Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

Trong liền vết thương, tế bào gốc trung mô được xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau.. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài “Nghiên cứu biệt hóa

Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xương, máu cuống rốn, dây rốn,

mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan Các tế bào

này có thể được nuôi cấy và nhân lên in vitro và dưới các điều kiện thích

hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xương, sụn, cơ và mỡ Hiện nay, tế bào gốc trung mô được coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô

Trong liền vết thương, tế bào gốc trung mô được xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau Tủy xương là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhưng vấn đề thu tủy xương gặp khó khăn và số lượng ngưới cho tủy xương cũng hạn chế Những vấn đề cần cân nhắc này

đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xưong

Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây Dây rốn là mô mềm có chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh dưỡng…cho thai Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ

Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tương đối

dư thừa Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hưởng cúa các vấn

đề về đạo đức và luật pháp Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập được

từ màng dây rốn Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trường nuôi cấy đặc trưng chưa hề bị biệt hoá, vẫn giữ được đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài “Nghiên cứu biệt hóa

tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” được tiến hành nhằm mục tiêu:

1 Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc

trung mô màng dây rốn

2 Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

Những đóng góp mới của luận án:

- Luận án có đóng góp mới cho nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu thực nghiệm, đã phân lập được tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người, các đặc tính tế bào gốc trung mô và ảnh hưởng của chúng trên vết thương bỏng

- Tế bào gốc trung mô màng dây rốn người có đặc tính sinh miễn dịch thấp Các tế bào có bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhưng bộc lộ HLA-

DR, với mức độ thấp Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô trên thỏ xuất hiện với hiệu giá thấp

- Tế bào gốc trung mô màng dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi trong môi trường định hướng in vitro

Bố cục luận án:

Luận án gồm 119 trang với 29 hình ảnh, 9 biểu đồ và 22 bảng, trong

đó: đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (30 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (23 trang); Kết quả nghiên cứu (36); Bàn luận (25 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang) Tài liệu tham khảo: 145 tài liệu (tiếng Việt 29, tiếng Anh 116)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƯƠNG

1.1.1 Diễn biến lâm sàng vết thương, vết bỏng sâu

Thông thường, các vết thương liền trong vòng 4 – 6 tuần Các vết thương khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết thương đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt Tùy thuộc vào diện tích, độ sâu của vết bỏng, sức đề kháng của cơ thể, vết bỏng cơ bản tiến triển theo ba giai đoạn đan xen và kế tiếp nhau là: Giai đoạn cấp tính, giai đoạn tái tạo và giai đoạn hình thành sẹo

1.1.2 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương

Quá trình liền vết thương có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thương Do đó quan niệm mới trong điều trị các tổn thương ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các

tế bào tổn thương phải được thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con người cần có da Thành phần tế bào da người chủ yếu gồm 2 loại là nguyên bào sợi và tế bào sừng

1.1.2.1 Nguyên bào sợi

1.1.2.2 Tế bào sừng

1.2 GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG

Do có vai trò quan trọng quyết định trực tiếp tới quá trinh liền vết thương nên nguyên bào sợi và tế bào sừng cũng là những tế bào được nuôi cấy để ghép trong điều trị vết thương

1.2.1 Vật liệu tương đương trung bì có tế bào

Vật liệu thay thế trung bì có tế bào là vật liệu dùng nguyên bào sợi để tạo một cấu trúc tái sinh trên giá đỡ làm từ một số nguyên liệu khác nhau

Cấu trúc này được cấy nguyên bào sợi để tổng hợp các protein và các thành phần khác của đệm gian bào mà có tác dụng kích thích những tế bào tại vết thương của người bệnh tăng cường hoạt động để làm nhanh liền vết thương

1.2.3 Vật liệu tương đương da hai lớp có tế bào

Vật liệu tương đương da hai lớp gồm biểu bì và trung bì là sản phẩm mới và phức tạp nhất hiện nay về cấu trúc Vật liệu được tạo ra bởi nuôi cấy nguyên bào sợi và tế bào sừng trên nền là giá thể collagen và cơ chất lycosaminoglycan…

Vật liệu tương đương da đồng loại là sản phẩm mới nhất và tiến bộ nhất gần đây, chúng đang được lưu hành trên thị trường Hai sản phẩm nguyên mẫu của dạng này là Apligraf và Orcel

1.3 TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 1.3.1 Tế bào gốc, đặc tính và phân loại tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới

Dựa theo nguồn gốc hoặc thời điểm phân lập, có thể phân loại các tế bào gốc thành các nhóm sau:

- Tế bào gốc phôi

- Tế bào gốc thai

- Tế bào gốc nhũ nhi

- Tế bào gốc trưởng thành

- Tế bào vạn tiềm năng do cảm ứng

1.3.2 Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh

1.3.3 Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc

1.3.4 Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết thương 1.3.4.1 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi

1.3.4.2 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng

1.4 DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN

Năm 2004, nhóm nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Singapore đã thành công trong việc xác định và phân lập được các TBG biểu mô và TBG trung mô từ màng dây rốn Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog (Pluripotency Sustaining ES Cell Factor) Điều này gợi ý cho thấy tính gốc của cả hai loại tế bào này cao hơn so với tính gốc của tế bào tuỷ xương, máu cuống rốn hay các tế bào gốc trưởng thành khác

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô:

Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô màng dây rốn người khi ghép dị loại

Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc trung mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm

Thỏ thí nghiệm đều đã trưởng thành từ 10-12 tháng tuổi, do Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng cung cấp

Nuôi đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mẫu mô dây rốn

Mô dây rốn thu từ sản phụ ngay sau khi sinh với các tiêu chuẩn nguồn mô như sau:

- Tiêu chuẩn y đức về nguồn cung cấp mô:

- Tiêu chuẩn sàng lọc

- Người hiến dây rốn thử máu âm tính với các bệnh truyền nhiễm

- Tính pháp lý của nguồn mô nghiên cứu

2.2.2 Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu

Các hoá chất và vật tư nuôi cấy do hãng Invitrogen và PAAcung cấp, đều đạt tiêu chuẩn quốc tế an toàn về độc tính, vi khuẩn, mycoplasma và vi rút

Môi trường nuôi cấy tế bào trung mô do Ngân hàng tế bào gốc Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo bản quyền chuyển nhượng của công

2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tương đương trung bì

Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care, USA cung cấp được dùng để làm giá đỡ tế bào

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt hóa tế bào

2.3.1.1 Phân lập tế bào gốc trung mô

2.3.1.2 Cấy chuyển nhân rộng số lượng tế bào gốc trung mô dây rốn 2.3.1.3 Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào

2.3.1.4 Xác định số lượng tế bào trong nuôi cấy

Số lượng TB được tính theo công thức: C = n/v (n: số lượng TB đã đếm được trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml) Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3

= 1.10-4 ml do đó công thức tính là:

C = n x 10 4 /ml

2.3.1.5 Đánh giá hình thái tế bào

- Đánh giá hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm giemsa

- Đánh giá hình thái mô bằng phương pháp nhuộm HE

- Đánh giá hình thái siêu cấu trúc

2.3.1.6 Phương pháp khảo sát biểu hiện của các kháng nguyên HLA của

tế bào gốc trung mô

- Phân tích biểu hiện của HLA-G và HLA-E bằng kỹ thuật western blot

- Phân tích HLA-DR bằng kỹ thuật flowcytometry

2.3.1.7 Xác định tính sinh miễn dịch của tế bào gốc

Nguyên liệu và chuẩn bị

- Tế bào gốc: là dòng tế bào cùng nguồn gốc và thế hệ tế bào đã sử

dụng ghép cho thỏ trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm

- Huyết thanh thỏ: các mẫu máu thỏ được lấy ở 4 thời điểm: Bắt đầu

nghiên cứu ghép tế bào gốc - D0 và các thời điểm sau đó là D15, D30, D60

Phương pháp phân tích miễn dịch ELISA

2.3.1.8 Biệt hóa tế bào gốc mô thành tế bào dạng nguyên bào sợi

- Môi trường cảm ứng biệt hóa

- Các bước biệt hóa

- Xác định khả năng tạo tấm vật liệu tương đương trung bì của tế bào

2.3.1.9 Xét nghiệm ELISA collagen typ I trong dịch nổi tế bào biệt hóa

2.3.2 Các phương pháp đánh giá hiệu quả ghép tế bào điều trị vết thương thực nghiệm

2.3.2.1 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm

Sơ đồ 2.1 Thiết kế nghiên cứu vết thương bỏng thực nghiệm

Thỏ nghiên cứu (n = 30)

Theo dõi diễn biến vết

thương bỏng vào các

thời điểm D0, D5, D10

Theo dõi diễn biến vết thương bỏng vào các thời điểm D0, D5, D10

Kết luận

2.3.2.2 Gây bỏng thực nghiệm

- Phương pháp gây bỏng: Theo phương pháp của Halovec và

Pocicado 1961 (có cải tiến)

2.3.2.3.Thay băng chăm sóc vết thương

2.3.2.4 Ghép tấm tế bào lên vết thương

Vùng A – vùng nghiên cứu ghép tấm tế bào (quy định vết thương bên phải lưng thỏ), vùng B – vùng đối chứng (chỉ ghép màng Tegaderm đơn thuần)

2.3.2.5 Xét nghiệm hình thái cấu trúc mô vết thương

N1: Số lượng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,001

N2: Số lượng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,01

5: 5 ml nước muối 0,9%

2.3.2.7 Các chỉ tiêu theo dõi toàn thân

* Toàn thân

* Cân nặng thỏ

2.3.2.8 Các chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết thương

- Theo dõi hàng ngày diễn biến

- Tính diện tích vết thương

2.3.2.9 Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu

- Xét nghiệm huyết học

- Xét nghiệm sinh hoá

2.3.2.10 Xác định hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh

2.3.2.11 Xác định hoạt độ enzym GPT trong huyết thanh

2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các số liệu đựơc tính theo trị giá trung bình (X  SD ) hoặc tỷ lệ %

Xử lý số liệu trên phần mềm SPSS 16.0 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi P<0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP, NUÔI CẤY BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN

3.1.1 Đặc điểm phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn

3.1.1.1 Kết quả phân lập và hình thái tế bào gốc trung mô dây rốn

Bảng 3.2 Thời gian tế bào tách ra khỏi mẫu mô và đạt 50% che phủ (n=17)

Chỉ tiêu

Trong 7 ngày

Trong 14 ngày

Trong 21 ngày

Trong 28 ngày

Sau 4 tuần tất cả các mẫu mô đều mọc tế bào

Theo dõi tế bào mọc ra khỏi mẫu mô nuôi cấy, thu tế bào bằng quy trình tripsin và cấy chuyển đến P3-P4

3.1.1.2 Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn

Bảng 3.3 Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô ở P2

Nguồn tế bào

Thời gian (ngày) Tỷ lệ % số

colony/tế bào thí nghiệm

Bắt đầu quan sát thấy colony

Thấy rõ đa số colony

3.1.2.1 Đặc điểm biểu hiện HLA-G, HLA-E và HLA-DR của tế bào

Ảnh 3.6 Kháng nguyên HLA-G và HLA-E có trong dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn được phát hiện bằng kỹ thuật western blot

Mức độ biểu hiện HLA-DR trên bề mặt TBGTM màng dây rốn đƣợc phân tích qua flowcytometry

Biểu đồ 3.2 Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện HLA-DR

của tế bào gốc trung mô màng dây rốn.

3.1.2.2 Tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn

Biểu đồ 3.3 Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng

nguyên siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA

Biểu đồ 3.4 Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng

nguyên là tế bào nguyên vẹn 3.1.3 Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi 3.1.3.1 Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong quá trình biệt hóa

Bảng 3.4 Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào

Thế hệ tế bào Hình sao Hình thoi Hình sợi Hình dạng

Bảng 3.6 Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa

(TBGTM)

Nhóm nghiên cứu (NBS biệt hóa) P

Môi trường nuôi cấy

(n=5) 0,045 ± 0,002 0,046 ± 0,001 >0,05 Dịch nổi nuôi cấy

(n=5) 0,069 ± 0,003 0,297 ± 0,011 <0,01

3.2 HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM 3.2.1 Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong ghép tế bào gốc trung mô

Bảng 3.8 Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu

3.2.2 Ảnh hưởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thương 3.2.2.1 Ảnh hưởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm sàng tại chỗ vết thương

Bảng 3.12 Thay đổi diện tích vết thương bỏng

Thời điểm Tỷ lệ % diện tích vết thương đã liền P

Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30)

D5 26,53 ± 12,04 25,84 ± 11,40 0,601 D10 77,44 ± 12,24 68,76 ± 11,14 < 0,01 D15 93,23 ± 3,74 87,36 ± 4,78 < 0,001

Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B rệt hơn (p<0,001)

3.2.2.2 Ảnh hưởng của ghép tế bào gốc trung mô đến thay đổi hình thái cấu trúc mô vết thương

Bảng 3.17 Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương

Thời điểm Số lượng tế bào viêm/ĐVDT

kê (P<0,001)

Bảng 3.18 Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương

Thời điểm Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT

Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 13,86  5,40 13,53  03,13 0,714

D10 67,10  9,09 52,73  10,38 <0,001

Ngày thứ 10 thấy số lƣợng nguyên bào sợi vùng A tăng hơn vùng B với p< 0,001

Bảng 3.19 Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương

Thời điểm Số lƣợng tân mạch/ĐVDT

Bảng 3.20 Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương

Thời điểm Chỉ số phân bào (có hiệu chỉnh MI x 100)

3.2.3 Vi khuẩn học vết thương bỏng thực nghiệm

Bảng 3.22 Thay đổi mật độ Số lượng vi khuẩn vết thương

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN

4.1.1 Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn

Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể dễ dàng thu được Do việc sử dụng chúng không bị các vướng mắc về vấn đề đạo đức, dây rốn là sự lựa chọn tối ưu cho việc phân lập tế bào gốc trung mô Hochedlinger và cộng sự

đã xác định OCT-4 cũng có biểu hiện ở các tế bào gốc trung mô dây rốn OCT-4 là một gene đặc biệt của tế bào gốc phôi, có vai trò quan trọng trong việc duy trì tình trạng không biệt hóa của tế bào gốc

Kết quả của chúng tôi có 15/17 mẫu mô nghiên cứu mọc tế bào ra khỏi mẩu mô trong 3 tuần sau nuôi cấy mô, đạt tỷ lệ 88,2% và cũng chỉ cần nuôi cấy trong hai tuần là đã có thể thu hoạch tế bào Kết quả nghiên