Lựa chọn chủng vi khuẩn để chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida và streptococcus suis gây ra ở lợn

40 3.2 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng A.. 3.4 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng S.. Ý nghĩa khoa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN XUÂN HUYÊN

LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ðỂ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO

ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS

SUIS GÂY RA Ở LỢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

NGUYỄN XUÂN HUYÊN

LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ðỂ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO

ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Cù Hữu Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin ñược chân thành cảm ơn thầy PGS TS Nguyễn Hữu Nam, các thầy

cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y, Ban ñào tạo sau ðại học- Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh chị em ñồng nghiệp tại Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, ñặc biệt là gia ñình ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

MỤC LỤC

Trang

Lời cam ñoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

MỞ ðẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ðặc tính của vi khuẩn A pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi do vi khuẩn gây ra ở lợn 3

1.2 ðặc tính của vi khuẩn P multocida và bệnh viêm phổi do vi khuẩn gây ra ở lợn 12

1.3 ðặc tính của vi khuẩn S suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn 17

1.4 Tình hình sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn ở nước ta 24

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nội dung nghiên cứu 27

2.2 ðối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu 27

2.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả thu thập các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập ñược dùng cho nghiên cứu 40

3.2 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng A pleuropneumoniae nghiên cứu 40

3.3 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype của các chủng P multocida nghiên cứu 47

3.4 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng

S suis nghiên cứu 50

3.5 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 58

3.6 Kết quả gây bệnh thực nghiệm một số chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis nghiên cứu trên lợn 63

3.7 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây ra ở lợn 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

1 Kết luận 74

2 Kiến nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AGID Agar Gel Immuno Diffusion

A pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae

BHI Brain Heart Infusion

CAMP Christie Atkins Munch-Peterson

NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction

PPLO Pleuropneumonia-like organism

P multocida Pasteurella multocida

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

RTX-toxin Repeats in the Structural Toxin

S aureus Staphylococcus aureus

S suis Streptococcus suis

TYE Tryptone Yeast Extract Broth

TSA Tryptone Soya Agar

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh gen omlA 29

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh gen quy ñịnh sản sinh ba loại ñộc tố

Apx của A pleuropneumoniae 30

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi ñể xác ñịnh serotype A, B, D của P multocida 32

Bảng 2.4 Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh gen gdh của S suis 34

Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh một số gen mã hoá các yếu tố ñộc

lực của S suis 35

Bảng 2.6 Trình tự các mồi dùng ñể xác ñịnh các serotype 1, 2, 7, 9 của S suis 36

Bảng 3.1 Kết quả lựa chọn các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu 40

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh học của các chủng A

pleuropneumoniae nghiên cứu 42

Bảng 3.3 Kết quả giám ñịnh A pleuropneumoniae bằng phương pháp PCR 43

Bảng 3.4 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng A pleuropneumoniae nghiên cứu

bằng phản ứng AGID 44

Bảng 3.5 Kết quả xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố Apx của các chủng A

pleuropneumoniae nghiên cứu 46

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh học của các chủng P multocida

nghiên cứu 48

Bảng 3.7 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng P multocida nghiên cứu 49

Bảng 3.8 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh học của các chủng S suis nghiên

cứu 51

Bảng 3.9 Kết quả giám ñịnh S suis bằng phương pháp PCR 52

Bảng 3.10 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng S suis nghiên cứu 54

Bảng 3.11 Kết quả xác ñịnh các gen mã hoá một số yếu tố ñộc lực của các chủng S

suis nghiên cứu 57

Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng A pleuropneumoniae nghiên cứu

trên chuột nhắt trắng 59

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng P multocida nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 61

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng S suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 63

Bảng 3.15 Kết quả gây bệnh thực nghiệm một số chủng A pleuropneumoniae, P multocida và S suis trên lợn 65

Bảng 3.16 ðặc tính của các chủng A pleuropneumoniae, P multocida và S suis ñược chọn ñể chế tạo thử nghiệm vacxin 69

Bảng 3.17 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin 70

Bảng 3.18 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng 71

Bảng 3.19 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 72

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 38

Hình 3.1 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh A pleuropneumoniae 43

Hình 3.2 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng A pleuropneumoniae 44

Hình 3.3 Sản phẩm PCR xác ñịnh ñộc tố Apx của A pleuropneumoniae 46

Hình 3.4 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng P multocida nghiên cứu 50

Hình 3.5 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh serotype của P multocida 50

Hình 3.6 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh S suis 53

Hình 3.7 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng S suis nghiên cứu 55

Hình 3.8 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh serotype của S suis 55

Hình 3.9 Sản phẩm của phản ứng PCR xác ñịnh ñộc tố của S suis 57

Hình 3.10 Lợn chết do gây bệnh thực nghiệm 66

Hình 3.11 Phổi lợn bị viêm dính thành ngực do A pleuropneumoniae 66

Hình 3.12 Phổi lợn bị viêm do P multocida 67

Hình 3.13 Lợn bị viêm, xuất huyết màng não do S suis 67

MỞ ðẦU

Hiện nay, chăn nuôi lợn tiếp tục ñóng vai trò quan trọng trong ngành chăn nuôi ở nước ta, số lượng ñầu lợn vẫn không ngừng gia tăng, quy mô chăn nuôi ngày càng lớn Theo ñịnh hướng ñược Thủ tướng Chính phủ phê duyệt trong quyết ñịnh số 10/2008/Qð-TTg ngày 16 tháng 01 năm 2008 về chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2020, thì ñến năm 2020 mục tiêu là phát triển nhanh quy mô ñàn lợn ngoại theo hướng trang trại, duy trì quy mô nhất ñịnh ñối với chăn nuôi lợn lai, lợn ñặc sản phù hợp với ñiều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng Tăng tổng ñàn lợn bình quân 2% năm, ñạt 35 triệu con trong ñó ñàn lợn ngoại nuôi trang trại công nghiệp chiếm 37%

Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn ở nước ta luôn phải ñối mặt với nhiều khó khăn như về chất lượng con giống, thức ăn, giá cả thị trường,… ñặc biệt là bệnh dịch vẫn thường xuyên xảy ra trên ñàn lợn gây thiệt hại lớn về kinh tế Một số bệnh thường xuyên xảy ra trong thời gian vừa qua có thể kể ñến như: Bệnh Tai xanh, Lở mồm long móng, bệnh ñường hô hấp ở lợn… không những ảnh hưởng ñến mục tiêu phát triển chăn nuôi mà còn ñe dọa ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người Trong ñó, bệnh ñường hô hấp ở lợn là một trong những bệnh ñã và ñang nhận ñược rất nhiều sự quan tâm của người chăn nuôi cũng như các nhà nghiên cứu vì những tổn thất kinh tế mà nó gây ra, ñặc biệt với mô hình chăn nuôi trang trại quy mô lớn

Trong số các nguyên nhân gây bệnh ñường hô hấp ở lợn, các loại vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae (A pleuropneumoniae), Pasteurella multocida (P multocida) và Streptococcus suis (S suis) ñã ñược nhiều tác giả nghiên cứu xác ñịnh

là những tác nhân thường gặp nhất gây bệnh viêm phổi cho lợn ở nước ta như: Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993), Nguyễn Ngọc Nhiên (1996), Cù Hữu Phú và cs (2005), ðỗ Ngọc Thúy và cs (2009), Cù Hữu Phú và cs (2011),… Các tác nhân này có khi là nguyên phát, có khi cộng phát hoặc thứ phát gây bệnh nên việc phát hiện và ñiều trị bệnh thường rất khó khăn và tốn kém Do ñó, việc

phòng bệnh do các loại vi khuẩn này gây ra có vai trò rất quan trọng, trong ñó việc

sử dụng vacxin phòng bệnh ñược xem là giải pháp tối ưu Tuy nhiên ở nước ta hiện nay, ngoài một số loại vacxin nhập ngoại với giá thành ñắt, chúng ta chưa sản xuất ñược vacxin phòng bệnh viêm phổi do các vi khuẩn này gây ra Vì vậy, việc nghiên cứu chế tạo một loại vacxin ña giá có thể phòng cùng lúc cả ba loại tác nhân gây bệnh viêm phổi ở lợn với hiệu quả phòng bệnh cao, giá thành thấp là hết sức cần thiết và cấp bách

Xuất phát từ nhu cầu thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Lựa chọn chủng vi khuẩn ñể chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra ở lợn”

Mục tiêu nghiên cứu

Lựa chọn ñược một số chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và

S suis phân lập ñược mang tính ñại diện, ñiển hình, phù hợp với thực ñịa ñể dùng

làm giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn và bước ñầu thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh của vacxin chế tạo ñược

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

Kết quả nghiên cứu bước ñầu sẽ là cơ sở, tiền ñề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm chọn ra ñược một bộ giống vi khuẩn phù hợp, có kháng nguyên tính cao,

ổn ñịnh ñể chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn có hiệu lực phòng bệnh cao, giá thành vừa phải, phù hợp với ñiều kiện thực tế ở nước ta

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ðặc tính của vi khuẩn A pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi

do vi khuẩn gây ra ở lợn

1.1.1 ðặc tính sinh học của vi khuẩn A pleuropneumoniae

* ðặc tính hình thái và tính chất nuôi cấy:

Theo phân loại của Pohl et al (1983), vi khuẩn A pleuropneumoniae thuộc

họ Pasteurellaceae, thuộc giống Actinobacillus, trước ñây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae, ñã ñược xác

ñịnh là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn

Vi khuẩn A pleuropneumoniae là loại cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích

thước 0,3- 0,5 x 0,6- 1,4 µm, không di ñộng, không sinh nha bào và có khả năng hình thành giáp mô Dưới kính hiển vi ñiện tử quan sát thấy vi khuẩn có lông hay còn gọi là pili có kích thước 0,5- 2 x 60- 450 nm (Utrena and Pijoan, 1991)

A pleuropneumoniae là một loại vi khuẩn khó tính, khó nuôi cấy trên các

môi trường thông thường và thường phụ thuộc vào yếu tố V ñể phát triển (Møller and Kilian, 1990) Do vậy, khi nuôi cấy vi khuẩn này cần các môi trường giàu dinh dưỡng Vi khuẩn không mọc trên môi trường thạch máu thông thường trừ khi thạch

máu ñược bổ sung NAD hoặc có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus) Vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc xung quanh ñường cấy S aureus với kích thước 0,5- 1 mm sau 24 giờ nuôi cấy trên thạch máu có cấy kèm S aureus và

hình thành vùng dung huyết β, vùng dung huyết này thường rõ hơn trên môi trường

thạch có bổ sung 5- 7% máu cừu (Kilian et al., 1978) Ngoài ra A pleuropneumoniae còn gây nên một vùng dung huyết tăng cường trong vùng dung huyết bán phần, xung quanh ñường cấy S aureus có ñộc tố dung huyết β gọi là hiện

tượng CAMP (Kilian, 1976) Hiện tượng này liên quan tới sự có mặt của ba chất làm tan tế bào là ApxI, ApxII và ApxIII

A pleuropneumoniae thuộc biotype 1 có thể phân biệt ñược với Haemophilus parasuis bởi khả năng gây dung huyết xung quanh ñường cấy S aureus trên thạch máu, vì vi khuẩn Haemophilus khi nuôi cấy trên thạch máu không gây ra hiện tượng dung huyết (Kilian et al., 1978)

Trên môi trường thạch TSA ñược bổ sung Yeast Extract (YE) và huyết thanh ngựa, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dưới ánh sáng ñèn ñiện có màu xám xanh sau 24- 48 giờ nuôi cấy Trên môi trường thạch chocolate, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhầy, màu trắng xám Vi khuẩn không mọc trên môi trường MacConkey

Vi khuẩn A pleuropneumoniae có khả năng lên men các loại ñường:

Glucose, Fructose, Maltose, Mannitol, Ribose, Xylose, và không lên men các loại ñường: Arabinose, Lactose, Raffinose, Trehalose, Phản ứng Indol âm tính, Oxidase, Catalase, Urease, CAMP Test dương tính

* Phân loại:

A pleuropneumoniae ñược xác ñịnh là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm

phổi - màng phổi ở lợn và ñược chia thành 2 biotype chính dựa trên nhu cầu sử dụng NAD hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Biotype 1 của

vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo cần có NAD, còn biotype 2 không ñòi hỏi có NAD trong quá trình nuôi cấy nhưng vẫn cần có các pyridine nucleotide ñặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotide ñể tổng hợp NAD cần thiết

cho sự phát triển của chúng Biotype 1 có ñộc lực cao hơn biotype 2 (Pohl et al.,

1983)

ðến nay, ñã xác ñịnh ñược trong biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên

sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS)

thành tế bào, ký hiệu từ 1- 12 (Perry et al., 1990), riêng serotype 5 ñược chia làm hai

loại 5a và 5b (Nicolet, 1988; Nielsen, 1988)

Trong biotype 2, các serotype 2, 4, 7 và 9 có chung nhóm quyết ñịnh kháng nguyên như biotype 1 Gần ñây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 ñược phát hiện

và ựược mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen et al., 1997) Blackall

et al (2002) ựã phát hiện ra serotype 15 thuộc biotype 1 ở 9 chủng phân lập ựược tại

Úc

* Cấu trúc kháng nguyên và các yếu tố ựộc lực:

Hiện nay ựã xác ựịnh ựược một số thành phần cấu trúc và các loại protein

của A pleuropneumoniae Một số trong các thành phần này liên quan tới quá trình

sinh bệnh

- Lớp vỏ vi khuẩn (Capsule Polysaccharide - CPS):

Vi khuẩn A pleuropneumoniae ựược bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có

bản chất là các polysaccharide Lớp vỏ polysaccharide này tắch ựiện âm và ựược cấu tạo bởi các ựơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer oligosaccharide gắn kết với

nhâu bởi các cầu nối phosphate (Perry et al., 1990) đây là một trong những thành

phần quyết ựịnh ựộc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân tố quyết ựịnh tắnh ựặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward and Inzana, 1997) Nhiều nghiên cứu ựã chứng

minh rằng 12 serotype A pleuropneumoniae ựược phân biệt bởi ựặc tắnh miễn dịch học của thành phần và cấu trúc polysaccharide vỏ (Perry et al., 1990)

Lớp vỏ polysaccharide của A pleuropneumoniae có ựộ dày từ 80- 230 nm

tùy thuộc vào các serotype khác nhau đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về

ựộ dày vỏ dẫn ựến sự khác nhau về ựộc lực Các serotype có lớp vỏ dày có ựộc lực mạnh hơn so với các serotype có lớp vỏ mỏng (Jensen and Bertram, 1986; Jacobsen

et al., 1996) điều này cho thấy lớp vỏ vi khuẩn có thể là một trong những yếu tố

ảnh hưởng ựến ựộc lực của các serotype khác nhau

- Lipopolysaccharide (LPS):

Lipopolysaccharide là thành phần chắnh của lớp màng ngoài vi khuẩn, và ựược cho là nguyên nhân gây tổn thương mô bào LPS có cấu trúc phức tạp gồm 3 vùng xác ựịnh: lipid A, Oligosaccharide lõi chứa 3-deoxy-D-manno-Oct-2-ulosonic

axit (Kdo), và chuỗi O-polysaccharide bao gồm các ñơn vị lặp ñi lặp lại (Jacques, 2004)

Udeze et al (1987) ñã xác ñịnh các trường hợp khi bị nhiễm bệnh ñiển hình

do A pleuropneumoniae thấy LPS có khả năng gây tổn thương mô phổi với những

mức ñộ khác nhau từ xuất huyết ñến hoại tử LPS và ngoại ñộc tố có khả năng tương

tác làm tăng ñộc lực của A pleuropneumoniae (Inzana, 1991) Ngoài ra, LPS ñược

xác ñịnh có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô và

lớp màng nhầy khí quản của lợn (Perry et al., 1990) Bám dính là hoạt ñộng ban ñầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn, rồi từ ñó gây ra bệnh Belanger et al (1990)

cho thấy 83% các serotype với LPS mịn (smooth LPS) bám dính phần lớn vào vành khí quản, trong khi 80% các serotype với LPS bán mịn (semi-smooth LPS) bám dính yếu ðiều này cho thấy, LPS có thể là một nhân tố quan trọng ñối với sự tồn tại

của A pleuropneumoniae ở ñường hô hấp trên của lợn

- ðộc tố của vi khuẩn A pleuropneumoniae:

Nhiều nghiên cứu ñã cho thấy mức ñộ ñộc lực khác nhau của các serotype A pleuropneumoniae phần lớn có liên quan ñến ngoại ñộc tố (Apx) sản sinh từ vi

khuẩn và ñược cho là ñóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn (Frey, 1995)

Người ta ñã chứng minh ñộc lực của A pleuropneumoniae có liên quan ñến

bốn loại protein ñộc tố, ñược xếp vào nhóm RTX-toxin và ñược ñặt tên là ñộc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII (Frey and Bosse, 1993) và ApxIV (Cho and Chae, 2001) Người ta tin chắc chắn về vai trò của Apx trong quá trình gây bệnh của

A pleuropneumoniae Mỗi ñộc tố này khác nhau do hoạt ñộng phân giải hồng cầu

gây ñộc tế bào Tính ñộc của mỗi loại ñộc tố có thể thay ñổi và phụ thuộc vào các

serotype khác nhau của A pleuropneumoniae (Frey, 1995)

+ ApxI là một protein có khả năng gây dung huyết mạnh, gây ñộc mạnh cho

tế bào, có trọng lượng phân tử 105- 110 kDa, ñược tiết ra bởi các chủng thuộc

serotype 1, 5, 9, 10 và 11 thuộc biotype 1 (Frey and Nicolet, 1990; Kamp et al.,

1994) và serotype 14 của biotype 2 (Rayamajhi et al., 2005) Operon mã hoá cho ApxI ñược xác ñịnh là gen ApxI gồm 4 gen là apxIC, apxIA, apxIB và apxID (Jansen

et al., 1993), trong ñó C là gen hoạt hoá, A là gen quy ñịnh cấu trúc ñộc tố, B và D

là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan ñến sự tiết ñộc tố qua

cả hai màng Các chủng sản sinh ra ApxI thường có ñộc lực cao, ñiều này cho thấy

ñộc tố có liên quan ñến ñộc lực của A pleuropneumoniae (Frey and Nicolet, 1990; Kamp et al., 1991)

+ ApxII là ñộc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức ñộ trung bình và

có trọng lượng phân tử khoảng 103- 105 kDa (Frey and Nicolet, 1988) Tất cả các

serotype của A pleuropneumoniae ñều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp et al., 1991, 1994; Rayamajhi et al., 2005) Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tương ứng Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này ñược tìm thấy ở tất cả các serotype của A pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3 (Frey, 1995)

+ ApxIII là ñộc tố không làm tan huyết nhưng có khả năng gây dung giải tế

bào mạnh, có trọng lượng phân tử 120 kDa (Kamp et al., 1991) ðộc tố ApxIII ñược tiết ra bởi các serotype 2, 3, 4, 6, 8 và 15 của A pleuropneumoniae (Rayamajhi et al., 2005) Vùng gen ñiều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen ñiều hòa (operon) cho apxI (Chang et al., 1993)

+ ApxIV là ñộc tố RTX thứ 4 của A pleuropneumoniae ñã ñược phát hiện và

ñề xuất ñặt tên là ApxIVA (Schaller et al., 1999) Gen ApxIVA không phát hiện thấy ở A pleuropneumoniae ñược nuôi cấy trong ñiều kiện phòng thí nghiệm, tuy nhiên khi gây nhiễm cho lợn bằng A pleuropneumoniae serotype 1, 5, 7 các nhà

nghiên cứu lại phát hiện thấy có sự hiện diện của kháng thể kháng ñộc tố ApxIVA sau 14 ngày tiêm Qua ñó cho thấy ApxIVA ñược tạo ra trong cơ thể vật chủ- môi

trường in vivo (khi gây bệnh) Gen ApxIVA ñược phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A pleuropneumoniae và ñiều ñó chứng tỏ nó có tính chất ñặc trưng của

loài (Cho and Chae, 2001) Vai trò của ñộc tố ApxIV với vật chủ như thế nào trong

quá trình gây bệnh cần ñược nghiên cứu kỹ, song ñã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và ñược tạo ra từ gen ñộc

tố của A pleuropneumoniae (Schaller et al., 1999; Liu J et al., 2009)

Không có serotype nào của A pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả

ba loại ñộc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 ñộc tố: Các serotype 1, 5, 9, 11

và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; Serotype 2, 3, 4, 6, 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII; Một số lượng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một ñộc tố Apx như: serotype

10 chỉ sản sinh ra ApxI và serotype 7, 12 chỉ sản sinh ra ApxII (Frey and Nicolet, 1990)

ðộc lực của các serotype A pleuropneumoniae thay ñổi từ mức ñộ mạnh ñến

yếu Sự thay ñổi này tùy thuộc vào loại ñộc tố mà mỗi serotype tiết ra Những serotype sản sinh ra một hoặc hai ñộc tố có ñộc lực mạnh hơn những serotype không

sản sinh ra ñộc tố (Frey and Nicolet, 1990; Kamp et al., 1991)

- Ngoài các yếu tố ñộc lực chính, A pleuropneumoniae còn có một số thành

phần khác ñược xác ñịnh có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học như: Protein màng ngoài (OMPs), fimbriae, ngưng kết tố, HlyX protein, men tiêu ñạm – protease, enzyme superoxide dismutase, Urease

1.1.2 Bệnh viêm phổi - màng phổi do vi khuẩn A pleuropneumoniae gây ra ở lợn

Vi khuẩn A pleuropneumoniae là một tác nhân gây bệnh viêm phổi - màng

phổi ở lợn ðây là một bệnh truyền nhiễm quan trọng ở ñường hô hấp của lợn và xảy

ra ở hầu hết các nước có nền công nghiệp chăn nuôi lợn phát triển Bệnh có mặt và lan truyền ở hầu hết các nước châu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nam

Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và Úc

Mặc dù A pleuropneumoniae có nhiều serotype khác nhau nhưng sự phân bố

các serotype có tính chất ñịa lý nhất ñịnh, ở mỗi quốc gia chỉ có một vài serotype nhất ñịnh lưu hành và gây bệnh trên ñàn lợn, như serotype 2 có ở Thụy ðiển, ðức

và Thụy Sĩ, còn serotype 1, 5 ở Mỹ và Canada Nhưng cũng có một số trường hợp phát hiện thấy nhiều serotype cùng lưu hành trên ñàn lợn ở cùng một nước

Maldonado et al (2009) cho biết: trong 127 chủng A pleuropneumoniae biotype 2

phân lập ựược ở Tây Ban Nha có 4,7% thuộc serotype 2; 4,7% thuộc serotype 4; 68,5% thuộc serotype 7; 1,6% thuộc serotype 11 và 26 chủng không xếp loại ựược

Về ựộc lực, có một số serotype có tắnh ựộc yếu và về dịch tễ chúng không quan trọng ở một số nước nhất ựịnh, nhưng lại có thể gây nên dịch ở một số nước khác (Brandreth and Smith, 1985)

Theo Bongtae et al (2001), từ năm 1995 ựến 1998, tại Hàn Quốc ựã phân lập ựược 76 chủng A pleuropneumoniae từ lợn mắc bệnh viêm phổi - màng phổi

Trong số ựó, tỷ lệ các chủng thuộc serotype 2 chiếm 60,53%, serotype 5 chiếm 26,32% và serotype 6 chiếm 13,16% Theo Min and Chae (1999), các serotype thường gặp tại Hàn Quốc là 2, 5, 6 và 7 Trong khi ựó, ở đài Loan thường xuất hiện

các serotype 1, 2, 5 (Chang et al., 2002)

Tại Việt Nam trong những năm gần ựây, A pleuropneumoniae ựã ựược phân

lập và xác ựịnh là một tác nhân gây bệnh nhiễm trùng hô hấp khá quan trọng cho lợn nuôi ở tất cả các trại lợn quy mô lớn Tuy tỷ lệ phát hiện ựược chưa cao, song sự có mặt của chúng ựã chứng tỏ vai trò quan trọng trong bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn nuôi tại Việt Nam

Cù Hữu Phú và cs (2005) khi nghiên cứu xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh ựường hô hấp ở lợn cho thấy có nhiều vi khuẩn gây bệnh cư trú tại ựường hô hấp

của lợn, trong ựó A pleuropneumoniae cư trú chủ yếu ở niêm mạc ựường hô hấp

trên Kiểm tra các mẫu bệnh phẩm của lợn khỏe và lợn bệnh cho thấy trong số 542

mẫu dịch ngoáy mũi của lợn dưới 3 tháng tuổi, số mẫu phân lập ựược A pleuropneumoniae là 43 (7,93%) và chỉ có 1/53 (0,19%) mẫu phổi, hạch phổi của lợn dương tắnh với A pleuropneumoniae Kết quả xác ựịnh serotype của 44 chủng vi

khuẩn phân lập ựược cho thấy chúng thuộc serotype 1, 2, 5 (trong ựó, có 19 chủng thuộc serotype 2 chiếm 43,18% và 22 chủng thuộc serotype 5 chiếm 50%)

Trịnh Quang Hiệp và cs (2004) ñã phân lập ñược A pleuropneumoniae ở

17/250 mẫu bệnh phẩm là dịch ngoáy mũi lợn nuôi tại 3 trại lợn của Thái Bình và Hải Phòng

Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) ñã phân lập ñược A pleuropneumoniae ở 63

trong tổng số 685 mẫu bệnh phẩm của lợn có biểu hiện bệnh ñường hô hấp nuôi tại 6 tỉnh phía Bắc là Hà Nội, Hà Tây, Bắc Giang, Thái Bình, Hải Phòng, Thái Nguyên

Trong ñó, kết quả phân lập A pleuropneumoniae từ các mẫu bệnh phẩm của lợn có

triệu chứng và bệnh tích viêm phổi - màng phổi ñiển hình là 53,16% (42/79 mẫu

dương tính) Kết quả xác ñịnh serotype cho thấy, trong số 63 chủng A pleuropneumoniae phân lập ñược có 54 chủng thuộc serotype 2 (chiếm tỷ lệ

85,71%) và 9 chủng thuộc serotype 5 (chiếm tỷ lệ 14,29%)

Cù Hữu Phú và cs (2011) ñã xác ñịnh ñược mối liên quan giữa hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn gây ra

với vai trò gây bệnh viêm phổi của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida, S suis ở lợn nuôi tại Việt nam Với 453 mẫu bệnh phẩm ñã xác ñịnh có 94 mẫu dương tính với virus PRRS và 173 mẫu phân lập ñược 3 loại vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis 22 chủng A pleuropneumoniae phân lập

ñược ñều thuộc các serovar 2 và 5 Trong ñó, ña số các chủng thuộc về serovar 2, với 17 chủng (chiếm tỷ lệ 72,27%) và 5 chủng thuộc serovar 5 (chiếm tỷ lệ 27,73%)

* Triệu chứng và bệnh tích của bệnh viêm phổi - màng phổi do A pleuropneumoniae gây ra ở lợn:

Nhìn chung tất cả các lứa tuổi lợn ñều bị cảm nhiễm, nhưng bệnh thường xảy

ra ở lợn 2- 6 tháng tuổi Trong trường hợp cấp tính của bệnh thì tỷ lệ chết thường cao Tỷ lệ chết cũng phụ thuộc vào ñộc lực của vi khuẩn và sự lưu hành bệnh trong môi trường Bệnh nặng hơn và tỷ lệ tử vong cao hơn nếu nhiễm kế phát các bệnh khác như bệnh Aujeszky’s và hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)

Triệu chứng lâm sàng có nhiều mức, phụ thuộc vào tuổi của lợn, tình trạng miễn dịch, ñiều kiện môi trường và mức ñộ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh Biểu

hiện lâm sàng của bệnh có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính

- Thể quá cấp tính: Một hoặc nhiều lợn cai sữa cùng một chuồng hoặc khác chuồng trở nên ốm nặng, sốt tới 41,5◦C, ñờ ñẫn, bỏ ăn, nôn mửa và ỉa chảy, con vật

bị bệnh nằm trên nền chuồng, không có dấu hiệu thở rõ ràng, mạch ñập tăng lên rất sớm và trụy tim mạch Da trên mũi, tai, chân và sau cùng là toàn bộ cơ thể trở nên tím tái ở giai ñoạn cuối và chết

Thời gian ngắn trước khi chết thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, gia súc ở tư thế ngồi ñể thở, nhiệt ñộ ở hậu môn giảm nhanh Ngay trước khi chết thường có chảy nhiều dịch bọt nhuốm máu ở mồm và lỗ mũi Lợn chết trong vòng 24- 36 giờ sau khi xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng Một số trường hợp con vật chết ñột ngột không có biểu hiện lâm sàng Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian diễn biến của bệnh ít nhất là 3 giờ từ khi bị nhiễm trùng cho ñến chết Ở lợn sơ sinh bệnh xảy ra như nhiễm trùng huyết dẫn tới hậu quả tử vong

- Thể cấp tính: Lợn sốt cao từ 40,5- 41◦C, da ñỏ, con vật mệt mỏi, không muốn dậy, không ăn uống Các dấu hiệu hô hấp nặng với khó thở, ho, và ñôi khi thở bằng mồm trở nên rõ Thường xuất hiện trụy tim mạch, với xung huyết ở các ñầu tứ chi Toàn thân suy sụp trong vòng 24 giờ ñầu Bệnh diễn biến khác nhau ở từng con vật, phụ thuộc mức ñộ tổn thương phổi và thời ñiểm bắt ñầu ñiều trị

- Thể mãn tính: Xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính mất ñi Không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự phát, với các cường ñộ khác nhau Có thể con vật kém

ăn, giảm tăng trọng, lười vận ñộng Ở các ñàn gia súc bị nhiễm mãn tính thường có nhiều súc vật bị nhiễm không biểu hiện rõ trên lâm sàng

Các dấu hiệu lâm sàng có thể trở nên rõ hơn bởi sự kết hợp với các yếu tố gây

nhiễm trùng ñường hô hấp khác (Mycoplasma, Pasteurella, virus,…) Các biến

chứng như viêm khớp, viêm nội tâm mạc và áp xe ở các vị trí khác nhau có thể xảy

ra cùng với nhiễm trùng A pleuropneumoniae

Tổn thương bệnh lý ñại thể chủ yếu ở ñường hô hấp ða số các trường hợp bị viêm phổi với tổn thương ở các thùy ñỉnh và thùy tim, cũng như một phần các mỏm trên của thuỳ hoành Ở các trường hợp lợn chết nhanh, khí quản và các phế quản chứa ñầy các chất tiết nhầy bọt có lẫn máu

Có thể thấy một số tổn thương ñại thể ở các trường hợp quá cấp tính, các vùng viêm phổi trở nên sẫm màu và chắc kèm theo viêm màng phổi có ít hoặc không có tơ huyết Viêm màng phổi tơ huyết thường rất rõ ở các gia súc chết trong giai ñoạn cấp tính của bệnh ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm trùng và khoang màng phổi chứa dịch lẫn máu Khi tổn thương tiến triển nặng hơn, viêm màng phổi tơ huyết trên vùng phổi tổn thương trở nên xơ và có thể dính rất chặt màng phổi vào thành ngực

Ở thể mãn tính, bệnh tích quan sát thấy là các ổ áp xe và kích thước khác nhau nằm chủ yếu ở trên thùy hoành và giới hạn với tổ chức xung quanh bởi một vỏ

mô liên kết mỏng, một số vùng của màng phổi có thể bị viêm dính vào thành ngực

1.2 ðặc tính của vi khuẩn P multocida và bệnh viêm phổi do vi khuẩn gây ra ở

lợn

1.2.1 ðặc tính sinh học của vi khuẩn P multocida

* ðặc tính hình thái và tính chất nuôi cấy:

Theo phân loại của Carter (1984) thì P multocida nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Pasteurellaceae, thuộc giống Pasteurella và thuộc loài P multocida P multocida là loại cầu trực khuẩn nhỏ, hình trứng hoặc bầu dục, kích

thước 0,25- 0,4 x 0,4- 1,5µm Vi khuẩn bắt màu gram âm, không có lông, không di

ñộng, không hình thành nha bào Trong cơ thể gia súc mắc bệnh, P multocida khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai ñầu Vì thế người ta gọi Pasteurella là

vi khuẩn lưỡng cực Nguyên nhân là do nguyên sinh chất dung dải dồn về hai ñầu Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, ñứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay ñổi hình thái

P multocida là loại vi khuẩn hiếu khắ hoặc yếm khắ tùy tiện, nhiệt ựộ thắch

hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 130C- 380C, tốt nhất là 370C, pH thắch hợp từ 7,2- 7,4 Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, khi môi trường ựược bổ sung thêm máu hay huyết thanh thì vi khuẩn phát triển tốt

Khuẩn lạc của vi khuẩn P multocida không gây dung huyết trên môi trường

thạch máu, vi khuẩn không mọc trên môi trường MacConkey Vi khuẩn có khả năng lên men ựường Glucose, Saccharose, Succrose, Mannitol, Xylose, không lên men Lactose, Maltose, Arabinose, Salixin Phản ứng Indol, Catalase, Oxydase dương tắnh Phản ứng Urease âm tắnh và không làm tan chảy gelatin

* Giáp mô và yếu tố ựộc lực của vi khuẩn P multocida:

Phần lớn các chủng P multocida ựều có giáp mô đó là một lớp vỏ nhày hay

dịch nhày bao bọc ngoài thành tế bào Giáp mô vừa có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác ựộng có hại của môi trường, vừa là nơi dự trữ các chất dinh dưỡng của vi khuẩn Giáp mô là yếu tố ựộc lực của vi khuẩn

Theo Carter (1952), ựa số các trường hợp vi khuẩn P multocida phân lập từ

ựộng vật mắc bệnh cấp tắnh sẽ thấy có giáp mô và có ựộc lực Khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vi khuẩn sẽ mất và vi khuẩn không còn ựộc lực Nhưng nếu cấy những vi khuẩn ựã mất giáp mô trên môi trường

có thêm máu hoặc tiêm truyền qua ựộng vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và

thể hiện ựộc lực Ông cũng ựã chia P multocida thành 5 serotype kháng nguyên

giáp mô khác nhau là serotype A, B, D, E và F

Bain (1982) cho rằng thành phần của giáp mô có chứa axit hyaluronic và gắn một lớp polysaccharide Lớp polysaccharide giáp mô là yếu tố quyết ựịnh bề mặt

quan trọng không chỉ ựối với P multocida mà còn ựối với một số vi khuẩn gây bệnh

khác

Theo Manninger (1991), ựộc lực của P multocida rất phức tạp và không ổn

ựịnh, nó tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh Những chủng vi

khuẩn P multocida có giáp mô thì có ựộc lực, không có giáp mô thì không có ựộc

lực Khả năng xâm nhập vào ký chủ và sự phát triển trong ký chủ của vi khuẩn là nhờ sự có mặt của giáp mô Vi khuẩn khi mất khả năng tái tạo giáp mô sẽ không còn

ñộc lực Tác giả còn thấy rằng nhiều chủng vi khuẩn P multocida phân lập ñược có

giáp mô rõ nhưng ñộc lực lại thấp vì ñộc lực của vi khuẩn có thể phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng

Một ñặc tính quan trọng khác của P multocida gây nên quá trình bệnh lý là

khả năng sản sinh nội ñộc tố, với thành phần chính của nội ñộc tố là lipopolysaccharide Chế phẩm tinh khiết của nội ñộc tố có tính chịu nhiệt, nhưng sẽ

bị giảm ñộc dưới tác dụng của Phenol ở 22◦C, hoặc khi xử lý bằng dung dịch Trichloracetic 4% trong 1 giờ ở 37◦C Lipopolysaccharide có thể gây viêm, sốt và sinh ra ñáp ứng miễn dịch chống vi trùng ở các mức ñộ khác nhau

* Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida:

Kháng nguyên của P multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay ñổi Cho ñến nay ñã xác ñịnh ñược vi khuẩn P multocida có

2 loại kháng nguyên chính là kháng nguyên giáp mô (K) và kháng nguyên thân (O) Kháng nguyên K bao xung quanh thân vi khuẩn che chở kháng nguyên thân O khỏi bị các phage tác dụng nhưng ñồng thời cũng ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O

Kháng nguyên giáp mô (K) có hai thành phần α và β Chúng ñược cấu tạo từ protein và polysaccharide, ngoài ra còn một số ít các lipopolysaccharide Kháng nguyên

K của vi khuẩn P multocida còn có khả năng gắn với thụ thể của tế bào hồng cầu Một

số chủng P multocida serotype D có khả năng sản sinh một yếu tố ñược gọi là ñộc tố gây hoại tử da (Dermonecrotic Toxin) ðộc tố này của P multocida serotype D có liên quan ñến bệnh viêm teo mũi ở lợn Vi khuẩn P multocida ñược chia thành các type giáp mô A,

B, D, E, F tuỳ thuộc vào cấu trúc polysaccharide bề mặt (Carter, 1952) Trong ñó, các

serotype A, B và D thường gây bệnh cho lợn (ðỗ Ngọc Thuý, 2007)

Kháng nguyên thân (O) là các kháng nguyên thành tế bào vi khuẩn, chỉ ñược bộc lộ khi kháng nguyên giáp mô (K) ñã tách ra Kháng nguyên O là một phức hợp

protein - lipid - polysaccharide, ñược chia thành 16 loại ký hiệu từ 1 - 16 (Heddleston, 1972)

1.2.2 Bệnh viêm phổi do P multocida gây ra ở lợn

Vi khuẩn P multocida có thể là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát gây

ra thể bệnh viêm phổi ở lợn, bệnh có thể gây chết lợn hoặc làm giảm khả năng tăng trọng của lợn do vậy gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi

Theo De Alwis (1992), bệnh viêm phổi do P multocida gây ra xuất hiện rộng

khắp thế giới, nhưng bệnh hay xảy ra và gây thiệt hại ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới như: Ấn ðộ, Pakistan, Iran, Thái Lan, Philippin, Indonexia, Triều tiên, Lào và

Việt Nam, ở tất cả các ñiều kiện khí hậu và ñiều kiện chăn nuôi Vì vi khuẩn P multocida thường cư trú ở ñường hô hấp trên của lợn khoẻ mạnh do vậy rất khó tiêu diệt Vi khuẩn P multocida gây bệnh thường kết hợp với các tác nhân khác như Mycoplasma hyopneumoniae, A pleuropneumoniae, làm cho quá trình viêm phổi

càng nặng thêm

Bệnh viêm phổi do vi khuẩn P multocida gây ra ở lợn ñã ñược nhiều nhà

khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu Tại Nhật Bản, trong số 116 mẫu P

multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh tích nhục hóa, áp xe phổi và viêm màng phổi

có 81,9% thuộc serotype A; 18,1% thuộc serotype D (Iwanmatsu and Sawada,

1988) Kang-Hee O et al (1990) khi phân lập vi khuẩn từ 155 mẫu phổi của lợn thịt

ñã cho biết các chủng vi khuẩn P multocida ñược xác ñịnh serotype A chiếm phần

lớn 60,4%, serotype D chiếm 18,6%, còn lại 21,0% chưa xác ñịnh ñược serotype Tại Triều Tiên, Ahn and Kim (1994) cho biết khi nghiên cứu 450 mẫu phổi lợn bệnh

ñã phân lập ñược 80 chủng P multocida trong ñó có 96,3% chủng thuộc serotype A

và 3,7% chủng thuộc serotype D

Ở nước ta P multocida cũng ñược thông báo là tác nhân gây bệnh quan trọng

ở lợn và ñược quan tâm nghiên cứu Nguyễn Ngọc Nhiên (1996) khi nghiên cứu 72

phổi lợn có bệnh tích bị nhục hóa, áp xe và viêm màng phổi cho biết tỷ lệ nhiễm P multocida là 37,5% Khi tiến hành xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh ñường hô hấp

của lợn nuôi tại một số tỉnh phía bắc, Cù Hữu Phú và cs (2005) cho biết ñã phân lập

ñược 48 chủng P multocida từ 542 mẫu dịch ngoáy mũi của lợn (chiếm tỷ lệ

8,86%) ðỗ Ngọc Thúy và cs (2007) khi ứng dụng kỹ thuật PCR ñể ñịnh type giáp

mô của các chủng P multocida phân lập ñược từ vật nuôi cho biết: hầu hết các

chủng phân lập ñược từ dịch ngoáy mũi của lợn khỏe, phổi hoặc dịch hầu họng của lợn tại lò mổ ñều thuộc type A, trừ một chủng phân lập từ phổi lợn bị bệnh viêm

phổi thuộc type D Nghiên cứu của Townsend et al (2000) ñã kết luận rằng 17 chủng P multocida phân lập ñược từ hầu họng của lợn khỏe tại lò mổ ở các tỉnh Cần

Thơ và Kiên Giang, Việt Nam ñều thuộc về type A3, D1 hoặc D3

Cù Hữu Phú và cs (2011), ñ
tiến hành xác ñịnh serotype của vi khuẩn P multocida phân lập ñược, kết quả cho thấy: trong số 35 chủng P multocida phân lập

ñược có 24 chủng thuộc serotype A (chiếm tỷ lệ 68,57%) và 11 chủng thuộc serotype D (chiếm tỷ lệ 31,43%)

* Triệu chứng và bệnh tích của bệnh viêm phổi do vi khuẩn P multocida gây ra ở lợn:

Triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm phổi do P multocida gây ra rất khác

nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn gây bệnh, thường xuất hiện 3 thể:

- Thể cấp tính: Thể này thông thường do hầu hết các chủng P multocida

thuộc serotype B gây ra Những con vật mắc bệnh thường có biểu hiện khó thở, hóp bụng vào ñể thở, gõ vào bụng có âm ñục “bịch, bịch”, sốt cao nhiệt ñộ lên tới 41-

420C, tỷ lệ chết cao (5- 40%) Ở những con vật chết và hấp hối có thể thấy những vết ñổi màu tím ở vùng bụng có thể là do sốc nội ñộc tố

- Thể á cấp tính: Ở thể này hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy ở những lợn lớn Ho ở những lợn ở lứa tuổi này thường ñược coi là tiêu chuẩn xác ñịnh mức ñộ nghiêm trọng của bệnh Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở thể này

giống như viêm màng phổi do A pleuropneumoniae gây ra, nhưng những ñặc ñiểm phân biệt chính là bệnh viêm phổi do P multocida thì hiếm khi gây ra chết ñột ngột,

hơn nữa lợn mắc bệnh viêm phổi do P multocida gây ra có thể tồn tại một thời gian

dài

- Thể mãn tính: ðây là thể ñặc trưng thường thấy của bệnh, con vật bệnh thỉnh thoảng xuất hiện ho, sốt nhẹ hoặc không Những con vật bị ảnh hưởng thường

ở giai ñoạn lợn lớn (10- 16 tuần tuổi)

Bệnh tích của bệnh do P multocida gây ra chủ yếu ở phần xoang ngực và thường kèm với bệnh tích của Mycoplasma hyopneumoniae ðặc trưng của bệnh này

xuất hiện ở thùy ñỉnh và mặt trong của phổi, cùng với việc có bọt khí trong khí quản

Có sự phân ranh giới rõ rệt giữa vùng tổ chức phổi bị tổn thương và vùng tổ chức phổi bình thường Phần bị ảnh hưởng của phổi sẽ có sự biến ñổi màu sắc từ ñỏ sang xám xanh phụ thuộc vào giai ñoạn của bệnh

Các trường hợp bệnh nghiêm trọng có thể xuất hiện viêm phế mạc và apxe ở các mức ñộ khác nhau Trong các trường hợp này thường thấy phế mạc dính chặt vào thành xoang ngực và phế mạc có vùng mờ ñục, khô ðây là bệnh tích chủ yếu

ñể phân biệt bệnh viêm phổi do Pasteurella với viêm phổi do Actinobacillus, trong

ñó thường thấy mủ chảy ra có màu vàng và dính cùng với rất nhiều sợi fibrin (Pijoan and Fuentes, 1989)

1.3 ðặc tính của vi khuẩn S suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn

1.3.1 ðặc tính sinh học của vi khuẩn S suis

* ðặc tính hình thái và tính chất nuôi cấy:

Theo Quinn et al (1994), S suis thuộc giống Streptococcus, họ Streptococcaceae,

bộ Lactobacillales, lớp Bacilli Vi khuẩn S suis có hình cầu hoặc hình trứng, ñường

kính có khi ñến 1 µm, chúng thường ñứng riêng lẻ, xếp thành ñôi hoặc thành từng chuỗi ngắn như chuỗi hạt, có ñộ dài ngắn không ñều nhau Chiều dài của chuỗi tuỳ thuộc vào ñiều kiện môi trường Vi khuẩn bắt màu Gram dương, yếm khí tùy tiện và không di ñộng Vi khuẩn không sinh nha bào, nhưng có khả năng hình thành giáp

mô Sự hình thành giáp mô có thể xác ñịnh ñược khi chúng sinh sống trong các mô hoặc phát triển trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh

Trên môi trường thạch máu, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhỏ, hơi vồng và sáng trắng, có thể dung huyết hoàn toàn hoặc không hoàn toàn

Vi khuẩn mọc tốt trên môi trường MacConkey, sau 24 giờ nuôi cấy hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng ñầu ñinh ghim

Vi khuẩn có khả năng lên men ñường Glucose, Lactose, Succrose, Inulin, Trehalose, Maltose, Fructose, không lên men các loại ñường Ribose, Arabinose, Sorbitol, Mannitol, Dextrose và Xylose Phản ứng Catalase và Oxidase âm tính

* Các loại kháng nguyên của S suis:

- Kháng nguyên thân (Somatic antigen): Kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng trong việc quyết ñịnh các yếu tố dịch tễ và ñộc lực của vi khuẩn Kháng nguyên thân nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) và ñược cấu tạo bởi các phân tử peptidoglycan ở lớp trong cùng, tiếp ñến là lớp giữa gồm các polysaccharide, lớp ngoài cùng là các protein gồm M protein, lipoteichoic acid, R và T protein

- Kháng nguyên giáp mô (Capsule antigen): Kháng nguyên giáp mô có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn, kháng lại khả năng thực bào của cơ thể vật chủ Nhiều nghiên cứu cũng ñã chỉ ra rằng các chủng có giáp mô thì có ñộc lực và

có khả năng gây bệnh, còn các chủng không có giáp mô thì không có khả năng này (Higgins and Gottschalk, 2002) Thành phần của kháng nguyên giáp mô khác nhau tùy thuộc vào loại vi khuẩn, ví dụ như các chủng thuộc nhóm A thì giáp mô ñược tạo thành bởi các axít hyaluronic, còn các chủng thuộc nhóm O thì thành phần của giáp mô là polysaccharide

- Kháng nguyên bám dính (Fimbriae antigen): Vai trò của kháng nguyên bám

dính của S suis còn chưa ñược biết ñến một cách rõ ràng, nhưng có ý kiến cho rằng

chúng ñóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu

mô Vi khuẩn S suis là một trong số ít các loại vi khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của S suis có cấu trúc mỏng, ngắn, ñường kính khoảng 2 ηm và dài có khi tới 200 ηm (Jacques et al., 1990)

* Phân loại vi khuẩn S suis theo serotype:

Trước ñây, S suis ñược phân loại huyết thanh học thành các nhóm theo ký

hiệu S, R, RS và T (de Moor, 1963) Sau ñó, các nhóm S, R và RS này lần lượt ñược

thay thế bằng các serotype ký hiệu lần lượt là 1, 2 và 1/2 (Windsor et al., 1975), còn nhóm T ñược thay thế bằng serotype 15 (Gottschalk et al., 1989)

Trong thời gian từ 1983 ñến 1995, có 32 serotype mới của S suis ñược phát

hiện và phân loại dựa trên cấu trúc kháng nguyên polysaccharide của giáp mô, nâng tổng số serotype của vi khuẩn này lên thành 35 loại (Ký hiệu từ 1 ñến 34, và 1/2)

(Perch et al., 1983; Higgins et al., 1995) Trong ñó, ñáng chú ý nhất là các chủng

thuộc serotype 2 phân lập ñược thường xuyên nhất ở lợn và cũng là nguyên nhân gây ra các thể bệnh nguy hiểm khác nhau ở lợn và người (Higgins and Gottschalk,

2002) Tuy nhiên sau ñó, S suis serotype 32 và 34 ñã ñược phân loại lại thành Streptococcus orisratti (Hill et al., 2005)

Các chủng thuộc các serotype khác nhau có ñặc tính gây bệnh khác nhau và gây ra các thể bệnh khác nhau Thậm chí các chủng vi khuẩn thuộc cùng 1 serotype cũng có thể gây ra các thể bệnh khác nhau do vùng ñịa lý mà chúng phân bố Một số serotype không có ñộc lực và có thể ñược phân lập từ lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng lâm sàng như các serotype 17, 18, 19 và 21 (Higgins and Gottschalk, 2002) Trong khi ñó, có một số chủng có thể phân lập ñược từ lợn và cả các loài ñộng vật

khác nữa như serotype 20 và 31 từ bê, serotype 33 từ cừu non (Gottschalk et al.,

1989, Higgins et al., 1995)

* Các yếu tố ñộc lực của vi khuẩn S suis:

Những hiểu biết về các yếu tố ñộc lực của vi khuẩn S suis còn rất hạn chế

Phần lớn những nghiên cứu ñược tiến hành với các chủng thuộc serotype 2 Các nhà khoa học ñều có chung quan ñiểm: có sự tồn tại của chủng ñộc và không ñộc của vi

khuẩn S suis serotype 2 (Lun et al., 2007) Thành phần polysaccharide của giáp mô

(capsular polysaccharide) ñược chứng minh là yếu tố ñộc lực quan trọng của vi khuẩn này vì các chủng ñột biến không có giáp mô ñều thể hiện là không có ñộc tính

và nhanh chóng bị loại bỏ khỏi hệ thống tuần hoàn của lợn và chuột trong các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm Tuy vậy không phải tất cả các chủng có giáp mô

ñều là chủng ñộc (Lun et al., 2007)

Ngoài polysaccharide của giáp mô, các yếu tố ñộc lực khác cũng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn là:

+ Yếu tố gây dung huyết, hay còn gọi là “suilysin” có trọng lượng phân tử 65 kDa và có ñộ phóng xạ riêng là 0,7x106 Units/ mg Suilysin (SLY) thuộc về nhóm ñộc tố với những ñặc ñiểm chung là: dễ bị oxy hoá, dễ bị hoạt hóa bởi một số hóa chất khử, dễ bị ức chế bởi cholesterol với nồng ñộ loãng, ức chế tính hoạt ñộng của

một số lượng ít Trong ñiều kiện in vivo, chuột và lợn ñã ñược chứng minh là có khả năng tạo ra miễn dịch khi ñược tiêm vacxin chứa suilysin ñể kháng lại S suis serotype 2 gây bệnh Suilysin là yếu tố ñộc lực quan trọng của S suis vì sự trung hoà của yếu tố này ñủ ñể bảo vệ chuột thí nghiệm chống lại các tác ñộng có hại của S suis serotype 2 (Gottschalk et al., 1998)

+ Hai loại protein: protein giải phóng muramidase (Muramidase-released protein - MRP) có trọng lượng phân tử 136 kDa và protein giải phóng yếu tố ngoại bào (Extracellular factor - EF) có trọng lượng phân tử 110 kDa ñã ñược xác ñịnh là

các yếu tố ñộc lực quan trọng trong sinh bệnh học của S suis serotype 2 gây bệnh ở lợn và người (Vecht et al., 1991) Các nghiên cứu về gây bệnh thực nghiệm trên lợn

cũng ñã cho thấy các chủng vi khuẩn có mang 2 yếu tố gây bệnh này ñã ñược phân lập từ các phủ tạng của lợn sau khi gây nhiễm với các triệu chứng ñiển hình của bệnh, trong khi ñó các chủng không mang các yếu tố gây bệnh này có thể phân lập ñược thường xuyên trong amidan của lợn khỏe và không có khả năng gây bệnh cho

lợn thí nghiệm (Smith et al., 1992; Vecht et al., 1991, 1992)

+ Các nhà nghiên cứu tại GREMIP (Trung tâm nghiên cứu thuộc trường ðại học Tổng hợp Montreal, Canada) cũng ñã mô tả một số loại protein bao gồm protein sốc nhiệt có trọng lượng phân tử 60 kDa, protein gắn albumin và protein có khả năng gắn với IgG Những protein này có thể ñược tạo ra bởi cả chủng ñộc và không

ñộc của tất cả serotype của S suis, kể cả serotype 2 Tuy nhiên, nhiều khả năng là các yếu tố ñộc lực này chỉ ñược tạo ra trong ñiều kiện in vivo (Gottschalk et al.,

2007)

+ Ngoài các yếu tố kể trên, yếu tố bám dính (adhesins), men phân hủy

protein, bacteriocin và fimbriae cũng ñược xem là các yếu tố ñộc lực của vi khuẩn S suis (Fittipaldi et al., 2012)

1.3.2 Bệnh do S suis gây ra ở lợn

Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn hay còn gọi là bệnh liên cầu ở lợn xảy

ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi ñến sau cai sữa vài

tuần ðặc biệt S suis serotype 2 có thể gây bệnh cho người ðặc trưng lâm sàng của

bệnh là nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm khớp và viêm phế quản phổi Thể nhiễm trùng huyết và viêm não có dịch thường thấy ở lợn từ 2- 3 tháng tuổi, thể viêm ñường hô hấp thường thấy ở lợn từ 2 tuần tuổi ñến 2 tháng tuổi, thể viêm âm ñạo, tử cung thường ở lợn cái hậu bị và lợn mang thai, thể viêm vú ở lợn ñang nuôi con và thể viêm hạch ở lợn sau cai sữa và vỗ béo

Vi khuẩn S suis serotype 2 ñược thông báo là loại thường gặp nhất gây bệnh

cho lợn và người ở hầu hết các nước trên thế giới (Higgins and Gottschalk, 2002;

Lun et al., 2007) Còn sự phân bố của các serotype khác và các thể bệnh do chúng

gây ra ở lợn ở các nước là có sự khác nhau (Higgins and Gottschalk, 2002) Ở các

nước Scandinavia, serotype 7 chiếm ưu thế trong những năm 80 (Perch et al., 1983),

nhưng sau ñó, số chủng thuộc serotype 2 lại vượt trội (Higgins and Gottschalk, 2002) Tại Nhật, serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất (28%), tiếp ñến là serotype 7 (11%)

(Kataoka et al., 1993) Serotype 9 là loại phổ biến nhất ở Australia (Gogolewski et al., 1990), trong khi ñó ở Anh, serotype 14 chiếm ưu thế (25%), chỉ sau serotype 2

(62%) (Higgins and Gottschalk, 2002)

Ở Anh, bệnh do serotype 2 gây ra chủ yếu là gây bại huyết và viêm não ở lợn

ñã cai sữa (Windsor and Elliott, 1975) Ở Hà lan, S suis serotype 2 là nguyên nhân

chính gây viêm phổi (42%), viêm não (18%), viêm nội tâm mạc (18%) và viêm ña

thanh mạc (10%) (Vecht et al., 1985) Ngoài serotype 2, S suis thuộc các serotype

khác cũng ñã phân lập ñược từ lợn bị viêm phổi - màng phổi ở ðan Mạch, Hà lan,

Bỉ , Phần Lan, Australia, Canada, Mỹ

Trong một ổ dịch do S suis serotype 9 gây ra tại Canada, Vasconcelos et al

(1994) ñã quan sát và thấy rằng 100% lợn chết có biểu hiện viêm khớp, 91% có viêm não, 73% có viêm phổi kẽ, 42% có viêm nội tâm mạc Các tác giả cũng ñã nhận xét rằng sự phân bố của các bệnh tích này ở lợn bệnh là hoàn toàn khác so với bệnh do serotype 2 gây ra Như vậy, nhiều khả năng là một vài serotype nhất ñịnh có các ñặc ñiểm ñộc lực và ñặc tính gây bệnh riêng Chính ñiều này ñã giải thích cho các trường hợp viêm phổi rất nghiêm trọng do serotype 3 gây nên ở Achentina

(Vena et al., 1991) hoặc là hiện tượng lây lan bệnh của serotype 14 ở Anh (Heath et al., 1996) và chính serotype này cũng ñã gây ra 1 ca bệnh ở người (Gottschalk et al.,

1989)

Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu ñã ñược tiến hành nhằm xác ñịnh

vai trò gây bệnh của S suis ở lợn Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993) về vai trò của S suis trong hội chứng ho thở truyền nhiễm của lợn cho

biết tỷ lệ phân lập vi khuẩn này là 74% Khương Bích Ngọc (1996) khi nghiên cứu

về bệnh cầu khuẩn của lợn cho biết tỷ lệ phân lập vi khuẩn S suis là 60% Nguyễn

Ngọc Nhiên (1996) khi nghiên cứu 72 phổi lợn có bệnh tích bị nhục hóa, áp xe và

viêm màng phổi cho biết tỷ lệ nhiễm S suis là 30,5% Nghiên cứu của Cù Hữu Phú

và cs (1998) cho biết tỷ lệ phân lập vi khuẩn S suis ở phổi và hạch phổi là 72%,

dịch ngoáy mũi là 43% Khi tiến hành xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh ñường hô hấp của lợn nuôi tại một số tỉnh phía bắc, Cù Hữu Phú và cs (2005) cho biết: tỷ lệ phân

lập ñược vi khuẩn Streptococcus ở các mẫu phổi và hạch phổi là 15,09%, và từ các

mẫu dịch ngoáy mũi là 6,64%

Gần ñây, ðỗ Ngọc Thúy và Lê Thị Minh Hằng (2009) ñã tiến hành nghiên cứu, thiết lập phản ứng PCR ñể giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây

bệnh của vi khuẩn S suis phù hợp với ñiều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, kỹ

thuật này ñảm bảo các yêu cầu về ñộ nhạy, ñộ ñặc hiệu và tính chính xác cao Khi

tiến hành nghiên cứu một số ñặc tính của các chủng vi khuẩn S suis ñang lưu hành

trên lợn tại miền Bắc Việt Nam, ðỗ Ngọc Thúy và cs (2009) cho biết: từ 211 chủng

S suis phân lập ñược từ lợn ở một số tỉnh miền Bắc khi nghiên cứu ñã xác ñịnh

ñược 7 kiểu tổ hợp gen của các yếu tố ñộc lực và 18 loại serotype Trong ñó, các serotype gây bệnh quan trọng và phổ biến ở lợn là serotype 2, 7 và 9 ñều ñược phát hiện thấy, ñáng lưu ý nhất là các chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất và ñược phân lập từ cả ở lợn ở lò mổ, lợn bị mắc PRRS và lợn có triệu chứng bệnh ñường hô hấp

Cù Hữu Phú và cs (2011), ñ
tiến hành xác ñịnh serotype của 116 chủng vi

khuẩn S suis phân lập ñược bằng phương pháp huyết thanh học và PCR, kết quả là:

không có chủng nào ñược xác ñịnh là thuộc serotype 1, số chủng thuộc serotype 9 chiếm tỷ lệ cao nhất 12,93%; tiếp ñến là serotype 2, chiếm 10,34%; serotype 7, chiếm 2,59% Các serotype 21, 27 và 29 có tỷ lệ tương ñương là 1,72% Serotype 2 ñược xác ñịnh ở cả lợn bị mắc PRRS và lợn có triệu chứng bệnh ñường hô hấp, nhưng trong ñó,

số chủng có nguồn gốc từ lợn mắc bệnh PRRS thuộc serotype 2 là chiếm tỷ lệ cao nhất 58,33%

* Triệu chứng và bệnh tích của bệnh do S suis gây ra ở lợn:

Triệu chứng của các thể bệnh do vi khuẩn S suis gây ra là rất phức tạp, khó

nhận biết và khó phân biệt khi mà bệnh có biểu hiện bội nhiễm, kế phát bởi một số

vi khuẩn khác Các thể bệnh và bệnh tích của bệnh do các serotype khác nhau gây ra

là không giống nhau (Vansconcelos et al., 1994)

Clifton-Hadley (1983) nghiên cứu ở lợn gây bệnh thực nghiệm và quan sát lợn trong các ổ dịch tự nhiên thấy: lợn từ 1-3 tuần tuổi thường mắc thể viêm não và viêm màng não với các triệu chứng như: ủ rũ, kém ăn, sưng hầu, khó nuốt, ñi lại khó khăn, lông khô, dựng ñứng, sốt, da mẩn ñỏ Lợn hoạt ñộng khó khăn, ñi lại loạng choạng, khi nằm có biểu hiện tư thế như bơi chèo, tê liệt Biểu hiện viêm não chính

là căn cứ chính để chẩn đốn bệnh vì triệu chứng này ít gặp hơn ở lợn trưởng thành

Vi khuẩn S suis serotype 1 thường gây ra các thể bệnh cho lợn ở lứa tuổi này

Thể viêm khớp thường xảy ra ở lợn cai sữa và lợn trưởng thành Lợn mắc bệnh cĩ hiện tượng viêm khớp, khớp bị viêm thường là khớp bẹn, đầu gối hoặc khớp bàn chân Các tổn thương đầu tiên bao gồm thủy thũng, sưng khớp, màng khớp xung huyết, dịch khớp đục Bệnh cĩ thể tiến triển nặng hơn với hiện tượng xơ hĩa và áp

xe các tổ chức trong khớp, khớp bị thối hĩa, viêm khớp cĩ mủ ở lợn con Ngồi ra, các triệu chứng như viêm não, viêm phổi, bại huyết, viêm nội tâm mạc, viêm teo mũi, sảy thai, viêm âm đạo cũng cĩ thể quan sát thấy, tùy thuộc vào serotype của chủng vi khuẩn gây bệnh Lợn mắc bệnh cĩ thể chết do khĩ thở, tím tái, hoặc kiệt

sức Các serotype khác nhau của S suis đều cĩ thể gây bệnh cho lợn ở lứa tuổi này

Mổ khám cĩ thể quan sát thấy các bệnh tích như da cĩ các đốm đỏ, các hạch lympho bị sưng và xung huyết, viêm thanh dịch cĩ fibrin bao phủ; bao khớp sưng, trong khớp chứa dịch trong và đục; màng não và não cĩ thể tích bình thường hoặc bị xung huyết, phù và cĩ chứa dịch tiết Trường hợp viêm não cấp tính do vi khuẩn gây

ra thì các biến đổi bệnh lý rất điển hình Với lợn bị bệnh thể phổi thì bệnh tích ở phổi cĩ các mức độ biểu hiện khác nhau từ viêm phổi - màng phổi dạng nhục hố đến viêm phổi dạng fibrin cĩ mủ

Các biến đổi về bệnh tích vi thể khơng cĩ sự sai khác giữa các serotype gây bệnh và thường tập trung ở não, phổi, tim và các khớp Các tổn thương cĩ thể quan sát thấy gồm viêm màng não, viêm não, viêm phổi - màng phổi cĩ mủ hoặc viêm phổi kẽ

1.4 Tình hình sử dụng vacxin phịng bệnh viêm phổi cho lợn ở nước ta

Hiện nay ở nước ta, ngồi một số loại vacxin phịng bệnh tụ huyết trùng lợn

do P multocida gây ra, chúng ta chưa sản xuất được vacxin phịng bệnh viêm phổi ở lợn, đặc biệt do các vi khuẩn A pleuropneumoniae và S suis gây ra Các loại vacxin phịng bệnh do P multocida gây ra ở lợn do các cơng ty trong nước sản xuất cĩ thể

kể đến như: Vacxin tụ huyết trùng lợn, vacxin tụ dấu phịng tụ huyết trùng và đĩng

dấu lợn của Xí nghiệp Thuốc thú y trung ương; Vacxin phòng tụ huyết trùng heo của công ty Navetco; Vacxin tụ huyết trùng lợn, vacxin kép phòng tụ huyết trùng và phó thương hàn lợn, vacxin kép phòng bệnh tụ huyết trùng và ñóng dấu lợn của Phân viện thú y Miền trung

Các loại vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn hiện ñang ñược sử dụng ở

nước ta chủ yếu là vacxin nhập ngoại Một số loại vacxin ngoại hiện ñang lưu hành

trên thị trường Việt Nam có thể kể ñến như:

- Vacxin RES-VAC (hãng Komipharm International- Hàn Quốc): vacxin ña giá phòng hội chứng hô hấp phức hợp trên heo do vi khuẩn gây ra bao gồm: Bệnh

viêm phổi ñịa phương do Mycoplasma hyopneumoniae, bệnh viêm teo xoang mũi truyền nhiễm do Bordetella bronchiseptica, bệnh tụ huyết trùng lợn do P multocida, bệnh Glasser’s do Haemophilus parasuis và bệnh viêm phổi - màng phổi do A pleuropneumoniae gây ra

- Vacxin Parapleuro Shield® P + BE (hãng Novatis): vacxin ña giá phòng

bệnh hô hấp phức hợp trên lợn như: bệnh viêm phổi - màng phổi do A pleuropneumoniae, bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm do B bronchiseptica, ñóng dấu lợn do Erysipelothrix rhusiopathiae, viêm phổi ña thanh dịch do H parasuis và tụ huyết trùng lợn do P multocida gây ra ở lợn

- Vacxin Donoban 10 (hãng Virbac): là loại vacxin ña giá có tác dụng phòng

ngừa cùng lúc các bệnh hô hấp trên lợn như bệnh viêm phổi ñịa phương do M hyopneumoniae, viêm phổi - màng phổi do A pleuropneumoniae, viêm phổi ña thanh dịch (bệnh Glasser’s) do Haemophilus, bệnh tụ huyết trùng do P multocida, viêm teo mũi truyền nhiễm do B bronchiseptica, và ñặc biệt là liên cầu khuẩn do S suis serotype 2 gây ra ở lợn

- Vacxin Porcilis® APP (hãng Intervet), vacxin BIOFORS APP (hãng Formosa), vacxin COGLAPIX® (hãng Ceva): phòng bệnh viêm phổi - màng phổi

do A pleuropneumoniae gây ra ở lợn

Trong những năm gần ñây, một số tác giả trong nước ñã tiến hành nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn, kết quả nghiên cứu bước ñầu cho thấy vacxin sản xuất ñã tạo ñược miễn dịch tốt khi thử nghiệm Các công trình nghiên cứu có thể kể ñến như:

Cù Hữu Phú và Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) tiến hành nghiên cứu chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi - màng phổi vô hoạt có bổ trợ keo phèn từ

một số chủng A pleuropneumoniae phân lập từ lợn tại một số tỉnh phía Bắc Việt

Nam, kết quả thử nghiệm bước ñầu cho thấy vacxin chế thử ñạt các chỉ tiêu về thuần khiết (100%), an toàn (100%) và ñạt hiệu lực cao trên chuột bạch (90%), vacxin thử nghiệm ñã có khả năng kích thích sinh miễn dịch ñối với các lợn ñược tiêm ở mức ñạt yêu cầu, các kháng nguyên có mặt trong vacxin bước ñầu kích thích sản sinh ñược miễn dịch trên lợn thí nghiệm ở mức khá tốt

ðỗ Ngọc Thúy và cs (2010) nghiên cứu chế tạo thử nghiệm vacxin vô hoạt

bổ trợ keo phèn phòng bệnh do vi khuẩn S suis gây ra trên lợn từ một số chủng S suis phân lập ñược Kết quả kiểm nghiệm bước ñầu cho thấy, vacxin chế tạo ñược

ñạt các chỉ tiêu về vô trùng khi kiểm tra trên các môi trường nuôi cấy, ñạt các chỉ tiêu về an toàn khi kiểm tra trên chuột bạch và vacxin bước ñầu có sinh ñáp ứng miễn dịch tốt trên lợn thí nghiệm

Cù Hữu Phú và cộng sự tại Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y ñã và ñang tiến hành nghiên cứu hoàn thiện quy trình chế tạo vacxin ña giá phòng bệnh viêm phổi ở

lợn do 3 loại vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây ra Vacxin ñược sản xuất từ các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis

phân lập ñược từ lợn mắc bệnh viêm phổi ở các ñịa phương nước ta Dự kiến ñây sẽ

là loại vacxin ña giá phòng bệnh viêm phổi cho lợn ñược sản xuất lần ñầu tiên ở nước ta và sẽ mang lại lợi ích lớn cho người chăn nuôi

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis

phân lập ñược từ lợn mắc bệnh viêm phổi lưu giữ tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y dùng cho nghiên cứu

- Giám ñịnh các ñặc tính sinh học, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây

bệnh của các chủng A pleuropneumoniae nghiên cứu

- Giám ñịnh các ñặc tính sinh học, xác ñịnh serotype của các chủng P multocida nghiên cứu

- Giám ñịnh các ñặc tính sinh học, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây

bệnh của các chủng S suis nghiên cứu

- Xác ñịnh ñộc lực của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P

multocida và S suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng và gây bệnh thực nghiệm trên

lợn

- Chọn chủng chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn

2.2 ðối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S

suis phân lập ñược từ lợn mắc bệnh viêm phổi ở một số tỉnh phía Bắc

- ðịa ñiểm nghiên cứu: Các nội dung nghiên cứu của ñề tài ñược tiến hành tại

Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y

2.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

* Các loại hóa chất, môi trường dùng ñể nuôi cấy, giám ñịnh vi khuẩn

Các loại hóa chất, môi trường dùng ñể nuôi cấy và giám ñịnh các loại vi

khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis, bao gồm:

- Môi trường thạch: Thạch máu (Blood Agar Base), thạch TSA (Tryptone Soya Agar), thạch BHI (Brain Heart Infusion Agar), thạch PPLO, thạch thường, thạch MacConkey, thạch chocolate,…

- Môi trường nước thịt: Nước thịt thường (Nutrient broth), nước thịt BHI (Brain Heart Infusion broth), nước thịt TYE (Tryptone Yeast Extract broth), nước thịt THB (Todd Hewitt Broth), nước thịt TSB (Tryptic Soy Broth),…

- Các chất bổ trợ: Fresh Yeast Extract, NAD, huyết thanh ngựa, máu cừu hoặc máu bê,…

- Môi trường, hóa chất xác ñịnh các ñặc tính sinh hóa: Oxidase, Catalase, Indol, Urease, ONPG; Các loại ñường: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Arabinose, Trehalose, Raffinose,…

* Các loại hóa chất dùng trong phản ứng PCR

Bao gồm các hóa chất dùng trong phản ứng PCR ñể giám ñịnh, xác ñịnh

serotype và yếu tố gây bệnh của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis như: PCR buffer, dNTPs, primers, Taq DNA polymerase, DNA ladder, loading

dye,…

* Giống vi khuẩn

- Các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae tham chiếu và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng dùng xác ñịnh serotype; Các chủng vi khuẩn S aureus, P multocida và S suis chuẩn do Nhật Bản và Úc cung cấp

- Các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập

ñược từ lợn mắc bệnh viêm phổi lưu giữ tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y dùng cho nghiên cứu

* ðộng vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh (18-20 g/con)

- Lợn 35- 40 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa ñược tiêm vacxin phòng bệnh viêm phổi

* Máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm

Bao gồm các dụng cụ thí nghiệm, buồng cấy, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, máy dùng cho phản ứng PCR, máy lên men sục khí sản xuất vacxin,…

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp giám ñịnh, xác ñịnh serotype và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn A pleuropneumoniae

* Phương pháp giám ñịnh các ñặc tính sinh học của vi khuẩn A pleuropneumoniae

Phương pháp giám ñịnh các ñặc tính nuôi cấy trên các loại môi trường, ñặc

tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập ñược theo Moller et al (1996) và theo các quy trình thường quy trong phòng thí nghiệm

Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y (Cù Hữu Phú và cs., 2011)

* Phương pháp xác ñịnh A pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR

Xác ñịnh A pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo Gram et al (1998):

- Chuẩn bị ADN ñích: Trộn 10 µl canh trùng nuôi cấy với 200 µl nước cất vô trùng Huyễn dịch sau ñó ñược xử lý nhiệt, làm lạnh, ly tâm và sử dụng 1 µl dịch nổi cho phản ứng PCR

- Mồi sử dụng: Cặp mồi của phản ứng ñược dựa vào chuỗi gen mã hóa omlA (outer membrane lipoprotein) ñặc trưng cho A pleuropneumoniae, gồm một mồi

xuôi LPF và một mồi ngược LPR, trình tự nucleotide của mồi ñược trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh gen omlA của A pleuropneumoniae

2 mM MgCl2, 200 µM mỗi loại dNTP], 0.05 µl Taq DNA Polymerase (5 units/µl), nước cất vừa ñủ 25 µl

- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các bước: 94◦C/2 phút, 26 chu kỳ (94◦C/1 phút, 52◦C/1 phút, 72◦C/1 phút) và 72◦C/10 phút

- Phân tích sản phẩm: Sản phẩm của phản ứng PCR ñược ñiện di trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch 1xTAE với hiệu ñiện thế 100V/30 phút, sau ñó nhuộm với ethidium bromide trong 15- 20 phút ðọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc

2000 Nếu vạch sản phẩm ADN hiển thị tương ñương với 950 bp thì có thể kết luận

chủng vi khuẩn kiểm tra là A pleuropneumoniae

* Phương pháp xác ñịnh ñộc tố Apx của A pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR

Xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố (Apx) của vi khuẩn A pleuropneumoniae bằng

kỹ thuật PCR theo Frey et al (1995):

- Chuẩn bị ADN ñích: Tương tự như mô tả ở trên

- Mồi sử dụng: Gồm 5 cặp mồi xác ñịnh 3 loại ñộc tố (Apx) của A pleuropneumoniae, trình tự nucleotide của các cặp mồi ñược trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi dùng ñể xác ñịnh gen quy ñịnh sản sinh ba loại

ñộc tố Apx của A pleuropneumoniae

Gen ñích Ký hiệu

mồi Trình tự nucleotide (5’- 3’)

Sản phẩm (bp)