1 Mẫu vật 25

2.1.2 Các mồi 25

2.1.3 Vector tách dòng và vector biểu hiện 26

2.1.4 Chủng biểu hiện 26

2.2 Phương pháp

27

2.2.1.Sơ đồ nghiên cứu 27

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 28

2.2.3.Phản ứng PCR 28

2.2.4 Thôi gel tinh sạch DNA 30

2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 31

2.2.6 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 31

2.2.7 Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE) 32

2.2.8 Biểu hiện gen mã hóa keratinase ở E.coli BL21 (DE3) 33

2.2.9 Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong B.subtilis 168M 36

2.2.10 Thử hoạt tính keratinase 40

Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .42

3.1 Kết quả tách ADN tổng số 42

3.2 Nhân gen keratinase bằng PCR 42

3.3 Biểu hiện gen keratinase trong E.coli 44

3.3.1 Tách dòng gen KerE trong vector pJET1.2 để biểu hiện trong E.coli 44

3.3.2 Kết quả phân tích trình tự gen 46

3.3.3.Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli 47

3.3.4 Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL21 48

3.4 Biểu hiện gen kerB trong tế bào B.subtilis 168M 51

3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer 51

3.4.2 Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli TOP10 53

3.4.3 Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis 54

3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M 55

3.5 Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168M 58

Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .61

4.1 Kết luận 61

4.2 Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO .62

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng – Phó

viện trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, là ngườithầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ

và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thànhluận văn

Em xin chân thành cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân – cô giáo đã

tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảotận tình của các cán bộ Phòng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen Đặc

biệt là Th.S Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và tiến

hành thí nghiệm

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy tạiKhoa Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN đã truyền đạt cho

em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua

Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết

ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống

và công việc để em có được kết quả này

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 08 năm 2014

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

B.subtilis Bacillus subtilis

bp Base pair(c

DNA Deoxyribonucleic axcid

E.coli Escherichia coli

EtBr Dung d Ethidium Bromide

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 Thành phần một phản ứng PCR 23Bảng 3 Thành phần gel cô 5% và gel tách 10% polyacrymide 25Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme XhoI và BamHI 26Bảng 5 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR1a 29Bảng 6 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR2 30Bảng 7 Hoạt tính của keratinase từ các chủng nghiên cứu 48

DANH MỤC CÁC HÌN H

Hình 2 Cấu trúc xoắn α và gấp nếp β của keratin 4

Hình 3 Cấu tạo phân tử của keratinase 6

Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và

B.subtilis

2

Hình 8 Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker và promoter của gen

α-amylase của chủng B subtilis 168M bằng phương

kiểm tra bằng SmaI và KpnI

Hinh 18 Kết quả kiểm tra hoạt tính các tế bào B subtilis

168M tái tổ hợp mang vector tái tổ hợppHT43[Bspr.Ker]

4

Hình 19 Điện di dịch enzyme thô trên gel SDS-PGE 47

và sản xuất keratinase.

Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc

phức tạp trong lông, tóc, móng, sừng Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase làthành viên của nhóm protease serine

Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn,

vi khuẩn Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase, hoạt tính keratinase

cao đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus và Streptomyces Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng B licheniformis và B.

subtilis là thành viên của nhóm protease serine [5] Đây là nhóm enzyme thương

mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin, các từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da

Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng tấn lông gà trong tự nhiên, điều này gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường Trong khi đó, lông gà chiếm khoảng 90% là keratin [9], việc thủy phân keratin đem lại được những ứng dụng to lớn, có thể làm phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như serine, cystein và proline, đặc biệt là tạo ra thức ăn chăn nuôi [50] Tuy nhiên, nếu xử lý lông vũ bằng các loại hóa chất như những

phương pháp trước đây sẽ làm mất hàm lượng axit amin của thức ăn và rất tốn kém Trong khi đó, nếu sử dụng keratinase trong quá trình thủy phân lông

vũ để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ không làm mất hàm lượng dinh dưỡng của

nó mà giá thành rẻ [38] và làm giảm ô nhiễm môi trường.

Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn,

vi khuẩn Trong đó, nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao, hoạt tính

keratinase đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ chi Bacillus và

StreptomycesNhận thấy tầm quan trọng của keratinase trong các ngành công nghiệp

nên keratinase đã được biết đế Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp keratinase từ các chủng hoang dại còn hạn chế, hoạt tính của enzyme thấp và thường lẫn tạp chất Do

đó Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của keratinase trong ứng dụng công nghiệp thì trọng tâm là nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua tách dòng Mặt khác gen và biểu hiện gen Trên thế giới đã có rất nhiều

nghiên cứu tách dòng và hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men trong hệ biểu hiện E c oli, B s ubtilis hoặc P p astoris đểkhám phá một hệ thống biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase , gen từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis được thể hiện trong Escherichia coli , Bacillus subtilis , và Pichia pastoriỞ Việt Nam hiện nay việc nghiên cứu keratinase còn hạn chế,

chưa có cơ sở nào sản xuất keraitnase ở quy mô công nghiệp Vì vậy Do đó với mục đích tìm ra được chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh karatinase cao để có thể đưa vào sản xuất với qui mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào Escherichia

coli và Bacillus”.

 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu Tạo tạo chủng tái vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh keratinase cao , nhanh và sạch nhằm ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp

- Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại

- Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B.subtilis.

- Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B.subtilis.

- Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại . Thử hoạt tính của keratinase tái tổ hợp

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Keratin

Keratin là một hợp chất sừng, thành phần chính trong da, tóc, lông, móng tay, móng guốc, sừng, răng và len (Hình 1) Đây là protein có cấu trúc bền vững, khó hòa tan, chứa một lượng lớn sulfua, các axit amin, đặc biệt là cystein (chiếm 24%), ngoài ra có các axit amin khác như: glycin, alanin, serin

và valin Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin còn có hàm lượng lớn lưu huỳnh trong cystein Chính các cystein có thể tạo thành cầu disulfide Những cầu nối này được tạo từ các nguyên tử lưu huỳnh liên kết với nhau, do đó nó không dễ dàng hòa tan, không dễ dàng bị phân hủy bởi các enzyme thông thường như: trypsin, pepsin, và papain… Tùy thuộc số lượng liên kết cysteine disulfide chứa trong keratin, có thể chia thành 2 loại: keratin cứng được tìm thấy trong móng guốc và keratin mềm tìm thấy trong mô linh hoạt như tóc và da (Hình 1).

Hình 1 Một số sản phẩm chứa keratin

Keratin chiếm khoảng 30% phần biểu bì của các tế bào sống và 85% protein của các tế bào chết (lớp vảy hoặc sừng đã chết ở bên ngoài da) Trong

tóc, keratin chiếm 65-95% và ở lông vũ chiếm gần 90% theo trọng lượng Mỗi

phân tử keratin là rất nhỏ khoảng 10 nm, chúng liên kết với nhau qua cầu disulfide, hydrogen với các muối cũng như các liên kết khác Từ các sợi keratin

có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn đã được ép thành các bó keratin lớn hơn

Keratin có 2 dạng cấu trúc xoắn α và gấp nếp β [50], α-keratin chủ yếu được tìm thấy trong động vật có vú còn β-keratin tạo thành các chuỗi polypeptide dạng mảnh có chủ yếu trong da các loài bò sát và các loài chim Cấu trúc của α và β-keratin trong tóc và lông có thể thấy khi chiếu xạ tia bằng tia X

Anpha- keratin (α-keratin): có Trong trong tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng tay, móng chân, và móng guốc của động vật có vú Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng liên kết hydro

.BB eta keratin (β-keratin): Có Trong trong móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim

và nhím, được hình thành chủ yếu trong các tấm β Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc α do các tấm β được nối với nhau bằng các cầu nối disulfide (Hình 2).

Hình 2 Cấu trúc xoắn α và gấp nếp β của keratin

Dựa vào số lượng sulfur, keratin có thể được chia thành 2 dạng keratin

“mềm” và keratin “cứng” [45]. Keratin mềm có thể tìm thấy trong da, có ít cầu nối disulfur và mềm dẻo hơn và có thể dễ dàng phá vỡ còn keratin cứng tìm thấy ở lông vũ, tóc, móng guốc, có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra, keratin cứng không hòa tan trong nước, và khó phân hủy hơn Trong tóc chủ yếu được cấu tạo bởi keratin cứng Keratin tồn tại phổ biến nhất hiện nay trong da động vật, sừng, tóc, lông với thành phần là các amino acidaxit

amin như: glutamic, lysine, cysteine, alanine và tyrosin e đây hầu hết là những amino acidaxit amin cần thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được, đóng vai trò

quan trọng trong việc duy trì và phát triển cơ thể Mặc dù rất khó phân hủy bởi những enzyme thông thường nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các protease – keratinase.

Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959 [28], tuy nhiên cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều Việc giảm cầu nối disulfur có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hủy keratin [9],[40] [10, 47] Keratinase là enzymee, có khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan Các keratinase tham gia thủy phân các chất thải keratin từ lông vũ trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, phân bón, các polymer và các amino acidaxit amin hiếm như serine, cysteine và proline.

1.2 Keratinase

Keratinase thuộc nhóm các protease kiềm có khả năng hoạt động mạnh trên keratin không hòa tan Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân cấu trúc phức tạp của keratin có trong lông vũ, tóc, lông cừu, collagen và casein, trong việc loại bỏ các rác tắc nghẽn trong các hệ thống xử lý nước thải Keratinase ở vi sinh vật chủ yếu enzyme ngoại bào khi sinh trưởng trên môi trường có chứa cơ chất keratin và đôi khi cũng có keratinase nội bào, chúng giúp cho enzyme thủy phân cầu disulfitde, sulfite hoặc thiosulfate có trong các cơ chất Keratinase ngoại bào thủy phân cấu trúc keratin trong sừng, lông, móng bằng cách giảm các cầu disulfide của keratin, quá trình này có sự hiện diện của các chất khử như natri sulfite, DTT (dithiothreitol), mercaptoethanol, glutathione, cysteine và thioglycolate

Keratinase được tạo ra từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau vi khuẩn,

xạ khuẩn và nấm Các enzyme này được tạo ra trong quá trình phân hủy các

cơ chất như keratin trong tóc, lông, sừng, … Các đặc tính về hóa sinh và lý

sinh của keratinase là rất đa dạng Phần lớn keratinase hoạt động ở điều kiện tối ưu là pH trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 30 0 C đến 60 0 C Hơn nữa kerainase có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học và các lĩnh vực y sinh học, được ứng dụng trong các hệ thống nước thải, thực phẩm, dệt may, dược phẩm, mỹ phẩm, keratinase cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp thuộc da trong quá trình tẩy lông của da động vật thay vì xử lý chúng với sodium sulfide Ngoài ra, sử dụng keratinase trong sinh khối sinh học có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi năng lượng và tái sử dụng các nhiên liệu.

Keratinase là enzyme thương mại do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với protease kiềm (Hình 3) và nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như

ức chế protease serine [5] Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động từ 18 đến 35 kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ hoặc lớn hơn 90 kDa đối với protease serine có khối lượng lớn.

Hình 3: Cấu tạo phân tử của enzyme Keratinase

Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn,

trong đó Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều chủng B licheniformis và

B subtilis được mô tả có khả năng thủy phân keratin, những loài khác như B pumilus và B cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase Sinh tổng hợp

keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ khuẩn, chủ yếu là từ các chi

Streptomyces Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các vùng đất khác nhau, có

khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và lông.

Tính chất:

Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:

Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm đứt liên kết của vòng xoắn Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất keratin trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn Khi đó protein keratin mang đầy đủ các tính chất của protein tan như là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân và phản ứng màu đặc trưng Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (S-S), làm suy giảm các protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein khác

pH và nhiệt độ:

Keratinase hoạt động được ở nhiệt độ từ 30 o C - 80 o C nhưng nhiệt độ tối ưu là: 50 o C và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20 o C [60] Keratinase bền vững trong khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [51].;

Chất kìm hãm:

Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase [ 51 ] Chất nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sự tổng hợp keratinase.[51]. Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặng hoá trị hai như: Cu 2+ , Ag 2+ , Hg 2+ và Pb 2+ thì cũng làm ức chế sự hoạt động của keratinase Một số hoá chất khác cũng ức chế phản ứng enzyme keratinase như: EDTA,…[30]

Chất hoạt hoá:

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại hoá trị hai như: Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ thì kích thích sự hoạt động của keratinase.[30].

Đặc tính hóa sinh của keratinase

Các đặc tính của enzyme được tạo ra từ vi khuẩn là rất đa dạng, tùy thuộc vào loại vi sinh vật sản xuất ra keratinase Các enzyme này chủ yếu là enzyme ngoại bào được tiết ra từ vi sinh vật Phần lớn các keratinase được tiết ra từ vi khuẩn có pH là kiềm hoặc trung tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0 Tuy nhiên, một số keratinase khác được tối ưu hoạt động ngoài phạm vi này, pH hoạt động ở kiềm hóa [10] hoặc pH là axít [21],[41][50, 51] Một số keratinase ổn định trên một khoảng pH rộng., Ví dụ như keratinase của chủng Nocardiopsis TOA-1,

được ổn định trong khoảng pH từ 1,5-12, trong 24h ở 30°C [37]

Trọng lượng phân tử keratinase đã được xác định Mặc

dù trọng lượng phân tử các enzyme từ 18 kDa [43] đến 240 kDa [13] , [11] nhưng đa số keratinase có trọng lượng phân

tử thấp hơn 50 kDa Phần lớn các keratinase là các đơn enzyme, tuy nhiên phân lớp đa enzyme cũng đã được ghi nhận [18], [52] Keratinase có trọng lượng phân tử cao thường kết hợp với các keratinase có đặc tính của metalloprotease hoặc chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã và đang được nghiên cứu Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [24] cho thấy các ion kim loại hóa trị 2 như Ca 2+ , Mg 2+ và Mn 2+ có xu hướng kích thích hoạt tính enzyme keratinase Ảnh hưởng này có thể liên quan tới việc duy trì hoạt tính của enzyme và tạo ra sự ổn định phức hợp giữa cơ chất và enzyme Ngoài ra các ion kim loại có thể bảo vệ cho enzyme chống lại biến tính

về nhiệt độ [6],[40][7, 48] Ngược lại, sự chuyển trạng thái và các kim loại nặng

khác như Cu 2+ , Ag + , Hg 2+ và Pb 2+ là nguyên nhân của sự bất hoạt các enzyme keratinase Các keratinase thường ổn định trong sự hiện diện của dung môi hữu cơ như DMSO, Triton X-100.

1.3.Một số chủng biểu hiện

1.3.1 Chủng chủ E coli

E coli là vi khuẩn Gram âm, có thể hiếu khí hoặc kị khí, không sinh bào

tử Chúng có bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ

cấp chỉ là một nhiễm sắc thể đơn với khoảng 5 triệu cặp bazơ Tế bào E coli có

khả năng sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy đơn giản, trung

bình 20 phút chúng lại phân chia một lần Đặc biệt, E coli có khả năng thu

nhận rất nhiều yếu tố di truyền từ môi trường ngoài như plasmid, phage với khả năng sao chép DNA rất lớn Chính vì vậy, chúng đã được cải biến để sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng cùng như biểu hiện

gen, có rất nhiều chủng được sử dụng như: E coli BL21(DE3), E coli DH5

Hình 4 Vi khuẩn E.coli Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn lựa chủng E coli BL21 (DE3) làm chủng chủ để biểu hiện Chủng biểu hiện E coli BL21 (DE3) là chủng đột biến, chứa đột biến Ion protease (một protease nội bào) và ompT protease (một

protease ngoại bào) nên hạn chế khả năng thủy phân protein Ngoài ra trong

hệ gen của chủng E coli BL21 (DE3) có chứa gen mã hóa T7 RNA polymerase,

[18] đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E.

coli BL21 (DE3) đặt dưới sự điều khiển promoter lac cảm ứng với IPTG T7

RNA polymerase rất đặc hiệu với promoter của phage T7 nên có khả năng phiên mã bất kỳ trình tự DNA nào nằm dưới sự điều khiển promoter T7 Đây còn là enzyme hoạt động mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần so với

các RNA polymerase khác có nguồn gốc từ E coli Do đó, sự có mặt T7 RNA

polymerase giúp tổng hợp một lượng lớn protein ngoại lai dưới sự điều khiển của promoter T7. Khi biểu hiện trong E coli là các protein sinh ra có xu hướng

tạo thành thể vùi không hòa tan, do nguyên nhân là E coli không có khả năng

thực hiện các biến đổi sau dịch mã (ví dụ như glycosyl hóa) nên ảnh hưởng đến

sự cuộn gấp, tính bền hoặc hoạt tính sinh học.

Ngoài ra, việc biểu hiện trong E.coli tồn tại một bất lợi, đó là sản phẩm

thường lẫn độc tố, và để loại bỏ hoàn toàn những độc tố này cần phải qua nhiều bước tinh chế rất khó khăn và tốn kém Do đó cần có những hệ thống biểu hiện khác không tạo ra độc tố để biểu hiện và thu nhận được protein dễ

dàng hơn với chi phí thấp Vi khuẩn B.subtilis là một trong những đối tượng

cho tiềm năng trên.

1.3.2 Chủng chủ Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, hình que thuộc chi Bacillus, có

khả năng tạo bào tử và có khả năng chịu đựng trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt (Hình 5) Toàn bộ bộ gen của B subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997 Tế bào vi khuẩn B subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một

nhiễm sắc thể tròn Kích thước tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp Khoảng 87% bộ gen (bao gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein Trong 4.100 gen thì có

192 gen được cho là không thể thiếu và 79 gen được cho là cần thiết cho các

quá trình sống của B subtilis Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào quá trình

trao đổi chất

Hình 5 Vi khuẩn B subtilis

Trong các điều kiện môi trường không thuận lợi, vi khuẩn B subtilis

hình thành nội bào tử Nội bào tử ở trung tâm có kích thước 0,5-0,8 X 0,4 µm.

Sự hình thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất Đầu tiên, nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là

tế bào mẹ Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử Khi hình thành vách ngăn, 30%

số nhiễm sắc thể đã nằm bên trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE Trước giai đoạn hình thành bào tử các tế bào vi khuẩn có thể tự tạo

ra chất đề kháng (kháng sinh) hoặc giết chết đồng loại để tìm kiếm chất dinh dưỡng

Thành tế bào của vi khuẩn là một cấu trúc cứng nhắc bên ngoài tế bào.

Nó bao gồm peptidoglycan, là một polymer của đường và amino axit Các peptidoglycan được tìm thấy trong vi khuẩn được gọi là murein Các thành phần khác kéo dài từ murein là axit teichoic, axit lipoteichoic, và protein Thành tế bào tạo thành rào cản giữa môi trường và tế bào vi khuẩn Do đó

B.subtilis có tính ổn định cao trong điều kiện môi trường khắc nghiệt Ngoài ra,

vật chủ này mang một số đặc điểm nổi bật khác như là: hoạt tính protease thấp, các plasmid tương đối bền về cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân bào, khả

năng sinh trưởng trên nhiều loại cơ chất khác nhau Đặc biệt B.subtilis là sinh

vật không gây bệnh và có khả năng tiết ra các protein ngoại bào với chức năng

trực tiếp vào môi trường nuôi cấy Chính những điều này làm cho B.subtilis làứng viên sángđược sử dụng nhiều giá để nghiên cứu biểu hiện protein ngoại lai 1.4 Ứng dụng của keratinase

Keratinase từ vi sinh vật đã được đặc biệt chú ý trong thập niên gần đây do nhiều ứng dụng của enzyme này trong các ngành công nghiệp như trong thực phẩm, nông nghiệp, chất tẩy rửa, thuộc da và các ngành công nghiệp dược phẩm Hiện nay, ứng dụng hứa hẹn nhất của keratinase từ vi sinh vật là sản xuất các chất dinh dưỡng với chi phí thấp hơn mà mang lại hiệu quả tốt với môi trường giàu lông vũ cho gia cầm

1.4.1 Ứng dụng trong nông nghiệp

* Sản xuất thức ăn chăn nuôi

Trong lông vũ có hơn 90% là protein, thành phần chính là β-keratin không hòa tan do chứa nhiều liên kết hydro, cầu disulfide và kỵ nước Do tính chất không hòa tan này, lông vũ kháng lại được sự thủy phân của protease thông thường như trypsin, pepsin và papain Tuy nhiên, lông vũ đã được xử lý

ở nhiệt độ và áp suất cao để tạo thành các sản phẩm giàu dinh dưỡng, sử dụng

bổ sung thức ăn chăn nuôi trong dưới hình thức chế phẩm dạng bột Việc xử lý bằng nhiệt gây tốn kém về chi phí và còn phá hủy một số axit amin thiết yếu là methionin, lysin và tryptophan, dẫn đến sản phẩm bị giảm về hiệu năng và chất lượng chất dinh dưỡng Khắc phục những nhược điểm đó thì sử dụng keratinase để tạo thành thành thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng Thức ăn từ lông vũ là tương đối rẻ tiền và còn tốt hơn bột đậu tương bởi tổng số axit amin chứa trong đó như cystein, valin và threonin cao và chúng có thể thay thế thức

ăn đậu tương ở mức 7% [4] Dịch thủy phân từ lông vũ giàu protein cũng có thể được sử dụng cho nông nghiệp như là phân hữu cơ giàu nitơ Việc sử dụng phân bón giàu nitơ hữu cơ phục vụ hai mục đích cải thiện tăng trưởng thực vật

và tăng cường hoạt động của vi sinh vật trong đất Trong khi đó thức ăn từ lông vũ giàu đạm sẽ là nguồn thay thế tiềm năng cho phân bón hóa học

* Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc

Khi bổ sung các vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn vào các loại thức ăn thì làm cho thức ăn của gia súc bảo quản được lâu hơn, khi gia súc ăn

sẽ dễ tiêu hoá hơn [3] [21][3, 24] Trong công nghiệp, phế liệu lông được biến đổi thành bột lông bằng cách sử dụng nhiệt độ và áp suất cao Tuy nhiên sử dụng bột lông đã thuỷ phân để thay thế protein có một số giới hạn Khi thêm 6% bột lông đã thuỷ phân vào bữa ăn của gà con làm giảm trọng lượng cơ thể của chúng Nhưng nếu sử dụng thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm [2]

Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng feather lysate, được cân bằng với một số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein tới 7% trong khẩu phần Trong các nghiên cứu khác, bột lông thương mại được ủ qua đêm với Keratinase keratinase để tạo ra một phần bột lông thuỷ phân Khả năng tiêu hoá amino acid axit amin của bột lông thủy phân với

Kkeratinase ở gà trưởng thành là 82% cao hơn so với bột lông thủy phân thương mại, là 60% Vậy có thể kết luận rằngDo vậy, keratinase có khả năng thuỷ phân và biến đổi bột lông vũ thành nguồn protein có thể tiêu hoá ở mức tối đa là 7% protein khẩu phần trong thức ăn [4].

1.4.2 Ứng dụng trong công nghiệp

Công nghệ thuộc da và chất tẩy rửa

Enzyme thủy phân protein đã có mặt ở thành phần chất tẩy rửa từ thời

cổ đại Trong thực tế, khoảng 89% chất tẩy rửa là các protease kiềm Tuy nhiên luôn cần nghiên cứu để đưa ra các enzyme mới để mở rộng phạm vi chất tẩy rửa có sử dụng enzyme Keratinase có khả năng liên kết và thủy phân các hợp chất rắn cấu tạo giống như lông vũ Đây là một đặc tính quan trọng của

enzyme làm cho chúng hấp phụ các chất phụ gia có trong các chất tẩy rửa bề mặt cứng, có thể loại bỏ các loại vết bẩn thường gặp trong giặt ủi, chẳng hạn như vòng cổ áo, cổ tay của áo sơ mi

1.4.3 Đối với môi trường sinh thái

Hiện nay, với sự phát triển của ngành chế biến gia cầm, đã kéo theo một lượng lớn rác thải lông vũ từ các khu giết mổ và trang trại chăn nuôi Nếu không được xử lý thì lượng rác thải này sẽ gây ra những mùi hôi thối từ khí

H 2 S làm ảnh hưởng đến cuộc sống của con người và môi trường sống Chúng

ta có thể bổ sung các chủng vi khuẩn đã được phân lập tuyển chọn vào các đống rác ủ để các chủng vi khuẩn này phân huỷ các hợp chất khó tiêu huỷ như lông vũ Đây là ý nghĩa rất quan trọng giúp môi trường được trong sạch và giảm thiểu sự ô nhiễm một cách cần thiết.

1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học

Prion là các hạt proteinaceous thường là nguyên nhân gây tử vong cho bệnh nhân mắc thoái hóa thần kinh được gọi là xốp truyền nhiễm encephalopathies (TSE) mà bao gồm bệnh bò điên và bệnh Creutzfeld-Jakob Shih và cộng sự đã chỉ ra rằng keratinase có khả năng làm giảm prion từ mô não của loài bò xốp não (BSE) do bị nhiễm từ động vật. [35]

Các peptide có hoạt tính sinh học từ keratin có chứa trong các vật liệu như len, da, tóc và lông là một trong những thành phần của thực phẩm chức năng

có giá rẻ và phong phú từ các nguồn tự nhiên Các chuỗi axit amin giàu prolin

có hoạt tính sinh học được dùng để phòng chống các bệnh cho con người bao gồm: ngăn chặn sự hình thành khối u, kiểm soát tăng huyết áp và bệnh Alzheimer [21].

1.5 Tình hình nghiên cứu

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Keratinase đã được nghiên cứu từ những năm 90, là một dạng protease rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật Vi sinh vật tổng hợp keratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí khác nhau, từ đất Nam Cực đến suối nước nóng, ở điều kiện môi trường hiếu khí và kỵ khí Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự

đa dạng rất lớn về đặc tính hóa sinh và lý sinh .[53]

Đến nay, các keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi

khuẩn, trong đó Bacillus spp được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều chủng B.

licheniformis và B subtilis được mô tả có khả năng thủy phân keratin [10],[13],

[45],[41], [11], [15], [70], những loài khác như B pumilus và B cereus cũng có

khả năng tổng hợp keratinase [29], [20] [33], [66], [34], [24] Sinh tổng hợp

keratinase cũng được nghiên cứu ở Actinomycetes, chủ yếu là từ chi

Streptomyces Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các vùng đất khác nhau, có

khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và lông Gushterova và cộng sự [22] đã phân lập hai chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có hoạt

tính thủy phân keratin cao là Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A Các loài chịu nhiệt như Streptomyces gulbarguensis [47],

Streptomyces thermoviolaceus [14] và Streptomyces thermonitrificans [38] cũng

đã được phân lập từ đất Ngoài những chủng ưa nhiệt, một số Streptomyces kém bền nhiệt đã được phân lập như Streptomyces pactum DSM 40.530 [52],

Streptomyces graminofaciens [48] và Streptomyces albidoflavus K1-02 [43]

Ngoài các chủng thuộc Bacillus spp và Actinomycetes, một số chủng vi

khuẩn có khả năng thủy phân keratin diễn ra ở nhiệt độ cao, pH và kiềm nhiệt

hóa đã được công bố Fervidobacterium pennavorans [20], Fervidobacterium

islandicum [41], Meiothermus ruber H328 [38], Clostridium sporogenes [30] và

các chủng Thermoanaerobacter sp [49] được phân lập từ các môi trường khắc

nghiệt như suối nước nóng, lỗ thông hơi nhiệt, và khu vực núi lửa Một số vi

sinh vật hoạt động ở môi trường kiềm như Nesternkonia sp [21] và

Nocardiopsis sp TOA-1 [39] cũng có khả năng thuỷ phân keratin Ngoài ra, các

loài khác nhau của cùng một chi (chẳng hạn, Bacillus) có thể tạo ra các

keratinase khác nhau [53] Chính vì vậy, khai thác đa dạng vi sinh vật sẽ cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với từng công việc cụ thể

Hiện nay trên thế giới, các kết quả nghiên cứu về keratinase cho thấy nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân lông vũ, chẳng hạn

các chủng thuộc các nhóm Bacillus, Chryseobacterium, Actinomycetes, Vibrio [34] [36][37, 39][70, 72][70, 72][70, 72][70, 72] [70, 72][70, 72][70, 72][70, 72]

[70, 72][70, 72][70, 72][71, 73][72, 74][72, 74][72, 74][72, 74][73, 75][73, 75][73,75][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][73, 75][73,

75][73, 75][73, 75][75][75][74][74][75][74][73][74][73] và nấm [17][19, 20] [18]

[19] [18, 19, 20] Sử dụng vi sinh vật và keratinase nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm dinh dưỡng từ bột lông vũ đã và đang được quan tâm Bột lông vũ

thủy phân bằng Bacillus licheniformis có bổ sung axit amin làm thức ăn cho gà

đã tạo ra sự tăng trưởng của gà tương tự như gà sử dụng nguồn thức ăn ở đậu

tương [22] Sử dụng keratinase thô từ chủng Bacillus licheniformis làm tăng

khả năng phân giải nguồn lông vũ thô cũng như là bột lông vũ Enzyme thủy phân này sẽ làm tăng khả năng tiêu hóa lông vũ tới 82% và có thể thay thế tới 7% protein ăn cho gà [21]

Một số nghiên cứu đã chứng minh được rằng vi sinh vật thủy phân keratin có thể tồn tại trong lông, móng, guốc Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này đã làm tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường Đặc biệt keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong công nghệ sinh học liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chăn nuôi [24]

Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành các axit amin, các peptide hòa tan sẽ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Các dạng phân hữu cơ này có thể được bón qua lá với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng làm tăng quá trình phát triển của cây, giảm được lượng phân bón hoá học vào đất và có khả năng tăng chất lượng cho sản phẩm Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần.

Ngoài ra, do nhu cầu sử dụng keratinase ngày càng cao nên các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào phân lập gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp Một số nghiên cứu đã được phân lập và biểu hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram

dương (Bacillus sp.) và xạ khuẩn (Nocardiopsis sp.) [3] hay phân lập gen và biểu hiện gen từ P.aeruginosa trong một hệ thống biểu hiện E coli [54] Gần

đây nhất, một số nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành biểu hiện gen từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis trong hệ biểu hiện E c oli, B s ubtilis và P p astoris để khám

phá một hệ thống biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase , gen từ vi khuẩn Bacillus

licheniformis được thể hiện trong Escherichia coli , Bacillus subtilis , và Pichia pastoris[35]

Như vậy, Keratinase keratinase đã được sản xuất và bán trên thị trường với nhiều mục đích khác nhau Sinh tổng hợp keratinase thường được cảm ứng bởi keratin [15], [7], [14], [23] Do đó, cơ chất keratin (lông gà, bột lông, tóc) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Hợp chất giàu keratin được tạo

từ ngành công nghiệp chăn nuôi, chế biến và thường bị loại bỏ như là chất thải.

Vì vậy, nhờ kỹ thuật vi sinh vật học các sản phẩm có giá trị (Keratinase, sinh khối vi sinh vật, bột đạm thủy phân) sẽ được tạo thành từ các nguyên liệu có giá trị thấp [22], [12], [17].

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Công nghệ sinh học đang được coi là hướng đi phát triển mũi nhọn của đất nước, trong đó có sự chú trọng đầu tư cho công nghệ enzyme, đặc biệt là enzyme tái tổ hợp Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu rộng

rãi như protease, lipase, amylase và được sản xuất với qui mô lớn Bên cạnh đó,

keratinase cũng thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu, do những ứng dụng loại enzyme này mang lại Tuy nhiên các nghiên cứu keratinase trong thủy phân lông vũ, cũng như các ứng dụng sử dụng nguồn lông vũ phế thải ở Việt Nam vẫn chưa nhiều Năm 1993, Văn Thị Hạnh cùng cộng sự [2] đã nghiên cứu tạo đạm hòa tan từ lông vũ phế thải bằng phương pháp thủy phân kiềm Nguyễn Đình Quyến và cộng sự 2001 [4], đã tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin Nghiên cứu này mới tiến hành đánh giá phân loại chủng vi khuẩn ở mức độ đơn giản về hình thái, chưa có đánh giá phân loại ở mức độ hóa sinh cũng như sinh học phân tử Kếtquả của đề tài đã nghiệm thu tháng 12/2010 đạt loại A enzyme Mặt khác, ở Việt Nam hiện nay chưa có cơ sở nào nghiên cứu về sản xuất keratinase với qui mô công nghiệp. Các nghiên cứu sản xuất bột lông vũ đều sử dụng hóa chất axit hoặckiềm đều cho ra những sản phẩm kém chất lượng ngoài ra các hóa chất này còn ảnhhưởng không nhỏ đến môi trường và cách phối trộn vào thức ăn cho gia súc, giacầm và thủy hải sản Các nghiên cứu mới dừng lại ở mức điều tra đánh giá và phânloại chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lông vũ nhưng vẫn chưa có hệ thống vàchưa đưa vào ứng dụng trong thực tiễn Do đó để có thể đẩy mạnh hướng nghiêncứu sản xuất keratinase ở quy mô công nghiệp, đầu tiên chúng tôi sẽ tiến hành Tiếpnối các nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tàinhiệm vụ: “Nghiên cứu sự biểu

hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào E.coli và Bacillus” Chúng tôi mong

muốn sẽ lựa chọn được chủng tái tổ hợp có khả năng sinh Kkeratinase cao, góp phần vào qui trình sản xuất keratinase theo qui mô công nghiêp.

Phần II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu

Một số c C hủng vi khuẩn

Chủng Bacillus sp DNd 1.2 phân lập từ lò mổ được xác định có hoạt tính

keratinase trong bộ chủng giống Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên

cứu hệ gen Các chủng vi khuẩn vật chọn dòng và chủ biểu hiện: E.coli TOP10F’, BL21 (DE3); Bacillus subtilis 168M.

Vector tách dòng và vector biểu hiện

- Vector tách dòng: vector pJET1.2/blunt và vector pZT57RT được dùng để tách dòng sản phẩm PCR nằm trong bộ kit “CloneJET™ PCR Cloning Kit” (Thermo Scientific).

- Vector biểu hiện trong E.coli: Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector

pET của hãng Novagen Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng

và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E coli Vector

pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen

(Hình 6)

- Vector biểu hiện trong B.subtilis: Vector pHT43 thuộc hệ vector pHT mua

của hãng Mobitec (CHLB Đức) được thiết kế chuyên để biểu hiện trong tế bào

Bacillus subtilis (Hình 6).

Hình 6 Vector biểu hiện

* Hóa chất

Dream Taq Polymerase (Thermo scientific, Mỹ), dNTPs (Thermo scientific, Mỹ), các enzyme giới hạn (NEB, Mỹ) Các cặp mồi được cung cấp bởi IDT, Mỹ Enzyme giới han hạn BamHI, NcoI của Thermo scientific, Mỹ,

LB medium,, Tris/HCl, (Sigma).

Thành phần môi trường khoáng (g/L): MgSO4.7H2O 0,25; FeCl3.6H2O 0,14;CaCl2.2H2O 0,1; MnSO4.4H2O 0,01; ZnSO4.7H2O 0,001; Na citrat 1; dung dịch vilượng 2 mL; K2HPO4 3; KH2PO4 1,5; (NH4)2SO4 5; Tryptophan 0,8; Glucose 6,5