Nghiên cứu quy trình giám định 11-Nor-9-Cacboxyl-Delta-9-Tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng GC-MS

Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu có thể thực hiện bằng phân tích miễn dịch, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC hay bằng sắc ký khí GC, tuy nhiên HPLC là phương pháp tốn kém hơn do giá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH 11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL

TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Trường

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Trường đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Em xin cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự nhiên đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, đặc biệt là sự chỉ bảo của PGS.TS.Nguyễn Văn Ri

Em cũng xin chân thành cảm ơn Ths Hoàng Ngọc Mai, cùng các anh chị Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình sự đã rất nhiệt tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho em

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn lãnh đạo phòng PC54 –CATP Hà Nội cùng các đồng nghiệp trong đội giám định Hóa học- phòng PC54 – CATP Hà Nội đã hết sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã hỗ trợ, là chỗ dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn

Học viên

Nguyễn Thị Tuyến

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa 3

1.1.1 Cần sa 3

1.1.2 Các chế phẩm từ cần sa 5

1.1.3 Tác hại của việc sử dụng cần sa 6

1.1.4 Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự 7

1.1.5 Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa 9 1.1.6 THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu 10

1.1.7 THC-COOH 12

1.2 Một số phương pháp phân tích THC-COOH 13

1.2.1 Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng 13

1.2.2 Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí 17

1.3 Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí đã được công bố 20

1.4 Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS 22 1.5 Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 24

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 24

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.3 Nội dung nghiên cứu 25

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 28

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 28

2.4 Thực nghiệm 29

2.4.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000 29

2.4.2 Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất 30

2.4.3 Khảo sát dung môi chiết 30

2.4.4 Khảo sát môi trường (pH) chiết 31

2.4.5 Khảo sát hiệu suất chiết 31

2.4.6 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 31

2.4.7 Xây dựng đường chuẩn 32

2.4.8 Đánh giá phương pháp phân tích 32

2.4.9 Phân tích mẫu thực tế 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS 34

3.2 Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất 40

3.3 Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 40

3.3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết 40

3.3.2 Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH) 43

3.3.3 Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 44

3.4 Phương pháp định lượng THC-COOH 44

3.4.1 Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 44 3.4.2 Xây dựng đường chuẩn 45

3.4.3 Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp 47

3.4.4 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 48

3.4.5 Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS 49

3.5 Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế 51

3.6 Hướng phát triển của đề tài 51

KẾT LUẬN 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS 7

Bảng 1.2 Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa 8

Bảng 1.3 Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu 9

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng 15

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí 21

Bảng 2.1 Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 25

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết 41

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết 43

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 44

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH 45

Bảng 3.5 Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn 47

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 47

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật 48

Bảng 3.8 Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực 51

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa 4

Hình 1.2 Cần sa trồng trong nhà 5

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu 12

Hình 1.4 Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS 16

Hình 1.5 Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS 16

Hình 1.6 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành 19

Hình 1.7 Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH 22

Hình 1.8 Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 23

Hình 2.1 Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 24

Hình 3.1 Phổ khối của THC-COOH chuẩn 35

Hình 3.2 Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN I 36

Hình 3.3 Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN I 37

Hình 3.4 Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN II 38

Hình 3.5 Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN II 39

Hình 3.6 Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết 42

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết 43

Hình 3.8 Đường chuẩn xác định THC-COOH 46

Hình 3.9 Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu 50

IS Internal standard (Chất nội chuẩn)

PFPA/PFPOH Pentafluoropropionic anhydride/pentafluoropropanol

MSTFA 2,2,2-Trifluoro-N-methyl-N-(trimethylsilyl)acetamide

LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantity (Giới hạn định lượng)

HPLC High performance liquid chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

GC Gas Chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khí khổi phổ)

LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối

phổ)

MỞ ĐẦU

Từ lâu người ta đã biết đến ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra

sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó

Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm soát được hành vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn Đó là nguyên nhân làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm cắp, giết người, cướp của, mại dâm, là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm kinh tế như buôn lậu, gian lận, tham nhũng [3]

Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội như thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Benzodiazepine, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat, hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần

sa đang ngày càng được giới trẻ sử dụng nhiều

Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng, chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài Từ cần sa người 61 chất khác nhau, với thành phần chủ yếu là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol), CBD (cannabidiol) Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng tâm lý tới người sử dụng cần sa.[16]

Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút Sau khi hút 24 giờ, khoảng 50% lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% còn lại được phân bố trong toàn cơ thể, chủ yếu ở các mô mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những ngày tiếp theo Khi bài tiết trong nước tiểu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH (11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol) và các sản phẩm liên hợp với một hoặc hai phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3] Đây chính là các đối tượng để kiểm tra việc sử dụng cần sa

Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu có thể thực hiện bằng phân tích miễn dịch, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay bằng sắc ký khí (GC), tuy nhiên HPLC là phương pháp tốn kém hơn do giá thành dung môi tương đối đắt Phương pháp sắc ký khí có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, độ nhạy và độ chọn lọc cao Vì thế chúng tôi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký khí khối phổ để xác định THC-COOH

Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người

sử dụng nó, đồng thời để phục vụ cho công tác giám định ma túy, đề tài này

chúng tôi tập trung “Nghiên cứu quy trình giám định

11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng thiết bị sắc ký khí khối phổ” nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa

đã được đưa vào danh mục các chất ma túy bị cấm Tuy nhiên, nó vẫn được trồng bất hợp pháp ở nhiều vùng thuộc Bắc Mỹ, Nam Mỹ, khu vực Caribe, châu Phi và Đông Nam Á Châu Mỹ chiếm khoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm 2006, sau đến Châu Phi (khoảng 22%) [21] Ở Việt Nam, nó còn có tên gọi là cây gai dầu, trước đây mọc nhiều ở khu vực Long Xuyên, Châu Đốc

Bộ phận chứa hoạt chất có tác dụng trên hệ thần kinh là lá, quả và hoa Các

bộ phận này được thu hoạch riêng, phơi khô, ép thành bánh hoặc bó lại để sử dụng bằng cách hút, đôi khi dùng đường uống Dưới đây là các đặc điểm hình thái đặc trưng của cần sa [21]:

Hình 1.1 Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa

A - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa đực

B - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa cái

1 - Chùm nhị hoa 8 - Hạt cần sa có lá bắc

2 - Nhị hoa (nhị khác và ngắn hơn) 9 - Hạt cần sa không có lá bắc

3 - Nhị hoa 10 - Hạt cần sa (nhìn ngang)

5 - Nhụy hoa cái có lá bắc 12 - Hạt cần sa (hình bổ dọc)

6 - Nhụy hoa cái không có lá bắc 13 - Hạt cần sa đã lột vỏ

7 - Bầu nhụy hoa cái (hình bổ dọc)

Tại một số nước đã xuất hiện hiện tượng trồng trái phép cần sa trong nhà,

có thể trồng theo phương pháp thủy canh, không cần đất mà sử dụng đèn chiếu sáng nhằm qua mặt các cơ quan an ninh cho thấy mức độ phức tạp và khó khăn trong công tác điều tra phòng chống tội phạm

Hiện nay, cần sa được sử dụng ở rất nhiều nơi, đặc biệt là bộ phận những người trẻ tuổi Cần sa thường được cuộn thành điếu giống như điếu thuốc lá để hút nhằm tạo cảm giác hưng phấn Một điếu cần sa nhỏ có thể được bán với giá thành rất đắt so với thuốc lá

Hình 1.2 Cần sa trồng trong nhà

1.1.2 Các chế phẩm từ cần sa

Trong nông nghiệp cây cần sa đã được sử dụng để lấy sợi từ lâu Các sản

Các chế phẩm từ cần sa được sản xuất với các quy trình khác nhau và cách chuyển hóa khác nhau để nhằm mục đích buôn lậu và sử dụng bất hợp pháp, các chế phẩm và sản phẩm trái phép của cần sa gồm ba loại chính là: Cây cần sa, nhựa cần sa và dầu cần sa do hàm lượng THC cao

Nhựa cần sa là sản phẩm chế biến bằng cách loại bỏ hạt, sợi, hàm lượng THC đạt 2-10% [4] Nhựa cần sa được sản xuất tại khoảng 65 nước trên thế giới, chủ yếu là tại các nước thuộc khu vực Bắc Phi và Tây-Nam Á, đặc biệt là Afghanistan và Pakistan [21]

Cần sa lỏng là dịch chiết lỏng của cần sa thực vật hoặc nhựa cần sa, với dụng cụ chiết tương tự như chiết soxhlet Các dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, clorofom, n-hexan, ete dầu hỏa, cần sa lỏng chứa THC tới 10-30% [16] 1.1.3 Tác hại của việc sử dụng cần sa

Cần sa gây ra hàng loạt những biến đổi về tâm lý và hành động ở người sử dụng, thường tạo ra những khoái cảm, hưng phấn, nói nhiều Nếu như người nghiện heroin chỉ trở nên hung dữ khi lên cơn thèm thuốc thì người nghiện cần sa

có thể trở nên hung dữ ngay cả khi đang hưng phấn Khi sử dụng cần sa, các cơ quan cảm giác như thị giác, thính giác, xúc giác và vị giác bị kích thích mạnh dẫn đến ảo giác, trí nhớ lẫn lộn, không phân biệt được quá khứ, hiện tại Người nghiện có thể quên đi mọi lo lắng, ưu tư, cảm thấy mình trôi nổi, bồng bềnh, không quan tâm đến việc gì, không có mục đích rõ ràng Từ đó dẫn đến những trang thái bất thường về hành vi, không làm chủ được các hoạt động của bản thân

Sử dụng cần sa lâu dài có thể bị rối loạn thần kinh, tình dục, giảm khả năng sinh sản, gây ra trụy thai, chết thai hay rối loạn nhiễm sắc thể Cần sa có thể gây ra bất tỉnh, thậm chí dẫn đến tử vong

Bên cạnh đó cần sa cũng có một vài công dụng dùng trong y học như chống lại tác dụng gây nôn của các chất hóa trị liệu chống ung thư, làm thư giãn

cơ, chống co giật, hạ nhãn áp Tuy nhiên việc sử dụng cần sa cho mục đích y học cần được kiểm soát chặt chẽ

1.1.4 Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS [21]

(-)-Δ9-trans-Tetrahydrocannabinol

Tetrahydrocannabinol, THC

- Công thức phân tử: C21H30O2

- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

- Gần như không tan trong nước (2,8 mg/l ở 23oC), tan tốt trong dung môi etanol, clorofom, hexan

- Dược lý: Giảm đau, kháng viêm, chống nôn

(-)-∆9-trans-Tetrahydrocannabinolic

Acid, THCA

- Công thức phân tử: C22H30O4

- Khối lượng phân tử: 358 g/mol

- Gần như không tan trong nước, tan tốt trong dung môi etanol, clorofom, hexan

- Dược lý: Kháng khuẩn, kháng sinh

Cannabinol, CBN - Công thức phân tử: C21H26O2

- Khối lượng phân tử: 310,43 g/mol

- Gần như không tan trong nước, tan tốt trong dung môi etanol, clorofom, hexan

- Dược lý: An thần, giảm đau, chống

co giật, kháng sinh, kháng viêm

Cannabidiol, CBD - Công thức phân tử: C21H30O2

- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

- Gần như không tan trong nước, tan tốt trong dung môi etanol, clorofom, hexan

- Dược lý: An thần, giảm đau, chống

co thắt, kháng viêm

Cannabigerol, CBG - Công thức phân tử: C21H32O2

- Khối lượng phân tử: 316,48 g/mol

- Dược lý: Kháng sinh, kháng viêm, giảm đau, chống nấm

Cannabivarin, CBV - Công thức phân tử: C19H22O2

- Khối lượng phân tử: 282,38 g/mol

Cannabichromene, CBC - Công thức phân tử: C21H30O2

- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

- Dược lý: Kháng viêm, kháng sinh, giảm đau, chống nấm,

Hàm lượng THC trong cần sa thực vật khoảng 0,5-5% Các kết quả phân tích hàm lượng THC trong cần sa thực vật ở Việt Nam khoảng 3-5%, tuy nhiên trong một số mẫu, có thể đạt tới 10-12% [4]

Bảng 1.2 Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa [21]

cần sa có hàm lượng THC từ 4 – 21 %, tùy thuộc vào điều kiện và kỹ thuật canh tác cụ thể, còn quá trình chiết nhựa và nụ hoa cần sa có thể cho ra sản phẩm dầu cần sa có hàm lượng THC lên tới 60% [10]

1.1.5 Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa

Chưa có nghiên cứu nào chỉ ra thời gian chính xác để phát hiện mẫu dương tính với người sử dụng cần sa, bởi nó phụ thuộc nhiều yếu tố như loại mẫu, độ nhạy của thiết bị phát hiện, tần suất, liều lượng, thời gian sử dụng lần cuối cùng,

hệ thống tiêu hóa, di truyền, tình trạng trao đổi chất, hệ thống bài tiết của mỗi cá nhân, đồng thời còn những yếu tố khác tác động vào như bệnh tật hay sử dụng cùng lúc các loại ma túy khác Dưới đây là thời gian gần đúng có thể phát hiện trên một số loại mẫu sau khi lấy mẫu đối với người sử dụng cần sa [5]

Bảng 1.3 Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu

Người sử dụng một lần 1-7 ngày 12-24 giờ Không chắc

chắn

Không có giá trị

Người sử dụng thường

Có thể kiểm tra huyết tương, nước bọt, mẫu tóc, hơi thở để phát hiện cần

sa trong cơ thể người sử dụng, tuy nhiên việc xét nghiệm nước tiểu được thực hiện với chi phí rẻ hơn, việc lấy mẫu nhanh chóng, thời gian phát hiện lâu hơn và

xử lý mẫu cũng dễ dàng hơn so với mẫu máu, mẫu tóc, nước bọt và hơi thở Vì thế, lấy mẫu nước tiểu sẽ thuận lợi đối với điều kiện tại các phòng thí nghiệm giám định Hóa học của các tỉnh thành trong cả nước cũng như Viện KHHS của

Bộ công an hiện nay

Thời gian để phát hiện được cần sa trong nước tiểu phụ thuộc rất lớn vào tần suất sử dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên (trên một lần một tuần), dạng chuyển hóa của THC là THC-COOH trong nước tiểu nồng độ có thể đạt hàng trăm ng/ml [5]

Xét nghiệm nước tiểu có thể dựa trên sự phát hiện THC-COOH, một dạng chuyển hóa của THC, nó là thành phần mang hoạt tính dược lý chính của cần sa Các nghiên cứu trên cơ thể người chỉ ra rằng, 80-90% tổng số THC được bài tiết trong vòng 5 ngày, khoảng 20% trong nước tiểu và 65% trong phân [11] Trong huyết tương nồng độ THC cao nhất sau khi hút một liều thường rơi vào 2ng/ml trong 4-6 giờ, và có thể phát hiện sau vài phút Nước tiểu của người sử dụng cần

sa có chứa THC-COOH ở cả dạng tự do và dạng liên hợp với axit glucuronic

THC có thể tích lũy trong mô mỡ, tạo ra nồng độ bài tiết cao hơn và thời gian phát hiện lâu hơn Nếu có tiền sử sử dụng cần sa, xét nghiệm nước tiểu với người sử dụng bình thường có thể phát hiện sau khi sử dụng 2 tuần, và có thể lâu hơn với người sử dụng kinh niên Bất kể thí nghiệm nào cũng cần đo cả dạng tự

do và dạng chuyển hóa, bao gồm cả thủy phân để tăng độ nhạy của phép phân tích

Hoạt chất THC có thể hấp thu qua niêm mạc đường tiêu hóa, tuy nhiên tốc

độ chậm và thất thường, mức độ hấp thu thường chỉ đạt 6-20% qua đường tiêm tĩnh mạch, 18% qua đường hút Do đặc tính ưa mỡ cao nên THC có thể phân bố rộng rãi trong toàn bộ cơ thể THC chuyển hóa ở phổi nếu dùng bằng cách hút, ở gan nếu uống [4]

Mặc dù trong cần sa có trên 60 chất Cannabis được tìm thấy nhưng hoạt chất chính tạo ra tác dụng của cần sa là THC, CNB và CBD Để xác định việc sử dụng cần sa, cần thiết phải kiểm tra dạng chưa chuyển hóa của các chất cannabinoid chính là THC, CBN, CBD Tuy nhiên lượng chất chưa chuyển hóa này trong nước tiểu rất thấp, với THC chỉ khoảng 0,005-0,01% liều sử dụng, và chỉ đào thải trong vòng vài giờ [4] Bởi vậy hiện nay đối tượng giám định chủ yếu là sản phẩm chuyển hóa của THC là 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol (THC-COOH)

1.1.6 THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu

1.1.6.1 Cấu tạo THC

- Công thức phân tử: C21H30O2

- Công thức cấu tạo:

1.1.6.2 Tính chất vật lý THC

- Ở dạng tinh khiết, THC ở trạng thái rắn kết tinh khi lạnh, dạng nhớt và dính khi ấm

- Tan rất ít trong nước nhưng tan tốt trong hầu hết các dung môi hữu cơ

- Khối lượng phân tử: M = 314,46 g/mol

- Nhiệt độ sôi: 157oC

- Độ tan trong nước: 0,0028 mg/ml ở 20oC

1.1.6.3 Tính chất hóa học và sự chuyển hóa THC

THC tan nhiều trong hầu hết các dung môi hữu cơ, đặc biệt là chất béo và rượu THC không bền với nhiệt độ cao và ánh sáng, dễ cháy Nó tác dụng với oxoaxit hay axit cacboxylic tạo ra este và nước Nó có thể bị oxy hóa thành anđehit hoặc xeton dưới điều kiện khác nhau

Khi sử dụng cần sa, hoạt chất chính trong cần sa là THC bị hấp thụ vào cơ thể THC chứa một nhóm –OH được chuyển hóa trong gan, qua quá trình hydro hóa nhóm –CH3 tạo thành THC-OH, thông qua quá trình oxy hóa một nhóm –OH xúc tác bởi các enzyme Cytochrome P450 (CYPs) trong gan tạo thành THC-COOH chứa một nhóm –COOH Sau đó THC-COOH chứa 2 nguyên tử Hydro linh động, tác dụng với axit glucuronic trong cơ thể người thành dạng muối của axit glucuronic, và được thải ra ngoài bằng đường nước tiểu sau khi thận bài tiết Quá trình chuyển hóa được thể hiện qua sơ đồ sau:

Công thức phân tử: C21H28O4

Khối lượng phân tử: 344,445 g/mol

Công thức cấu tạo:

Thời gian bán hủy: 5,2-6,2 ngày [8]

Do đặc điểm công thức cấu tạo có 2 nguyên tử H+ linh động của nhóm –

OH và nhóm –COOH nên THC-COOH có các phản ứng hóa học đặc trưng của nguyên tử H+

1.2 Một số phương pháp phân tích THC-COOH

- Phương pháp sắc ký bản mỏng: Việc định tính các cấu tử dựa vào tỷ số giữa độ di chuyển của chất so với độ di chuyển của dung môi trong cùng thời gian chạy sắc ký Sau đó, dựa vào diện tích pic trong mẫu để bán định lượng cấu

tử cần phân tích

- Phân tích miễn dịch: Ưu điểm của phương pháp là không cần chiết và làm sạch mẫu, thời gian phân tích nhanh và có thể áp dụng với một lượng mẫu lớn Các kháng thể sử dụng trong các kít thử thường có hoạt tính cao với sản phẩm chuyển hóa THC-COOH, tuy nhiên còn có tác dụng chéo đối với các sản phẩm chuyển hóa khác Vì thế phương pháp này ít khi được sử dụng do tốn kém

và không tin cậy

Hiện nay, phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng được dùng rộng rãi để phân tích THC cũng như THC-COOH vì có ưu điểm hiệu quả tách tốt, độ nhạy và độ chính xác cao

1.2.1 Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng

Để phân tích THC-COOH trên thiết bị HPLC, các bước chuẩn bị, xử lý mẫu cũng tương tự như đối với sắc ký khí được trình bày trong mục 1.2.2 phía dưới Tuy nhiên đối với phương pháp này, chúng ta không cần thực hiện giai đoạn dẫn xuất mẫu Vì với thiết bị HPLC có thể phân tích được cả các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi và khó bay hơi

Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách chất dựa trên cả hiện tượng vật lý và hóa học Trong quá trình sắc ký, trong cột sắc ký luôn xảy ra cân bằng động giữa pha tĩnh

và pha động, nghĩa là sự vận chuyển và phân bố chất tan luôn được lặp đi lặp lại giữa hai pha Chất phân tích được di chuyển từng lớp qua pha tĩnh từ đầu đến cuối cột sắc ký theo pha động với dòng chảy liên tục, tốc độ và thành phần nhất

định, hay gradient Do tính chất và cấu trúc của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển của mỗi chất cũng khác nhau Khi ở trong pha động, nó dịch chuyển theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại bị pha tĩnh giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu, có chất tan bị lưu giữ ít trên cột Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký

Tùy theo tính chất và hàm lượng chất phân tích, trong sắc ký lỏng người ta đưa ra một số phương pháp cơ bản sau:

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng

LOQ (ng/ml)

H (%)

Khoảng tuyến tính (ng/ml)

Dưới đây là sắc ký đồ của THC-COOH được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ

Hình 1.4 Sắc đồ của THC- COOH khi phân tích bằng LC- MS

Hình 1.5 Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS

1.2.2 Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí

1.2.2.1 Thủy phân mẫu

Trên 80% lượng THC-COOH có trong nước tiểu dưới dạng liên hợp glucuronic Do vậy phải tiến hành thủy phân để tách gốc glucuronic ra khỏi THC-COOH Đối với mẫu cần sa, thủy phân trong môi trường kiềm cho hiệu quả cao

và ổn định hơn các phương pháp thủy phân trong môi trường axit và men

1.2.2.2 Phương pháp chiết

Sau khi tiến hành thủy phân để tách THC-COOH ra khỏi dạng liên hợp của

nó với axit glucuronic, thì việc quan trọng tiếp theo là phải tách chúng ra khỏi nước tiểu, hiệu quả tách càng cao đồng nghĩa với việc phân tích càng chính xác

Có nhiều phương pháp tách chiết, tuy nhiên cần lựa chọn phương pháp sao cho phù hợp với đối tượng mẫu, yêu cầu phân tích cũng như điều kiện phòng thí nghiệm Một số phương pháp phù hợp để chiết THC-COOH từ nước tiểu là chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn

Quá trình tách trong chiết pha rắn cũng tương tự như chiết lỏng- lỏng và phương pháp sắc ký, chủ yếu dựa trên định luật phân bố chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau Chiết pha rắn thuận lợi hơn so với việc chiết pha lỏng, nhưng trong đề tài này để phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại nhiều phòng thí nghiệm Kỹ thuật hình sự ở Công an các tỉnh thành trong cả nước, chúng tôi lựa chọn chiết pha lỏng để tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu

1.2.2.3 Kỹ thuật dẫn xuất

Dẫn xuất: Kỹ thuật dẫn xuất hóa đóng vai trò quan trọng trong sắc ký khí nhằm phân tích các chất khó bay hơi, đặc biệt là các hợp chất chứa một hoặc nhiều nhóm chức, mà có khả năng hấp phụ đặc trưng gây ra sự giãn pic và làm biến dạng pic, đặc biệt ở nồng độ thấp Việc dẫn xuất hóa không chỉ tạo nên các pic cân đối mà còn làm tăng độ phân giải, giúp định lượng chính xác Các kiểu dẫn xuất thường dùng là trialkyl silan hóa, este hóa, alkyl hóa…[1]

THCCOOH là hợp chất phân cực, chứa proton H+, nên sử dụng dẫn xuất alkylsilyl là phù hợp Trong quá trình dẫn xuất, phản ứng phải được thực hiện

dưới điều kiện không có nước, trong lọ thủy tinh có nút xoáy với đệm teflon BSTFA ( N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit) được sử dụng nhiều trong sắc ký khí, thúc đẩy sự tạo thành các ete enol-TMS ngoại trừ các nhóm keton được bảo

vệ Phản ứng xảy ra chậm ở nhiệt độ phòng, nên có thể thúc đẩy bằng cách thêm xúc tác trimetylclosilan (TMCS)

1.2.2.4 Phương pháp phân tích định tính và định lượng

Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu phù hợp với khả năng của thiết bị sắc ký khí (GC) kết nối detector khối phổ (MS), vì thế kết quả phân tích

Trong sắc ký khí, mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này

Khi pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn, thì kỹ thuật phân tích gọi là sắc ký khí - rắn (GSC) Khi pha lỏng được gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc được phủ dưới dạng một lớp phim mỏng lên thành cột mao quản, thì kỹ thuật này gọi là sắc ký khí -lỏng (GLC) [1]

Sắc ký khí là phương pháp có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, đối với những detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp có thể đạt 0,1ppb

Tuy nhiên phương pháp có hạn chế là chỉ phù hợp với các hợp chất dễ bay hơi [2] Chính vì vậy, trước khi phân tích THC-COOH bằng GC, cần dẫn xuất nó

để tạo hợp chất dễ bay hơi nhằm phù hợp với phương pháp

Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành như sau:

- Phương pháp phân tích định lượng:

Trong sắc kí, hai phương pháp thường được sử dụng để định lượng chất phân tích là phương pháp nội chuẩn và phương pháp ngoại chuẩn

Phương pháp nội chuẩn dựa trên sự so sánh cường độ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn Các chất dùng làm chất nội chuẩn là các chất không có trong thành phần của mẫu, cho tín hiệu ổn định và khoảng thời gian lưu nằm gần khoảng thời gian lưu của chất phân tích Chất nội chuẩn được đưa vào mẫu cần phân tích với nồng độ đã biết Khi tính toán máy

sẽ dựa vào tỉ lệ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn

Sơ đồ chức năng thiết bị sắc kí khí

1- Nguồn khí mang 5 - Detector

2- Điều chỉnh áp suất 6 - Máy ghi

3 - Bộ phận bơm mẫu 7 - Phần mềm và computer

4- Cột tách

để tính ra nồng độ Phương pháp này có độ chính xác cao vì nó loại bỏ được các yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích (yếu tố nền, sự sai khác về thể tích bơm mẫu giữa các lần đo)

Nguyên tắc của phương pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hay chiều cao pic thu được) trong mẫu chưa biết với dung dịch chuẩn của chất đó

Trước tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng

độ thích hợp Từ các kết quả thu được ta xây dựng đường chuẩn có dạng: y = a +

bx Đo diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào đường chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x)

Với thiết bị phân tích hiện đại GC-MS Agilent 7000 các thông số làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng…có độ ổn định tốt, các lần bơm mẫu có độ lặp lại cao nên chúng tôi dùng phương pháp ngoại chuẩn để phân tích định lượng [1] 1.3 Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí đã được công bố

Dưới đây là bảng một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH với các điều kiện về thủy phân, phương pháp chiết, dung môi chiết, chất dẫn xuất, thiết bị phân tích, chất nội chuẩn sử dụng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu suất thu hồi và khoảng tuyến tính của đường chuẩn

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí

STT Tác nhân và nhiệt

Thiết bị phân tích Nội chuẩn

LOD (ng/ml)

LOQ (ng/ml)

H (%)

Khoảng tuyến tính (ng/ml)

1,2-1500 (r=0,9978)

4

Pha lỏng n-hexan/etylaxetat BSTFA

MS/MS

6

COOH-d3;

COOH-d9

(r=1)

1.4 Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS

Hoạt chất chính của cần sa khi được đưa vào trong cơ thể người là THC, qua quá trình chuyển hóa sẽ chuyển thành THC-OH rồi sau đó chuyển sang dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH, tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm mạnh để chuyển dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH về dạng tự do, sau đó dẫn xuất THC-COOH bằng chất dẫn xuất BSTFA với chất dẫn xuất TMCS để làm tăng khả năng phản ứng

Chất dẫn xuất BSTFA chứa nhóm -TMS thay thế cho 2 nguyên tử hydro linh động của THC-COOH tạo thành THC-COOH-2TMS và được phân tích trên GC-MS Quá trình phản ứng được thể hiện qua sơ đồ sau:

Hình 1.7 Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH

1.5 Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS

THC-COOH-2TMS với khối lượng phân tử m/z = 488, sau khi đưa vào phân tích trên GC-MS có thể phân mảnh theo cơ chế sau:

Hình 1.8 Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Để xác định THC-COOH trong nước tiểu, cần khảo sát các điều kiện thủy phân, môi trường pH để chiết lỏng - lỏng, dung dịch chiết, hiệu suất chiết, chất dẫn xuất và điều kiện dẫn xuất trước khi đưa vào phân tích bằng máy GC-MS

Phân tích hàm lượng THC-COOH trong nước tiểu bằng quy trình đã lựa chọn được trên GC-MS

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu nước tiểu nghi sử dụng cần sa Các mẫu nước tiểu đều được thử phản ứng miễn dịch với kít thử cần sa Thông tin về một số mẫu nước tiểu bị thu giữ theo lời khai của đối tượng như sau:

Hình 2.1 Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ

Bảng 2.1 Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ

Ký

hiệu Đặc điểm

Thể tích mẫu

Thông tin mẫu (theo lời khai của đối tượng)

2.1.3 Nội dung nghiên cứu

Sau khi dẫn xuất THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích trên GC-MS Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC-COOH, để xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng phương pháp sắc

ký khí khối phổ, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu:

- Lựa chọn và khảo sát lại điều kiện thủy phân và dẫn xuất

- Khảo sát dung môi chiết

- Khảo sát môi trường chiết (pH)

- Đánh giá hiệu quả chiết

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phát hiện (LOQ)

- Xây dựng đường chuẩn của THC-COOH

- Đánh giá tính phù hợp của phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối, hiệu suất thu hồi…

- Ứng dụng: Phân tích trên các mẫu nước tiểu nghi sử dụng Cần sa bị bắt giữ 2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

- KOH (dùng để pha dung dịch KOH 10M)

- Muối khan Na2SO4 (Merck, Đức) được nung ở 2500 C trong 2h trước khi

sử dụng

- Nước cất hai lần

- Khí N2 kỹ thuật 99% dùng để đuổi dung môi

- Khí He tinh khiết dùng làm khí mang cho thiết bị GC/MS

- Chất dẫn xuất N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit (BSTFA) chứa 1% trimetylclosilan (TMCS) hãng Sigma-Aldrich

- Các dung môi tinh khiết: Xyclohexan, etylaxetat, dietylete, methanol, hexan, isooctane, metylencloride, 2-propanol, (Merck, Đức)

n Kít thử miễn dịch Acon, Mỹ

* Cách pha các dung dịch chuẩn và dung dịch đệm như sau:

+ Dung dịch chuẩn gốc THC-COOH nồng độ 2000 ng/ml được chuẩn bị như sau: 0,1 mg chuẩn THC-COOH được pha với hỗn hợp dung môi n-hexan/etylaxetat (9:1, v/v), định mức đến 50 ml Dùng dung dịch chuẩn này để pha loãng với các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn nằm trong khoảng từ 10 ÷

2000 ng/ml bao gồm: 10; 50; 250; 500; 1000; 1500; 2000 ng/ml Các dung dịch chuẩn này sau đó được làm khô bằng dòng khí nitơ, thêm dung dịch BSTFA chứa

1% TMCS rồi dẫn xuất và phân tích trên sắc ký Sau khi phân tích và dựng đường chuẩn, sẽ sử dụng các kết quả nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn cho mục đích phân tích định lượng THC-COOH có mặt trong nước tiểu của đối tượng

sử dụng cần sa

+ Dung dịch đệm pH=1: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,388 gam NaOH; 1,019 gam axit xitric và 1,547 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml

+ Dung dịch đệm pH=2: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,562 gam NaOH; 1,608 gam axit xitric và 1,470 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml

+ Dung dịch đệm pH=3: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,806 gam NaOH; 2,118 gam axit xitric và 1,263 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml

+ Dung dịch đệm pH=4: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 1,120 gam NaOH; 3,724 gam axit xitric và 0,931 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml

Tất cả các dung dịch đệm sau khi pha đều được kiểm tra lại bằng máy đo pH 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Lọ thủy tinh có nắp loại 100 ml

- Pipet, ống đong các loại, phễu chiết, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh bình định mức các loại

- Máy đo pH Thermo scientific

- Tủ sấy, tủ ấm

- Cân phân tích Sartorius CPA 225D có độ chính xác 10-5

- Máy điều nhiệt Memmer, Germany

- Máy cô quay Eyela, Japan

- Máy siêu âm Branson 1510

- Máy lắc Unitwist 300

- Máy GC-MS Triple Quad 7000, USA

- GC Agilent Techologies 7890A

- Agilent Technologies 7693 Autosample

- Cột HP-5MS-5% phenyl metyl silox (30m x 250µm x 0,25µm)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu trắng được lấy từ những người khỏe mạnh, không sử dụng bất cứ loại

ma túy nào Mẫu thực tế được lấy từ các đối tượng nghi đã sử dụng cần sa của các đơn vị bắt được, sau đó kiểm tra sơ bộ bằng que thử, mẫu nào dương tính với cần

sa sẽ dùng để tiến hành phân tích

Các mẫu đều ghi đầy đủ thông tin về tên, độ tuổi, tiền sử sử dụng và ngày

sử dụng gần đây nhất và ngày lấy mẫu Các mẫu đều được bảo quản trong tủ lạnh

ở nhiệt độ -20oC đến khi phân tích

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

Phân tích với đối tượng mẫu phức tạp như mẫu sinh học, quá trình chuẩn

bị mẫu phải hết sức cẩn thận, đòi hỏi khắt khe và tốn nhiều thời gian nhất Nó quyết định đến nhiều đại lượng của phương pháp phân tích

Để tăng độ nhạy của phép phân tích, quá trình thủy phân và chiết cần được thực hiện cẩn thận Trước khi thủy phân mẫu, cần đo thể tích, pH mẫu, quan sát

độ đục, độ tạo bọt, có thể lọc nếu nhiều cặn

Mẫu được xử lý theo 3 bước như sau:

- Bước 1: Tiến hành thủy phân với mẫu nước tiểu: Lấy 10 ml nước tiểu vào

lọ thủy tinh, thêm 2ml dung dịch KOH 10M, đậy kín và thủy phân ở nhiệt độ và thời gian được lựa chọn, điều chỉnh pH rồi tiến hành chiết

- Bước 2: Mẫu sau khi được chiết, để phân lớp, tách phần dung dịch hữu

cơ, loại nước bằng Na2SO4 khan, đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC, chuyển dịch cô vào lọ thủy tinh nhỏ, cô khô bằng dòng N2 Sau đó được dẫn xuất trước khi phân tích để tăng độ nhạy phép phân tích

- Bước 3: Mẫu sau khi làm bay hơi được cho thêm 20µl BSTFA trimetylsilyl trifloaxetamit) chứa 1% TMCS (trimetylclosilan) Làm nóng dung

(N,O-bis-dịch ở nhiệt độ và thời gian được lựa chọn Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, bơm 1µl để phân tích sắc ký khí

2.4 Thực nghiệm

2.4.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000

Điều kiện làm việc trên GC-MS Triple Quad 7000 được khảo sát với cùng chương trình làm việc, với cùng 1 mẫu chuẩn ở cùng một nồng độ theo 2 chương trình nhiệt độ khác nhau

Điều kiện làm việc:

- Thể tích bơm mẫu: 1µl

- Kiểu bơm: Không chia; Thời gian không chia: 0,75 phút

- Khí mang: He; Tốc độ dòng: 3 ml/phút; Kiểu đẳng dòng

- Kiểu va chạm điện tử EI+(Electron Impact): 70 eV

- Chế độ quét: Full scan/SIM; Khoảng m/z: 40-500

- Nhiệt độ buồng bơm mẫu Injector: 250oC

- Nhiệt độ lò sang cột Transferline: 280oC

- Nhiệt độ nguồn ion: 230oC

* Chương trình nhiệt độ thứ nhất (theo tham khảo quy trình của trung tâm ma túy, viện KHHS)

- Nhiệt độ ban đầu của cột mao quản là 100oC, giữ trong 2 phút Sau đó tăng đến 270oC với tốc độ 20oC/phút Nhiệt độ cuối cùng 270oC được giữ trong

20 phút Tổng chương trình nhiệt độ là 30,5 phút

- Sơ đồ mô tả chương trình nhiệt độ:

100oC (2 phút) 270oC (20 phút)

Tổng cộng: 30,5 phút

* Chương trình nhiệt độ thứ hai [14]

- Nhiệt độ ban đầu của cột mao quản là 120oC, giữ trong 2 phút Sau đó tăng nhanh đến 200oC với tốc độ 50oC/phút, tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ

200C/ phút

15oC/phút Nhiệt độ cuối cùng 280oC được giữ trong 5 phút Tổng chương trình nhiệt độ là 13,933 phút

- Sơ đồ mô tả chương trình nhiệt độ:

Tổng cộng: 13,933 phút 2.4.2 Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất

- Điều kiện thủy phân: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu dương tính, đo pH bằng giấy quỳ, thêm 2 ml KOH 10M, thủy phân ở các nhiệt độ 50oC,

55oC và 60oC trong thời gian 20 phút bằng máy điều nhiệt Để nguội, đo lại pH, thêm dung môi chiết, thu dung môi chiết, loại nước, cô khô, dẫn xuất và bơm vào sắc ký

- Điều kiện dẫn xuất: Lấy vào 3 lọ sắc ký cùng một lượng chuẩn COOH nồng độ 250 ppb Cô khô, bơm 20µl dẫn xuất BSTFA chứa 1% TMCS Làm nóng ở các điều kiện sau:

THC-+ 90oC trong 20 phút

+ 90oC trong 30 phút

+ 100oC trong 20 phút

2.4.3 Khảo sát dung môi chiết

Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên Đo pH của mẫu, rồi điều chỉnh đến pH =2 bằng dung dịch HCl 2M Thêm 3ml dung dịch đệm pH = 2 Thêm 20 ml dung môi chiết Lắc bằng máy lắc trong 30 phút Xử lý mẫu sau khi chiết, dẫn xuất, bơm 1

µl mẫu vào GC-MS để phân tích

Qua tham khảo các tài liệu, các hệ dung môi sau được lựa chọn để khảo sát dung môi chiết: iso-octan; n-hexan/etylaxetat (9:1,v/v); n-hexan/etylaxetat (7:3,v/v); metylencloride/2-propanol/etyaxetat (1:1:3,v/v/v); etylaxetat/dietyete (1:1, v/v); xyclohexan/etylaxetat (7:1,v/v) Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình

500C/ phút 150C/ phút

2.4.4 Khảo sát môi trường (pH) chiết

Sau khi lựa chọn được hệ dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, cố định dung môi và khảo sát môi trường pH trong khoảng pH = 1 ÷ 4

Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên Thêm dung dịch HCl 2M để điều chỉnh pH đến các giá trị pH=1; pH=2; pH=3; pH=4 Thêm 3 ml dung dịch đệm có pH tương ứng Thêm 20 ml dung môi chiết đã tối ưu được, lắc bằng máy lắc trong 30 phút

Xử lý mẫu sau khi chiết, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình Kết quả được trình bày trong chương 3 2.4.5 Khảo sát hiệu suất chiết

Tiến hành độc lập hai thí nghiệm sau:

- Thí nghiệm I: Lấy vào lọ sắc ký dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, làm khô rồi đem dẫn xuất

- Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu trắng, thêm

50 µl dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, điều chỉnh đến pH đã tối ưu bằng dung dịch HCl 2M, thêm 20 ml dung môi đã tối ưu, tiến hành chiết và xử lý mẫu trước khi phân tích trên GC-MS

Tiến hành phân tích ở cùng một điều kiện trên GC-MS đã tối ưu được Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình Kết quả được trình bày trong chương 3

2.4.6 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị

Giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD) và giới hạn định lượng của thiết bị (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu nền

LOD và LOQ được xác định dựa vào sai số giữa các lần bơm một dung dịch có nồng độ nhỏ của chất cần phân tích lên thiết bị Ban đầu tiến hành bơm lặp dung dịch này 7-10 lần Sau đó, tính độ lệch chuẩn SD theo công thức: