Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang

Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những

và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Ở nước ta hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại,

trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với hơn

60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan

từ rong nâu Việt Nam

Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu

về fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội

I.2 Mục tiêu của luận án

Nghiên cứu chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối

quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan

2

I.3 Những đóng góp mới của luận án

1/ Việc khử trùng ngưng được thực hiện bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis) sử dụng chính các nhóm (-SO3H) của phân tử fucoidan làm nguồn axít để chuyển hóa fucoidan polysacarit về dạng fucoidan oligosacarit dưới điều kiện rất nhẹ nhàng, nên hạn chế tối đa quá trình bẻ ngắn mạch quá mức về dạng các monomer không mong muốn Nhờ vậy đã thu được các sản phẩm fucoidan oligosacarit phù hợp cho phân tích khối phổ

2/ Lần đầu tiên tại Việt Nam đã kết hợp cả 02 kỹ thuật phân tích khối phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS trong phân tích cấu trúc của polysacarit Việc kết hợp này giúp chúng ta nhận được đầy đủ hơn các thông tin về cơ chế phân mảnh các ion carbohydrate trong phổ khối, nhờ vậy đã cho phép giải được một cách tường minh cấu trúc phức tạp của fucoidan có nguồn ngốc từ rong nâu Việt Nam

3/ Lần đầu tiên cấu trúc của phân đoạn fucoidan SmF3 có hoạt tính gây

độc tế bào ung thư từ rong S mcclurei đã được thiết lập Mạch chính của

-) và (→6-)-Galp ở cuối đầu khử

4/ Tất cả các phân đoạn fucoidan từ Sargassum mcclurei ít gây độc tế

bào và ức chế sự hình thành các tế bào ung thư kết tràng DLD-1, chính vì

vậy chúng là các tác nhân kháng ung thư tiềm năng

I.4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 113 trang: Mở đầu (02 trang), Nội dung chính gồm

98 trang được chia làm 03 chương gồm: Chương 1 Tổng quan (33 trang), Chương 2 Đối tương, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm (11 trang), Chương 3 Kết quả và thảo luận (52 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Danh mục các công trình công bố có liên quan đến luận án (01 trang), 143 tài liệu tham khảo (12 trang)

II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

3

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được lựa chọn nghiên cứu là 08 loài rong nâu phổ biến

và có trữ lượng lớn nhất ở vùng biển vịnh Nha Trang bao gồm các loài

rong Sargassum denticapum, Sargassum polycystum, Sargassum binderi, Sargassum oligocystum, Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Turbinaria ornata, Padina australis, các mẫu rong được thu thập, phân

loại và định danh bởi chuyên gia phân loài rong biển TS Lê Như Hậu 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu: fucoidan được thu nhận bằng cách chiết rong trong dung môi axit loãng (pH: 2-3), sau đó sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi anion để tách phân đoạn tinh chế fucoidan

2.2.2 Các phương pháp phân tích thành phần của fucoidan: phương pháp trắc quang, đo độ đục và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2.2.3 Các phương pháp phân tích cấu trúc của fucoidan: phân tích liên kết bằng methyl hóa, phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối nhiều lần Negative-ion tandem ESI-MS/MS và MAILDI-TOF/MS/MS

2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan: được thực hiện theo phương pháp của Likhitwitaywid và Colburn

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Phương pháp chiết và tách phân đoạn fucoidan từ rong nâu

Phương pháp chiết fucoidan: Fucoidan được thu nhận bằng cách

chiết rong trong dung môi axit HCl loãng (pH: 2-3) ở 70oC, trong thời gian 2 giời (chiết lặp lại 3 lần) Dịch chiết được gom lại và cô đặc bằng màng siêu lọc 10kDa, dịch chiết sau đó được kết tủa trong cồn 98% hoặc đông khô để thu bột fucoidan

Phương pháp tách phân đoạn fucoidan: Fucoidan sau khi được

phân lập từ rong nâu sẽ được tiến hành tách phân đoạn tinh chế bằng sắc

ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose

2.3.2 Các phương pháp phân tích thành phần của fucoidan

Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: được thực hiện bằng

phương pháp so màu với phenol và axit sulfuric đậm đặc, ở λ = 490 nm

Phân tích thành phần đường đơn: được thực hiện bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC), sau khi fucoidan được thủy phân bằng trifluoroacetic axít

4

Phân tích hàm lượng sulfate: được thực hiện bằng phương pháp đo

độ đục với BaCl2/gelatin, ở bước sóng λ = 360 nm

Phân tích hàm lượng axít uronic: được thực hiện bằng phương

pháp so màu với thuốc thử Carbazol, ở bước sóng λ = 525 nm

2.3.3 Các phương pháp phân tích cấu trúc fucoidan

Phân tích liên kết bằng methyl hóa: fucoidan được methyl hóa bằng

methyl iodua trong dung môi dimethylsulfoxide, sau đó tiến hành thủy phân, khử mở vòng và acetyl hóa Sản phẩm sau khi acetyl hóa được phân tích bằng GC-MS

Thủy phân tạo oligosacarit-fucoidan sử dụng cho phân tích khối phổ: được tiến hành bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU

Fucoidan từ 08 loài rong nâu thuộc 3 chi rong Sargassum, Padina

và Turbina đã được chiết tách và phân tích hàm lượng (bảng 3.1) Kết quả cho thấy hàm lượng fucoidan dao động từ 0,82 % (Sargassum swartzii) đến 2,57 % (Sargassum polycystum), hàm lượng fucoidan trong hai loài rong Padina australis và Turbina ornata tương ứng là 1,93 % và

1,23 % Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan trong các loài rong thuộc

các chi khác nhau là khác nhau và trong cùng một chi (Sargassum) cũng

không giống nhau Sự khác nhau về hàm lượng fucoidan trong các loài rong có thể được giải thích là do ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng của rong như vị trí địa lý, thời gian thu rong và cả phương pháp chiết Bảng 3.1 Hàm lượng và thành phần monosacarit của fucoidan

từ 08 loài rong nâu Việt Nam

Thành phần đường đơn của fucoidan

Axít uronic

* Hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo

** Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan; nd: không phát hiện thấy

5

3.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN

Để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành thủy phân fucoidan thành các monomer trong môi trường axít Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đường đơn của fucoidan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành xác định theo tỉ lệ mol giữa các gốc đường đã được thủy phân Sắc ký đồ của các mẫu đường chuẩn được trình bày trên hình 3.1 Kết quả phân tích thành phần monosacarit, hàm lượng sulfate và uronic axít của các mẫu fucoidan được trình bày trên bảng 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn

Kết quả bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 35,8-55,8 % trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó cao nhất là fucoidan

từ rong Turbina ornata (55,8%) và thấp nhất là fucoidan từ rong S.swartzii (35,8%) Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi Sargassum chiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose, ngoại trừ fucoidan từ rong S.polycystum có tỉ lệ fucose:galactose = 2:1 Trong khi đó, các mẫu fucoidan từ hai chi rong khác là Turbina ornata và Padina australis cũng giống như fucoidan của loài rong S.polycystum

hàm lượng galactose chiếm gần bằng một nửa so với fucose Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của 08 loài rong nghiên cứu đều có chứa các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ hơn là mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) và glucose (0-20,6%) Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan Bên cạnh thành phần là các gốc

6 đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate và axít uronic Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 3.1), dao động trong khoảng 20,40-33,15%, trong đó lớn nhất là

fucoidan của rong S.mcclurei (33,15%) và nhỏ nhất là fucoidan từ rong S.swartzii (20,40%),

Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác định các đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trưng cấu của chúng

3.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN

05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbina ornata được chúng tôi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân

tích các đặc trưng cấu trúc của chúng Vì đây là những loài rong phổ biến,

có trữ lượng lớn và có khả năng khai thác ở quy mô công nghiệp

Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) được chỉ ra trên hình 3.2-hình 3.6 Kết quả tách phân đoạn của các mẫu fucoidan cho thấy fucoidan

từ các loài rong S.denticapum, S.polycystum và S.mcclurei đều thu được

03 phân đoạn khác nhau Kết quả này cho thấy fucoidan từ mỗi loài rong này sẽ tồn tại ít nhất 03 kiểu cấu trúc khác nhau Trong khi đó fucoidan từ

hai loài rong Turbinaria ornata và S.swartzii lần lượt thu được 04 và 05

phân đoạn khác nhau, như vậy fucoidan từ hai loài rong này cũng sẽ tồn tại ít nhất là 04 và 05 dạng cấu trúc khác nhau Tuy nhiên, các phân đoạn tương ứng với mỗi loài rong được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau, như vậy có thể đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn tương ứng với mỗi loài rong sẽ không giống nhau Kết quả phân tích thành phần hóa học của mỗi phân đoạn fucoidan từ 05 loài rong nghiên cứu ở trên (bảng 3.2-3.6) cho thấy thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan giữa các loài rong là khác nhau và trong cùng một loại rong cũng khác nhau Tuy nhiên, chúng đều có đặc điểm chung là hàm lượng sulfate trong các phân đoạn fucoidan tăng dần theo nồng độ rửa giải của muối NaCl, hàm lượng fucose và galactose tăng tỉ lệ nghịch với hàm lượng của

các gốc đường khác, đặc biệt trong phân đoạn SmF3 từ rong S.mcclurei

chỉ tồn tại hai gốc đường là fucose và galactose Như vậy với phần chính

là fucose, galactose và sulfate fucoidan từ 05 loài rong trên được xếp vào nhóm các sulfated galactofucan, khác với các sulfate fucan từ rong ôn đới

Bảng 3.2 Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan

từ rong S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Tổng carbohydrate

*: tính theo khối lượng của fucoidan

Hình 3.3 Tách phân đoạn fucoidan từ rong

S.swartzii bằng sắc ký trao đổi anion trên

SdF1

SdF2 SdF3

Hình 3.2 Tách phân đoạn fucoidan từ rong

S.denticapum bằng sắc ký trao đổi anion trên

cột DEAE-cellulose

Hình 3.4 Tách phân đoạn fucoidan từ

rong S.polycystum bằng sắc ký trao đổi

anion trên cột DEAE-cellulose

SpF1

SpF2 SpF3

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

SmF1 SmF2 SmF3

Hình 3.5 Tách phân đoạn fucoidan từ

rong S.mcclurei bằng sắc ký trao đổi

anion trên cột DEAE-Macroprep

SwF2

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

SwF1 SwF3

SwF4 SwF5 SwF2

Hình 3.6 Tách phân đoạn fucoidan từ rong

Turbinaria ornata bằng sắc ký trao đổi

anion trên cột DEAE-cellulose

ToF1 ToF2 ToF3 ToF4

8 Bảng 3.3 Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan

từ rong S.swartzii thu được bằng sắc ký trao đổi anion

nd: không phát hiện thấy

Bảng 3.4: Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan

từ rong S.polycystum thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit của fucoidan,

Bảng 3.5 Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan

từ rong S.mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit, % mol Phân đoạn

fucoidan

theo nồng

độ NaCl

Hàm lượng

Tổng carbohydrate

Bảng 3.6 Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan

từ rong Turbina ornata thu được bằng sắc ký trao đổi anion

Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan

9 Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng

và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi rút, Do vậy, trước khi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc trưng cấu trúc của fucoidan rong nâu Việt Nam nhằm mục đích ứng dụng chúng làm thực phẩm chắc năng và dược liệu Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư người

3.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN

3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan

Fucoidan từ 06 loài rong S.mcclurei (F-Sm), S.polycystum (F-Sp), S.swartzii (F-Ss), S.denticapum (F-Sd), S.oligocystum (F-So) và Turbinaria ornata (F-To) được chúng tôi lựa chọn thử nghiệm hoạt tính

gây độc tế bào trên 05 dòng ung thư của người là ung thư gan (Hep-G2), ung thư màng tim (RD), ung thư phổi (LU), ung thư ruột kết (DLD-1) và ung thư vú (MDA-MB-231) Thí nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Nga và Viện Sinh học và Công nghệ sinh học - Hàn Quốc Kết quả cho thấy tất cả các mẫu fucoidan thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với ít nhất 02 dòng tế

bào ung thư, trong đó fucoidan từ rong S.swartzii cho kết quả dương tính

trên 04 dòng tế bào ung thư (bảng 3.7 và 3.8)

Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan

từ 06 loài rong nâu của Việt Nam Dòng tế bào ung thư của người Fucoidan

10 Bảng 3.8 Giá trị IC50 của các mẫu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào

Dòng tế bào Fucoidan

MB-231

Trong số 06 mẫu fucoidan được thử nghiêm hoạt tính gây độc tế

bào ở trên, chúng tôi lựa chon các phân đoạn của fucoidan từ S.swartzii

và S.mcclurei tiếp tục thử nghiệm với dòng tế bào ung thư vú và ung thư

ruột kết Kết quả cho thấy tất cả các phân đoạn thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với các mức độ ức chế khác nhau (hình 3.7 và 3.8) Như vậy có thể thấy hoạt tính sinh học của fucoidan phụ thuộc vào các yếu tố đặc trưng cấu trúc của fucoidan

Hình 3.7 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB-231

của các phân đoạn fucoidan từ rong Sargassum swartzii

11

Hình 3.8: Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư kết tràng DLD-1

của các phân đoạn fucoidan được chiết tách từ rong Sargassum mcclurei

3.5 ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN

3.5.1 Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR

Các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3, SmF3 và ToF2 từ 05 loài rong

có hoạt tính sinh học tốt, đồng thời có thành phần đường đơn giản nhất so với các phân đoạn fucoidan còn lại được lựa chọn để phân tích các đặc trưng cấu trúc Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các phân đoạn fucoidan đều thu được những dải hấp thụ chính ở số sóng từ 1240-1272cm-1 cho thấy sự có mặt của nhóm sulfate Ngoài ra, các dao động hấp thụ trong vùng số sóng từ 800-845 cm-1 cho biết vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường pyrannose (bảng 3.9)

Bảng 3.9 Một số vân phổ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của fucoidan

được chiết tách từ một số loài rong nâu Việt Nam

Mẫu Số sóng dao động

đặc trưng (cm-1)

Vị trí nhóm sulfate

SdF3 847,90 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 SpF3 835,40 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 SwF5 803,77 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2

và/hoặc C3 SmF3 839,22 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 ToF2 820,00 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2

và/hoặc C3

SmF3-DS (100 μg/ml)

Đối chứng

SmF1 (100 μg/ml)

SmF2 (100 μg/ml)

SmF3 (100 μg/ml)

đủ về cấu trúc của chúng Tuy nhiên, trên phổ 13C-NMR của tất cả các phân đoạn fucoidan đều có những đặc điểm chung để nhận biết fucoidan

thông qua các tín hiệu của gốc α-L-Fucp đó là những tín hiệu mạnh xuất

hiện trong vùng trường cao 15-18 ppm đặc trưng cho nhóm metyl (CH3-)

và các tín hiệu trong vùng trường thấp 97-102 ppm đặc trưng cho cacbon α-anomeric (C1) của gốc đường 1→3)-α-L-fucopyranose, vùng tín hiệu 67-86 ppm là vùng của cacbon C2-C5 của vòng pyranoid Bên cạnh đó, phổ 13C-NMR cũng cho thấy sự có mặt của gốc đường β-D-Galactose thông qua các tín hiệu đặc trưng cho cacbon C6 không liên kết và cacbon C1 của gốc β-D-Galactose tương ứng ở độ dịch chuyển hóa học trong vùng 61-62 ppm và 103-104 ppm Ngoài ra, các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 20,9 ppm và vùng (173-175 ppm) trên phổ 13C-NMR của các phân đoạn SpF3 và SwF5 còn chỉ ra sự có mặt của nhóm O-acetyl trong phân tử của hai loại fucoidan này

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của các polysacarit nói chung và của fucoidan nói riêng đều hết sức phức tạp, độ phân giải không cao với rất nhiều pic trùng chập và chen lấn nhau Vì vậy, rất khó để giải