Phân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit

Phân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfitPhân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit Phân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit Phân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit Phân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit Phân lập nấm fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng (zingiber officinale roscoe) và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit

MỤC LỤC

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 2 TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GỪNG 2

2.1.1 Nguồn gốc của cây gừng 2

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng 3

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ gừng trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.4 Các bệnh sau thu hoạch ở gừng và biện pháp bảo quản 6

2.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH THỐI KHÔ 7

2.3 TỔNG QUAN VỀ FUSARIUM OXYSPORUM 8

2.3.1 Đặc điểm và phân loại 8

2.3.2 Sự phân bố 10

2.3.3 Phạm vi kí chủ 10

2.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ MUỐI VÔ CƠ 11

2.4.1 Tổng quan về natri benzoat 11

2.4.2 Tổng quan về natri sulfit 14

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 16

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 16

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.2.1 Phân lập và định danh loài 18

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 21

3.2.3 Phương pháp xử lí số liệu 24

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI NẤM THỐI KHÔ HẠI GỪNG 25

4.1.1 Kết quả giám định hình thái nấm F.oxysporum 25

4.1.2 Phân loại 26

4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NGƯỠNG GÂY BỆNH NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN CỦ GỪNG 27

4.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THỜI GIAN NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ NẤM FUSARIUM OXYSPORUM 30

4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA NATRI BENZOAT VÀ NATRI SULFIT ĐẾN SỰ

SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM FUSARIUM OXYSPORUM Ở

ĐIỀU KIỆN IN VITRO 31

4.4.1 Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến đường kính tản nấm F.oxysporum 32

4.4.2 Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến sinh khối nấm F oxysporum 37

4.4.3 Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến sự nảy mầm của bào tử nấm F.oxysporum 40

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 KẾT LUẬN 46

5.2 KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gừng 3Bảng 2.2 Tình hình sản xuất gừng năm 2012 4Bảng 2.3 Diện tích, sản lượng của gừng trên thế giới 1998 – 2009 5

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh F.oxysporum trên củ gừng.21

Bảng 4.1 Tỷ lệ bệnh ở các nồng độ bào tử khác nhau trên củ gừng 27Bảng 4.2 Sự phát triển của vết bệnh trên gừng ở các mức bào tử khác nhau 28

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của natri benzoat đến đường kính tản nấm F.oxysporum ở

các mốc thời gian khác nhau 32

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của natri sulfit đến đường kính tản nấm F.oxysporum ở

các mốc thời gian khác nhau 35Bảng 4.5 Ảnh hưởng của natri benzoat đến sự nảy mầm của bào tử nấm

F.oxysporum 40 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của natri sulfit đến sự nảy mầm bào tử F.oxysporum, ở

các mốc thời gian khác nhau 43

DANH MỤC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ, HÌNH V

Hình 2.1 Bào tử nấm F.oxysporum 9

Hình 2.2 Bệnh thối do nấm F.oxysporum 10

Hình 2.3 Héo cà chua do nấm F.oxysporum 11

Hình 2.4 Cấu tạo của natri benzoat 12

Hình 2.5 Cấu tạo của natri sulfit 14

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập nấm F.oxysporum trên gừng 19

Hình 4.1 Tản nấm T1 trên môi trường 1/2 PDA 25

Hình 4.2 Hình ảnh vi thể nấm (100X) 25

Hình 4.3 Kết quả giải trình tự gen 28S chủng nấm phân lập được 26

Hình 4.4 Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng nấm định danh trong ngân hàng gen 27

Hình 4.5.: Sự phát triển của vết bệnh củ gừng ở các nồng độ bào tử nấm F.oxysporum sau 192 giờ 29

Hình 4.6: Sự nảy mầm của bào tử nấm F.oxysporum tại các mốc thời gian khác nhau, (100X) 31

Hình 4.7 Hiệu lực ức chế của natri benzoat đến đường kính tản nấm F oxysporum, sau 192 giờ nuôi cấy 33

Hình 4.8 Ảnh hưởng của natri benzoat đến đường kính tản nấm F.oxysporum sau 192 giờ nuôi cấy 34

Hình 4.9 Hiệu lực ức chế của natri sulfit đến đường kính tản nấm F oxyspoum, sau 192 giờ nuôi cấy 35

Hình 4.10 Ảnh hưởng của natri sulfit đến đường kính tản nấm F.oxysporum sau 192 giờ nuôi cấy 36

Hình 4.11 Hiệu lực ức chế của natri benzoat đến sinh khối nấm F.oxysporum sau 144 giờ nuôi cấy 37

Hình 4.12 Ảnh hưởng của natri benzoat đến sinh khối nấm F.oxysporum, sau 144 giờ nuôi cấy 38

Hình 4.13 Hiệu lực ức chế của natri sulfit đến sinh khối nấm F.oxysporum, 39

sau 144 giờ nuôi cấy 39

Hình 4.14: Ảnh hưởng của natri sulfit đến sinh khối của nấm F.oxysporum, 39

sau 144 giờ nuôi cấy 39Hình 4.15 Hiệu lực ức chế của natri benzoat đến tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm

F.oxysporum sau 6 và 12 giờ 41

Hình 4.16 Ảnh hưởng của natri benzoat đến sự nảy mầm của bào tử nấm

F.oxysporum sau 6 giờ nuôi cấy, (100X) 41

Hình 4.17: Ảnh hưởng của natri benzoat ở các nồng độ khác nhau sự nảy mầm

nấm F.oxysporum, sau 12 giờ, (100X) 42 Hình 4.18: Hiệu lực ức chế của natri sulfit đến sự nảy mầm của bào tử nấm F oxysporum, sau 12giờ, (100X) 44

Hình 4.19 : Ảnh hưởng natri sulfit ở các nồng độ khác nhau đến sự nảy mầm của

bào tử nấm F.oxysporum, sau 6giờ, (100X) 44

Hình 4.20: Ảnh hưởng của natri sulfit ở các nồng độ khác nhau đến sự nảy mầm

của bào tử nấm F.oxysporum , sau 12giờ, (100X) 45

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AUDPC : (Area Under Disease Progress Curve) đường

cong tiến triển chung của bệnhATP : Adenosin triphosphat

B.subtilis : Bacillus subtilis

C.albicans : Candida albicans

CFR : (Cost and Freight) giá thành và cước

FAO : (Food and Agriculture Organization of the

United Nations) Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

F.acuminatum : Fusarium acuminatum

F.avenaceum : Fusarium avenaceum

FDA : (Food and Drug Administration) Cục Quản

lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

F.equiset : Fusarium equiseti

F.oxysporum : Fusarium oxysporum

HLUC : Hiệu lực ức chế

INS : (International Numbering System) Hệ thống

đánh số quốc tếMIC : (The minimum concentration showing over

inhibition of mycelia growth) Nồng độ ức chế tối thiểu sự phát triển sợi nấm

PDA : Potato Dextrose Aga

PDB : Potato Dextrose Broth

PE : Polyetylen

P.fluorescens : Pseudomonas fluorescens

rRNA : Deoxyribonucleic acid

Rs : (Pupees) Tiền Ấn Độ

USD : (United States dollar) Đô la Mỹ

USDA : (United States Department of Agriculture) Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ

T.aureiviride : Trichoderma aureiviride

T.harzianum : Trichoderma viride

TLB : Tỷ lệ bệnh

TNT : Trinitrotoluen (thuốc nổ)

T.viride : Trichoderma viride

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta nằm trong vành đai nhiệt đới khí hậu gió mùa, là điều kiện rấtthích hợp cho việc phát triển nền nông nghiệp trong đó gia vị là một trongnhững loại cây phổ biến không những cung cấp sản lượng lớn cho thị trường nộiđịa mà còn mang lại giá trị cao trong xuất khẩu tạo nguồn thu nhập ổn định chongười nông dân Một trong những cây gia vị đó là gừng

Gừng (Zingiber officinale), một thành viên thuộc họ Zingiberaceae, là

một gia vị nổi tiếng được sử dụng trong chế độ ăn uống hàng ngày ở nhiều nướcchâu Á [24] Tuy nhiên trên thực tế sản xuất gừng thường bị ảnh hưởng bởinhiều bệnh do nấm, vi khuẩn và tuyến trùng…Cây thường bị bệnh như héo rủ do

Ralstonia solanacearum, thối rễ gây ra bởi loài Pythium, Fusarium, Sclerotium, Pseudomonas và những loài khác… Những bệnh ở gừng gây giảm năng suất và giá trị cảm quan Trong đó có thối khô gây ra bởi Fusarium oxysporum gây ảnh

hưởng nghiêm trọng đến chất lượng gừng Bệnh héo trên gừng được ghi nhậnlần đầu tiên tại Quảng Nam vào năm 2000 [4] Bệnh gây ra thiệt hại nghiêmtrọng, nhiều nông dân thất thu 100% Vì vậy việc tìm ra biện pháp ngăn ngừa vàkiểm soát bệnh là một vấn đề rất quan trọng

Phương pháp sử dụng hóa chất đang được áp dụng phổ biến để kiểm soáttác nhân gây bệnh trên rau quả trong quá trình canh tác, ra hoa, bảo vệ quả non

và bảo quản Với ưu điểm đơn giản, dễ sử dụng, có tác dụng nhanh và một lúc

có thể xử lí một khối lượng nguyên liệu lớn nên rất phù hợp với bảo quản côngnghiệp [2] Natri benzoat và natri sulfit là những hợp chất có khả năng khángnấm, kháng khuẩn rất tốt, ở liều lượng cho phép chúng không gây ảnh hưởng

đến sức khỏe con người Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài ”Phân lập nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối khô trên củ gừng và nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của muối natri benzoat và natri sulfit”.

PHẦN 2 TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GỪNG

2.1.1 Nguồn gốc của cây gừng

Cây gừng có tên khoa học là: Zingiber officinale Roscoe thuộc:

Loài: Zingiber officinale

Gừng có tên gọi khác là: can khương hay sinh khương [49] Là một câygia vị quan trọng, được trồng chủ yếu ở Trung Á để xuất khẩu trên toàn thế giới

Họ gừng (Zingiberaceae) là một họ thực vật thân thảo sống lâu năm với các thân

rể bò ngang hay tạo củ bao gồm 47 chi và khoảng trên 1000 loài phân bố ở vùngcận nhiệt đới [65] Thân cây gừng có hai dạng đó là thân ngầm (thường gọi làcủ) và thân khí sinh

Thân rễ có khi phồng thành củ Thân rễ (quen gọi là củ) không có hìnhdạng nhất định, phân nhánh trên một mặt phẳng, làm thành nhiều đốt, kích thướckhông đều, dài 3-7 cm, dày 0,5-1,5 cm, mặt ngoài màu trắng tro hay vàng nhạt,

có vết nhăn dọc, ở đầu đốt có vết tích của thân cây đã rụng, trên các đốt có vếtsẹo của các lá khô (vảy), vết bẻ màu trắng tro hoặc ngà vàng, lõi tròn rõ, mùithơm, vị cay nóng

Thân khí sinh: cấu tạo từ nhiều bẹ, lá ôm lấy lõi thân

+ Bẹ lá: hình lưỡi liềm Biểu bì trên hình đa giác, có kích thước lớn hơnbiểu bì dưới Các bó mạch nhỏ, gồm từ 1- 6 mạch gỗ, mạch gỗ ở trên, libe ởdưới, các tế bào xung quanh hóa mô cứng Tại đoạn có bó mạch, mô mềm vàbiểu bì bị ép dẹp

+ Thân: tế bào biểu bì hình chữ nhật, nhỏ Dưới biểu bì là mô mềm, tế bàohình tròn, vách mỏng Trụ bì gồm 2-3 lớp tế bào uốn lượn tạo thành 1 vòng liêntục Bên trong và ngoài vòng trụ bì có nhiều bó mạch gỗ nhỏ gồm từ 1-6 mạch

gỗ, libe chồng lên gỗ Các bó gỗ ngoài trụ bì thường có vòng mô cứng bao xungquanh, các bó phía trong thì không có Mô mềm, tế bào đa giác hoặc chữ nhật,đôi khi có chừa các khuyết lớn

Ở bẹ lá và thân đều chứa rải rác tinh thể canxi oxalat hình khối nhỏ, túitiết và tế bào tiết rải rác trong vùng mô mềm

+ Lá: lá không cuống, mọc so le thành 2 dãy, hình ngọn giáo, thắt lại ởgốc, đầu nhọn dài 15-20 cm, rộng 2 cm, mặt trên màu lục sẫm bóng, mặt dướinhạt, gân lá song song Bẹ nhẵn, có thể ôm vào nhau thành một thân giả [49]

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gừng [49], [47]

Thành phần củ gừng tươi Trong 100g củ gừng khô Trong 100g

Năng lượng 333kJ (80 kcal) 1.404 kJ (336 kcal)

farnesen (10%) và một lượng nhỏ các hợp chất ancol monoterpenic nhưgeraniol, linalol, borneol.

Nhựa dầu chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay Thành phần chủyếu của nhóm chất cay là zingeron, shogaol và zingerol, trong đó gingerol chiếm

tỷ lệ cao nhất Ngoài ra, trong tinh dầu gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren,eucalyptol và các gingerol Cineol trong gừng có tác dụng kích thích khi sử dụngtại chỗ và diệt khuẩn [49]

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ gừng trên thế giới và Việt Nam

2.1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ gừng trên thế giới

Năm 1585, gừng từ phương Đông được đưa vào trồng ở châu Mỹ và châu Âu.Trong năm 2012, Ấn Độ với hơn 30% sản lượng xuất khẩu toàn cầu và trởthành nước dẫn đầu thay thế Trung Quốc, đẩy Trung Quốc xuống vị trí thứ 2(khoảng 20%), tiếp theo là Nepal (với khoảng 12%), Nigieria và Thái Lan (7%)

Bảng 2.3 Diện tích, sản lượng của gừng trên thế giới 1998 – 2009 [10]

2.1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ gừng ở Việt Nam

Hiện nay gừng được xuất khẩu chủ yếu sang thị trường Trung Quốc, đã cómột số công ty Nhật Bản muốn nhập gừng nước ta với khối lượng lớn Năngsuất trồng gừng dưới tán rừng có thể đạt trung bình 3 – 4 tấn/ ha

Ở Việt Nam, cây gừng được trồng khá phổ biến từ Bắc (tỉnh Lạng Sơn) vàoNam (Cà Mau) Nhưng chủ yếu được trồng với quy mô nhỏ, trong các hộ giađình với sản lượng chưa nhiều, cung cấp cho thị trường địa phương và trongnước là chính [59]

2.1.4 Các bệnh sau thu hoạch ở gừng và biện pháp bảo quản

Gừng là loại cây có nhiều công dụng trong việc chữa bệnh, dùng làm gia vịcho các bữa ăn, đặc biệt củ gừng còn dùng để làm mứt Trong suốt quá trìnhsinh trưởng gừng bị nhiều loại dịch hại tấn công nhưng đáng lo ngại nhất là bệnhthối củ [63]

2.1.4.1 Các bệnh thường gặp ở gừng

 Thối xanh

Đây là bệnh hại nghiêm trọng nhất trên gừng và không có thuốc trị hữu

hiệu Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas solanascerum và Ewiniam sp gây nên.

Triệu chứng: cây gừng đang xanh tốt bổng dưng bị héo đột ngột vào giữatrưa, vài hôm sau toàn bộ cây bị vàng, khi nhổ lên đỉnh sinh trưởng sẽ có nhựađục như sữa

Vết bệnh lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu xám hơi mọng nước, sau đó lớndần và ăn sâu vào bên trong củ bị thối Bệnh này còn gây hại trong thời gian bảoquản Vi khuẩn tồn tại trong đất xâm nhập vào củ qua vết thương Bệnh lây lanrất nhanh, nếu thấy bệnh xuất hiện cần thu hoạch sớm để tránh thiệt hại

 Thối khô

Đây là bệnh do nấm Fusarium sống trong đất gây ra.

Triệu chứng: vết bệnh thường xuất hiện trên chóp lá và cháy từ chóp vàohoặc có những vết cháy hình tròn hoặc bầu dục trên lá, lá vàng, rụng và chếttương đối chậm hơn so với héo do vi khuẩn Nếu bệnh phát triển mạnh, nấm tấncông vào nách lá, xuống củ làm chết cả cây Trên củ có vết màu nâu, phần củ bịnhăn nheo, teo tóp lại có phủ nấm màu trắng và thường xuất hiện trong điều kiệnthời tiết có mưa bão, độ ẩm cao [67]

 Thối mềm

Thối mềm là một căn bệnh phá hoại nhất trong tổng số các bệnh trên gừng

Bệnh truyền qua đất và thường gây ra bởi Phythium spp trong đó P aphanidermatum và P myriotylum là phổ biến nhất Nấm sẽ sinh trưởng và phát

triển khi độ ẩm cao do gió mùa Tây Nam mang lại Chồi nhỏ thường mẫn cảmvới các tác nhân gây bệnh Bệnh bắt đầu nhiễm từ phía ngoài vào trong Tại khuvực bị nhiễm trở nên mọng nước và thối lan vào thân rễ dẫn đến thối mềm và cómùi hôi đặc trưng

Triệu chứng: xuất hiện đầu tiên là mép lá có màu vàng sáng và nhạt dầnvào trong phiến lá Trong giai đoạn đầu, phần giữa của lá vẫn xanh trong khi lề

lá trở nên vàng Sau đó lây lan toàn bộ, lá cuối cùng héo và khô lại [25]

2.1.4.2 Các biện pháp bảo quản

Bảo quản lạnh

Gừng tươi có thể được bảo quản trong môi trường lạnh và ẩm ướt Theothực nghiệm cho thấy có thể thiết kế buồng lạnh tại trạng trại PeruvannamuzhIIISR để lưu trữ gừng tươi, duy trì nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài 6 ÷ 7oC.Thời hạn sử dụng của gừng tươi có thể được kéo dài bằng cách lưu trữ ởnhiệt độ 10 – 12oC và độ ẩm cao (trong một nghiên cứu về gừng ở Hawaii), chấtlượng ổn định trong suốt 28 tuần khi bảo quản ở 12,5oC và độ ẩm tương đối90% Trong khi đó lưu trữ 22oC và độ ẩm 70% rút ngắn chỉ còn 20 tuần do mấtquá nhiều nước và hàm lượng chất xơ

Phương pháp chiếu xạ

Chiếu xạ tại 0,05 – 0,06 kGy có thể sử dụng để ức chế nảy mầm và kéo dàithời hạn sử dụng của gừng tươi Tuy nhiên chiếu xạ ở các mức thấp làm giảmhàm lượng các chất dễ bay hơi ở gừng tươi, được ghi nhận bằng phân tích cảmquan sau 5 tháng bảo quản

 Kết hợp kiểm soát bằng sinh học và bao gói

Sự kết hợp của kiểm soát sinh học với Trichoderma sp và lưu trữ trong túi

polyethylene ở nhiệt độ 25 – 30oC có thể kiểm soát cả sự mất nước do nấm

Sclerotium.

Theo viện nghiên cứu gia vị ở Ấn Độ nghiên cứu khuyến cáo bảo quảngừng tươi trong túi nhựa polyethylene, thông gió 2% bao bì ngăn cản cả việcmất nước và nấm mốc [14]

2.2 TỔNG QUAN VỀ BỆNH THỐI KHÔ

Đặc điểm bệnh thối khô

Thối khô do nấm Fusarium gây ra là vấn đề nghiêm trọng nhất ở gừng, phổ

biến hơn héo do vi khuẩn Nó đã được tìm thấy trong hầu hết diện tích trồng

rừng thương mại tại Hawaii Cây bị bệnh do nấm F.oxysporum f.zingiberi không

héo nhanh chóng như héo vi khuẩn Thay vì cây gừng bị nhiễm bệnh lá còi cọc

và ngã vàng những chiếc lá khô lâu hơn trong thời gian dài

Biểu hiện là cây bị vàng và còi cọc hơn giữa các cây xanh khỏe mạnh Câygừng cuối cùng bị khô do các loại nấm xâm nhập vào và làm toàn bộ hệ thốngmao dẫn hóa nâu Thân rễ không trở nên mềm và nhũng như héo do vi khuẩn vàcũng không có rỉ chất nhờn

Bệnh có thể bắt đầu trong giống trồng ban đầu, cũng có những nhận xét chorằng các loại nấm có thể dễ dàng xâm nhập vào hạt giống khỏe mạnh khi bịthương do nấm trong đất bị nhiễm vào trong lúc trồng Khi thối lan vào phầnthân rễ mới bị lõm Sự lây nhiễm càng nhanh chóng và dễ dàng hơn trong thờigian bảo quản gừng.

Fusarium oxysporum f.zingiberi là một loại nấm có thể tìm thấy trong thân

rễ bị nhiễm bệnh Các loại nấm cũng sản sinh ra các cấu trúc trong các mô phânhủy của thân rễ bị nhiễm bệnh Do đó, mô từ cây trồng bị nhiễm bệnh còn lạitrên thực tế như một nguồn chứa của các loại nấm Một khi cánh đồng gừng bịnhiễm, nấm có thể tồn tại trong đất nhiều năm Củ gừng được thu hoạch từ cánh

đồng bị nhiễm bởi nấm Fusarium gây thối khô có thể bị nhiễm bệnh và nấm sẽ

tiếp tục phân hủy mô thân rễ trong bảo quản Đây là thối khô đặc trưng bởi sựthối của mô vỏ và thỉnh thoảng kèm theo màu tím nhạt ở khu vực bị nhiễm bệnh

và phát triển các hệ thống sợi bông trắng nhẹ trên mặt cắt của củ gừng [36]

Theo NARI (2004), nhiễm trùng do nấm Fusarium thường liên quan đến các

vết thương hoặc hư hại do côn trùng và giun tròn Vết bệnh nhỏ, màu nâu bấtthường và thối khô đặc trưng trên thân rễ là sự xuất hiện sợi nấm màu trắng [18]

2.3 TỔNG QUAN VỀ FUSARIUM OXYSPORUM

2.3.1 Đặc điểm và phân loại

Fusarium là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký

sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau Nó là nguyên nhân chính làm héo

rủ cây chủ Hệ nấm lan tỏa khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ Fusarium cũng

sản xuất một số chất độc tiết vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây ra héo rủ

Rất nhiều loại thực vật bị Fusarium tấn công [1].

Các bệnh héo Fusarium là vấn đề quan trọng ở Việt Nam Những bệnh héo này

do các loài của F.oxysporum gây ra Một vài F.oxysporum cũng có thể gây thối dưa

hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc bị dụng cụ gặt hái làm tổn thương [4]

Theo Killan và Maire cho rằng F.oxysporum vẫn tồn tại ở dạng hậu bào tử

trong các mô bệnh của cây cọ (rễ và cuống lá…) Với sự phân hủy của mô nhưvậy bào tử hậu có thể được phát tán vào đất Các loại nấm có thể sống sót khi kýsinh trên vật chủ Các loại nấm phân bố không đồng đều và được tìm thấy ở độsâu 0 - 30 cm và đôi khi hơn 1 m ở trong đất Bào tử hậu là rất hiếm nhưng cóthể tồn tại trong đất lâu hơn 8 năm Ngay với một số lượng nhỏ cũng có thể bắt

đầu gây bệnh và nhiễm trùng Trong điều kiện thích hợp, bào tử hậu nảy mầm

và xâm nhập vào các mô mạch của rễ Các tiểu bào tử tiến vào các mạch gỗ, khi

bị cản trở thì chúng có khả năng nảy mầm, các ống mầm xâm nhập và hìnhthành các bào tử nhỏ Cây chết khi các loại nấm và các độc tố phát tán

F.oxysporum tấn công vào mô và hình thành các sợi nấm trong tế bào làm cây

chết Sau khi cây chết các sợi nấm tiếp tục phát triển và hình thành rất nhiều hậubào tử trong đất Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loại nấm là 21 –27,5oC, sinh trưởng vẫn còn đáng kể ở 18 và 32oC, nhưng dừng lại ở mức 7 và

37oC [24]

Fusarium có hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không

màu, chuyển nâu khi già Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héocây chủ

Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử

đính lớn, bào tử đính nhỏ, và bào tử vách dày (bào tử hậu) Bào tử đính lớn dài,nhiều nhân, hình lưỡi liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống bào tử Đầu và cuốibào tử lớn thuôn nhọn Một vài bào tử lớn tách rời và không gắn trên cuống bào

tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là cuống bào tử Tiểu bào tử đính thườngđơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bìnhhay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh Bào tử hậu hìnhtròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm.Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc thành cácống mầm nếu bào tử gặp điều kiện thuận lợi [26]

Hình 2.1 Bào tử nấm F.oxysporum [40]

2.3.2 Sự phân bố

Các chủng mầm bệnh đã được báo cáo là phân phối rộng rãi ở khắp cáckhu vực, lần đầu tiên được báo cáo ở Ohio (1940), nó đã trở nên phổ biến và trởthành mối lo ngại đến nền kinh tế cho đến khi phát hiện ra ở Florida (1961) Kể

từ đó chúng được nhanh chóng báo cáo trong một số các quốc gia khác bao gồmAustralia, Brazil, Anh, Israel, Mexico, Moroco, Hà Lan và Iraq [42]

2.3.3 Phạm vi kí chủ

Nấm Fusarium là một trong những tác nhân gây bệnh nghiệm trọng ở cây

trồng trên thế giới Chúng thường xâm nhập vào các bộ phận của cây dưới mặtđất Nấm trong chi này gây ra một loạt các bệnh trên một phạm vi rộng đốivới cây chủ, chúng có thể xuất hiện trong đất, trong không khí hay truyền quađường nước, thậm chí chúng còn tiềm ẩn trong các hạt giống và có khả nănghồi sinh [16]

 F.oxysporum gây hại trên chuối:

F.oxysporum là một trong những tác nhân quan trọng gây bệnh héo trên

chuối Căn bệnh này đã được báo cáo trong tất cả các vùng sản xuất chuối trênthế giới ngoại trừ những nước giáp với Địa Trung Hải, Melanesia, Somalia vàmột số đảo ở Nam Thái Bình Dương [21]

Héo do Fusarium được xem như là một bệnh đặc trưng ở chuối Chúng

xâm nhập qua các mô mạch vào rễ gây ra sự đổi màu và héo Bên ngoài, xuấthiện những dấu hiệu rõ ràng của bệnh, lá vàng nhạt sau đó biến đổi dần sangvàng tươi và cây bắt đầu chết Bên trong các triệu chứng đầu tiên rõ ràng hơn đó

là có sự biến đổi từ nâu đỏ sang nâu sẫm của các mạch gỗ [20]

Hình 2.2 Bệnh thối do nấm F.oxysporum ở chuối [52], [43]

F.oxysporum gây hại trên cà chua

Héo ở cà chua gây ra bởi các mầm bệnh xâm nhập vào qua hệ thống mạch

dẫn làm gián đoạn dòng chảy, trong đó F.oxysporum là nguyên nhân chính.

Triệu chứng đầu tiên thường là sự xuất hiện màu vàng ở lá sau đó héo dần vàcuối cùng cây chết Các biểu hiện lúc đầu có thể xảy ra ở một cành sau đó landần ra cả cây cho đến khi các lá bị héo Nếu ta tiến hành cắt tại nơi xuất hiện vếtbệnh sẽ nhận thấy sự biến đổi màu nâu đỏ

Hình 2.3 Héo cà chua do nấm F.oxysporum [67]

Ở phần trung tâm của thân và màu xanh lá cây bên ngoài Trong điều kiện

nhiệt độ và độ ẩm cao như ở trong nhà F.oxysporum có thể gây thiệt hại đáng

kể hơn Các tác nhân gây héo Fusarium có thể tồn tại nhiều năm trong đất

[27], [29]

F.oxysporum gây hại trên khoai tây

Thối do F.oxysporum ở khoai tây thường có biểu hiện: thân cây bị thối

đen do các mảnh mục nát dần và lan rộng lên toàn thân cây Các tổn thương trên

củ xuất hiện thường là hơi nhũn, hóa nâu, nhiễm bệnh thông qua các vết thương

và cuối cùng cây chết Cây và củ khô dần là do các mạch dẫn bị tác nghẽnkhông có hoặc rất ít nước được cung cấp đến cây héo dần và chết [26]

2.3.4 Biện pháp phòng trừ

F.oxysporum là tác nhân gây bệnh héo nghiêm trọng đối với nhiều loại cây trồng

về mặt kinh tế Nó là tác nhân gây bệnh truyền qua đất là chủ yếu, có thể sốngtrong thời gian dài gây ảnh hưởng đến cây bệnh sau thu hoạch, do vậy việc tìmtra giải pháp để ngăn ngừa là vấn đề rất quan trọng:

Biện pháp cải thiện đất

Để giảm nhẹ mức độ nghiệm trọng của của bệnh thường sử dụng các chấtmethyl bromde, choloropicrin và metam natri để xông đất và khử trùng Thôngthường người dân nâng độ pH của đất lên 6,5 -7,0 để đạt hiệu quả khử trùng tốtnhất [41], [61]

Biện pháp sinh học

Kiểm soát thối khô bằng biện pháp sinh học là phương pháp hiệu quả nhất Các

nhà nghiên cứu tại đại học bang Michigan đang điều tra hiệu quả của Bacillus subtilis Bacillus pumilis và Trichoderma harzinum trong kiểm soát thối khô

[46]

2.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ MUỐI VÔ CƠ

2.4.1 Tổng quan về natri benzoat

2.4.1.1 Giới thiệu về natri benzoat

Tên tiếng Việt: Natri benzoat

Tên tiếng Anh: Sodium benzoat

INS: 211

Hình 2.4 Cấu tạo của natri benzoat [53]

Natri benzoat là muối natri của axit benzoic, có công thức hóa học:

C6H5COONa

2.4.1.2 Ứng dụng của natri benzoat [44]

Natri benzoat là chất bảo quản thường được sử dụng trong đồ uống có ga.Thông thường đối với các sản phẩm sử dụng 0,03% - 0,08% Natri benzoatthường được sử dụng để bảo quản siro có mùi thơm trước khi bổ sung các axittrong nước giải khát Đồ uống không có ga thường đòi hỏi nồng độ cao hơn,thường là 0,05% - 0,1% natri benzoat trong các sản phẩm

Tuổi thọ của rượu táo không tiệt trùng có thể được kéo dài rất nhiều bằngcách sử dụng natri benzoat và nó được bổ sung ngay sau khi nước được ép Mộtmùi hương nhẹ, vị rõ ràng hơn có thể được truyền cho rượu táo bởi nồng độnatri benzoat thấp 0,04%

Trong bơ thực vật được quy định theo tiêu chuẩn của danh mục mô tảtrong 21 CFR 166,110 natri benzoat được cho phép như một chất bảo quản nồng

độ lên đến 0,1% Đặc biệt chú ý đến việc bảo quản kết hợp cho thêm ít muốihoặc muối bơ thực vật tự do, muối có tác dụng hiệp đồng với natri benzoat

Trong các sản phẩm trái cây, nước ép trái cây, xà lách thông thường natribenzoat sẽ được sử dụng ở mức 0,05% - 0,1% để bảo quản Anh đào ngâm rượuđược bảo quản với nồng độ 0,05 - 0,1% natri benzoat Thời hạn sử dụng củamón salat cam quýt ướp lạnh và khối lượng được cải thiện bằng cách sử dụngnatri benzoat 0,08%

Ngoài ra natri benzoat được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm dượcphẩm, vệ sinh và mỹ phẫm

Trong sản xuất thuốc viên dạng nén với mức 2 - 4% bột natri benzoattrong viên có tác dụng làm chất bôi trơn hiệu quả và làm thời gian tan rã nhanhchóng

Natri benzoat là một chất bảo quản an toàn và kinh tế, những lợi thế củanatri benzoat trong các ứng dụng này là nó không màu, không mùi dễ tan và nóichung là tương thích với các thành phần khác

2.4.1.3 Tính chất vật lý natri benzoat

Trạng thái và hình dạng vật lý: hạt màu trắng hoặc bột tinh thể

Mùi: không có mùi

Khi tiếp xúc với natri benzoat ở nồng độ cao có thể gây ngộ độc cấp tính.Khi tiếp xúc trực tiếp với natri benzoat có thể gây ho, đối với da có thể gây phátban, làm cho mắt mẩn đỏ, nếu nuốt vào sẽ gây buồn nôn, ói mửa, và đau bụng.Khi nuốt vào bụng lượng lớn natri benzoat có thể gây rối loạn chuyển hóa, nângcao lactate huyết thanh và thở nhanh Hạ kali máu và giảm canxi máu [50].

Ngộ độc mãn tính:

FDA (1990) đã chứng minh rằng natri benzoat có thể phản ứng với axitascorbic, hay còn gọi là vitamin C, để tạo thành benzen gây ung thư Việc sửdụng có thể góp phần tích lũy các bệnh ung thư như ung thư máu Điều nàytạo ra một mối nguy nghiêm trọng, bởi vì natri benzoat thường được sử dụngtrong thực phẩm có tính axit với vitamin C, chẳng hạn như nước trái cây,nước ngọt và salat [54]

 Liều lượng sử dụng

Theo quy ước đặt tính gây độc của tổ chức quản lý chất độc quốc tế, natribenzoat được xếp vào nhóm không gây ung thư, mà thuộc nhóm một số ngườicần tránh vì có thể gây dị ứng cho đối tượng có cơ địa nhạy cảm với hóa chất

Tại Việt Nam, tiêu chuẩn natri benzoat sử dụng để bảo quản thực phẩm , tùyloại quy định hàm lượng dưới 0,05% hoặc dưới 0,2% trọng lượng sản phẩm [4]

Nồng độ tối đa axit benzoic hoặc natri benzoat được thêm vào thực phẩm vớimục đích bảo quản là trong khoảng 2000 mg/kg thức ăn Tuy nhiên ở một sốnước nồng độ tối đa cho phép là khác nhau, USA là 0,1%, ở các nước khác từ0,15 – 0,25%, nồng độ cho phép của Uỷ ban Châu Âu (EC) lên đến 0,015 –0,5% [38]

2.3.1.4 Cơ chế kháng vi sinh vật của natri benzoat

Mặc dù chưa có chưa có nghiên cứu nào có thể giải thích rõ ràng cơ chếkháng khuẩn của natri benzoat nhưng nó được cho rằng có liên quan đến khảnăng hòa tan lipit của natri benzoat cho phép tích tụ trên màng tế bào hoặc cấutrúc khác và bề mặt của tế bào [44]

Natri benzoat ưa mỡ, dễ dàng thâm nhập vào màng tế bào cơ thể ảnhhưởng đến tính thẩm thấu của màng tế bào, ức chế khả năng hấp thụ các axit

amin của tế bào, axit hóa thành các tế bào trong cơ thể dự trữ ion kiềm trong tếbào và ức chế khả năng hô hấp, đồng thời ngăn chặn phản ứng ngưng tụ củaacetyl coenzyme A [64].

Khi có mặt các chất sát khuẩn, vi sinh vật đồng thời ngừng phát triển,ngừng sinh trưởng và chết nhanh chóng Sự chết của tế bào không xảy ra ngaycùng một lúc trong cả quần thể mà diễn ra dần dần Một số yếu tố chủ yếu là cáchóa chất có thể thể hiện tác dụng ức khuẩn hoặc diệt khuẩn tùy theo nồng độ củachúng có trong môi trường [7]

2.4.2 Tổng quan về natri sulfit

2.4.2.1 Giới thiệu về natri sulfit

Tên tiếng việt: Natri sulfit

Tên tiếng anh: Sodium sulfit

INS: 221

Hình 2.5 Cấu tạo của natri sulfit [66]

Natri sulfit là muối natri của axit sunfuro H2SO3 Khi hòa tan SO2 vàonước, sẽ tạo ra giữa phản ứng giữa SO2 với nước và tạo thành axit sunfuro(H2SO3) Cho dung dịch axit này phản ứng với NaOH hoặc Na2CO 3 tạo ra natrisulfit, có công thức hóa học: Na2SO3 [9]

2.4.2.2 Ứng dụng natri sulfit

Muối natri sulfit ngoài chức năng tham gia bảo quản ra con có tác dụngđiều chỉnh độ axit, làm rắn chắc, ổn định, chống oxy hóa, xử lý bột, tạo phứckim loại

Natri sulfit được dùng trước tiên trong ngành công nghiệp sản xuất giấy

và bột giấy Nó được dùng làm chất khử, chất thải có oxi trong quá trình xử lýnước, trong ngành công nghiệp nhiếp ảnh để bảo vệ dung dịch tráng phim khỏi

bị oxi hóa và để rửa sạch thuốc thử khỏi các cuộn phim và giấy ảnh, làm chất tẩyrửa, chất khử clo và lưu huỳnh trong ngành in ấn và ngành da giày làm chấtsulfit hóa các phần da được chiết Nó còn dùng để tinh chế TNT trong quân sự

Nó dùng trong sản xuất hóa chất làm tác nhân sunonat và sunfomety hóa, trongsản xuất natri thiosulfat [66]

Ngoài ra nó còn dùng trong nhiều ứng dụng khác như tách quặng, thu hồidầu, bảo quản thực phẩm, làm phẩm nhuộm [57]

2.4.2.3 Tính chất vật lý của natri sunfit

Trạng thái: tinh thể màu trắng

Mùi: không mùi

Điểm nóng chảy: 600oC

Độ hòa tan trong nước: 49,5g/100 ml ở 20oC

Trọng lượng phân tử: 126,04

2.4.2.4 Tính độc hạị

Ngộ độc cấp tính: khi tiếp xúc trực tiếp có thể gây kích ứng mắt, da và

đường hô hấp Gây ngộ độc vừa phải khi ăn Nếu nuốt phải natri sulfit có thểgiải phóng axit lưu huỳnh trong dạ dày, gây ra khó chịu cho đường tiêu hóa,buồn nôn, mửa, tiêu chảy, đau bụng, mất nước, buồn ngủ, sửng sờ, rối loạn tuầnhoàn và có thể tử vong Nuốt một lượng lớn natri sulfit có thể gây ra sự dư thừanatri trong cơ thể, đặc trưng bởi khát, bồn chồn, suy nhược, đau đầu, chóng mặt,huyết áp thấp, mê sảng và có thể ngừng hô hấp Khi bệnh nhân hen suyễn tiếpxúc có thể gây dị ứng với da hoặc phản ứng hô hấp nhạy cảm Natri sulfit gâychậm tăng trưởng, kích thích dây thần kinh, teo tủy xương, trầm cảm và bệnhbại liệt ở động vật

Ngộ độc mãn tính: natri sulfit trong những thử nghiệm ngắn hạn chothấy gây ra sự sai lệch nhiễm sắc thể trong tế bào của chuột Theo khảo nghiệm

cho thấy nó gây đột biến trong nấm men và Micrococcus aureus, nhưng không gây đột biến trong Ames salmonella Không có dữ liệu cho thấy natri sulfit gây nguy

hiểm cho việc sinh sản của con người Khi được tiêm với liều lượng 1 -5 mg, natrisulfit can thiệp với phân bào trong sản xuất trứng ở chuột, bò và cừu [48]

Liều lượng sử dụng

Sulfit là một trong những chất phụ gia quan trọng, trong đó mức sử dụng thườngkhông phản ảnh mức độ còn lại trong thực phẩm Tùy loại sản phẩm khác nhau

mà quy định về hàm lượng tối đa là khác nhau Mứt, thạch…mức độ tooid đa là3000mg/kg Giới hạn tối đa cho các chất cô đặc của nước ép trái cây là 2000mg/

kg Đối với giấy và trái cây là 3000mg/kg [51]

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Rajan và cộng sự (2002) đã tiến hành nghiên cứu các vi sinh vật gây hại

trên củ gừng Kết quả cho thấy các bệnh ở gừng gắn liền với Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum, Pythium spp., Fusarium oxysporum và Pratylenchus coffeae Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được tiến hành cho thấy sự tham gia của Pythium sp (thối mềm), Fusarium oxysporum (thối khô) và R.solanacearum (héo) và nhận thấy rằng Pratylenchus coffeae tăng mức độ nghiêm trọng nhiễm bệnh cùng với F.oxysporum [32].

Ogasawara và cộng sự (2008) cho rằng: sự phát triển của Candida albicans

trong môi trường RPMI 1640 bị ức chế bởi natri sulfit pH 3-6 Trong điều kiện

pH 7 tăng trưởng của C.albicans không bị ức chế bởi natri sulfit Trong điều kiện

có tính axit, natri sulfit có ảnh hưởng Candidacial và hoạt động này được thể hiện trong 150 phút Sự tổng hợp ATP trong C.albicans giảm do natri sulfit Sự sản sinh ethanol của C.albicans bị ức chế bơi natri sulfit ở pH 5 [17].

Năm 2009, D Stanojevic và cộng sự đã tìm hiểu sự ảnh hưởng của cácmuối như natri benzoat, natri nitrit và kali sorbat và sự phối hợp của (natri nitrit

và natri benzoat, natri nitrit với kali sorbat, natri benzoat và kali sorbat) cho vàonhững thực phẩm hư hỏng do vi khuẩn và nấm, trong ngành công nghệ thực

phẩm Các loài vi sinh vật được sử dụng thử nghiệm là: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, phylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus flavus, Fusarium oxysporum, Candida albicans, Trichoderma harsianum và Penicillium italicum Kết quả cho thấy chất kháng

khuẩn mạnh nhất được đưa ra bởi natri nitrit (MIC 0,5mg/ml) liên quan đến

các loài Pseudomonas aeruginosa Và sự phối hợp hiệu quả cao nhất 40% thử nghiệm đối với loài (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus mucoides và Candida albicans) với sự kết hợp của natri benzoat và kali

benzoat [35]

Natri benzoat ở nồng độ 0,02% và 0,04% không ảnh hưởng đến sự tăng

trưởng của A niger nhưng ở nồng độ 0,1% có hiệu quả cao nhất Natri benzoat

0,02% có tác dụng tốt hơn so với kali sorbat theo nghiên cứu của AhmadHeydaryinia và cộng sự (2011) [11].

Miru Du và cộng sự (2012) đã phân lập được, tổng cộng có 260 chủng

Fusarium trong 698 củ khoai tây thu thập trong 6 vùng sản xuất khoai tây quan trọng ở miền bắc Trung Quốc, trong đó có 5 loài Fusarium khác nhau là Fusarium sambucinum, F.avenaceum, Fusarium oxysporum, F.equiseti và F.acuminatum đã được phân lập [30].

Silvino Intra Moreira và cộng sự (2013) đã nghiên cứu về một số nấm và

vi khuẩn liên quan đến bệnh thối khô sau thu hoạch ở gừng, kết quả cho thấy:

bệnh chủ yếu do Acremonium murorum, Acrostalagmus luteo-albus, Fusarium sp., Fusarium oxysporum, Lasodiplodia theobromae và Sclerotium rolfsii gây

ra Đối với thân rễ lấy mẫu trong quá trình thu hoạch, tỷ lệ trung bình các tác

nhân gây bệnh như sau: Fusarium oxysporum (74%), Fusarium sp (31%), Fusarium solani (21%), Nigrospora oryzae (5%),…Mucor hiemalis (1%) [34].

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Vũ Thúy Nga (2012) đã tiến hành phân lập và tuyển chọn một số chủng

Bacillus có khả năng ức chế loại nấm gây bệnh héo rủ cây trồng cạn Fusarium oxysporum là loại ký sinh gây hại nghiêm trọng nhiều loại cây trồng [5].

Trần Vũ Phến và cộng sự (2012) đã nghiên cứu khả năng chống chịu của

một số giống gừng đối với bệnh thối củ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum hoặc nấm Fusarium proliferatum [6].

Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi đã được ghi nhận rộng rãi tại nhiều nước là nguyên nhân gây bệnh héo Fusarium ở gừng Tuy nhiên, những mẫu nấm F.oxysporum phân lập được từ gừng ở Quảng Nam trên các giống gừng ở

địa phương để chứng minh rằng đó là nấm bệnh chứ không phải nấm hoạisinh [4]

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về bênh hại do nấm F.oxysporum nhưng chưa

có tài liệu nào được công bố về việc gây hư hại của nấm F.oxysporum trên gừng

sau thu hoạch và biện pháp phòng ngừa nó Do đó đề tài nghiên cứu của chúngtôi là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Nấm Fusarium oxysporum: được phân lập từ củ gừng bị nhiễm bệnh

thối khô trong tự nhiên, tại phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm, khoa Cơ khícông nghệ, trường Đại học nông lâm Huế

- Hóa chất: C6H5COONa (natri benzoat)

- Hóa chất: Na2S2O3 (natri sulfit)

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phân lập và định danh loài

3.2.1.1 Phương pháp thu mẫu bệnh

- Mẫu bệnh thu từ những củ gừng có triệu chứng vết bệnh ban đầu điểnhình rửa sạch bằng nước để loại bỏ tạp chất Sau đó khử trùng bằng cồn 70o, rửalại bằng nước cất vô trùng

- Mẫu bệnh được ủ trong hộp vô trùng bọc túi PE và ghi đầy đủ thông tincần thiết (địa điểm, tên giống, ngày tháng thu mẫu…)

Gửi mẫu định danh

Khử trùng bằng cồn 70oMẫu bệnh quả

Ủ mẫuDùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh

Cấy truyền sang môi trường 1/2 PDA

Cấy lên môi trường 1/2 PDA

Ủ ở nhiệt độ 25oC trong 7 ngày

Quan sát bào tử dưới kính hiển vi, giám định nấm

Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử

Giám định lại dưới kính hiển vi

Giữ mẫu

3.3.1.2 Phương pháp phân lập

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập nấm F.oxysporum trên gừng

Thuyết minh quy trình

 Khử trùng và ủ mẫu bệnh

Sau khi thu thập mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tại đây những củgừng có vết bệnh điển hình được rửa dưới vòi nước sạch để loại bỏ tạp chất vàbụi bẩn bám trên bề mặt Tiếp theo khử trùng bằng cồn 70o sau đó rửa sạch lạibằng nước cất vô trùng và để ráo nước [4]

Đặt củ gừng bệnh lên giấy được phun ẩm bằng nước cất vô trùng, sau đócho vào hộp nhựa đã được khử trùng bằng cồn 70o, bao bọc lại bằng bì nilong,trên bề mặt có đục lỗ nhỏ tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển Cuối cùng chovào tủ ấm ủ ở nhiệt độ 25oC Sau khoảng 2 - 4 ngày quan sát khi thấy xuất hiện cóbào tử, làm giám định bào tử gây bệnh thối khô trên củ gừng Sau khi giám định sơ

bộ ta tiến hành phân lập nấm trên môi trường thích hợp

 Phân lập nấm

Sau khi tiến hành ủ bệnh, khi quan sát thấy có bào tử trên vết bệnh được ủthì tiến hành lấy tăm vô trùng chấm vào mô bệnh và cấy lên đĩa peptri chứa môitrường 1/2 PDA Đĩa được ủ ở nhiệt độ thích hợp 25oC trong khoảng 2 - 4 ngàybắt thì đầu quan sát bào tử

 Cấy truyền

Kiểm tra các đĩa hằng ngày, mô tả sự phát triển của sợi nấm và quan sátbào tử Tiến hành cấy truyền bằng cách dùng dao cắt một miếng thạch có kíchthước (2 x 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm sang môi trường 1/2 PDA [4]

 Làm thuần

Giai đoạn cuối cùng trong việc phân lập nấm là làm thuần mẫu nấm Quansát dưới kính hiển vi thấy bào tử thuần nhất tiến hành làm thuần Chỉ cho mộtbào tử hoặc một đỉnh sinh trưởng được cấy sang môi trường sạch để đảm bảonấm được cấy là hoàn toàn thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử

 Giám định nấm bằng kính hiển vi

Khi tản nấm đã xuất hiện bào tử, thường trong 4 ngày, tiến hành làm tiêubản quan sát hình thái sợi nấm và bào tử ở vật kính 100, khi kết quả giám định làđúng với nấm phân lập thì chụp hình và giữ mẫu ở 4oC [7]

 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

Nguyên tắc định danh dựa trên sự khác biệt trình tự nucleotide ở trênvùng 28S đối với vi nấm giữa các loài khác nhau Giải trình tự gen 28S rRNA vàtra cứu trên BLAST SEARCH để xác định loài nấm

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

3.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh của F.oxysporum bằng lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm

F.oxysporum được nuôi cấy trên môi trường 1/2 PDA.

Nấm ủ trong tủ ấm ở 25oC, sau 7 ngày tiến hành thu nhận bào tử

Thử khả năng lây bệnh trên củ gừng sau thu hoạch ở các nồng độ khácnhau: 100 bào tử/ml, 104 bào tử/ml, 105 bào tử/ml, 106 bào tử/ml, 107 bào tử/ml

Nồng độ bào tử được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer

Thí nghiệm được tiến hành với 6 công thức (CT) và 3 lần lặp lại Mỗi củ

lây 2 vết đồng đều trên tất cả các củ [3].

+ Đặt mẫu trên giấy vô trùng, đưa vào hộp nhựa đã khử trùng bằng cồn

70o Phun nước vô trùng tạo độ ẩm cho nấm phát triển

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh F.oxysporum trên củ gừng.

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Thời gian hình thành vết bệnh ( giờ)

+ Đường kính vết bệnh (mm)

+ Mức độ phát triển bệnh được xác định theo đường cong tiến triển bệnhAUDPC (Area Under Disease Progress Curve) theo Campbell và Madden (1990)

AUDPC: đường cong tiến triển chung của bệnh.

yi, yi + 1: tỷ lệ bệnh trong lần theo dõi thứ i và thứ i + 1

ti, ti + 1: thời gian theo dõi bệnh ở lần thứ i và thứ i + 1 (giờ)

n: tổng số lần theo dõi bệnh

3.2.2.2 Xác định thời gian nảy mầm của bào tử F.oxysporum

- Tiến hành

+ Hút 20 μll môi trường cho vào lam lõm

+ Hút 4 µl huyền phù bào tử nồng độ 106 bào tử/ml cho vào môi trường

đã chuẩn bị

+ Để yên trong tủ cấy vô trùng khoảng 5 phút, đậy kín Ủ ở 25oC cứ sau

1 giờ quan sát và đếm số lượng bào tử nảy mầm

Mỗi công thức lặp lại 3 lần

- Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian nảy mầm của bào tử: tiến hành quan sát xác định số bào tử nảymầm [33]

3.2.2.3 Đánh giá khả năng kháng F.oxysporum của natri benzoat và natri sulfit

ở điều kiện in vitro

 Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến đường kính tản nấm

F.oxysporum

- Tiến hành thí nghiệm

Các muối vô cơ như natri benzoat và natri sulfit được khảo sát ở các nồng

độ khác nhau: 0%; 0,02%; 0,04%; 0,08%; 0,16 % đối với natri benzoat và cáccông thức: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,8%; 1,6% đối với natri sulfit trên môi

trường 1/2 PDA ở điều kiện in vitro để đánh giá khả năng ức chế nấm F.oxysporum trên gừng thông qua đường kính tản nấm.

- Cách tiến hành:

+ Dùng pipetman hút natri benzoat và natri sulfit vào các bình tam giácchứa môi trường PDA [phụ lục 1] (đã tiệt trùng, để nguội ở nhiệt độ 450C) đểđạt đến nồng độ yêu cầu.

+ Cho 14ml môi trường lần lượt vào các đĩa peptri vô trùng để đông.+ Khuẩn lạc sau khi nuôi cấy 7 ngày được cắt từ rìa khuẩn lạc và đặt vàogiữa môi trường đã chuẩn bị

+ Ủ ở nhiệt độ 250C, quan sát, đo đường kính 48 giờ một lần

+ Thí nghiệm được thực hiện 6 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần[13]

C: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức đối chứng (%)

T: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức thí nghiệm (%)

 Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến sinh khối nấm

Fusarium oxysporum

- Cách tiến hành:

+ Hút 20 µl huyền phù bào tử nồng độ 106 bào tử/ml đã chuẩn bị vào chaithủy tinh có chứa môi trường đã chuẩn bị

+ Tiến hành nuôi cấy trong thời gian 7 ngày ở điều kiện 25oC

+ Thu sinh khối nấm bằng cách lọc trên giấy đã sấy đến khối lượng khôngđổi, sau đó thu sinh khối khô bằng cách sấy đến khối lượng không đổi ở 55oC[13], [7], [33]

- Chỉ tiêu theo dõi

Hiệu lực ức chế (HLUC)

HLUC (% )= C−T

C ×100

Trong đó:

C: sinh khối khô ở công thức đối chứng

T: sinh khối tươi khô ở công thức thí nghiệm

 Ảnh hưởng của natri benzoat, natri sulfit đến tỷ lệ nảy mầm của bào

tử F.oxysporum

- Tiến hành

Hút 20 µl môi trường PDA có chứa natri benzoat hoặc natri sulfit ở cáccông thức khảo sát vào lam lõm được đặt trong đĩa petri vô trùng, để nguội chomôi trường đông, sau đó cấy 4 µl huyền phù bào tử ở nồng độ 106 bào tử/ml trênmôi trường thạch Để yên trong tủ cấy vô trùng khoảng 5 phút, đậy kín và ủ ởnhiệt độ 25oC Sau 6 và 12 giờ bắt đầu quan sát sự nảy mầm của bào tử và sựphát triển hệ sợi nấm Thí nghiệm được thực hiện trên 6 công thức, mỗi côngthức lặp lại 3 lần [13]

- Tính kết quả:

+ Tỷ lệ nảy mầm của bào tử ở các công thức

+ Hiệu lực ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm

HLUC (%) = C−T C × 100%

Trong đó:

C: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức đối chứng (%)

T: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức thí nghiệm (%)

3.2.3 Phương pháp xử lí số liệu

Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai ANOVA (Anova SingleFactor) và so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp DUNCAN trên phầnmềm thống kê SPSS, chạy trên hệ điều hành Window

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI NẤM THỐI KHÔ HẠI GỪNG

4.1.1 Kết quả giám định hình thái nấm F.oxysporum

Sau khi thu thập một số mẫu gừng có vết bệnh thối khô điển hình, tiếnhành phân lập mẫu trên môi trường PDA

Với 15 mẫu gừng phân lập, kết quả thu được 4 chủng nấm từ vết bệnhthối khô trên củ gừng là (T1, T2, T3, T4) Các chủng nấm này được tiến hànhquan sát đại thể và vi thể

Quan sát các chủng T1, T2, T3, T4, nhận thấy chủng T1 có những đặc

điểm hình thái, màu sắc, bào tử giống với chủng F.oxysporum.

*Đặc điểm đại thể và vi thể của chủng T1:

Hình 4.1 Tản nấm T1 trên môi trường 1/2 PDA Đặc điểm đại thể: Nấm F.oxysporum hình thành và phát triển tốt trên

môi trường PDA ở nhiệt độ thích hợp là 25oC (tràn đĩa sau 8 ngày nuôi cấy) Hệsợi nấm phân nhánh, tản nấm tròn có màu trắng hoặc không màu rồi chuyểnsang tím nhạt, sợi nấm tơi xốp và mọc dày lên ở giữa và mỏng dần ở xungquanh

Hình 4.2 Hình ảnh vi thể nấm (100X)

(a) Bào tử (b) Cành phân sinh

(c) Cuống phân sinh

Đặc điểm vi thể: Có ba dạng bào tử; đại bào tử đính dài, bên trong có

nhiều vách ngăn đa số là 3 vách, nhiều nhân hình lưỡi liềm hoặc thân cong sinh

ra từ cuống bào tử Đầu và cuối bào tử lớn thuôn nhon Một vài bào tử lớn táchrời và không gắn trên cuống bào tử; tiểu bào tử đính có dạng hình trụ, bầu dụcthường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ mộtthể bình hay những cuốn bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh; hậu bào tửthì có hình bầu dục, chúng phát triển đơn lẻ hoặc thành cụm

So sánh kết quả quan sát của chúng tôi với các đặc điểm của chủng nấm

Fusarium, trong giáo trình môn nấm học của Nguyễn Văn Bá (2005), kết quả cho thấy chủng nấm thu được có đặc điểm tương tự như F.oxysporum ở cả đặc

điểm đại thể và vi thể [1]

Qua những đặc điểm đại thể và vi thể, chúng tôi nhận thấy rằng chủng

phân lập có các đặc điểm hình thái học giống với đặc điểm chủng F.oxysporum

trong cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam theo Burgess và cộng sự(2008) [4]

Cũng theo R.hafizi và cộng sự (2014), tiến hành thí nghiệm trên môitrường PDA ở điều kiện 25oC nhận định về đặc điểm về hình thái bào tử và đặc

điểm tản nấm F.oxysporum tương tự với chủng nấm chúng tôi phân lập được [22].

4.1.2 Phân loại

Chủng nấm được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA

và tra cứu trên BLAST SEARCH Kết quả thể hiện ở hình 4.3 và hình 4.4.

CTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGTTTAACGGCGTGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGAGGAACGCGAATTAACGCGAGTCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTTGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAAAAGTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCAAATGACCGAGTTTGGAGAGCTTTCCGGCCCTGAGTGGTAGTTGCCCCCTCTCTGGGCC

Hình 4.3 Kết quả giải trình tự gen 28S chủng nấm phân lập được

Hình 4.4 Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng nấm

định danh trong ngân hàng gen

Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA và so sánh mức độ tương đồng giữacác đoạn gen với dữ liệu đã công bố trong ngân hàng gen thông qua chươngtrình BLAST SEARCH cho thấy trình tự gen của chúng tôi phân lập được tương

đồng 100% với chủng F.oxysporum.

Qua kết quả quan sát trên đại thể và vi thể cũng như kết quả giám định

chúng tôi kết luận chủng nấm phân lập được là Fusarium oxysporum Chủng

nấm này được chúng tôi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NGƯỠNG GÂY BỆNH NẤM FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CỦ GỪNG

Để đánh giá tác hại cũng như mức độ gây bệnh của nấm F.oxysporum sau

khi thu hoạch, chúng tôi tiến hành lây bệnh nhân tạo trên củ gừng, nhằm xác

định nồng độ huyền phù bào tử nấm F.oxsporum có thể hình thành vết bệnh rõ

ràng trong điều kiện ở nhiệt độ 25oC Tuy nhiên phải chọn nồng độ thích hợp để

gây bệnh nếu nồng độ quá thấp thì vết bệnh không rõ ràng, phát triển chậm đồngthời nồng độ cũng không nên quá cao, tốc độ phát triển nhanh khó có thể quansát được thường xuyên Chúng tôi thực hiện thí nghiệm khảo sát ở các nồng độ

CT IV với tỷ lệ bệnh 66,67% Sau 96 giờ tất cả các vết bệnh đều hình thành ởcác nồng độ bào tử được lây bệnh Qua quan sát thấy rằng, vết bệnh ban đầuchưa điển hình và còn có sợi nấm xung quanh như ở CT I, CT II, sau một thờigian, các sợi nấm sẽ mất dần và xuất hiện vết bệnh điển hình như ở CT III và

Ghi chú: - Các giá trị trung bình đường kính vết bệnh theo cột có cùng chữ cái

in thường là không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05.

Các giá trị trung bình AUDPC theo cột có cùng chữ cái in thường là không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05.

Từ bảng 4.2 cho thấy, ở các thời điểm khác nhau (48 giờ, 96 giờ , 144 giờ

và 192 giờ) đường kính vết bệnh tăng dần theo nồng độ bào tử lây bệnh Kết quả

xử lý cho thấy giữa các công thức thí nghiệm, giá trị trung bình đường kính vết

bệnh đều sai khác có ý nghĩa thống kê Ở CT IV với mức 107 bào tử/ml có khảnăng gây bệnh trên củ gừng lớn nhất, đường kính vết bệnh tại thời điểm 192 giờ

là 6,21 (mm), tiếp đến là CT III với mức nồng độ 106 bào tử/ml là 5,37 (mm), côngthức 105 và 104 bào tử/ml có đường kính vết bệnh lần lượt là 5,12 (mm) và 4,01 (mm)

Mức độ phát triển bệnh được xác định theo đường cong tiến triển bệnhAUDPC và được thể hiện ở bảng 4.2 Kết quả cho thấy ở các nồng độ bào tửkhác nhau, mức độ hình thành vết bệnh cũng khác nhau Theo chiều tăng củanồng độ bào tử, tốc độ hình thành vết bệnh và đường kính vết bệnh cũng tăngtheo, mức độ phát triển bệnh lớn nhất ở CT IV

105 (bào tử/ml)

Hình 4.5 Sự phát triển của vết bệnh củ gừng ở các nồng độ bào tử nấm

F.oxysporum sau 192 giờ

Hình 4.5 cho thấy, sau 192 giờ gây bệnh nhân tạo nồng độ đối chứngkhông thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh, chứng tỏ không có sự phát triển của nấm

F.oxyspoum, ở nồng độ 104 bắt đầu xuất hiện sự hình thành vết bệnh nhưngchưa rõ ràng và khó quan sát được, đường kính vết bệnh nhỏ và xuất hiện cácsợi nấm trắng Ở nồng độ 105, 106 vết bệnh lớn dần và xug quanh vết bệnh xuấthiện quần thâm màu nâu Ở nồng độ 107 vết bệnh hình thànhnhanh và dễ dàngquan sát được Ở công thức 106 vết bệnh cũng xuất hiện rõ ràng nhanh hơn 105

nhưng không mạnh như 107 Do đó, chúng tôi chọn nồng độ bào tử là 106 bào tử/

ml là ngưỡng gây bệnh cho các thí nghiệm tiếp theo

Kết quả quan sát được của chúng tôi cùng phù hợp với các nghiên cứu

khác Theo Silvino Intra Moreira và cộng sự (2013) đã đưa ra kết luận F oxysporum làm xuất hiện màu nâu ở các mô biểu bì và vỏ của củ gừng tại gần

nơi tiêm bệnh, đồng thời có sự tăng trưởng sợi nấm trắng bên ngoài và bên trong

107(bào tử/ml)

106 (bào tử/ml)

Quá trình này được thể hiện bởi 3 giai đoạn (kích hoạt, trương nở bào tử,xuất hiện mầm) Định nghĩa một bào tử được coi là đã nảy mầm khi chiều dàiống mầm lớn hơn một phần hai đường kính của bào tử và nhỏ hơn hai lần đườngkính bào tử Các bào tử không nảy mầm cùng một thời gian.Vì vậy thời gian nảymầm bào tử sẽ phụ thuộc vào thời gian bào tử được coi là nảy mầm và tỷ lệ phầntrăm của các bào tử đã nảy mầm [8].

Tản nấm sau 7 ngày nuôi cấy được tiến hành thu bào tử vào epperdorf.Cho vào lam lõm 20 µl môi trường để nguội sau đó cho vào 4 µl bào tử nồng độ

106 tiến hành ủ ở 25oC Sau mỗi giờ kiểm tra tỷ lệ nảy mầm của bào tử

Kết quả quan sát thời gian nảy mầm của bào tử nấm F.oxysporum được

thể hiện ở hình 4.6