Nghiên cứu quy trình sản xuất dịch lên men lactic giàu carotenoids từ đầu tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei) và thử nghiệm ứng dụng dịch lên men làm thức ăn cho cá tứ vân (capoeta tetrazone)

Phế liệu này được sử dụng chủ yếu trong sản xuất chitin – chitosan, tuy nhiên các phương pháp sản xuất chitin – chitosan đều sử dụng NaOH và HCl ở nồng độ cao dẫn đến việc dư thừa hóa ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-oOo -

ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)

VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG DỊCH LÊN MEN

LÀM THỨC ĂN CHO CÁ TỨ VÂN (Capoeta Tetrazona)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa - 2014

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-oOo -

NGUYỄN THỊ NHƯ XUÂN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT DỊCH LÊN MEN LACTIC GIÀU CAROTENOIDS TỪ

ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)

VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG DỊCH LÊN MEN

LÀM THỨC ĂN CHO CÁ TỨ VÂN (Capoeta Tetrazona)

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Như Xuân

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và các cá nhân trong trường, đã giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn PGSTS Trang Sĩ Trung, Hiệu phó Trường Đại học Nha Trang và TS Lê Minh Hoàng, đã hết lòng chỉ bảo và hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy giáo ThS Nguyễn Công Minh, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Sau đại học và Khoa Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi thuận lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu và bảo vệ luận văn

Xin cảm ơn đến gia đình và các bạn đã luôn quan tâm, chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn thành công việc

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về nguyên liệu tôm và phế liệu tôm 3

1.1.1 Nguồn lợi từ tôm 3

1.1.2 Diện tích nuôi trồng, sản lượng và thị trường xuất khẩu tôm ở Việt Nam 3

1.1.3 Giới thiệu chung về phế liệu tôm 4

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 11

1.2.1 Tác nhân lên men lactic 11

1.2.2 Cơ chế lên men lactic 13

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 14

1.3 Tổng quan phương pháp lên men phế liệu thủy sản bằng vi khuẩn lactic 15

1.3.1 Phương pháp lên men lactic phế liệu thủy sản 15

1.3.2 Cơ sở lý thuyết lên men lactic 18

1.3.3 Các dạng hư hỏng thường gặp trong lên men lactic 21

1.4 Tổng quan về cá Tứ Vân 23

1.4.1 Phân loại 23

1.4.2 Đặc điểm phân bố 23

1.4.3 Đặc điểm hình thái 23

1.4.4 Điều kiện sống và phát triển của cá Tứ Vân 24

1.4.5 Đặc điểm sinh sản 24

1.4.6 Điều kiện cho ăn của cá Tứ Vân 25

1.5 Tổng quan về thành phần dinh dưỡng cho cá cảnh 26

1.5.1 Vai trò của protein và các sắc tố trong việc đối tượng cá cảnh 26

1.5.2 Thức ăn cho cá cảnh 32

iv 1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng vi sinh vật để lên men phế liệu tôm nhằm mục đích thu protein, astaxanthin và sử dụng astaxanthin bổ sung vào thức

ăn cho cá 33

1.6.1 Nghiên cứu trong nước 33

1.6.2 Nghiên cứu trên thế giới 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Vật liệu nghiên cứu 38

2.1.1 Mẫu 38

2.1.2 Thiết bị chuyên dụng 38

2.1.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 39

2.2.2 Phương pháp phân tích 40

2.3 Bố trí thí nghiệm 43

2.3.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 43

2.3.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết 44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic 51

3.1.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men chua 51

3.1.2 Kết quả test sinh hóa của những chủng vi khuẩn được chọn 56

3.1.3 Đánh giá khả năng lên men nguyên liệu đầu tôm của hai chủng đã chọn 58

3.2 Nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn lactic LB7 đã phân lập từ thực phẩm lên men tự nhiên vào công đoạn lên men nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng 60

3.2.1 Phân tích thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) 60

3.2.2 Tối ưu điều kiện lên men dịch đầu tôm thẻ chân trắng bằng chủng vi khuẩn LB7 phân lập được từ thực phẩm lên men chua tự nhiên 61

3.2.3 Kiểm tra chất lượng vi sinh của dịch lên men 72

3.3 Thử nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men lactic và tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung vào thức ăn tổng hợp đến màu sắc của cá Tứ Vân 72 3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men khác nhau đến màu sắc của cá Tứ Vân 73 3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đậu nành khác nhau đến màu sắc của cá Tứ Vân 77 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất dịch lên men lactic từ nguyên liệu đầu tôm và bổ sung vào thức ăn tổng hợp cho cá 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thống kê diện tích nuôi tôm 2010 tại 6 tỉnh ĐBSCL .3

Bảng 1.2: Thành phần đầu và vỏ phế liệu tôm (%) 6

Bảng 1.3: Một số loài vi khuẩn lactic có trong sản phẩm ủ chua .15

Bảng 3.1: Một số đặc điểm hình thái của 16 chủng vi khuẩn phân lập được 52

Bảng 3.2: Một số đặc tính sinh hóa của 16 chủng vi khuẩn 54

Bảng 3.3: Giá trị OD600 của một số chủng vi khuẩn 55

Bảng 3.4: Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 60

Bảng 3.5: Một số thành phần cơ bản trong dịch lên men đầu tôm thẻ chân trắng 65

Bảng 3.6: Một số thành phần cơ bản trong dịch lên men đầu tôm thẻ chân trắng 69

Bảng 3.7: Một số thành phần cơ bản trong dịch lên men đầu tôm thẻ chân trắng 72

Bảng 3.8: Chất lượng vi sinh của dịch lên men bằng vi khuẩn lactic 72

Bảng 3.9: Sự biến đổi màu sắc của cá theo thời gian thí nghiệm qua các tỷ lệ dịch lên men bổ sung vào thức ăn tổng hợp khác nhau .73

Bảng 3.10: Sự biến đổi màu sắc của cá theo thời gian thí nghiệm qua các tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung vào thức ăn tổng hợp khác nhau 77

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Đồ thị thể hiện phần trăm thị trường xuất khẩu chính trong 9 tháng đầu năm

2011 của Việt Nam đối với mặt hàng thủy sản .4

Hình 1.2: Các liên kết hóa học của astaxanthin trong tôm .8

Hình 1.3: Sơ đồ tóm tắt lên men lactic phế liệu tôm 17

Hình 1.4: Chiều dài của cá Tứ Vân sau các khoảng thời gian: 3 ngày tuổi, 5 ngày tuổi, 7 – 8 ngày tuổi, 15 – 20 ngày tuổi, 25 ngày tuổi (lần lượt từ trái sang phải) .24

Hình 1.5: Sơ đồ trao đổi protein tổng số ở cá .27

Hình 1.6: Công thức của một số dạng carotenoids của động vật thủy sinh .28

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic 41

Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 43

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ chế phẩm thích hợp bổ sung vào phế liệu tôm 45

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian lên men phế liệu tôm thích hợp 46

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ rỉ đường thích hợp bổ sung vào phế liệu tôm 47

Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thử nghiệm tỷ lệ dịch lên men lactic bổ sung vào thức ăn tổng hợp cho cá Tứ Vân 48

Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thử nghiệm tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung vào thức ăn tổng cho cá Tứ Vân 49

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB2 51

Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB4 51

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB7 51

Hình 3.4: Hình nhuộm Gram của một số chủng vi khuẩn 55

Hình 3.5: Hình kiểm tra khả năng chuyển hóa tạo indol của 6 chủng vi khuẩn 56

Hình 3.6: Hình kiểm tra khả năng tạo khí H2S của 6 chủng vi khuẩn 57

Hình 3.7: Hình kiểm tra khả năng khử nitrat của 6 chủng vi khuẩn 58

Hình 3.8: Hàm lượng astaxanthin và protein thu được trong dịch lên men đầu tôm khi sử dụng 2 chủng vi khuẩn khác nhau 59

Hình 3.9: Biến đổi của pH ở các tỷ lệ chế phẩm vi sinh khác nhau 62

Hình 3.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm đến hàm lượng protein, astaxanthin thu được trong dịch lên men đầu tôm 63

Hình 3.11: Biến đổi pH trong các khoảng thời gian lên men khác nhau 66 Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng protein và astaxanthin thu đơợc trong dịch lên men 67 Hình 3.13: Giá trị pH của mẻ ủ ở nồng độ rỉ đường khác nhau 70 Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường đến hàm lượng astaxanthin và protein có trong dịch lên men 71 Hình 3.15: Màu sắc của cá nuôi sau 45 ngày tại 2 nghiệm thức: thức ăn tổng hợp (đối chứng) và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 5% (v/w) dịch lên men 74 Hình 3.16 : Màu sắc của cá nuôi sau 45 ngày tại 2 nghiệm thức: thức ăn tổng hợp (đối chứng) và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 10% (v/w) dịch lên men 75 Hình 3.17: Màu sắc của cá nuôi sau 45 ngày tại 2 nghiệm thức: thức ăn tổng hợp (đối chứng) và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 15% (v/w) dịch lên men 75 Hình 3.18: Màu sắc của cá nuôi sau 45 ngày tại 2 nghiệm thức: thức ăn tổng hợp (đối chứng) và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 20% (v/w) dịch lên men 76 Hình 3.19: Màu sắc của cá nuôi sau 45 ngày tại 2 nghiệm thức: thức ăn tổng hợp (đối chứng) và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 25% (v/w) dịch lên men 76 Hình 3.20: Màu sắc của cá sau 45 ngày nuôi tại 2 nghiệm thức: mẫu đối chứng và thức

ăn tổng hợp có kết hợp với 5% (v/w) dầu đậu nành 78 Hình 3.21: Màu sắc của cá sau 45 ngày nuôi tại 2 nghiệm thức: mẫu đối chứng và thức

ăn tổng hợp có kết hợp với 10% (v/w) dầu đậu nành 79 Hình 3.22: Màu sắc của cá sau 45 ngày nuôi tại 2 nghiệm thức: mẫu đối chứng và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 15% (v/w) dầu đậu nành 79 Hình 3.23: Màu sắc của cá sau 45 ngày nuôi tại 2 nghiệm thức: mẫu đối chứng và thức

ăn tổng hợp có kết hợp với 20% (v/w) dầu đậu nành 80 Hình 3.24: Màu sắc của cá sau sau 45 ngày nuôi tại 2 nghiệm thức: mẫu đối chứng và thức ăn tổng hợp có kết hợp với 25% (v/w) dầu đậu nành 80 Hình 3.25: Quy trình sản xuất dịch lên men bằng đầu tôm thẻ chân trắng và bổ sung dịch lên men vào thức ăn tổng hợp cho cá 81

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay ở Việt Nam ngành công nghiệp chế biến tôm thải ra hơn 200.000 tấn phế liệu và xu hướng ngày càng tăng nên đã gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng [94] Theo tài liệu nghiên cứu thành phần hóa học trong phế liệu tôm gồm: protein, khoáng, chitin, chất màu chủ yếu là astaxanthin tuy hàm lượng nhỏ nhưng hoạt tính sinh học cao [10] Phế liệu này được sử dụng chủ yếu trong sản xuất chitin – chitosan, tuy nhiên các phương pháp sản xuất chitin – chitosan đều sử dụng NaOH và HCl ở nồng

độ cao dẫn đến việc dư thừa hóa chất hơn nữa quá trình sản xuất chitin lại chưa chú ý đến công đoạn tiền xử lý để loại bớt một phần protein và khoáng nhằm mục đích giảm tải cho hệ thống xử lý nước thải và tận thu được nguồn protein, sắc tố có giá trị dinh dưỡng cao từ đầu tôm Đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng công đoạn tiền xử

lý trong quá trình sản xuất chitin và xử lý vi sinh vật là một quá trình được nhiều nhà khoa học quan tâm Phương pháp sử dụng vi sinh vật trong sản xuất chitin – chitosan bên cạnh thu sản phẩm xuất chitin – chitosan đạt chất lượng còn có thể thu hồi dịch lên men chứa hàm lượng chất có giá trị như: protein, astaxanthin, khoáng để tận dụng nguồn dinh dưỡng này làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, đối tượng thủy sản, nâng cao được giá trị của nguyên liệu và đặc biệt giúp giảm tải quá trình xử lý nước thải, hạn chế ô nhiễm môi trường Do đó, việc sử dụng vi sinh vật trong sản xuất chitin – chitosan rất quan trọng nên trong nghiên cứu này mục tiêu đề tài là áp dụng vi sinh vật ở công đoạn đầu của sản xuất chitin nhằm thu sản phẩm dịch lên men chứa những thành phần dinh dưỡng để làm thức

ăn cho các đối tượng trong NTTS, đồng thời góp vai trò trong việc hạn chế ô nhiễm môi trường do nguồn phế liệu tôm thải ra từ công nghiệp chế biến thủy sản ở Việt Nam

Với tính cấp thiết và lý do đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất dịch lên

men lactic giàu carotenoids từ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và thử nghiệm ứng dụng dịch lên men làm thức ăn cho cá Tứ Vân (Capoeta Tetrazona)”

được thực hiện

2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu đầu tôm

- Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men chua tự nhiên

- Xác định chế độ len men lactic thích hợp bao gồm: tỷ lệ chế phẩm bổ sung, thời gian lên men, tỷ lệ rỉ đường bổ bung vào nguyên liệu đầu tôm

- Thử nghiệm phối chế dịch lên men vào thức ăn cho cá Tứ Vân bao gồm: tỷ lệ dịch lên men bổ sung vào thức ăn và tỷ lệ dầu bổ sung tạo màng bao thức ăn

3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài là dẫn liệu khoa học về việc thu dịch lên men từ đầu tôm Những dẫn liệu khoa học này sẽ là tài liệu tham khảo cho sinh viên, giảng viên và các cán bộ nghiên cứu khoa học Đồng thời, kết quả nghiên cứu này sẽ

là cơ sở cho các nghiên cứu về lên men phế liệu từ tôm tiếp theo sâu và rộng hơn như nghiên cứu sản xuất quy mô công nghiệp, tinh chế, sử dụng làm thức ăn cho người…

Ý nghĩa thực tiễn: Việc tận dụng đầu tôm sau quá trình chế biến để sản xuất thức ăn cho cá cảnh không chỉ giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra được sản phẩm rất cần thiết cho việc sản xuất thức ăn cho nuôi trồng thủy sản – một ngành đang được quan tâm và ngày càng phát triển Việc tận dụng phế liệu đầu tôm sẽ mang lại lợi ích to lớn cho các doanh nghiệp chế biến thủy sản, đem lại hiệu quả kinh tế cao

Tính mới của đề tài: Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men tự nhiên,

sử dụng vào lên men đầu tôm nhằm ức chế hoạt động của vi sinh vật gây thối, tạo môi trường thuận lợi để enzyme hoạt động, thu hồi dịch lên men từ đó ứng dụng trong việc

bổ sung vào thức ăn nuôi cá Tứ Vân giúp tăng hàm lượng chất dinh dưỡng và tăng khả năng lên màu cho cá

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Nguồn lợi từ tôm

Hiện nay nuôi tôm đã phát triển ở nhiều địa phương trên cả nước Việt Nam và tôm nuôi đã đóng góp vào tỷ trọng xuất khẩu thủy sản suốt một thập kỷ vừa qua Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, lạch ven biển miền Trung và ở ĐBSH, sông Thái Bình ở miền Bắc Ngành hàng tôm nước lợ ở ĐBSCL giữ vai trò quan trọng trong lĩnh vực NTTS của Việt Nam, năm 2011 ngành công nghiệp tôm tại vùng này đã chiếm 92% diện tích nuôi và 75% sản lượng tôm nuôi cả nước [11] Giá trị xuất khẩu của tôm thường chiếm tỉ lệ cao trong tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam Tính trong năm 2012 thì giá trị xuất khẩu tôm đạt 2,25 tỷ USD (VASEP) Tôm Việt Nam chủ yếu được xuất khẩu dưới dạng tôm đông lạnh, đóng hộp và chế biến [14] Ngành NTTS nói chung và ngành nuôi tôm xuất khẩu nói riêng đã trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước ta hiện nay

1.1.2 Diện tích nuôi trồng, sản lượng và thị trường xuất khẩu tôm ở Việt Nam

Nghề nuôi tôm xuất hiện ở Việt Nam cách đây khoảng 100 năm trước Số liệu ghi chép được cho thấy vào thập kỉ 70 cả miền Bắc và miền Nam Việt Nam đều tồn tại hình thức nuôi tôm quảng canh Diện tích nuôi tôm ở ĐBSCL thời kì này đạt khoảng 70.000 ha Ở Miền Bắc, trước năm 1975 có 15.000 ha nuôi tôm nước lợ [25] Từ đó cho đến nay diện tích nuôi tôm ở Việt Nam đã tăng lên đáng kể và trở thành một trong những nước có diện tích nuôi tôm thuộc vào loại lớn nhất trên thế giới Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL bao gồm 6 tỉnh thuộc ĐBSCL, trong đó

Cà Mau có diện tích thả tôm lớn nhất

Bảng 1.1: Thống kê diện tích nuôi tôm 2010 tại 6 tỉnh ĐBSCL [3]

Song song với việc mở rộng về diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh

từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000, Việt Nam trở thành một trong 5 nước

có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm

Penaeus monodon, P merguiensis, P orientalis, và Metapenaeus ensis, trong đó P monodon là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất Từ năm 2000 tôm thẻ

chân trắng Nam Mỹ (P vannamei cũng được đưa vào nuôi ở Việt Nam)

Trong những năm gần đây, sản lượng nuôi tôm tăng lên đáng kể, năm 2011 tổng sản lượng nuôi tôm đạt 632,9 nghìn tấn và tăng 6,8% so với năm 2010 nhưng đến năm 2012 sản lượng nuôi tôm giảm gần 4% do dịch bệnh, tuy nhiên riêng sản lượng nuôi tôm nước lợ đã đạt hơn 470.000 tấn [15]

Thị trường xuất khẩu tôm quan trọng của Việt Nam là Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc và liên minh Châu Âu (Đức, Anh, Pháp và Bỉ là nhập khẩu tôm nhiều) Hiện nay Nhật Bản vẫn được xem là thị trường lớn nhất nhập khẩu tôm Việt Nam, đạt 505.180 triệu USD Năm 2011 sản phẩm tôm xuất khẩu đạt 220.000 tấn tương đương khoảng 2,4 tỷ USD, xuất khẩu tôm chiếm 18% về khối lượng và 38% về giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam [11] Năm 2012, Việt Nam xuất khẩu tôm sang 92 thị trường, tổng giá trị ước tính 2,25 tỷ USD, giảm 4,7% so với cùng kỳ năm ngoái [15]

Thị trường xuất khẩu chính trong 9 tháng đầu năm 2011 của Việt Nam đối với mặt hàng thủy sản thể hiện ở Hình 1.1

Hình 1.1: Đồ thị thể hiện phần trăm thị trường xuất khẩu chính trong 9 tháng

đầu năm 2011 của Việt Nam đối với mặt hàng thủy sản (Vasep 2011)

1.1.3 Giới thiệu chung về phế liệu tôm

Theo thống kê của Tổ chức lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) thì sản lượng tôm trên thế giới khoảng trên dưới 4 triệu tấn/năm Hầu hết sản lượng tôm trên thế giới từ các nước đang phát triển như: Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc,

5 Ecudo, Malaysia, Ấn Độ và Indonexia Theo đó đã tạo ra một lượng phế liệu tôm rất lớn, ước tính có khoảng 1,6 – 2 triệu tấn/năm [2] Ở Mexico mỗi năm chất thải tôm thải ra từ 35.000 tấn đến 40.000 tấn, một phần chất thải này làm thức ăn cho gia súc nhưng hầu hết đều gây ảnh hưởng đến hệ sinh thái [88]

Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm rất dồi dào, khả năng khai thác từ 25.000 – 30.000 tấn/năm Toàn vùng biển Nam Bộ có trữ lượng và khả năng khai thác lớn nhất nước ta, ước tính khả năng khai thác bằng 50% sản lượng của cả nước Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển trong những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 Qua đó thì lượng phế liệu thải ra của tôm cũng vô cùng lớn, theo thống kê của Trung tâm Nghiên Cứu Chế Biến Thủy Sản, Đại học Thủy Sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000 tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 75.000 tấn/năm và tiếp tục tăng trong những năm tiếp theo Năm 2008 Việt Nam đứng hàng đầu thế giới về nuôi tôm sú, tôm sú là đối tượng nuôi rất quan trọng trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến xuất khẩu ở nước ta (chủ yếu tập trung ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long trên 90% sản lượng) Theo Bộ Thủy Sản (2008), tổng sản lượng tôm nuôi 392.000 tấn, trong đó tôm sú khoảng 360.000 tấn Cùng với việc tăng sản lượng tôm sú xuất khẩu sẽ là sự gia tăng lượng phế liệu đầu, vỏ tôm [2]

Với sản lượng tôm hàng năm mà nước ta đạt được như trên đã đem lại giá trị kinh tế rất cao cho đất nước nhưng chính vì vậy mà phế liệu từ tôm bị thải ra môi trường cũng ngày càng nhiều do đó nếu không có hướng giải quyết vấn đề trên thì môi trường sẽ ngày càng bị ô nhiễm nghiêm trọng từ đó gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Hiện nay phế liệu tôm thải ra từ các cở sở chế biến tôm bao gồm: Đầu, vỏ

và đuôi tôm ngoài ra còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến màu Tùy thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể vượt quá 60%

khối lượng sản phẩm, ví dụ: Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm, tôm sú: Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới

40% trọng lượng tôm Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ đuôi của tôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm Đối với tôm thẻ thì lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37% [22] Nguồn phế liệu này ngày càng tăng lên do đó nếu không được giải quyết sẽ gây

ra vấn đề về môi trường

Qua các nghiên cứu người ta đã xác định được trong đầu tôm chứa những thành phần chủ yếu là protein, sắc tố, chitin, lipid, chất khoáng và đây là cơ sở để ta tiến hành nghiên cứu những phương pháp nhằm thu hồi những hợp chất có giá trị còn tồn tại trong phế liệu, từ đó ngoài việc mang lại lợi ích kinh tế thì cũng sẽ giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường

1.1.3.1 Thành phần, tính chất phế liệu tôm

Trong thành phần phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 35 ÷ 45% trọng lượng của tôm nguyên liệu, phần vỏ chiếm 10 ÷ 15% Tuy vậy, tỷ lệ này còn phụ thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng [10]

Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, canxi cacbonate, sắc tố mà có thể được phục hồi [73] Tỷ lệ các thành phần này không ổn định vì chúng thay đổi theo giống, đặc điểm sinh thái, sinh lý,… Thành phần chitin và protein trong vỏ tươi tương ứng là 4,50% và 8,05%, trong vỏ tôm khô là 11 –27,50%

và 23,25 – 53% Hàm lượng chitin, protein, khoáng và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bảo quản cũng như phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30 – 40%), khoáng (30 – 50%), chitin (13 – 42%) [22]

Bảng 1.2: Thành phần đầu và vỏ phế liệu tôm (%) [10]

Protein: Protein đầu tôm phần lớn thuộc loại khó tiêu hóa và khó trích ly, protein đầu tôm thường tồn tại ở hai dạng chính là dạng tự do (có trong nội tạng và có gắn với phần thân tôm) và dạng liên kết với chitin hoặc canxicacbonat như một phần thống nhất của vỏ tôm

Hệ enzyme: Hệ enzyme của tôm thường có hoạt độ mạnh hơn đặc biệt ở cơ quan nội tạng thuộc phần đầu tôm do đó bộ phận này rất dễ bị hư hỏng Hệ enzyme của tôm bao gồm: Protease là enzyme chủ yếu trong đầu tôm, chủ yếu phân giải protein thành acid amin Lipase phân giải lipid thành glyxeryl và acid béo Đối với Tyrozinaza thì khi có mặt của oxi không khí thì sẽ biến đổi tyrozin thành melanin có màu đen ảnh hưởng đến giá trị cảm quan và chất lượng của sản phẩm

7 Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng, và những hợp chất hữu

này đã gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế

Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ

Astaxanthin: Là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của caroten, thường ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh đặc trưng cho tôm Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin Trong đầu tôm có chứa một lượng nhỏ sắc tố nhưng nó cực kỳ có giá trị vì vậy người ta đã có nhiều nghiên cứu nhằm thu hồi sắc tố một cách triệt để nhất trong phế liệu tôm và đi kèm với nó là việc thu hồi protein

để từ đó làm tăng giá trị sản phẩm, tạo sản phẩm mới và cải thiện môi trường đáng kể

Lipid: Chứa một lượng đáng kể, chủ yếu gồm các acid béo chưa no bão hòa như EPA, DHA Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con người và có nhiều ứng dụng khác trong y học

Chất ngấm ra ở đầu tôm: Trymethylamin (TMA), Trymethinlaminoyt (TMAO), Betain, bazo purin, các acid amin tự do, ure…

Từ thành phần, tính chất nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm, nhận thấy đây là nguồn nguyên liệu phong phú không chỉ sản xuất chitin - chitosan mà còn chứa một lượng protein, astaxanthin và các acid béo không no có lợi cho cơ thể cần được thu hồi

Vậy trong phế liệu tôm có chứa rất nhiều thành phần giá trị nên cần có chế độ xử lý thích hợp đối với nguồn phế liệu tôm bao gồm đầu và vỏ nhằm thu được thành phẩm có chất lượng cao Việc tách phần lớn protein, chất màu, khoáng trước khi sản xuất chitin, chitosan bằng cách sử dụng vi sinh vật để lên men lactic và ta tận dụng dịch lên men này làm thức ăn cho chăn nuôi là một phương phát xử lý phế liệu tôm này Từ đó, vừa góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế, vừa giảm được sự ô nhiễm môi trường do nguồn phế liệu tôm thải ra, bảo vệ môi trường đưa ngành thủy sản phát triển bền vững

1.1.3.2 Thành phần caroteinoprotein

Carotenoprotein là phức chất giữa protein và carotenoid được tìm thấy ở nhiều sinh vật biển Đặc biệt, carotenoprotein có nhiều ở nhiều loài động vật giáp xác, không những tồn tại nhiều ở lớp ngoại bì, trong vỏ mà còn phân bố rộng ở các bộ phận cơ quan như trứng, dạ dày hay bạch huyết của chúng [41] Một số loài giáp xác đã được nghiên cứu

chiết rút carotenoprotein như tôm, cua, ghẹ [52], [66] Carotenoprotein được chia thành 2 nhóm chính: (1) carotenoprotein thật: có sự liên kết chặt chẽ giữa carotenoid với protein, (2) carotenolipoprotein: carotenoid liên kết với các nhóm lipid và không thể hiện liên kết

cụ thể với protein [66] Zagalsky cho rằng phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng mang điện của β-astaxanthin là điều kiện tiên quyết cho phản ứng giữa nhóm carbonyl trong carotenoid với các gốc amin để hình thành carotenoprotein [97] Bên cạnh

đó, tất cả các carotenoprotein đều được tách ra thành carotenoid và apoprotein bằng aceton hoặc ethanol Crustacyanin và ovorudin là những carotenoprotein có thể được khôi phục lại dạng tự nhiên khi trộn hỗn hợp dung dịch aceton của carotenoid với dung dịch protein, pha loãng với nước, tách aceton ra Các carotenoid có liên quan đến protein thì ít

bị oxi hóa hơn các carotenoid khác ở dạng tự do [52]

Carotenoid có nguồn gốc từ sinh vật biển được sử dụng rộng rãi như là một chất màu tự nhiên an toàn cho các ngành công nghệ thực phẩm, được phẩm và mỹ phẩm Carotenoid có vai trò quan trọng để loại trừ hoặc ngăn chặn một số bệnh thoái hóa cơ thể như chứng xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa cơ thể và các bệnh về mắt [68] Carotenoid chiết tách từ các loài giáp xác có chức năng hình thành sắc tố được xem như là một nguồn tiền tố vitamine A quan trọng và là nhóm chất chống oxy hóa

Hình 1.2: Các liên kết hóa học của astaxanthin trong tôm [27]

9 Armenta và Guerrero – Legarreta cho biết trong phế liệu tôm, carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%) [36] Astaxanthin là một carotenoid, thuộc nhóm chất phytochemical tecpen, là chất sắc tố màu vàng đỏ Giống như nhiều carotenoid, nó là một chất màu hòa tan trong mỡ hoặc dầu Astaxanthin có thể được tìm thấy trong vi tảo, men bia, cá hồi, cá, loài nhuyễn thể, tôm, tôm càng, động vật giáp xác, và những chiếc lông của một số loài chim Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu tập trung ở phần vỏ ngoài Astaxanthin thường tồn tại ở dạng tự do, dạng mono hay di-ester với các acid béo không

no mạch dài, hoặc dưới dạng phức hợp carotenoprotein của đồng phân quang học (3S, 3’S) Hàm lượng astaxanthin trong vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể theo tùy loài (từ 10-140 mg/kg trọng lượng ướt hay là khoảng 50 – 700 mg/kg trọng lượng khô), chứng tỏ ở vỏ các loài giáp xác chứa một nguồn astaxanthin tự nhiên đáng kể [22] Astaxanthin được thu nhận từ các loài sinh vật biển, có ảnh hưởng rất lớn đối với cơ thể con người, như có khả năng ngăn chặn sự oxy hóa của các acid béo không no có lợi, ngăn chặn ảnh hưởng của tia cực tím, tăng khả năng miễn dịch, hình thành chất màu, quá trình sao chép và truyền dẫn thông tin [68] Astaxanthin là chất chống oxy hóa rất hiệu quả, có khả năng bảo vệ phospholipid của màng tế bào khỏi sự peroxid hóa, hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin lớn hơn gấp 10 lần các carotenoid khác như zeaxanhin, lutein, canthaxanthin

và β-caroten Ngoài ra, astaxanthin cũng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch 1.1.3.3 Các hướng tận dụng phế liệu tôm hiện nay

Sản xuất chitin – chitosan: Chitin – chitosan có nguồn gốc khác nhau như từ tôm, cua, mực… chúng đóng một vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp Hiện nay chitin – chitosan được nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như ứng dụng vào trong việc xử lý nước thải, công nghiệp dệt nhuộm, giấy, cố định enzyme, tạo viên bọc tế bào trong y học, làm chất ổn định trong mỹ phẩm… Có rất nhiều ứng dụng dựa vào chitin – chitosan do vậy nguồn phế liệu tôm hiện nay được sử dụng nhiều trong việc sản xuất chitin và chitosan

Sản xuất bột màu astaxanthin: Thành phần hóa học của tôm rất giàu protein nên trước khi sản xuất chitin chúng ta nên thu hồi protein lại Trong thành phần của vỏ phế liệu cũng chứa sắc tố astaxanthin, tuy nó có hàm lượng nhỏ nhưng giá thành lại cao trên thị trường (2.500 USD/kg) Hơn nữa astaxanthin còn là một carotenoid có tác dụng kích thích sinh trưởng, kháng một số bệnh, chống oxy hóa, tăng chất màu cho sản phẩm nuôi, tăng màu hương vị cho sản phẩm

Chế phẩm thu được là thành phần carotenoprotein ngày càng sử dụng phổ biến trong thực phẩm, đặc biệt sử dụng trong chế biến thực phẩm chức năng; vì ngoài tính dinh dưỡng do protein mang lại thì nó còn có tính chức năng của carotenoid và protein mạch ngắn (peptide) mang lại như tính chống oxy hóa Bên cạnh đó, các acid amin cũng góp phần tạo màu và mùi trong công nghệ chế biến thực phẩm [52]

Sản xuất làm thức ăn chăn nuôi: Hiện nay ở nước ta đa số sử dụng phế liệu tôm đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn nuôi Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy hiện nay có chứa bột tôm và nó chiếm 30% thành phần thức ăn Bột tôm được chế biến tốt

có chứa acid amin tương tự như amin trong đậu tương hay trong bột cá Phế liệu tôm

có chất lượng càng cao thì bột tôm có chất lượng càng cao Do vậy việc xử lý và chế biến phế liệu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất bột tôm có chất lượng cao Nếu công nghệ chế biến không phù hợp thì nó cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và acid béo thiết yếu sẽ bị ảnh hưởng

Hiện nay có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất bột tôm là phương pháp sấy khô và phương pháp ủ xi lô:

+ Phương pháp sấy khô bằng nhiệt độ

Ưu điểm là đơn giản, có thể chế biến nhanh lượng phế liệu tôm đông lạnh, tính kinh tế cao

Nhược điểm là chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao

+ Phương pháp ủ xi lô: ở phương pháp này người ta sử dụng acid hữu cơ và vô cơ trong việc ủ nhằm tác động của enzyme khử trùng và hạn chế phát triển của vi sinh vật Sau khi ủ tiến hành trung tính bằng các chất kiềm, chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi

Phương pháp này có ưu điểm là chất lượng tốt nhưng giá thành cao và phức tạp Sản phẩm súp và canh: Có thể sử dụng các mẫu thừa của tôm chất lượng cao sau khi chế biến làm món canh và súp tôm Đầu tôm được sử dụng làm nguyên liệu tạo mùi cho món súp tôm đặc biệt, tôm vụn được sử dụng làm món canh tôm

Làm các sản phẩm định hình: Thịt tôm vụn hoặc không đạt chuẩn có thể được chế biến thành các sản phẩm định hình Sản phẩm này được định hình lại thành những hình con tôm hay các hình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm Bằng cách tạo ra các hình dạng khác nhau, ướp tẩm gia vị hay bao bột, ta có thể làm ra rất nhiều sản phẩm tôm đẹp mắt Các sản phẩm định hình này được làm chín trong các lò thường hoặc lò vi sóng giống như các sản phẩm từ tôm khác

11

1.2.1 Tác nhân lên men lactic [24]

1.2.1.1 Khái quát chung

Tác nhân lên men lactic là vi khuẩn lactic Tế bào của chúng hình cầu (hoặc hình hơi oval) và hình que Đường kính của các dạng cầu khuẩn từ 0,5 – 1,5 µm Cầu khuẩn

đứng riêng lẽ, cặp đôi hoặc chuỗi (Streptococcus) có chiều dài khác nhau Kích thước

dạng hình que từ 1– 8 µm các tế bào trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi

Tất cả các vi khuẩn lactic đều không chuyển động và không sinh bào tử, Gram dương (+), kị khí tùy tiện Trực khuẩn lactic nhạy cảm hơn cầu khuẩn với oxy [22]

Vi khuẩn lactic có thể lên men được mono và disaccarit Một số chủng không lên men được saccarose, số khác là maltose, lactose Tinh bột và các polysaccarit khác các

vi khuẩn lactic không lên men được Số chủng dị hình sử dụng được pentose và acid [22]

Phần lớn vi khuẩn lactic, đặc biệt là chủng trực khuẩn lên men đồng hình, có nhu cầu lớn về tập hợp các acid amin hoặc các nitơ hữu cơ có cấu tạo phức tạp Hầu hết vi khuẩn lactic đều có nhu cầu các vitamin (trong đó có B1, B2, B6, PP, acid pantotenic và folic) [22]

Vi khuẩn lactic có hoạt tính protelytic, chúng có thể thủy phân protein thành peptid và các acid amin, chủng trực khuẩn có hoạt tính cao hơn những loài khác [22]

etylic, nhiều loại sống trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn chịu được nồng độ muối cao (7 – 10%) [22]

Một số vi khuẩn có khả năng tạo màng nhầy, là các polysaccarit (polymer sinh học), một số khác sinh bacterioxin – chất có hoạt tính kháng sinh, chất đại diện và được dùng trong bảo quản là nisin [22]

Đa số các vi khuẩn lactic thuộc dạng ưa ấm nhiệt độ sinh trưởng tối thích là

30 phút Loài trực khuẩn có thể phát triển ở pH 3,8 – 4, pH tối thích cho trực khuẩn lên men là 5,5 – 6 [22]

1.2.1.2 Các chủng lên men đồng hình

Streptococcus lactic: Hình cầu, kết đôi hoặc chuỗi ngắn, ưa ấm, nhiệt độ thích

chủng tạo thành bacterioxin ở dạng nisin Chủng này được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm sữa chua, bơ chua, phomat [22]

Str cremosis: Hình cầu, kết thành chuỗi dài, ưa ấm và tạo thành ít acid Khoảng

baterioxinở dạng diplococxin [22]

Str thermophilus: Chuỗi hình cầu dài, phát triển mạnh ở nhiệt độ 40 – 45 oC,

tích tụ trong môi trường khoảng 1% acid, được sử dụng cùng với Lactobacillus trong

chế biến sữa chua và phomat [22]

Lactobacillus bungaricus: Hình que lớn (đôi khi ở dạng hạt), thường kết chuỗi

dài, không lên men saccarozơ Vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp phát triển là 40 –

acid lactic, được dùng trong sản xuất sữa chua Địa Trung Hải, Cumic [22]

L casein: Thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn khác nhau, tích tụ tới 1,5%

xuất phomat [22]

L acidophilus: Vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ tối thiếu là 20 oC, nhiệt độ thích hợp

bacteriocin ức chế vi sinh vật gây bệnh đường ruột Một số chủng sinh màng nhầy, dùng để sản xuất các sản phẩm sữa acidophin [22]

L delbrueckii: Trực khuẩn ưa nhiệt, đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi dài,

cơ chất tích tụ được 2,5% acid, được sử dụng sản xuất acid lactic và sản xuất bánh mì

L plantarum: Trực khuẩn nhỏ thường kết đôi hoặc kết thành chuỗi, nhiệt độ tối

xanh cho gia súc [22]

13 1.2.1.3 Các chủng lên men dị hình

Lactobacillus brevis: Tìm thấy chủ yếu trong muối dưa chua bắp cải, rau cải, dưa

chuột Lên men được saccarozơ và tích tụ được 1,2% acid lactic, ngoài sinh ra acid nó còn

L diacetilacte, Str citrovonus sản phẩm tạo ra của các loại này ngoài acid

muối của acid citric [22]

1.2.2 Cơ chế lên men lactic

Lên men lactic là sự chuyển hóa kị khí các chất glucid thành acid lactic nhờ hoạt động sống trực tiếp vi sinh vật Lên men lactic là một trong những quá trình chuyển hóa phát triển nhất trong tự nhiên Có hai dạng lên men lactic: lên men đồng hình và lên men dị hình

Lên men đồng hình (lên men điển hình) cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (80 – 90%) Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon để tạo thành acid acetic, ethanol,

C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 22,5 Kcal

Quá trình chuyển hóa glucose đến acid pyruvic vi khuẩn lactic đồng hình xảy ra như ở các loại vi khuẩn kị khí khác, theo con đường đường phân Ở những vi khuẩn không có enzyme pyruvatdecacboxylaza, acid pyruvic không bị phân giải mà lại là

điện tử tạm thời được tách ra trong quá trình oxy hóa photphoglyxerinaldehyt thành

về NAD Phản ứng oxy hóa khử được xúc tác bởi enzyme lacticodehydrogenaza được biểu thị ở phương trình:

Lên men dị hình (lên men không điển hình): Nhóm lên men lactic không điển hình còn gọi là lên men lactic dị dạng Nhóm vi khuẩn này quá trình lên men phức tạp hơn Sản phẩm chính là acid lactic cùng số lượng khá lớn những sản phẩm phụ khác

trưnng Sự biến đổi glucose vi khuẩn lên men dị hình xảy ra khác với vi khuẩn lên men

đồng hình Vi khuẩn dị hình không có enzyme aldolaza làm thay đổi con đường chuyển hóa đầu tiên của glucose Sau khi photphoryl, đường bị oxy hóa (điện tử H+)

photphoxentalaza tham gia biến đổi thành aldehytphotphatglyxerin và được chuyển hóa thành acid pyruvic, tiếp tục khử tạo acid lactic Axetylphotphat bị khử photphoryl thành acid acetic hoặc rượu etylic Chất điện tử cuối cùng theo con đường này là acid pyruvic và aldehyt axetic

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

Nguồn carbon: Nguồn carbon tốt nhất là các loại đường nhưng ở một mức độ nhỏ, các đường chứa nhóm rượu, còn polysacarit thì thực chất không thể lên men Tốc độ lên men các loại monosaccarit, disaccarit và oligosaccarit của các loại khác nhau là khác nhau đến mức có thể dùng tiêu chuẩn này để phân biệt giữa các loài Nếu khi nhân giống người

ta dùng một lượng đường thông thường hiếm khi được dùng làm nguồn carbon thì vi khuẩn có thể thích nghi được đối với loại đường đó và về sau chúng có thể phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này, mà vẫn không làm ảnh hưởng tới khả năng lên men của các loại đường thông thường Nồng độ đường glucose ban đầu cao sẽ làm giảm thời gian và tăng lượng acid lactic tạo ra trong quá trình lên men [89], [24]

Vitamin B6: Một vitamin quan trọng trong sự sinh tổng hợp các acid amin của

vi khuẩn lactic cũng có thể thay thế bởi một số acid amin Tuy nhiên phụ thuộc vào từng loại vi khuẩn lactic, nhiều acid amin vẫn được coi là acid amin không thể thay

trường hợp các hợp chất này vẫn mang đặc tính của những nhân tố sinh trưởng Tốc độ sinh trưởng khi có mặt chúng có thể gấp nhiều lần so với khi có mặt acid amin tự do

Sự phụ thuộc của tốc độ sinh trưởng vào nồng độ các vitamin có thể được sử dụng cho phép định lượng các vitamin này nhờ vi khuẩn, những phép thử này thường rất nhạy, chẳng hạn có thể phát hiện hàm lượng B12 nhỏ tới picogam/ml [24]

Các acid béo: Cũng ảnh hưởng lên sinh trưởng của các vi khuẩn lactic nhờ những cơ chế còn chưa được biết rõ

Phosphate: Là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu Các muối amon không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất Song chúng gây một số ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin Sự có mặt của một số muối khoáng có lẽ không phải là bắt buộc và hàm lượng có sẵn của chúng trong các môi trường phù hợp [24]

15 Nhiệt độ: Là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi khuẩn Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sinh trưởng mà vi khuẩn được chia làm 2 nhóm là nhóm ưa nhiệt và nhóm phát triển ở nhiệt độ vừa phải

Như đã nói ở trên acid lactic mới tạo thành phải được trung hòa liên tục, để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nằm giữa pH 5,5 và 6,0 Lên men

bị ức chế mạnh ở pH 5 và sẽ dừng lại ở pH < 4,5 [24]

1.3.1 Phương pháp lên men lactic phế liệu thủy sản

Ủ chua hay còn gọi là lên men thức ăn cho gia súc, động vật nuôi là phương pháp

để bảo quản nguyên liệu có từ lâu đời trong nhân dân Quá trình ủ chua được thực hiện nhờ có các chủng vi khuẩn lactic có sẵn trong môi trường tự nhiên hoặc được cung cấp từ ngoài vào giúp cho sản phẩm ủ chua đạt được chất lượng mong muốn từ đó cung cấp nguồn dinh dưỡng cho động vật Thức ăn ủ chua là một dạng thức ăn rất thiết yếu cho động vật nuôi trong nông nghiệp Nó là kết quả của quá trình acid hóa, mà thực chất là kết quả của sự lên men trong điều kiện yếm khí Một số loài vi khuẩn lactic được Tomas James Rees [92] tìm thấy trong thành phẩn ủ chua được nêu ra ở Bảng 1.3

Bảng 1.3: Một số loài vi khuẩn lactic có trong sản phẩm ủ chua [92]

P pentosaceus

E faecalis

Trong nông nghiệp, người ta sử dụng ủ lên men cho nguyên liệu cây nông nghiệp, cỏ tươi để làm thức ăn cho động vật nuôi: Trâu, bò, heo, gà… Trong môi trường lên men, người ta thường bổ sung muối, rỉ đường thích hợp, nồng độ acid để ức chế vi sinh vật gây thối, gây hư hỏng nguyên liệu Nguyên liệu sau khi lên men bên trong sẽ tạo thêm một số sản phẩm có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng sinh (Nizin, diplocacxin…) [29] Do đó, kích thích cho gia súc, động vật nuôi ăn ngon miệng, tiêu hóa tốt, chóng lớn, lên cân, và đồng thời kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu hơn so với nguyên liệu tươi ban đầu

Ngoài việc áp dụng lên men trên nguyên liệu thuộc cây nông nghiệp, người ta còn tiến hành lên men đối phế liệu cá, nội tạng bào ngư, phế liệu đầu vỏ tôm, để sử dụng làm thức ăn cho động vật nuôi [29]

Cá sau khi ủ lên men làm thức ăn động vật ở dạng lỏng, có thể sử dụng cá nguyên liệu hay phế liệu cá, với sự tham gia của enzyme nội tại trong bản thân nguyên liệu, các thành phần acid hay vi khuẩn lactic bổ sung vào trong quá trình ủ Một thử nghiệm với cá

ủ lên men bắt đầu tại Thụy điển năm 1963, sử dụng acid chlohydric, acid sunfuric, acid formic và rỉ đường [70], đã cho kết quả là ức chế vi sinh vật gây thối, tăng khả năng phân giải protein, khoáng Ở Việt Nam năm 2002, dự án nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men lactic trong bảo quản và chế biến phế thải thủy sản đã sử dụng rỉ đường, chế

phẩm vi sinh L plantarum để tạo sản phẩm lên men khi ủ chua cá nhằm cung cấp thức ăn

cho vật nuôi, kết quả cho thấy khả năng bảo quản phế thải kéo dài đến 60 ngày, sản phẩm

có mùi chua, màu nâu đỏ và không hôi [29] Tiến hành lên men cho nguyên liệu cá có thể thực hiện theo hai cách: Đó là ủ trực tiếp bằng việc bổ sung acid vào và ủ cá nhờ quá trình lên men với sự tham gia của vi khuẩn lactic, cả hai cách đều bổ sung chất dinh dưỡng cho vật nuôi nhưng thực hiện ủ cá theo phương pháp sinh học thì sẽ cho kết quả tốt hơn là ủ theo phương pháp bổ sung acid [67]

Đối với phế liệu tôm phương pháp lên men cũng được ứng dụng khá phổ biến để bảo quản và đồng thời để chế biến dịch dịch lên men và sử dụng phối trộn thức ăn gia xúc Cũng trong dự án nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men lactic trong bảo quản và chế biến phế thải thủy sản thì người ta đã nghiên cứu trên đối tượng phế liệu tôm bằng cách bổ sung rỉ đường và chế phẩm vi sinh, dịch lên men thu được qua quá trình theo dõi 60 ngày thì thấy có mùi chua, màu nâu sẫm [29]

17 Sản phẩm lên men phế liệu tôm làm thức ăn cho động vật ở dạng lỏng, đôi khi còn gọi là protein lỏng Sự hoá lỏng của mô tôm là kết quả của việc thủy phân protein nhờ hoạt động của enzyme trong bản thân nguyên liệu, ngoài ra còn được hỗ trợ bằng cách bổ sung thêm các acid hữu cơ do vi khuẩn lactic sinh ra, acid vô cơ được thêm vào Protein thu được trong dịch lên men đánh giá chất lượng của quá trình ủ chua sản phẩm [8]

Bổ sung trực tiếp chủng vi khuẩn lactic vào mẻ ủ phế liệu tôm là phương pháp thu hồi protein, astaxanthin phổ biến hiện nay Như vậy, khi áp dụng phương pháp này, đã tận thu phần lớn protein để làm thức ăn chăn nuôi từ nguồn phế liệu tôm, bên cạnh đó hàm lượng chất màu astaxanthin sẽ thu được trong dịch lên men, ủ chua bằng phương pháp sinh học sẽ ít làm ảnh hưởng đến thành phần astaxanthin này nên hàm lượng astaxanthin thu được cao Đồng thời trong quá trình ủ còn có một lượng khoáng trong vỏ tôm cũng được tách ra một phần do kết hợp sử dụng lượng acid hỗn hợp gồm hữu cơ và vô cơ với nồng độ và tỷ lệ thích hợp trong quá trình ủ Bã tôm sau khi được tách riêng khỏi dịch ép,

sẽ sử dụng cho việc sản xuất chitin Có thể minh họa bằng sơ đồ quy trình Hình 1.4

Hình 1.3: Sơ đồ tóm tắt lên men lactic phế liệu tôm Quá trình lên men phế liệu tôm bằng vi sinh vật là một phương pháp sinh học, sản phẩm ủ chua dựa trên quá trình lên men tự nhiên của vi khuẩn lactic, sản phẩm tạo

ra trong điều kiện yếm khí chủ yếu là acid lactic kết quả làm cho pH trong mẻ ủ giảm xuống so với pH ban đầu pH giảm làm ức chế vi khuẩn yếm khí có hại do đó sản phẩm lên men phế liệu tôm có thể làm thức ăn gia súc và được bảo quản lâu Quá trình biến đổi pH trong thời gian lên men phế liệu tôm có thể chia thành các giai đoạn sau

và các giai đoạn này có đặc tính riêng biệt:

 Giai đoạn đầu, giai đoạn hiếu khí: khi lên men thì vẫn tồn tại khí oxi trong mẻ

ủ, lúc này pH của phế liệu tôm tương đối cao, pH từ 6,9 – 7 Trong điều kiện này thì

các vi sinh vật hiều khí, hiếu khí tùy ý như nấm, nấm men và Enterobacteria vẫn hoạt động, giai đoạn này thường mất khoảng một vài giờ

 Quá trình lên men kéo dài trong thời gian vài ngày sau khu ủ và trở thành kị khí Vi khuẩn lactic phát triển và trở thành vi khuẩn chiếm ưu thế Acid lactic và các acid khác được tạo ra làm pH giảm xuống còn 3,8 – 3,5

 Giai đoạn này ổn định, hầu hết các vi sinh vật giai đoạn 2 từ từ giảm số lượng Một số vi sinh vật có khả năng chịu acid tồn tại trong thời gian này gần như không

hoạt động, những vi sinh vật khác như Clostridia và trực khuẩn thì tồn tại dưới dạng

bào tử, chỉ có một số enzyme như protease chịu acid và một số vi sinh vật chẳng hạn

như Lactobacillus Buchneri tiếp tục hoạt động ở mức thấp

 Sau một thời gian lên men pH trong môi trường lại có xu hướng tăng lên vì khi acid lactic tích tụ khá cao thì chính các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, lúc này một số nấm men, nấm mốc có khả năng phân hủy acid lactic cũng phát triển mạnh như nấm mốc

Oidium lactic và nấm men Mycodema Các loài vi sinh vật này có khả năng phân hủy acid

lactic bằng cách oxy hóa acid lactic để cung cấp năng lượng cho chúng nên bắt đầu lượng acid lactic giảm xuống thì lại tạo điều kiện cho vi sinh vật gây thối phát triển [96], bên cạnh đó sau khi ủ thì mẻ lên men sẽ được lấy ra thì bắt đầu có sự tiếp xúc với không khí Điều này làm kích hoạt các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mà chủ yếu là nấm men, nấm mốc, trực khuẩn làm cho mẫu lên men hư hỏng [60]

Trong thời gian lên men, vi khuẩn acid lactic chuyển đổi cacbonhydrat thành acid lactic và giảm độ pH Hỗn hợp lên men sẽ được bảo vệ nhờ độ pH giảm xuống thấp, tạo điều kiện cho các enzyme phân giải protein (protease) có sẵn trong phế liệu tôm, làm phá vỡ các mô protein tạo ra sản phẩm có dạng lỏng Hầu hết protein được thủy phẩn thành các peptide ngắn, một số trong đó có thể tiếp tục chuyển hóa tạo các acid amin tự do [71] Những sản phẩm lên men này có thể sử dụng làm thức ăn gia súc

và phân bón [58] Những vi khuẩn gây bênh như Clostridium botulinum sẽ bị phá hủy

trong quá trình lên men [78]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết lên men lactic

1.3.2.1 Vai trò của acid lactic do vi khuẩn lactic tạo ra và acid vô cơ / hữu cơ bổ sung trong quá trình lên men

Trong quá trình lên men lactic ở thời gian đầu tiên có bổ sung acid vô cơ nhằm mục đích hạ thấp pH ban đầu để khống chế quá trình gây thối do vi sinh vật gây thối,

19 bảo quản nguyên liệu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho chủng vi khuẩn lactic được

bổ sung vào thực hiện quá trình lên men hiệu quả, đồng thời enzyme nội tại hoạt động

Thông thường người ta sử dụng acid formic với hàm lượng 3% (w/v) làm tác nhân để hạ pH xuống 4, acid formic chứa một số thành phần có tác dụng khử trùng, ức chế vi khuẩn và bảo quản phế liệu [8]

Việc sử dụng các acid hữu cơ như acid formic để bảo quản phế liệu từ nguyên liệu tươi đã được dùng trong thực phẩm bắt đầu từ sau chiến tranh thế giới thứ II Với những lợi ích của acid formic như không tạo ra thành phần acid thừa trong dịch

ủ nên không cần phải trung hòa bằng một bazơ trước khi sử dụng sản phẩm thu được Nhìn chung giá thành của acid hữu cơ này tương đối cao nên người ta đã kết hợp thêm các thành phần acid vô cơ khác để có thể giảm bớt giá thành sử dụng [69] Vì vậy, khi ủ phế liệu tôm, có thể sử dụng hỗn hợp acid hữu cơ và vô cơ như là acid formic, acid chlohydric, và/hoặc acid sunfuric, acid propyonic và hydrochloric và/hoặc acid sunfuric với các nồng độ khác nhau [8]

Sự hiện diện của acid hữu cơ do chủng vi khuẩn lactic tạo ra và acid vô cơ bổ sung vào trong quá trình lên men lactic sẽ làm giảm pH của môi trường, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rữa, và do đó kéo dài thời gian bảo quản cho nguyên liệu Việc hạ pH môi trường ủ bằng acid vô cơ và lên men bằng chủng vi khuẩn lactic trong quá trình ủ có những tác dụng sau:

+ Khi hạ pH bằng acid vô cơ ở giai đoạn đầu tiên trong quá trình lên men có tác dụng thủy phân đường thành những đường đơn nhằm cung cấp nguồn cacbon dồi dào cho sự phát triển của vi khuẩn lactic Đồng thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rữa, tạo môi trường thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển

+ Tác dụng thủy phân protein trong phế liệu tôm do hoạt động của enzyme protease trong bản thân nguyên liệu, hạ pH thúc đẩy lên mem lactic nhờ quá trình ủ có

bổ sung rỉ đường

+ Ức chế hoạt động, sự phát triển của vi sinh vật gây thối, nấm mốc, bảo quản cho vỏ tôm không bị hư hỏng, đảm bảo chất lượng chitin sau này

+ Với acid hữu cơ do vi khuẩn lactic tạo ra có tác dụng kháng khuẩn, decalxi hóa, tách khoáng ra khỏi vỏ tôm tạo điều kiện thuận lợi khi sản xuất chitin

+ Mặt khác còn tạo thành dịch chứa protein, astaxanthin lỏng có giá trị về mặt dinh dưỡng khi thu hồi tận dụng làm thức ăn cho gia súc động vật nuôi, có tác dụng ngăn chặn sự oxy hóa astaxanthin, ổn định hàm lượng này để có thể tận thu dịch

Như vậy, có thể sử dụng phương pháp lên men lactic cho nguyên liệu đầu tôm nhằm tách protein, astaxanthin và khoáng trước khi sử dụng sản xuất chitin Dịch lên men thu được sẽ chứa các sản phẩm được tách từ phế liệu tôm như khoáng, protein và astaxanthin có hàm lượng cao trong dịch ủ [84] Bên cạnh đó là việc lợi dụng bản thân enzyme protease trong phế liệu tôm để thủy phân protein; kết hợp với một lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men và ủ trong một thời gian nhất định thì sẽ có bã tôm với hàm lượng khoáng, protein, sắc tố,… tách ra đáng kể do đó quá trình sản xuất chitin tiếp theo sẽ ít tốn kém hóa chất hơn, thời gian sản xuất ngắn

1.3.2.2 Vai trò của enzyme có trong phế liệu tôm

vai trò quan trọng của quá trình phân giải protein Cơ chế phân giải protein cũng giống như sử dụng xút để khử protein Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme đem đến nhiều mặt tích cực hơn như nâng cao chất lượng chitin, chitosan, hàm lượng protein-astaxanthin [21], [32] Trong phế liệu tôm có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 05/1993) thì hoạt độ enzyme của protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin và một vài loại enzyme khác có mặt trong phế liệu tôm như alkaline phosphatase, ß-N-acetyl glucosaminse, chitinase

1.3.2.3 Quá trình ủ lên men lactic

Quá trình tạo ra các acid, chủ yếu là acid lactic là tác nhân chủ yếu trong việc sử dụng lên men lactic Các chủng lactic có mặt trong sản phẩm sẽ làm thay đổi các tính chất cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Các sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men sẽ ức chế sự hoạt động của đa số các vi sinh vật gây thối khác, do đó làm tăng tính an toàn và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm Các loài vi khuẩn lactic bao

gồm: Lactococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus,

Sporolactobacillus [39]

21 Lên men lactic được thực hiện trong điều kiện có mặt của hệ vi khuẩn lactic và nguồn cơ chất là cacbonhydrate như: Saccharose, glucose, fructose, tinh bột ngô, tinh bột sắn…kết quả là trong điều kiện thích hợp cho sự hoạt động của vi khuẩn lactic sẽ tạo ra acid lactic và một số loại protease [80] Acid lactic sẽ làm hạ pH và ức chế sự hoạt động của các vi sinh vật gây thối rữa Thành phần canxicacbonat trong vỏ tôm sẽ

tác dụng với acid lactic để tạo ra lactatcanxi ở dạng không hoà tan Phản ứng này gần tương tự như quá trình khử khoáng bởi HCl trong phương pháp hoá học Sơ đồ của phản ứng như sau:

Đồng thời trong quá trình lên men này protein cũng bị hoá lỏng do hệ enzyme

có sẵn trong nguyên liệu và do vi khuẩn lactic sinh ra [39]

Trong quá trình lên men lactic ở giai đoạn đầu vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác đều hoạt động, số lượng vi khuẩn lactic chiếm đa số khi được bổ sung từ nguồn ngoài vào, nhờ số lượng vượt trội này mà vi khuẩn lactic sẽ hấp thu cơ chất để hạ pH của môi trường Vì vậy, trong giai đoạn này cần tạo điều kiện tốt cho vi khuẩn lactic phát triển Vi khuẩn lactic hô hấp yếm khí tuyệt đối nên tạo ra môi trường không có oxy [28] Trong công nghệ lên men lactic người ta thường nghiền nguyên liệu nhỏ để tăng

bề mặt tiếp xúc, hạn chế oxy Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic là: Nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, vitamin, các hợp chất vô cơ, oxy, nhiệt độ, pH môi trường

Sau khi lên men lactic một thời gian thì chính môi trường pH thấp sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn lactic, vi khuẩn lactic sẽ bị dừng hoạt động ở pH môi trường nhỏ hơn 3 Do vậy việc kiểm soát quá trình lên men lactic là vô cùng quan trọng Trong thực tế, người ta có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách tăng pH môi trường để tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic tiếp tục hoạt động sinh tổng hợp enzyme

1.3.3 Các dạng hư hỏng thường gặp trong lên men lactic

Gây biến mốc: Nấm mốc là tên chung để chỉ các loại nấm có cấu trúc hình sợi Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng không có bào tử, không có diệp lục, không có khả năng

mốc sẵn có ở khắp nơi trong tự nhiên Trong môi trường yếm khí và có đường làm thức

ăn, nấm mốc phát triển rất mạnh, không đòi hỏi nghiêm khắc về nhiệt độ pH thích hợp với nấm mốc nói chung từ 1,2 – 3,0 [35] Đa số nấm hoại sinh phát triển tốt ở nhiệt độ 28

Khi ủ lên men thì phần trên bề mặt của mẻ ủ thường có nấm mốc gây hại phát triển Sự sản sinh của nấm mốc làm sản phẩm bị biến màu, mùi và mất chất dinh dưỡng (do sự phân giải của các hợp chất chứa nitơ) thậm chí sản phẩm dịch lên men chứa nấm mốc có thể gây độc cho vật nuôi Để hạn chế nấm mốc phá hoại trong quá trình lên men cần nén chặt nguyên liệu, hạn chế không khí lọt vào, thời gian xếp nén giữa các tầng nguyên liệu không nên để quá lâu, nấm mốc dễ xâm nhập và ủ trong điều kiện kín

Gây mùi thối: Chủ yếu do sự phát triển của trực khuẩn butyric yếm khí xâm nhập vào sản phẩm ủ Trực khuẩn butyric có nhiều trong đất, có khả năng cố định nitơ

môi trường lên men, trực khuẩn butyric gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển, phân giải

rỉ đường và acid lactic, không sinh độc, không gây bệnh nhưng acid butyric có mùi thối Để tránh sự phá hoại của trực khuẩn butyric cần tạo điều kiện thuận lợi để khuẩn lactic phát triển mạnh, sản sinh nhiều acid lactic làm pH đạt từ 3,0 – 4,5 khi đó khuẩn butyric không có điều kiện phát triển

Điều kiện ủ trong quá trình lên men không đảm bảo: Hàm lượng nước cao sẽ làm cho acid lactic sinh ra bị pha loãng dẫn đến thời gian giảm pH kéo dài thời gian lên men từ

đó các vi khuẩn gây thối sẽ có điều kiện phát triển mạnh làm hư hỏng sản phẩm lên men Hàm lượng rỉ đường bổ sung vào mẻ lên men thiếu sẽ không có đủ cơ chất cho vi khuẩn lactic phát triển, khi đó chúng sẽ phát triển chậm lại, pH sẽ không hạ thấp được gây thối nguyên liệu Lượng vi khuẩn lactic bổ sung quá ít sẽ dẫn đến vi khuẩn lactic phát triển chậm, lượng acid sinh ra ít không ức chế được vi khuẩn gây thối làm chúng sản phẩm lên men hư hỏng

Như vậy, để thu được dịch lên men đạt chất lượng thì cần phải hạn chế những yếu tố ảnh hưởng xấu trong quá trình lên men và tạo những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển Sản phẩm dịch lên men thu được sẽ bổ sung vào thức ăn cho động vật chăn nuôi

và phần bã được sử dụng sản xuất chitin – chitosan

Phạm vi địa lý tự nhiên của C tetrazona ở Indonesia (Sumatra và Borneo), Thái

Lan và Malaysia Ngoài ra, cá cũng được tìm thấy ở nhiều nơi khác của châu Á Ngoài

tự nhiên chúng phân bố ở các thủy vực nước chảy nhẹ, nước ấm, có bóng râm, thường phân bố tầng giữa [50]

1.4.3 Đặc điểm h ình thái

Ngoài tự nhiên cá Tứ Vân có thể phát triển đến 7 cm chiều dài và 3 cm chiều cao thân Tuy nhiên, trong điều kiện nuôi giữ, kích cở thường nhỏ hơn, khoảng 5 cm chiều dài Đạt tuổi thành thục 6 – 7 tuần tuổi, khi đó chiều dài tổng cộng của cơ thể: 2 – 3 cm Khi thành thục, cá cái thường to hơn cá đực cùng lứa tuổi Cá cái có bụng tròn hơn, vây lưng màu đen, vây bụng màu đỏ nhạt bình thường trong khi cá đực có mũi màu đỏ sáng, sặc sở hơn bình thường, vây lưng có một đường đỏ sáng Nền thân của

cá có màu sắc, hoa văn từ màu bạc đến vàng nâu, xanh, điểm đặc trưng nhất của loài là

có 4 sọc đứng (tứ vân), phổ biến là sọc màu đen, gốc vi và mũi màu đỏ [50]

Có năm loại cá Tứ Vân có thể được phân loại dựa trên mô hình của các dấu sọc

có trên cơ thể Mặc dù phân loại dựa theo các mẫu màu sắc có thể giúp phân biệt loài nhưng nó có thể không phù hợp để phân loại các mô hình cơ thể khác nhau cho các giống lai thương mại Lai giữa các cặp cá hoặc trong nội bộ được thực hiện để đạt được màu sắc khác nhau và các mẫu để đáp ứng nhu cầu thị trường đối với giống Tứ

Vân mới Cá Tứ Vân vàng và bạch tạng là những ví dụ của cá lai sản xuất thương mại [50]

Các dấu hiệu thay đổi cơ thể của cá theo tuổi tác và chiều dài cơ thể được thể hiện trong Hình 1.6

Hình 1.4: Chiều dài của cá Tứ Vân sau các khoảng thời gian: 3 ngày tuổi, 5 ngày tuổi,

7 – 8 ngày tuổi, 15 – 20 ngày tuổi, 25 ngày tuổi (lần lượt từ trái sang phải) [50]

1.4.4 Điều kiện sống và phát triển của cá Tứ Vân

Cá Tứ Vân phát triển mạnh trong nước với độ cứng của 100 đến 250 phần triệu

22 °C đến 25 °C Chăn nuôi ở nhiệt độ thay đổi ở khoảng từ 23 °C đến 28 °C thì 25 °C

là lý tưởng Cá Tứ Vân khá khỏe mạnh và có khả năng chịu được nhiệt độ thấp nhất là

18 °C và cao 32 °C [50]

Cá sống thành đàn, hiếu động, hay cắn phá Biết được đặc điểm này, khi nuôi giữ trong các bể kiếng cần dành cho chúng không gian cần thiết và nhất là phải thả theo bầy đàn, mật độ trung bình 1 con/10 lit nước [50]

1.4.5 Đặc điểm sinh sản

C tetrazona thường đạt thành thục sinh dục ở một chiều dài cơ thể từ 20 đến 30

mm trong tổng chiều dài hoặc khoảng sáu đến bảy tuần tuổi Cá đực hiển thị một màu

đỏ tươi sáng trên các tia vây và mõm, trong khi cá cái có xu hướng tròn hơn ở vùng

bụng và hơi ít nhiều màu sắc Tất cả cá C tetrazona khi giao phối với một tỷ lệ giới

tính của một đực và một cái với cá đực có thái độ hung hăng trong khi nữ là phục tùng Trong điều kiện sinh sản thực tế, cá đực siết vây cá cái trong thời gian đó trứng và tinh trùng được sinh ra trên bề mặt Hành vi này có thể kéo dài trong vài giờ hoặc cho đến khi tất cả trứng được đẻ ra [50]

25

1.4.6 Điều kiện cho ăn của cá Tứ Vân

Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đóng một vai trò quan trọng trong tăng trưởng, màu sắc, và sức khỏe tổng thể của cá cảnh Khi nuôi cá ở mật độ cao, điều quan trọng là để nuôi một chế độ ăn uống của tỷ lệ thích hợp của protein, lipid, carbohydrate, vitamin và khoáng chất Điều này đặc biệt đúng đối với cá Tứ Vân Mặc

dù Tứ Vân được coi là ăn tạp nhưng khi phân tích ruột của cá sống ở hoang dã chỉ ra rằng chúng thích một chế độ ăn thực vật hơn Một nghiên cứu được thực hiện tại Malaysia tìm thấy cá với 15 loại khác nhau của thực vật phù du, một nguồn của các

mô thực vật bậc cao, bốn loại khác nhau của động vật phù du và cả côn trùng thủy sinh

và trên cạn trong ruột Trong nghiên cứu phân tích dạ dày của Kortmulder trên loài cá

Tứ Vân khác cũng cho thấy kết quả tương tự Một thức ăn nuôi thương phẩm tốt cho

Tứ Vân nên có ít nhất 28% đến 32% tổng lượng protein tính theo trọng lượng, và nguồn gốc nên có nhiều axit amin thiết yếu và các axit béo không bão hòa cao (HUFA) Bên cạnh đó, ấu trùng cá đòi hỏi mức độ cao của tổng số protein trong khẩu phần ăn của nó (30 – 45%) Chất lượng của các protein có sẵn là một yếu tố quan trọng khi lựa chọn thức ăn thích hợp cho cá Không có nhiều thông tin có sẵn về các yêu cầu dinh dưỡng của Tứ Vân nhưng nhu cầu dinh dưỡng chung của cá nước ấm nhiệt đới dường như không khác nhau rất nhiều giữa các loài (Nghiên cứu Quốc gia Hội đồng 1983) [50]

Cá Tứ Vân nuôi trong hệ thống với mật độ cao nên được cho ăn một chế độ ăn hoàn chỉnh bao gồm một số chất màu nâng cao, chẳng hạn như astaxanthin, ít nhất hai lần mỗi ngày để bổ sung chất màu vào thức ăn giúp cá tăng sắc tố

Cá Tứ Vân giống như nhiều cá nuôi khác, có một đường tiêu hóa trong việc tiêu hóa thức ăn không hiệu quả Cách chia tổng số thức ăn hàng ngày thành ba hoặc nhiều phần trong suốt cả ngày như vậy sẽ loại bỏ sự dư thừa thức ăn thừa, giảm ô nhiễm hữu

cơ và cung cấp nhu cầu oxy trên hệ thống, thúc đẩy tăng trưởng nhanh hơn Cho ăn sáng với số lượng thức ăn thích trong ngày Cá Tứ Vân hoạt động vào ban ngày và chấm dứt hoạt động từ 22 giờ đêm đến 4 giờ sáng và có một đỉnh cao trong hoạt động

14 giờ đến 18 giờ Do đó, nên được cho ăn 14 – 18 giờ và không nên cho ăn từ 20 giờ đến 6 giờ [50]

Nhiệt độ nước và chất lượng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình nuôi cá Khi nhiệt độ giảm xuống dưới 20 °C, cá Tứ Vân sẽ tiêu thụ ít thức ăn Trong điều kiện thời

tiết lạnh, tốt nhất là để nuôi vào cuối buổi chiều khi nhiệt độ nước đã có cơ hội để nâng cao từ bức xạ mặt trời Định kỳ kiểm tra các phản ứng cho ăn và lượng thức ăn còn lại trên đáy hồ, ao sẽ giúp để xác định số lượng thích hợp để ăn Thức ăn phải được hoàn toàn tiêu thụ trong vòng 15 phút sau khi cho ăn Nếu tất cả các thức ăn đã được tiêu thụ trong khoảng thời gian nên cho ăn nhiều hơn một chút để xác định điểm thoả mãn của cá Không có tài liệu về tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) hoặc tỷ lệ phần trăm trọng lượng cơ thể cá Tứ Vân hay nhiều cá cảnh trang trí khác Bằng cách so sánh

dữ liệu cho cá có kích thước tương tự và đặc điểm sinh học, cá Tứ Vân nên được cho

ăn 10% so với trọng lượng cơ thể của nó [50]

1.5.1 Vai trò của protein và các sắc tố trong việc đối tượng cá cảnh

Protein là vật chất hữu cơ chủ yếu xây dựng nên các tổ chức mô của cá cũng như của động vật, protein chiếm khoảng 60 – 75% tổng số vật chất khô của cơ thể Tùy kích thước, loài cá nuôi mà thành phần protein được bổ sung khác nhau Protein được hình thành từ các acid amin, trong đó có 10 acid amin cá không thể tự tổng hợp

mà phải bổ sung từ thức ăn bên ngoài gồm methionine, arginine, threonine, tryptophan, histidine [50] Cá sử dụng protein để đáp ứng nhu cầu amino acid cho cơ thể Protein vào cơ thể sẽ được các enzyme protease thực hiện quá trình tiêu hóa hóa học giải phóng các amino acid tự do Các amino acid này sẽ được hấp thụ qua thành ống tiêu hóa và đi vào máu, được máu vận chuyển đến các tổ chức cơ quan, các tổ chức mô khác nhau, ở đó chúng sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp protein mới Nhu cầu protein phụ thuộc vào việc sử dụng các amino acid để xây dựng nên các protein mới (xảy ra đối với động vật trong thời kỳ sinh trưởng và sinh sản) hoặc để thay thế các protein già cũ (chức năng duy trì) Thức ăn thiếu protein sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng của cá và các loại động vật vì chúng phải huy động các nguồn protein trong các tổ chức

cơ thể để đáp ứng nhu cầu amino acid, dẫn đến khối lượng bị sút giảm Ngược lại nếu thức ăn quá dư thừa protein thì chỉ một phần từ protein thức ăn sẽ được sử dụng để tổng hợp nên các protein mới trong cơ thể, phần còn lại sẽ được chuyển hóa thành năng lượng, hoặc bài tiết ra ngoài cơ thể Protein là thành phần có giá thành cao nhất trong thức ăn vì vậy nếu hàm lượng protein trong thức ăn quá cao sẽ gây ra lãng phí làm giảm hiệu quả nuôi Hàm lượng protein trong nuôi trồng thủy sản nói chung nguồn cấp dữ

27 liệu trung bình 18 – 20% đối với tôm biển, 28 – 32% cho cá da trơn, 32 – 38% cho cá

rô phi [51] Cá sử dụng protein cũng như các động vật có xương sống ở trên cạn, quá trình tổng hợp protein và quá trình dị hóa protein diễn ra đồng thời trong suốt quá trình sống [14] được thể hiện ở Hình 1.7

Hình 1.5: Sơ đồ trao đổi protein tổng số ở cá [14]

Carotenoids là sắc tố có màu tan trong dầu Khoảng màu của sắc tố này nằm trong dãi từ màu vàng đến đỏ sậm Vật chất chứa sắc tố phân bố rất rộng ở động vật và thực vật cụ thể ở đây carotenoids có trong thành phần phế liệu tôm đặc biệt là ở phần đầu tôm Các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu đến thành phần này từ những năm 1950 Cho đến nay người ta biết đến gần 600 loại carotenoids khác nhau Carotenoids là thành phần dinh dưỡng mà động vật không thể tổng hợp được, những thành phần này không chỉ rất cần thiết mà chúng còn đóng vai trò quan trọng khác nhau đối với cả động vật không xương sống và có xương sống [14]

Đối với người nuôi trồng thủy sản và những người sản xuất thức ăn cho nuôi trồng thủy sản thì điều quan trọng nhất là khả năng tạo sắc tố của carotenoids Khả năng này được xác định bằng cấu trúc của chúng, màu sắc đặc trưng, khả năng tiêu hóa được, khả năng chuyển đổi và sự tương đồng đặc trưng đối với các mô [14]

Cấu trúc carotenoids: Carotenoids là thành phần cao phân tử đặc trưng bởi mạch gồm nhiều nối đôi có dạng khác nhau Số lượng nối đôi dao động từ 7 đến 15 và thường là 11 đối với carotenoids của cá Sự tồn tại một số lượng lớn các nối đôi trong phân tử là nguyên nhân dẫn đến sự không ổn định (dễ biến đổi) các loại sắc tố này

Giảm cấp Sinh tổng hợp

Oxy hóa Tổng hợp Đi vào

Các thành phần chức Nito khác

Protein cơ thể Amino acid tự do

Amino acid thức ăn

Amino acid

không cần thiết

CO 2

NH Ammonia

Carotenoids dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ cao hoặc cường độ chiếu sáng mạnh Có 3 loại carotenoids thường gặp [14]:

nhất trong tự nhiên Cấu trúc của chúng bao gồm hai đơn vị mang điện tích ở hai đầu

Canthaxanthin : sắc tố này có hai nhóm ketone ở vị trí 4 và 4’

Astaxanthin : sắc tố màu đỏ này có hai nhóm OH ở vị trí 3 và 3’ và có 2 nhóm keton ở vị trí 4 và 4’ Đây là thành phần sắc tố chính ở cá hồi và các loại giáp xác

Màu sắc của carotenoids do thành phần quan trọng quyết định là hai loại ketocarotenoids: canthaxanthin và astaxanthin Không giống như giáp xác, cá không

có khả năng tổng hợp nên các sắc tố từ carotenoids đơn giản Trong tự nhiên, carotenoids được cung cấp từ thức ăn tự nhiên nhưng trong môi trường thâm canh, chúng được cung cấp từ thức ăn [14] Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy trong

cơ thể các sinh vật như trong vi tảo nước ngọt Haematococcus pluvialis, trong nấm men Phaffia rhodozyma, trong tôm, cua và một số loài cá như cá hồng, cá

hồi….Astaxanthin trong cá hồng, cá hồi chủ yếu tập trung ở phần cơ thịt, da và gan [55],[56],[57],[58], tạo cho cơ, da và trứng thủy sản có màu vàng, cam hay đỏ Astaxanthin không phải là hormone nên không gây hại đến khả năng sinh sản của cá

29

Cá sẽ chuyển hóa Astaxanthin trong thức ăn thành tuaxanthin và tích lũy dưới da cá Hiện nay, trong công nghệ nuôi cá cảnh, để nhuộm màu cho cơ, da hay làm cho cá chuyển màu vàng cam, màu đỏ, trong thức ăn cá cảnh thường được bổ sung Astaxanthin hay Canthaxanthin để cá có màu sắc đẹp hơn và dễ tiêu thụ hơn [42] Ngoài ra, chất tạo màu Astaxanthin còn giúp tăng hoạt động sinh trưởng, phát triển tuyến sinh dục, tăng khả năng chịu sốc, nâng cao giá trị thương phẩm của vật nuôi Do vậy, Astaxanthin chính là nhân tố vi lượng khá quan trọng đối với động vật thủy sinh Trong một nghiên cứu về cá hồi Atlantic salmon, khi nuôi cá với các nồng độ Astaxanthin khác nhau (từ 0 đến 200mg kg-1), Torrissen và cộng sự đã kết luận rằng không có sự sai khác về màu sắc trong thịt cá fillet khi tăng hàm lượng Astaxanthin trên 60mg kg-1 [51]

Sau khi tiêu hóa và hấp thu, sắc tố carotenoids có thể bài tiết ra ngoài theo con đường phân Tuy nhiên, các sản phẩm tiêu hóa carotenoids cũng có thể bị hấp thu trở lại bởi tế bào niêm mạc ruột Carotenoids là thành phần tan trong chất béo vì vậy khả năng hấp thu của chúng có liên quan chặt chẽ đến lipid và khả năng tiêu hóa được của chúng bị ảnh hưởng bởi thành phần lipid trong thức ăn Astaxanthin trong các loại dầu

có khả năng tiêu hóa, hấp thụ cao hơn 85 – 90% so với trong bột tôm 75 – 80% Khả năng tiêu hóa được của carotenoids phụ thuộc chủ yếu vào dạng và sự tồn tại trong tự nhiên của carotenoids Vì vậy, khả năng tiêu hóa được của astaxanthin có thể dao động

từ 10% đến 60% và phụ thuộc rất nhiều vào nguồn gốc, trong khi khả năng tiêu hóa được của canthaxanthin chỉ có thể đạt từ 20 – 30% Astaxanthin thường có khả năng tiêu hóa, hấp thụ tốt hơn khi chúng tồn tại dưới dạng ester so với dạng tự do [14]

Người ta cũng có thể nghiên cứu khả năng tiêu hóa được của carotenoids có trong thức ăn thông qua việc xác định hàm lượng sắc tố có trong máu cá Canthaxanthin được tìm thấy trong serum 3 giờ sau khi cho cá ăn Hàm lượng tối đa sau 24 giờ cho ăn Sau thời gian này thì hàm lượng astaxanthin trong máu có giảm xuống Hàm lượng astaxanthin trong máu có thể cao hơn từ 2 đến 3 lần so với canthaxanthin Hàm lượng carotenoids trong máu sẽ giảm ít nhất là 3 ngày sau khi dừng bổ sung carotenoids [14] 1.5.1.4 Sự trao đổi và tiêu chuẩn đánh giá hiệu quả sắc tố của carotenoids

Phân loại carotenoids dựa trên khả năng của động vật thủy sinh đối với việc trao đổi sắc tố carotenoids thành astaxanthin Dựa trên khả năng này mà người ta chia động vật thành 3 nhóm: