Khảo sát nguồn gen duy trì và phục hồi hữu dục một số dạng CMS ngô bằng chỉ thị phân tử DNA

Sử dụng bất dục ñực tế bào chất ñể sản xuất giống ngô lai ngô lai ba dòng, không phải rút cờ dòng mẹ sẽ giảm nhẹ công lao ñộng, hạ giá thành sản xuất hạt giống.. Việc phát hiện ra các dò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

NGUYỄN XUÂN CAO

KHẢO SÁT NGUỒN GEN DUY TRÌ VÀ PHỤC HỒI HỮU DỤC MỘT SỐ DẠNG CMS NGÔ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

NGUYỄN XUÂN CAO

KHẢO SÁT NGUỒN GEN DUY TRÌ VÀ PHỤC HỒI HỮU DỤC MỘT SỐ DẠNG CMS NGÔ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số : 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI, NĂM 2014

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Cao

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:

PGS.TS Phan Hữu Tôn, Trưởng bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học Ứng dụng, khoa CNSH, người thầy ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và trong quá trình hoàn chỉnh luận văn

Tập thể các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học, ñặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học Ứng dụng ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt thời gian tôi làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Cao

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng ngô lai trên thế giới và Việt Nam 3

2.5 Hệ thống ngô lai ba dòng sử dụng bất ñực tế bào chất 14

2.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng giống ngô lai sử dụng bất dục ựực tế bào

2.7 Tình hình nguyên cứu, ứng dụng và ưu ựiểm của chỉ thị phân tử trong chọn

2.7.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống ngô

3.1 Vật liệu nghiên cứu, thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu 24

3.1.2 Thời gian nghiên cứu: Tháng 8/2013 ựến tháng 5/2014 24

3.3.2 Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học của các dòng CMS, các dòng ngô tự

3.3.3 Lai cưỡng bức các dòng CMS với các dòng ngô tự phối 27

3.3.4 đánh giá khả năng bất dục, hữu dục các tổ hợp lai F1 27

3.3.5 Xác ựịnh khả năng chứa gen duy trì và phục hồi hữu dục cho các dạng CMS

của các dòng ngô tự phối bằng các chỉ thị phân tử DNA 28

4.3 Xác ựịnh dòng duy trì và phục hồi hữu dục qua ựánh giá khả năng bất dục,

4.3.1 đánh giá khả năng bất dục, hữu dục của hạt phấn bằng cách nhuộm I-KI 1% 35

4.3.2 Xác ựịnh dòng duy trì và phục hồi hữu dục bằng phương pháp quan sát sự

4.4 Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của

các dòng CMS, duy trì, phục hồi và các tổ hợp lai F1 hữu dục 42

4.4.1 Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của

4.5.1 Kiểm tra ñộ nguyên vẹn và tinh sạch của DNA tổng số 54

4.5.2 Kết quả xác ñịnh gen rf3 duy trì cho dạng CMS-S bằng cặp mồi CAPSE3P1 và

4.5.3 Kết quả xác ñịnh gen rf4 duy trì cho dạng CMS-C bằng cặp mồi b0329-13.1 55

4.5.4 Tiến hành phản ứng PCR bằng cặp mồi 76755P2 phát hiện gen Rf3 phục hồi

4.5.5 Tiến hành phản ứng PCR bằng mồi b0440-16.2 nhằm phát hiện gen Rf4 phục

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngơ thế giới giai đoạn 2004-2008 4

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng ngơ một số nước trên thế giới giai

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam giai đoạn 2000-2013 và dự đốn 2014 8

Bảng 4.1 Các tổ hợp F1 bất dục hạt phấn khi nhuộm I-KI 1% 36

Bảng 4.2 Các tổ hợp F1 hữu dục hạt phấn khi nhuộm I-KI 1% 37

Bảng 4.3 Kết quả nảy mầm hạt phấn của các tổ hợp F1 bất dục hạt phấn khi nuơi

Bảng 4.4 Kết quả nảy mầm hạt phấn của các tổ hợp F1 hữu dục hạt phấn nuơi cấy

Bảng 4.5 Một số đặc điểm nơng sinh học của các dịng CMS 43

Bảng 4.6 Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của dịng CMS 44

Bảng 4.7 Một số đặc điểm nơng sinh học của các dịng duy trì 45

Bảng 4.8 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dịng duy trì 46

Bảng 4.9 Một số đặc điểm nơng sinh học của dịng phục hồi 48

Bảng 4.10 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của dịng phục hồi 50

Bảng 4.11 Một số đặc điểm nơng sinh học của các tổ hợp F1 hữu dục 51

Bảng 4.12 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai F1 53

Bảng 4.13 Kết quả phát hiện gen duy trì rf3, rf4 và gen phục hồi Rf3, Rf4 bằng PCR 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Kích thước ñoạn băng DNA khi nhân bằng các mồi phát hiện

Hình 4.2 Soi hạt phấn dưới kính hiển vi khi nhuộm với I-KI 1% 35

Hình 4.3 Sự phát triển của hạt phấn khi nuôi cấy trên môi trường thạch 39

Hình 4.9 Ảnh ñiện ñi sản phẩm cắt với enzyme MseI phát hiện gen Rf3 57

Hình 4.10 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi b0440-16.2 phát hiện

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Ngô là một loại ngũ cốc quan trọng, ñứng thứ ba sau lúa mì và lúa gạo ðây là cây lương thực giàu dinh dưỡng, góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực ñứng hàng thứ 2 sau lúa gạo Trong những năm gần ñây, diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng ngô tăng mạnh Tuy nhiên, số lượng các giống ngô nước ta vẫn còn ít, ña số các giống gieo trồng hiện nay là các giống ngô lai có nguồn gốc nước ngoài, giá thành rất cao

Sản xuất hạt giống ngô lai chủ yếu bằng phương pháp lai cưỡng ép Phương pháp lai này thì cây mẹ sẽ ñược khử ñực hoặc là cây mẹ thuộc dạng CMS (bất dục ñực

tế bào chất) ðối với phương pháp khử ñực cây mẹ thì tốn thời gian, công sức, hiệu quả không cao Sử dụng bất dục ñực tế bào chất ñể sản xuất giống ngô lai (ngô lai ba dòng), không phải rút cờ dòng mẹ sẽ giảm nhẹ công lao ñộng, hạ giá thành sản xuất hạt giống Trong công tác chọn tạo giống ngô lai ba dòng các nhà chọn tạo giống

thường quan tâm ñến bất dục ñực dạng CMS-T, CMS-S, CMS-C (Liu et al., 2002) do

có tính bất dục ổn ñịnh

Hiện nay, có bốn dạng bất dục ñực tế bào chất là CMS-T (Taxas), CMS-C

(Charrua), CMS-S (USDA), CMS-O (Parvez A et al., 2007) Tương ứng mỗi dòng bất

dục ñực ñều có gen duy trì và phục hồi tương ứng Hiện nay, người ta ñã phát hiện ñược

các gen phục hồi khác nhau cho các dạng CMS Trong ñó gen Rf1, Rf2, Rf8, Rf* phục hồi cho dạng CMS-T; gen Rf3, Rf9 phục hồi cho dạng CMS-S và gen Rf4, Rf5, Rf6 phục

hồi cho dạng CMS-C; dạng CMS-O hiện nay vẫn chưa phát hiện ñược xác ñịnh

Ngày nay, chỉ thị phân tử ñược sử dụng rộng rãi như một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu chọn tạo các giống mới Việc phát hiện ra các dòng duy trì và phục hồi hữu dục cho một số dạng CMS có ý nghĩa rất quan trọng trong chọn tạo giống ngô lai ba dòng mới Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi tiến hành

ñề tài: “Khảo sát nguồn gen duy trì và phục hồi hữu dục một số dạng CMS ngô

bằng chỉ thị phân tử DNA”

1.2 Mục ựắch yêu cầu của ựề tài

1.2.1 Mục ựắch

Tìm ra ựược một số dòng ngô tự phối có chứa gen duy trì bất dục, gen phục hồi hữu dục cho một số dạng CMS đánh giá một sổ tổ hợp lai F1 hữu dục giữa các dòng phục hồi và một số dòng CMS

- đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học các dòng CMS, các dòng ngô tự phối và F1 hữu dục của chúng

- Chiết tách DNA và phát hiện gen duy trì và phục hồi trong tập ựoàn các dòng ngô tự phối bằng chỉ thị phân tử DNA

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

- Việc tìm ra ựược các dòng duy trì và phục hồi hữu dục có ý nghĩa lớn trong việc

chọn tạo giống ngô lai ba dòng mới Kết quả nghiên cứu của ựề tài sẽ góp phần ựịnh hướng cho việc tạo ra các dòng CMS mới, các tổ hợp lai F1 có năng suất cao, chất lượng và kháng sâu bệnh tốt

- Bổ sung tài liệu nghiên cứu chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử, cũng như áp dụng công nghệ sinh học vào trong chọn tạo giống mới, ựặc biệt là ngô lai ba dòng

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về ngô

Cây ngô (Zea may.L) thuộc họ Zea, phân họ ngô (Maydeae), họ phụ hoà thảo (Phanicoideae), họ hoà thảo (Grmaineae), lớp một lá mầm (Cosmobionia) và có bộ

nhiễm sắc thể 2n=20 Cây ngô là cây hàng năm với hệ thống rễ chùm phát triển, là loài cây giao phấn có hoa ñơn tính cùng gốc

Với những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng Vavilov (1926) ñã chứng minh miền Trung Nam Mehico là trung tâm phát sinh thứ nhất và vùng núi Andet thuộc Peru là trung tâm phát sinh thứ hai của cây ngô Nhận ñịnh này của ông ñã ñược nhiều nhà khoa học tán thành ðặc biệt, Harsberger (1893) ñã kết luận ngô bắt nguồn từ một cây hoang dại từ miền Trung Mehico Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép giữa ngô ñã thuần hóa nhỏ (dạng thay ñổi không ñáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc ñoạn Luxuriantes Song ñiều quan trọng nhất nó ñã hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng ñã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị ñứng cạnh lúa mì và lúa nước

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng ngô lai trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất ngô lai thế giới

Ngành sản xuất ngô thế giới tăng liên tục từ ñầu thế kỉ 20 ñến nay, nhất là trong hơn 40 năm gần ñây, ngô là cây trồng có tốc ñộ tăng trưởng về năng suất cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu Trong nhiều thập kỷ qua các nhà khoa học trên thế giới ñã thành công trong nghiên cứu, khai thác tiềm năng của cây ngô Chính vì vậy ngô phát triển không ngừng về năng suất, diện tích và sản lượng Theo thống kê năm

2007, bảng 2.1 thể hiện diện tích, năng suất, sản lượng ngô thế giới giai ñoạn

2004-2009

Bảng 2.1 Diện tắch, năng suất, sản lượng ngô thế giới giai ựoạn 2004-2008

Năm Diện

tắch Năng suất Sản lượng

2004/05 145,0 4,9 714,8 2005/06 145,6 4,8 696,3 2006/07 148,6 4,7 704,2 2007/08 157,0 4,9 766,2 2008/09 158,5 5,0 810,2

(Diện tắch: Triệu ha, Năng suất:Tấn/ha, Sản lượng: Triệu tấn)

Vào năm 1961, năm suất ngô trung bình của thế giới chưa ựạt ựến 20 tạ/ha, năm

2004 dã ựạt 49,9 tạ/ha Năm 2007, diện tắch ngô ựã ựạt 157,0 triệu ha, năng suất 4,9 tấn/ha và sản lượng ựạt 766,2 triệu tấn Năm 2008 diện tắch ngô ựã ựạt 158,5 triệu ha, năng suất 5,0 tấn/ha và sản lượng ựạt 810,2 triệu tấn điều này ựã chứng minh ngô là cây trồng có tốc ựộ tăng trưởng về năng suất cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu ựồng thời thể hiện vị trắ quan trọng của cây ngô trong nền kinh tế thế giới

Có ựược kết quả như vậy trước hết là nhờ việc ứng dụng rộng rãi thuyết ưu thế lai trong chọn tạo giống cây trồng, mà ngô ựược ựánh giá là cây thành công nhất trong việc ứng dụng ưu thế lai trong Nông nghiệp Tiếp ựó là không ngừng cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác như: tăng mật ựộ, làm ựất tối thiểu, bón phân hợp lý ựiều này cũng góp một phần trong việc tăng năng suất ngô

đặc biệt trong thời gian gần ựây, cùng với việc ứng dụng thành công hiện tượng

ưu thế lai vào chọn tạo giống theo phương pháp truyền thống thì việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn rạo giống cây trồng cũng ựược triển khai và ựạt ựược những kết quả quan trọng như: sử dụng chỉ thị phân tắch ựa dạng di truyền phân nhóm ưu thế lai, tạo giống chịu hạn, chuyển gen chống chịu vào các dòng thuần có khả năng kết hợp cao đó

là cơ sở tạo ra những giống tốt góp phần tăng nhanh năng suất ngô trên thế giới

Việc ứng dụng công nghệ gen ựược phát triển mạnh từ ựầu những năm 90 và hiện nay vẫn ựang tăng mạnh Năm 2004 có 81 triệu ha cây trồng biến ựổi gen, trong

ñó ngô kháng sâu ñục thân và kháng thuốc trừ cỏ có 19,3 triệu ha (chiếm 24%) Diện tích trồng ngô chuyển gen lớn nhất ở nước Mỹ, năm 2005 diện tích ñược trồng bằng giống ñược tạo bằng công nghệ sinh học chiếm 52%, năng suất ngô nước Mỹ ñạt hơn

10 tấn/ha trên diện tích 30 triệu ha Năm 2007 diện tích trồng ngô chuyển gen trên thế giới ñã ñạt 35,5 triệu ha, riêng tại Mỹ ñã lên tới 29 triệu ha, chiếm 77% trong tổng số hơn 37,9 triệu ha ngô của nước này (GMO.COMPAS, 2007)

Có thể nói, nghiên cứu và sử dụng ngô lai thì Mỹ là một trong những nước thành công nhất Các nhà di truyền cải lương giống ñã sớm thành công trong việc chọn lọc và lai tạo giống ngô Theo E.Rinke (1979), việc sử dụng giống ngô lai ở Mỹ bắt ñầu từ năm 1930, ñến năm 1957 chủ yếu sử dụng giống ngô lai ba và lai kép sau ñó giống lai ñơn cải tiến và lai ñơn ñược tạo ra và sử dụng chiếm 80-85% tổng số giống lai, trong ñó hơn 90% lai ñơn

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng ngô một số nước trên thế giới giai

Trung Quốc là nước có diện tắch ngô ựứng thứ 2 thế giới và là quốc gia sản xuất ngô lai số một Châu Á, với diện tắch năm 2007 là 26,97 triệu ha trong ựó hơn 90% diện tắch trồng bằng giống ngô lai Năng suất ngô bình quân của Trung Quốc ựã tăng

từ 5,09 tấn/ha, năm 2006/2007 lên 5,18 tấn /ha năm 2007/2008 Ở khu vực đông Nam

Á, Thái Lan là một trong những nước ựầu tư ựáng kể cho chương trình sản xuất ngô khá sớm, song gần ựây lại chững lại

Nghiên cứu và sử dụng ngô lai ở một số nước ựang phát triển bắt ựầu từ những năm 1960 như Achentina, Brazil, Colombia Tuy nhiên, do ựiều kiện kinh tế xã hội

và yếu tố môi trường, diện tắch ựất canh tác phần lớn dựa vào nước trời, ựất ựai nghèo dinh dưỡng, xói mòn thường xuyên nên phát triển ngô còn chậm Mặc dù, diện tắch ngô của những nước này chiếm 68% diện tắch ngô toàn cầu nhưng chỉ ựạt 46% tổng sản lượng ngô thế giới (CIMMYT, 2001), (Lê Quý Kha, 2006)

Công tác nghiên cứu lai tạo giống ngô hiện nay ựang có bước chuyển biến mới,

ựó là ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo dòng thuần Trong những năm gần ựây việc nghiên cứu tạo ra những dòng ựơn bội kép (Double Halploid - DH), dòng thuần về mặt di truyền (Chomozygous lines) bằng nuôi cấy invitro ựã giúp cho công việc tạo ra các dòng thuần một cách nhanh chóng, tiết kiệm ựược hơn nửa thời gian so với việc tạo dòng bằng phương pháp thông thường (Ngô Hữu Tình và cs, 1999)

Theo Ngô Hữu Tình thì 21% sản lượng ngô thế giới ựược dùng làm lương thực, 71% ựược dùng làm thức ăn chăn nuôi Ở các nước phát triển phần lớn sản lượng ngô ựược dùng cho chăn nuôi: Thái Lan 96%, Bồ đào Nha 91%, Mỹ 76%, Trung quốc 76%

Theo dự báo mới nhất của tổ chức Lương thực thế giới (FAO), sản lượng ngô thế giới năm 2013 ựược dự báo ựạt khoảng 963 triệu tấn, tăng 10% so với năm 2012

Tại Hoa Kỳ, nước sản xuất ngô lớn nhất thế giới, tốc ựộ trồng ngô trong những tháng

ựầu năm chậm hơn so với bình thường do ựiều kiện thời tiết bất lợi Tuy nhiên, thời tiết vào giữa tháng 5 khá thuận lợi ựã khuyến khắch nông dân gieo trồng, từ ựó nhanh chóng bù lại sản lượng ựã mất trong những tháng trước Nếu ựiều kiện thời tiết vẫn ôn hòa, các nhà sản xuất có thể tăng diện tắch trồng ngô lên mức kỷ lục kể từ năm 1936

Nếu thành công thì sản lượng ngô thế giới sẽ trở lại bình thường sau ñợt hạn hán kéo dài trong năm trước và dự kiến tăng lên khoảng 340 triệu tấn

Trung Quốc, quốc gia ñứng thứ 2 về sản xuất ngô, dự kiến năm 2013 sẽ tăng

sản lượng lên 2,8% so với cùng kỳ năm trước, dự báo vào khoảng 214 triệu tấn

Tại EU, hoạt ñộng sản xuất ngô có xu hướng tăng nhẹ với mức sản lượng dự

kiến tăng khoảng 16% so với năm trước (tương ñương tăng 9 triệu tấn), ñạt mức 65 triệu tấn

2.2.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực ñứng thứ hai về diện tích và sản lượng, tương ứng 1,12 triệu ha và 4,8 triệu tấn (2011) Năng suất ngô ñã không ngừng tăng lên, ñặc biệt từ khi các giống ngô lai ñược ñưa vào sản xuất

Năng suất ngô Việt Nam những năm 1960 chỉ ñạt trên 1 tấn/ ha, với diện tích hơn 200 nghìn ha; ñến ñầu những năm 1980, năng suất cũng chỉ ñạt 1,1 tấn/ ha và sản lượng hơn 400.000 tấn do vẫn trồng các giống ngô ñịa phương với kĩ thuật canh tác lạc hậu Từ giữa những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm Cải tạo Ngô và Lúa mỳ Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến ñã ñược ñưa vào trồng ở nước ta góp phần nâng năng suất lên gần 1,5 tấn/ha vào ñầu những năm 1990 Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô nước ta thực sự có những bước tiến nhảy vọt là từ ñầu những năm 1990 ñến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng giống ngô lai ra sản xuất, ñồng thời cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác theo ñòi hỏi của giống mới

Ngay từ những năm 1972 – 1973, các nhà nghiên cứu ngô Việt Nam ñã bắt ñầu chuẩn

bị cho chương trình tạo giống ngô lai và ñược tập trung cao ñộ từ năm 1990 ñến nay Năm 1992 – 1994, Viện Nghiên cứu Ngô ñã lai tạo ra 5 giống ngô lai không quy ước là: LS-3, LS-5, LS-6, LS-7, LS-8 Bộ giống ngô lai này gồm giống chín sớm, chín trung bình và chín muộn, có năng suất từ 3-7 tấn/ha ñã ñược mở rộng nhanh chóng trên phạm vi toàn quốc, mỗi năm diện tích gieo trồng trên 80.000 ha, tăng năng suất 1tấn/ha so với giống thụ phấn tự do (Trần Hồng Uy, 1997)

Theo ước tính năm 1991 diện tích trồng ngơ lai chưa đến 1% trên hơn 400 nghìn ha trồng ngơ, đến năm 2007 giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu

ha Năm 1994 sản lượng ngơ Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn, năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn, năm 2007 cĩ diện tích, năng suất và sản lượng cao nhất từ trước tới nay: Diện tích 107280 ha, năng suất 36,9 tạ/ha, sản lượng vượt ngưỡng 4 triệu tấn ðây là một tốc độ nhanh trong lịch sử phát triển ngơ lai và Châu Á gĩp phần đưa nghề trồng ngơ của nước ta đứng trong hàng ngũ những nước tiên tiến về sản xuất ngơ lai ở

Châu Á (bảng 2.3) Tới năm 2013 diện tích đạt 117310 ha, năng suất đạt 44,3 tạ/ha,

sản lượng vượt ngưỡng 5 triệu tấn Theo dự đốn năm 2014 thì diện tích đạt 120000

ha, năng suất đạt 44,5 tạ/ha, sản lượng đạt khoảng trên 5,3 triệu tấn Tuy nhiên năng suất và sản lượng của ngơ nước ta cịn thấp so với thế giới

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam giai đoạn 2000-2013 và dự đốn 2014

Năm 2000 2005 2007 2012 2013 Dự đốn

2014 Diện tích

Nguồn: Tổng cục thống kê (2005), Bộ NN&PTNT (2007), MARD/ Post Estimate (2014)

Hiện nay thị phần giống ngơ lai của Việt Nam chiếm khoảng 60%, chủ yếu là giống ngơ lai đơn, áp dụng vào sản xuất ở tất cả các vùng sinh thái trong cả nước Các giống dài ngày như LVN10, HQ2000, LVN98 Các giống trung ngày: LVN24, LVN12, LVN17, LVN8960 các giống ngắn ngày: LVN9, LVN20, LVN24, LVN25, LVN99 (Nguyễn Thị Nhài, 2005)

Công nghệ sinh học là một ngành mới ñược áp dụng ở Việt Nam nhưng bước ñầu ñã ñạt ñược những thành công Từ năm 1995, Viện Di truyền nông nghiệp ñã có các nghiên cứu về ñơn bội ngô, tiếp ñó kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở Viện Nghiên cứu Ngô ñã ngày càng hoàn thiện và chọn ra hơn 10 dòng ñơn bội kép bước ñầu ñánh giá

là rất triển vọng Phương pháp này cho kết quả khá ổn ñịnh và hiệu quả Phần lớn các dòng thuần ở Viện Nghiên Cứu Ngô ñã ñược phân nhóm ưu thế lai giúp ñịnh hướng chọn tạo giống lai có hiệu quả nhanh

Như vậy ñể sản xuất ngô Việt Nam theo kịp các nước tiên tiến và ñạt năng suất trung bình của thế giới, việc quan trọng nhất là tăng cường thu thập các nguồn nguyên liệu phù hợp, chọn tạo các giống chống chịu phục vụ cho các vùng khó khăn, chọn tạo các giống ngô thực phẩm có năng suất và chất lượng cao, kết hợp chọn tạo giống bằng các phương pháp hiện ñại với truyền thống, ñẩy mạnh nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật canh tác ñể phát huy tối ña tiềm năng của giống và bảo vệ môi trường sinh thái

Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn sản lượng ngô năm

2010 ước ñạt 4,6 triệu tấn, tăng 235,1 nghìn tấn khoảng 5,4% so với năm 2009, nhờ tăng cả diện tích gieo trồng và năng suất Diện tích ngô ñạt 1126,9 nghìn ha, tăng 37,7 nghìn ha do chuyển một phần diện tích lúa thiếu nước canh tác sang trồng ngô và do năm 2009 diện tích ngô của các tỉnh miền Bắc bị ảnh hưởng nặng bởi trận lụt lịch sử Năng suất ngô năm 2010 ước ñạt 40,9 tạ/ha, tăng 0,7 tạ/ha so với năm trước

2.3 Hiện tượng ưu thế lai

2.3.1 Khái niệm

Ưu thế lai (heterosis) là một thuật ngữ ñể chỉ tính trạng của con lai F1 có sức sống cao hơn, sinh trưởng nhanh hơn, phát triển mạnh hơn, chống chịu tốt hơn,khả năng thích nghi, chất lượng hạt, các tính trạng năng suất cao hơn trung bình giữa hai

bố mẹ hoặc vượt trội cả hai bố mẹ

2.3.2 Cơ sở khoa học của ưu thế lai

Cơ sở di truyền của hiện tượng ưu thế lai vẫn là vấn ñề gây tranh cãi trong suốt lịch sử phát triển của nghành di truyền học Một số giả thuyết ñã ñược nêu ra trong thế

kỷ XX ñể giải thích hiện tượng ưu thế lai và ñược nhiều người thừa nhận như:

Giả thuyết tính trội:

Theo giả thuyết này thì tính trội ñược hình thành trong quá trình tiến hoá của sinh vật Các gen trội có lợi lấn át gen lặn có hại gây hiệu quả xấu Có nghĩa là gen trội át chế tác ñộng của gen lặn tương ứng cùng locus trên NST tương ñồng Ví dụ khi lai

aabbccvới AABBCC con lai F1 có kiểu gene AaBaCc nên có ưu thế lai rõ rệt

Giả thuyết siêu trội

Giả thuyết này cho rằng nhiều tính trạng có lợi cho sự sinh trưởng do gen trội kiểm soát còn gen lặn tương ứng thì có tác dụng ngược lại Tính dị hợp tử của một allen ở một vị trí nhất ñịnh sẽ sản sinh ra các vật chất có ảnh hưởng ñến sức sống, vượt

xa của các loài mang allen ñồng hợp tử do tác dụng tương hỗ giữa các allen khác nhau trên cùng một vị trí Theo giả thuyết này thì cơ thể có kiểu gen Aa sẽ có sức sống hơn hẳn cơ thể mang kiểu gen AA và aa Mô hình toán học tổng quát của giả thuyết này là:

AA < Aa > aa

Giả thuyết cân bằng di truyền

Theo giả thuyết này thì mỗi cơ thể sinh vật ở trạng thái cân bằng di truyền nhất ñịnh, ñảm bảo cho sự hình thành một kiểu hình thái tương ứng với ñiều kiện sống Khi lai các cá thể có kiểu cân bằng di truyền khác nhau, sẽ hình thành cơ thể mới có trạng thái cân bằng di truyền mới khác cân bằng di truyền cũ do vậy con lai xuất hiện những tính trạng mới tốt hơn ở bố mẹ

2.4 Hệ thống ngô lai ba dòng

2.4.1 Cơ chế bất dục ñực tế bào chất

Cơ chế kiểm soát tính trạng bất dục ñực tế bào chất

Nghiên cứu về tái tổ hợp gene và tương tác giữa gene nhân của các dòng cho phấn với gene tế bào chất của các dòng bất dục ñực tế bào chất, cho thấy có ba kiểu phản ứng khác nhau:

- Duy trì tính bất dục ñực tế bào chất tạo ra con lai giữa dòng bất dục ñực tế bào chất với dòng cho phấn biểu hiện bất dục ñực

- Phục hồi tắnh hữu dục ựực: Con lai giữa dòng bất dục ựực tế bào chất với dòng cho phấn biểu hiện hữu dục ựực

- Phục hồi hoặc duy trì tắnh bất dục ựực không hoàn toàn: Con lai giữa dòng bất dục ựực tế bào chất với dòng cho phấn biểu hiện bất dục ựực hoặc hữu dục không hoàn toàn

Cơ sở di truyền bất dục ựực tế bào chất

Giả thuyết ựơn gene: Cho rằng tắnh bất dục ựực là kết quả của mối tương tác giữa gene lặn trong nhân và kiểu tế bào chất ựã có thay ựổi về cấu trúc Gene này tuân

thủ theo quy luật của Mendel Khi kiểu gene nhân là RR hoặc Rr thì kết quả là sẽ cho

con lai hữu dục hoàn toàn hoặc hữu dục một phần Nếu gen nhân là rr thì con lai sẽ bất dục hoàn toàn đó là do 2 cơ chế : (1) Gene trội trong nhân có khả năng ựiều hòa tương tác nhân và tế bào chất bình thường nên tạo cơ hội cho sự phát triển hạt phấn bình thường (2) Các alen trội có thể kìm chế ảnh hưởng bất dục hóa do ựó giao tử ựực phát triển bình thường

Những cơ sở giải thắch tắnh bất dục ở cây CMS

- Các ty thể chịu trách nhiệm về những biến ựổi ở bào chất bất dục, tức những biến cố về chức năng năng lượng của ty thể là nguyên nhân sơ cấp gây nên tắnh bất dục của hạt phấn

Ở ngô, dạng bất dục ựực tế bào chất kiểu Texas mẫn cảm có tắnh ựặc thù với nấm Helminthosporium maydis chủng T (dạng ngô này nhiễm bệnh rất nặng, không sử dụng trong sản xuất hạt lai) độc tố (Toxin) chiết xuất từ nấm này gây ức chế sự phophoril hóa tới 50% ở ty thể cây bình thường, và ức chế toàn bộ (100%) ở ty thể cây bất dục ựực tế bào chất kiểu Texas Kết quả này là một trong các dẫn liệu, chứng tỏ bào chất bất dục liên quan tới ựặc ựiểm của ty thể

- Ở cây bình thường và cây CMS có thể chứa quần thể bao gồm cả 2 dạng ty thể: ty thể hữu dục và ty thể bất dục Những sai khác về số lượng của 2 dạng này tạo nên tỷ lệ tương quan khác nhau giữa 2 dạng điều này dẫn ựến các mức ựộ khác nhau

về sự cung cấp năng lượng ở tế bào

- Ở cây CMS mức ñộ cung cấp năng lượng của tế bào tăng ở giai ñoạn nảy mầm và cây non Ngược lại, ở giai ñoạn phát sinh giao tử mức ñộ cung cấp năng lượng không ñược ñầy ñủ so với nhu cầu cần thiết ñể ñảm bảo cho quá trình hình thành hạt phấn Ở cây hữu dục, mức cung cấp năng lượng ở giai ñoạn phát sinh giao tử là cao, ñảm bảo hình thành các hạt phấn hữu dục

- Ở giai ñoạn phát sinh giao tử tồn tại mức ngưỡng về cung cấp năng lượng cho

sự phát triển cây bình thường của hạt phấn Các mức cung cấp năng lượng bị thiếu hụt lớn hay nhỏ so với mức ngưỡng gây nên những mức ñộ bất dục sâu sắc hay kém sâu sắc (ngoại diện) của kiểu gen CMS

- Kiểu bất dục sâu sắc tương ứng với việc dễ tìm thấy dạng duy trì tốt, ngược lại khó tìm thấy dạng phục hồi tốt

- Kiểu bất dục ngoại diện dễ phục hồi nhưng khó duy trì

- Nhiều tác ñộng của những yếu tố ngoại cảnh có thể làm thay ñổi về tỷ lệ tương quan giữa các ty thể bình thường và ty thể bất dục, tù ñó dẫn tới sự thay ñổi mức

ñộ bất dục của cây CMS (do có sự biến ñổi về cung cấp năng lượng)

Bảng 2.4 Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân STT Kiểu gen Kiểu tế bào chất Kiểu hình (hạt phấn)

Vậy hạt phấn của ngô chỉ bị mất hoạt tính khi có yếu tố bất dục trong tế bào

chất mà lại thiếu thiếu gene phục hồi hữu dục (Rf) ở trong nhân, alen của gene này là

rf là gene củng cố tính bất dục Cây ñược phục hồi hữu dục Rfrf.S cho tự thụ phấn thì ở

ñời sau sẽ có 1/4 rfrf có hạt phấn hỏng Nếu lấy bắp của dạng rfrf.S thụ phấn của

rfrf.N, thì phấn hoa của toàn bộ ñời sau sẽ bị hỏng, cây này chỉ còn bắp mang nhị cái

đó là cách dùng phương pháp di truyền ựể khử cờ ngô Khi sản xuất hạt giống, những cây này muốn có hạt thì phải thụ phấn hữu dục của những cây bình thường Nếu muốn

dùng những hạt ựó ựể sau này trồng lại thì cây bố phải có kiểu gene RfRf và kiểu tế

bào chất N (bình thường) hoặc S (bất dục)

Trong sản xuất giống ngô có thể dùng tổ hợp dòng thuần dạng 1 làm cây mẹ và dạng 3 hoặc dạng 4 ựồng hợp tử làm cây bố Như thế sẽ ựỡ mất công khử ựực ở cây

mẹ và hạt lai thu ựược từ cây mẹ sẽ có kiểu gene Rfrf, kiểu tế bào chất S Kiểu gene

này ựảm bảo ựược sự thụ phấn bình thường lúc trồng trong sản xuất

2.4.2 Tầm quan trọng của bất dục ựực tế bào chất

Sự xuất hiện của giống lai ựã ựưa ựến sự gia tăng về năng suất và chất lượng Chắnh vì thế sản xuất hạt giống cần ựòi hỏi có nguồn gen tốt từ cây mẹ và cây bố cung cấp hạt phấn phải có chất lượng tốt Sản xuất giống thì cần tránh trường hợp tự thụ (phấn của cây mẹ tự thụ cho chắnh bắp của chúng) điều này có thể ựược thực hiện

bằng tay hoặc sử dụng cây mẹ bất dực ựực (Chase et al., 2010) Trong số các hệ thống

di truyền, CMS là hệ thống không chuyển gen quan trọng nhất trong ngô lai Bất dục ựực ựược hình thành bởi ựột biến của ty thể DNA làm gián ựoạn sự phát triển của hạt phấn chức năng (Schnable và Wise, 1998) Khả năng sinh sản của bắp thường không

bị ảnh hưởng (Laughnan và Gabay, 1983) và cây này có thể nhận phấn của cây khác nếu hạt phấn phù hợp Các ựặc ựiểm di truyền theo dòng mẹ có thể ựược bù ựắp bởi gen phục hồi, trong ựó phục hồi khả năng sinh sản trong các thế hệ con lai F1 của CMS có thể là hữu dục hoặc bất dục Sản xuất hạt giống lai ựòi hỏi CMS, duy trì và

phục hồi dòng bố mẹ, CMS mang kiểu gen rfrf và một tế bào chất CMS Cây có khả năng duy trì cho dòng CMS thì có kiểu S.rfrf và N- tế bào chất bình thường, còn cây

có khả năng phục hồi thì phải chứa kiểu gen RfRf Trong trường hợp của ngô, chi phắ sản xuất giống bằng CMS có thể ựược giảm khoảng 2% (W.Schmidt et al., 2008)

Không có số liệu chắnh thức về việc sử dụng hiệu quả của CMS trong sản xuất hiện

nay của hạt giống lai, nhân trên phạm vi rộng hơn 150 ha (H.Camp et al., 2010) Cũng

như sản xuất hạt giống lai, CMS cũng là một giải pháp khả thi của các vấn ựề bảo tồn của cây trồng chuyển gen và không chuyển gen hoặc thực vật bản ựịa Chuyển gen

thực vật CMS sẽ không phát tán phấn hoa cho môi trường, vì vậy thụ phấn của cây

trồng không biến ñổi gen hoặc thực vật bản ñịa sẽ không xảy ra (Munsch et al., 2008)

Trong bối cảnh này, Feil (2002) ñề xuất trồng CMS lai ñể sản xuất thuốc không có nguy cơ phấn hoa trôi Hệ thống Plus- lai kiểm soát việc phát tán của phấn hoa từ ngô biến ñổi gen và làm tăng năng suất hạt của nó bằng cách phát triển diện tích trồng CMS (80%) Một số nghiên cứu khẳng ñịnh năng suất tăng từ 5 ñến 10% (Weingartner

et al., 2002)

2.5 Hệ thống ngô lai ba dòng sử dụng bất ñực tế bào chất

2.5.1 Khái niệm về hệ thống ngô lai ba dòng

Ngô lai ba dòng là hệ thống ngô lai khi sản xuất hạt lai F1 phải sử dụng ba loại dòng có bản chất di truyền khác nhau: Dòng bất dục ñực tế bào chất CMS (cytoplasmic male sterility) còn ñược gọi là dòng A, dòng duy trì bất dục ñực (maintainer line) ñược ký hiệu là dòng B và dòng phục hồi hữu dục ñực (restorer line) ñược gọi là dòng R

2.5.2 Dòng bất dục ñực tế bào chất (CMS)

Dòng A (dòng bất dục): là dòng có nhụy phát triển bình thường nhưng hạt phấn

bị thui chột hoàn toàn, nó không tự thụ phấn như ngô thường mà muốn kết hạt phải nhờ vào phấn của dòng bố khác Nếu nhuộm hạt phấn bằng dung dịch I-KI (1%) và soi trên kính hiển vi thì hạt phấn không nhuộm màu, có hình dạng bất thường: hình tam giác, hình thoi, hình trăng khuyết… Nhìn bằng mắt thấy bao phấn có màu trắng, rung cây lúc hoa nở không có phấn tung ra, nếu cách ly dòng A khi trỗ bông thì hạt bị lép hoàn toàn, nếu dùng phấn của cây ngô khác rũ vào nhụy hoa dòng A thì dòng A kết ñược hạt

Cơ chế của sự bất dục là sự tương tác giữa gen nhân và gen trong tế bào chất Cây bất dục biểu hiện tính bất dục cần ñảm bảo ñủ 2 ñiều kiện: chứa dạng tế bào chất

bất dục (S) và một hay 2 gen lặn nằm trong nhân (rfrf) ñể duy trì tính bất dục ñực Cây bất dục ñực phải có kiểu gen S.rfrf ở những cây này nhân không thể bù ñắp sự thiếu

hụt về mặt năng lượng ở những ty thể bất dục gây nên Hạt phấn sinh ra ở những cây

này không tích luỹ ñược năng lượng, hạt phấn bị lép, méo mó biến dạng không có khả năng nảy mầm và thụ tinh

Hiện nay người ta ñã xác ñịnh ñược 4 dạng bất dục ñực tế bào chất ở ngô là: CMS-T, CMS-S, CMS-C, CMS-O Mỗi dạng gen gây bất dục ñực CMS có gen hoặc nhóm gen duy trì và phục hồi riêng Việc tìm ra giống ngô nào có chứa gen duy trì hoặc phục hồi cho mỗi dạng này là việc làm cần thiết ñể tạo dòng CMS mới phục vụ chọn tạo giống ngô lai 3 dòng

Bất dục ñực tế bào chất CMS không có khả năng sản xuất hạt phấn di truyền theo dòng mẹ CMS ñược tìm thấy trong hơn 150 loài (Laser và Lersten ,1972; Wise

và Pring, 2002) Ngô có ba loại CMS chính (Zea mays, L): Texas (T), USDA (S) và Charrua (C) Gen nhân có thể ngăn chặn các kiểu hình CMS và phục hồi khả năng sinh sản Tế bào chất T và C ñược ñặc trưng bởi bào tử phục hồi, trong khi S tế bào chất ñược ñặc trưng bởi giao tử phục hồi Phục hồi bào tử có nghĩa là tất cả các giao tử ñực (phấn hoa) ñược sản xuất bởi một cá thể có kiểu gen phục hồi ở dạng dị hợp tử sẽ có thể thụ tinh thành công giao tử cái Phục hồi giao tử có nghĩa là các giao tử ñực mang alen phục hồi sẽ có thể thụ tinh thành công giao tử cái vì phục hồi ñang xảy ra ở mức

ñộ ñơn bội (giao tử)

a Dạng CMS-T

Bất dục ñực tế bào chất dạng Texas, lần ñầu tiên ñược phát hiện bởi Golden June tại Texas (Rogers và Edwardson, 1952) CMS-T là một hệ thống mô hình ñể nghiên cứu bất dục ñực tế bào chất và phục hồi khả năng sinh sản Các gen ty thể chịu

trách nhiệm về bất dục ñực là T-urf13 Khả năng sinh sản ñược khôi phục tế bào chất ngô T do sự kết hợp của hai nhân gen là Rf1 và Rf2a Rf1 là liên quan ñến việc tích lũy thêm 1,6/0,6 kb T-urf13 bản sao lại trong khi Rf2a là một aldehyde dehydrogenase và

không liên quan ñến bản sao lại Ngoài ra còn có phục hồi một phần khả năng sinh sản

cho T tế bào chất, Rf8 và Rf* kết hợp với Rf2a sẽ phục hồi khả năng sinh sản và một phần

có liên quan ñến sự tích luỹ bổ sung của 1,42/0,42 kb và 1,4/0,4-kb T- urf13 bản sao

Tế bào chất T ñã trở thành nguồn nguyên liệu ñể sản xuất hạt giống lai trong những năm 1950 và 1960 Tuy nhiên, CMS-T giảm hoàn toàn không sử dụng ñược vì mất mùa ñáng kể trong ngô bởi bệnh ñốm lá nhỏ năm 1970, CMS-T là rất dễ bị các chủng ñộc tố T của Cochliobolus heterostrophus (giai ñoạn sinh bào tử của Bipolaris

maydis) Các gen ty thể T-urf13 chịu trách nhiệm về bất dục ñực và mẫn cảm với ñộc

tố T (Dewey et al.,1988) Tế bào chất của T cũng rất mẫn cảm với các ñộc tố của

Mycosphaerella zeae - maydis (giai ñoạn sinh bào tử của Phyllosticta maydis ), các tác nhân gây bệnh của bạc lá ngô (Scheifele và Nelson, 1969) Thiệt hại từ dịch bệnh năm

1970 ước tính ñạt 700 triệu ha (Ullstrup, 1972) Kể từ khi dịch bệnh này, CMS-T không ñược sử dụng ñể sản xuất hạt giống lai

Kiểu hình của tế bào chất ngô T là rất lớn Trong tế bào chất bình thường, bao phấn màu vàng ñầy ñặn và có khả năng tung phấn Bất dục ñực tế bào chất T, những bao phấn khép kín chặt chẽ hoặc nếu có thì chỉ một vài bao phấn có khả năng tung phấn Nếu không thì bao phấn là hầu như luôn luôn nâu, héo và không có khả năng tung phấn, thụ phấn cho bắp Tapetum ở bên trong các tế bào xung quanh locule, nơi các thành bào tử phát triển Lớp này có nhiều hơn một chức năng, nó cung cấp các bào

tử với các chất dinh dưỡng, giải phóng các bào tử từ các bức tường callose và nó tạo ra những tiền chất cho sự phát triển của thành bên ngoài hạt phấn (exine) (Bedinger, 1992) Khi exine phát triển thành tế bào tapetum vượt qua ñược sự cảm ứng chết tế bào dẫn ñến việc giải phóng các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của hạt phấn Thời ñiểm suy thoái là rất quan trọng làm gián ñoạn thường dẫn ñến bất dục Trong một tế bào chất bình thường, microsporocytes ñược gắn với thành callose của bao phấn phát triển Trong giai ñoạn meiocyte, các tế bào tapetal ñang trải qua quá

trình nguyên phân mà không bào ñể trở thành binucleate (Horner et al., 1993) Các bào

tử nhỏ trải qua hai ñơn vị phân bào giảm nhiễm ñể sản xuất một bộ bốn bào tử Tường callose sau ñó làm giảm và exine bắt ñầu phát triển Trong sự phát triển của bào tử nhỏthì mặt trong ñó hợp nhất thành một không bào lớn duy nhất Không ñối xứng phân chia xảy ra sản xuất một tế bào sinh sản và tế bào ống Các tế bào sinh sản lại phân chia sản xuất hai tế bào tinh trùng Tapetum bắt ñầu làm suy giảm chất dinh dưỡng cho ra các hạt phấn hoa Phấn hoa sau ñó bắt ñầu mất nước ñể chuẩn bị cho bước tung hạt phấn

b Dạng CMS-S

CMS-S là dạng bất dục ựực tế bào chất S Bộ gen ty thể của CMS-S của ngô có chứa hai episomes tuyến tắnh, S1 (6397 cặp base) và S2 (5453 cặp base), Các episome S2chứa hai khung ựọc mở không xác ựịnh, URF1 (3512 cặp base) và URF2 (1017 cặp base) đã có nghiên cứu chứng minh rằng một polypeptide với một phân tử khối lượng 130 kDa là sản phẩm gen của URF1 Polypeptide này lần ựầu tiên ựược phát hiện trong Coomassie blue-stained gel protein của CMS-S nhưng không có trong CMS-T, CMS-C, hoặc protein ty thể bình thường Các sản phẩm protein của một sự

hợp nhất chứa ựầu 5Ỗ của gen lacZ E.coli và một ựoạn từ URF1 của S2 ựược công

nhận bởi kháng huyết thanh tăng so với 130 kDa biến thể polypeptide Ty thể của giống lai F1 của CMS-S x Ky2l (dòng mẹ của CMS) chứa nhiều protein 130 kDa như là tìm thấy trong CMS-S ty thể của các CMS Có 2 gen phục hồi cho

2.5.3 Dòng duy trì bất dục

Dòng duy trì (dòng B): Là dòng tự thụ phấn, khi dùng phấn của nó thụ phấn cho dòng A thì cây F1 thu ựược sẽ bất dục y hệt ựặc tắnh dòng mẹ của nó Nghĩa là cây ngô mọc từ hạt dòng A thế hệ sau lại bất dục phấn hoàn toàn Dòng B làm nhiệm vụ duy trì tắnh bất dục của dòng A Mỗi dòng A chỉ có một dòng B duy trì tắnh bất dục tương ứng với nó

Về mặt di truyền: Các gen trong tế bào chất kiểm soát tính hữu dục, gen trong nhân là gen lặn kiểm soát tính bất dục phấn Do vậy, dòng duy trì luôn cho hạt phấn hữu dục và quá trình thụ phấn thụ tinh bình thường nên luôn cho tỷ lệ kết

hạt tự thụ cao Công thức kiểu gen của dòng duy trì là N.rfrf Khi lai dòng này với dòng bất dục S.rfrf sẽ thu ñược dòng CMS giống hệt dòng ban ñầu ðồng thời, về

kiểu gen thì gen nhân của dòng CMS và dòng duy trì hoàn toàn giống nhau Do vậy, biểu hiện tính trạng hình thái của dòng CMS nhận ñược sau khi thụ phấn của dòng B sẽ giống hệt dòng CMS ban ñầu và không xảy ra sự phân ly các tính trạng ở dòng CMS Như vậy, dòng B và dòng A là một cặp song sinh chỉ khác nhau ở tính trạng hữu dục hạt phấn

là ngô thường có nhiều ñặc ñiểm nông sinh học tốt có năng suất khá cao, chất lượng tốt, có khả năng phục hồi hữu dục cho dòng A Dòng phục hồi hữu dục ñóng vai trò vô cùng quan trọng trong chương trình chọn tạo giống nhằm khai thác tính bất dục ñực ñặc thù của một công cụ di truyền mới là dòng CMS

Gen trong tế bào chất của dòng phục hồi có thể là gen kiểm soát tính hữu dục ñực hoặc bất dục ñực (N hoặc S), nhưng gen trong nhân là dạng ñồng hợp tử trội

(RfRf) hoặc ở dạng dị hợp tử (Rfrf) kiểm soát tính hữu dục phấn Do gen trong nhân ở

hai trạng thái khác nhau nên khi lai với dòng CMS sẽ gây nên hiện tượng phục hồi hoàn toàn hoặc phục hồi một phần

Cơ chế của hiện tượng phục hồi có thể dựa trên nhiều cở sở khác nhau:

Như chúng ta ñã biết hoạt ñộng của các gen nhân và ty thể có liên quan ñến nhau Nhiều loại enzyme có mặt trong ty thể nhưng lại chịu sự chi phối của cả gen trong nhân Với hiện tượng bất dục ñực tế bào chất, như ñã nêu ở phần trên có thể do

ñơn gen hoặc ña gen kiểm soát Do vậy, nếu là phục hồi ñơn gen thì hoạt ñộng của chúng hình dạng và bổ khuyết những khiếm khuyết trong chuỗi hô hấp ñể ñưa tới sự phục hồi chức năng năng lượng của ty thể ñảm bảo cho hạt phấn phát triển bình thường Nhiều tác giả cho rằng, khi cây trồng biểu hiện tính bất dục ñực có nghĩa là ty thể không nạp ñủ các enzyme hay các cấu phần của enzyme do các gen nhân ñiều khiển mà các enzyme này tham gia vào chu trình hô hấp cung cấp năng lượng cho tế bào Khả năng phục hồi có thể xảy ra theo các khuynh hướng sau:

- Làm thay ñổi cấu trúc không gian hoặc sự thiếu hụt liều lượng các enzyme Trong trường hợp này các gen phục hồi có tác dụng chấn chỉnh lại cấu trúc và bổ khuyết những thiếu hụt của enzyme Kết quả ty thể ñược nạp ñủ enzyme và các hoạt ñộng của

1950 và 1957, Jones ñã ñưa ra hai cơ chế giải thích tác ñộng của các allen trội ñối với quá trình hình thành tính hữu dục:

Các allen trội của các gen phục hồi có khả năng ñiều hoà mối tương tác giữa nhân và tế bào chất ñể ñảm bảo cho hạt phấn hữu dục phát triển và loại trừ sự phát triển của các hạt phấn bất dục

Các allen trội có khả năng kiềm chế các tác ñộng bất dục ñực hoá do vậy hạt phấn hình thành và phát triển bình thường

Tiêu chuẩn chọn một dòng phục hồi hữu dục:

Dòng phục hồi tốt phải có những tiêu chuẩn sau:

+ Cây phải phát triển tốt

+ Thời gian sinh trưởng dài hơn dòng bất dục

+ Có nhiều tính trạng quý có thể di truyền cho con lại F1, ñồng thời thời lấn át các tính trạng xấu của dòng bất dục như: sức sinh trưởng mạnh, chống chịu sâu bệnh tốt, chống ñổ, chống úng, chịu rét thời kỳ mạ,…

+ Bao phấn to mẩy, chứa nhiều hạt phấn, khi nở hoa bao phấn mở và tung phấn mạnh, tập trung, khả năng bám dính của hạt phấn tốt, nảy mầm nhanh và thụ tinh mạnh

+ Có khả năng phục hồi mạnh, con lai F1 ñậu hạt cao trên 85%

+ Có khả năng tương hợp di truyền rộng ñể có thể phục hồi hữu dục cho nhiều dòng bất dục ñực khác nhau tạo ra những tổ hợp lai xa ñịa lý sinh thái hoặc xa huyết thống nhằm khai thác tiềm năng ưu thế lai cao

+ Dòng phục hồi phải có khả năng phục hồi mạnh nghĩa là ñộ kết hạt của con lai của nó phải tương ñương với ñộ kết hạt của một giống bình thường

+ Có các tính trạng nông sinh học tốt hơn khả năng kết hợp tốt hơn và có ưu thế lai ñáng kể ở các con lai

2.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng giống ngô lai sử dụng bất dục ñực tế bào chất trên thế giới và Việt Nam

ðể tạo ra giống ngô lai có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu với sâu bệnh và những ñiều kiện bất thuận, thích nghi rộng là việc là ñòi hỏi sự ñầu

tư cao về trình ñộ chuyên môn, kinh nghiệm, vật tư thiết bị và thời gian Quá trình tạo giống phải qua các công ñoạn: Rút dòng, chọn lọc dòng, làm thuần dòng từ các nguồn nguyên liệu, các giống ngô lai thương phẩm Thường thường thời gian ñể tạo dòng thuần mất khoảng 4 - 5 năm (nếu mỗi năm làm 2 vụ) ðồng thời người ta phải tiến hành nghiên cứu khả năng kết hợp của các dòng ñể tìm kiếm các tổ hợp lai ưu tú, thử nghiệm các tổ hợp lai ở các vùng sinh thái khác nhau, xây dựng qui trình công nghệ sản xuất hạt giống cho từng giống ngô lai khi ñã ñược công nhận ñưa vào sản xuất

ðối với công tác nghiên cứu và chọn tạo giống ngô lai ba dòng thì trong những năm 1950-1960, dạng bất dục ñực tế bào chất T ñã trở thành nguồn nguyên liệu ñể sản

xuất hạt giống lai Tuy nhiên, CMS-T giảm hoàn toàn không sử dụng ñược vì mất mùa ñáng kể trong ngô bởi bệnh ñốm lá nhỏ năm 1970, CMS-T là rất dễ bị các chủng ñộc

tố T của Cochliobolus heterostrophus (giai ñoạn sinh bào tử của Bipolaris maydis).Tế bào chất của T cũng rất mẫn cảm với các ñộc tố của Mycosphaerella zeae - maydis (giai ñoạn sinh bào tử của Phyllosticta maydis ), các tác nhân gây bệnh của bạc lá ngô (Scheifele và Nelson, 1969) Thiệt hại từ dịch bệnh năm 1970 ước tính ñạt 700 triệu ha (Ullstrup, 1972) Kể từ khi dịch bệnh này, CMS-T không ñược sử dụng ñể sản xuất hạt giống lai Do vậy hiện nay người ta thường quan tâm tới dạng CMS-C và CMS-S trong nghiên cứu và chọn tạo giống ngô lai ba dòng Tuy nhiên cho tới nay rất ít các giống ngô ba dòng ñược ñưa vào sản xuất thực tiễn

Ở Việt Nam, trong 2 năm 2000 - 2001 Viện Nghiên cứu Ngô cũng bước ñầu thành công trong nghiên cứu sử dụng bất dục ñực tế bào chất ñể sản xuất thử hạt giống ngô lai, không phải rút cờ dòng mẹ nhằm giảm nhẹ công lao ñộng

ñể hạ giá thành sản xuất hạt giống Một số giống ngô lai sử dụng bất dục ñực tế bào chất như SC185, TN99-A1, Vn8960 ñã ñược thử nghiệm nhưng cho năng suất thấp, tính bất dục và hữu dục không ổn ñịnh, mẫn cảm với thời tiết Do vậy việc ñưa các giống ngô lai 3 dòng vào thực tiễn sản xuất là rất khó khăn Cho ñến nay cũng có một số nghiên cứu về chọn tạo giống ngô lai 3 dòng, tuy nhiên kết quả thu ñược chưa ñược hiệu quả

2.7 Tình hình nguyên cứu, ứng dụng và ưu ñiểm của chỉ thị phân tử trong chọn giống ngô lai

2.7.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống ngô lai ba dòng có sử dụng bất dục tế bào chất

Kể từ khi chỉ thị PCR ñược phát minh và ñược sử dụng từ những năm 1980, ñây là một kỹ thuật quan trọng ñược ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng Cho ñến nay nhiều chỉ thị ñã ñược phát hiện ra như chỉ thị SSR, ALP, STS,… nó ñã trợ giúp ñắc lực cho công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và ứng dụng trong công tác chọn tạo các dòng bố mẹ của ngô lai nói riêng ðối với ngô lai,

chỉ thị phân tử có ứng dụng lớn: Xác ñịnh các tính trạng cụ thể và bảo vệ nguồn tài nguyên di truyền của bố mẹ; lập bản ñồ di truyền và trợ giúp của chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ngô

Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với tính trạng kiểu hình ñã ñược sử dụng

ñể xác ñịnh các ñặc trưng của các dòng bố mẹ trong nghiên cứu ngô lai và ñể xác ñịnh tiềm năng ưu thế lai Chỉ thị phân tử ñã ñược sử dụng ñể lập bản ñồ một số gen quan trọng và ñịnh vị một số gen số lượng QTLs (Quantitative trait loci) thông qua liên kết di truyền Một số gen vô cùng quan trọng ñối với nghiên cứu và phát triển ngô lai như gen kiểm soát tính trạng phục hồi hữu dục; gen kiểm soát tính trạng bất dục ñực tế bào chất; gen tương hợp rộng ñã ñược ñịnh vị

Như vậy, từ những nghiên cứu trên chúng ta có thể thiết kế các cặp mồi và sử dụng phương pháp PCR ñể tìm nguồn gen này ở các giống ngô ñịa phương và nghiên

cứ sự ña dạng giữa các dạng CMS khác nhau tiện cho việc phân tích của một số lượng

lớn các mẫu (Liu et al., 2002) Nghiên cứu này cho thấy khi nhân bằng các mồi phát

hiện dạng CMS thì các kích thước các dạng CMS-C, CMS-T và CMS-S sẽ nhân lên các ñoạn DNA có kích thước 398bp, 440bp và799 bp

+ Marker phân tử như RFLPs và markers PCR ñược thiết kế vào các ñặc tính ñộc ñáo của khu vực mtDNA có thể ñược sử dụng cho phân biệt ngô loại CMS chính, nhanh hơn so với các thủ tục kiểm tra, qua truyền thống

2.7.2 Ưu ñiểm của việc sử dụng chỉ thị phân tử

- Chỉ thị phân tử và bản ñồ di truyền cho phép nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ: giữa tính trạng - gen - môi trường Do vậy, họ có thể dễ dàng ñưa ra một chiến lược thích hợp và chuẩn xác trong chương trình chọn giống của mình nhằm tìm kiếm, phát hiện những biến dị di truyền trong số các cá thể, giữa các giống trong loài

- Chỉ thị phân tử giúp các nhà chọn giống chọn lọc chính xác các tổ hợp gen quan tâm, Họ có thể quy tụ một số gen quý vào một giống ñã xác ñịnh

- Nó giúp các nhà chọn giống tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất ñịnh trong một thời gian ngắn

- Việc sử dụng chỉ thị phân tử giúp cho các nhà chọn giống rút ngắn ñược thời gian và giảm công sức, nâng cao hiệu quả chọn chọn lọc

Xuất phát từ những xu hướng và thực tiễn trên chúng tôi tiến hành ñề tài nghiên cứu này nhằm thể tìm ra ñược những chỉ thị DNA sử dụng hữu hiệu nhất, phù hợp với các giống của Việt Nam nhằm trợ giúp ñắc lực cho công tác chọn tạo ngô lai ba dòng

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu, thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu bao gồm:

- Các dịng CMS ngơ: C437JA, C836A, C437R và C437K Hai dịng duy trì cho C437JA

và C836A lần lượt là C437JB và C836B làm đối chứng để phát hiện gen duy trì

- 82 dịng ngơ tự phối đang được trồng và lưu trữ tại trung tâm Bảo tồn và Phát triển

nguồn gen cây trồng, ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

- 60 tổ hợp lai F1 giữa CMS và dịng tự phối

(Danh sách cụ thể của các dịng ngơ tự phối và các tổ hợp lai giữa chúng với các dịng

bất dục CMS được trích dẫn ở phần phụ lục)

Ngồi ra chúng tơi cịn sử dụng các dịng duy trì C437JB, C836B làm đối

chứng dương khi dùng chỉ thị phân tử phát hiện gen duy trì rf3 và rf4 trong tập đồn

các dịng ngơ tự phối nghiên cứu

Thiết bị:

- Chày cối sứ máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh điện di, máy li tâm, máy votex, tủ lạnh, lị vi sĩng,,,

- Các loại ống eppendoff, các loại pipet và đầu típ…

3.1.2 Thời gian nghiên cứu: Tháng 8/2013 đến tháng 5/2014

3.1.3 ðịa điểm nghiên cứu

ðề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm thuộc bộ mơn Sinh học phân tử và Cơng nghệ sinh học Ứng dụng- Khoa cơng nghệ sinh học và Khu thí nghiệm đồng ruộng, Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng, trường ðại học Nơng

nghiệp Hà Nội

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Lai thử các dòng CMS và các dòng ngô tự phối ựể tạo các tổ hợp lai F1 đánh giá khả năng phục hồi, duy trì của một số dòng ngô tự phối thông qua soi hạt phấn sau khi nhuộm với I-KI 1% và ựánh giá nảy mầm hạt phấn của các tổ hợp lai F1

- đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học của các dòng CMS, các dòng ngô tự phối và các tổ hợp lai F1 hữu dục của chúng

- Xác ựịnh khả năng chứa gen duy trì và phục hồi hữu dục của các dòng ngô tự phối bằng các chỉ thị phân tử DNA

3.3 Phương pháp nghiên cứu

+ Phân lân : 100kg P2O5 ( 625 kg supe lân)

+ Phân kali: 80 kg K2O ( 133,33 kg kaliclorua)

- Cách bón: Phân chuồng hoặc phân vi sinh và phân bón lót toàn bộ

Phân ựạm và kali bón thúc chia làm 3 ựợt:

+ Bón thúc ựợt 1: 1/3 N( 86,67 kg ure) + ơ kg K2O( 66,67 kali ) khi ngô ựược 3-5 lá + Bón thúc ựợt 2 : 1/3 N( 86,67 kg ure) + ơ kg K2O( 66,67 kali ) khi ngô ựược 7-9 lá + Bón thúc ựợt 3: Bón ựợt phân còn lại vào giai ựoạn xoắn nõn( trước trổ cờ 15 ngày)

3.3.2 Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học của các dòng CMS, các dòng ngô tự phối và F1 của chúng

Các chỉ tiêu ñánh giá ñặc ñiểm nông sinh học ñược tiến hành theo quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-56: 2001/BNNPTNT

- Ngày gieo

- Ngày mọc : Ngày có trên 50% số cây có bao lá mầm lên khỏi mặt ñất (mũi chông)

- Ngày tung phấn: Ngày có ≥ 50% số cây có hoa nở ñược 1/3 trục chính

- Ngày phun râu: Ngày có ≥ 50% số cây có râu nhú dài từ 2-3cm

- Ngày chín: Ngày có ≥ 75% cây có lá bị khô hoặc chân hạt có chấm ñen

- Chiều cao cây (cm): ðo từ gốc sát mặt ñất ñến phân ñốt bông cờ của 5-10 cây mẫu vào giai ñoạn chín sữa

- Chiều cao ñóng bắp (cm): ðo từ gốc sát mặt ñất ñến mắt ñóng bắp trên cùng (bắp thứ nhất) của 30 cây mẫu vào giai ñoạn chín sữa

- Số bắp/cây: Tổng số bắp/tổng số cây trên ô, ðếm số bắp và số cây trong ô lúc thu hoạch

- Chiều dài bắp (không kể lá bi) (cm): ðo từ ñáy bắp ñến mút bắp của 30 cây mẫu lúc thu hoạch, Chỉ ño bắp thứ nhất của cây mẫu

- ðường kính bắp (không kể lá bi) (cm): ðo ở giữa bắp của 5-10 cây mẫu lúc thu hoạch, Chỉ ño bắp thứ nhất

- Số hàng hạt/bắp: ðếm số hàng hạt ở giữa bắp của 5-10 cây mẫu lúc thu hoạch Chỉ ñếm bắp thứ nhất

- Số hạt/hàng: ðếm số hạt của hàng có chiều dài trung bình của bắp của 5-10 cây mẫu lúc thu hoạch Chỉ ñếm bắp thứ nhất

- Dạng hạt, màu sắc hạt: Quan sát 5-10 cây lúc thu hoạch

- Khối lượng 1000 hạt (g): Cân 8 mẫu, mỗi mẫu 100 hạt ở ñộ ẩm 14%, lấy 1 chữ số sau dấu phẩy

- Năng suất thực thu (tạ/ha)

3.3.3 Lai cưỡng bức các dòng CMS với các dòng ngô tự phối

Dùng các dòng CMS làm mẹ, bố là các dòng tự phối trong tập ựoàn nghiên cứu Chiều hôm trước(16h-19h) tiến hành bao cờ của dòng tự phối và bắp của CMS bằng bao cách ly Sáng (8h-9h) tiến hành lai, lấy phấn của dòng tự phối thụ phấn cho các dòng CMS (thao tác nhanh, cẩn thận) Ghi rõ công thức lai, ngày lai

Chọn những cây ựiển hình của giống, dùng bao cách ly bao cờ, bao bắp lại Cần bao trước khi cờ tung phấn và bắp phun râu (thông thường thì cờ sẽ tung phấn trước 2-

3 ngày thì râu mới phun)

Theo dõi sự xuất hiện của râu ngô, khi râu ngô nhú ra 3-4 cm thì tiến hành thụ phấn bằng cách ựem phấn của cờ dòng tự phối thụ cho bắp của CMS, sau ựó dùng bao lớn bao bắp và ghi công thức lai ngay trên bao

3.3.4 đánh giá khả năng bất dục, hữu dục các tổ hợp lai F1

để ựánh giá khả năng bất dục, hữu dục các tổ hợp lai F1 chúng tôi tiến hành ựánh giá khả năng bất dục và hữu dục của hạt phấn bằng các nhuộm I-KI 1%; ựánh giá khả năng nảy mầm của hạt phấn trên môi trường thạch theo Du He-Wei, 2010

Các phương pháp tiến hành như sau:

3.3.4.1 đánh giá khả năng bất dục và hữu dục của hạt phấn bằng các nhuộm I-KI 1%

Tiến hành pha I-KI 1% : 3g I2tinh thể, 18g KI, 1 lắt nước

Chọn thời ựiểm cây tung hạt phấn mạnh nhất thì lấy phấn vào sáng sớm cho vào túi sạch (ựã bao cách ly từ hôm trước) Lấy 0,1mg hạt phấn cho lên lam kắnh, sau ựó nhỏ

1 giọt I-KI 1% lên lam kắnh và ựậy lamen Soi trên kắnh hiển vi, ựếm 3 quang trường trên kắnh hiển vi và tắnh trung bình:

- Nếu hạt phấn căng tròn, màu xanh ựen và tỷ lệ ựó ựạt lớn hơn 80% thì tổ hợp ựó là tổ hợp hữu dục hạt phấn, ựồng nghĩa là dòng bố của các tổ hợp này có khả năng phục hồi hữu dục hạt phấn

- Nếu hạt phấn màu vàng, méo mó và tỷ lệ ựó lớn hơn 80% thì tổ hợp ựó là tổ bất dục hạt phấn, chứng tỏ là dòng bố của các tổ hợp này có khả năng duy trì bất dục hạt phấn

3.3.4.2 đánh giá khả năng nảy mầm của hạt phấn trên môi trường thạch

Chọn thời ựiểm cây tung phấn nhiều nhất thì lấy phấn (ựã bao cách ly từ hôm trước) Pha môi trường PMG (pH=6,2) hấp ở nhiệt ựộ 1210C, 1atm trong 15 phút, ựổ vào ựĩa peptri và bảo quản ở tủ 40C sau 12h thì bắt ựầu cấy Lấy 0,01mg hạt phấn trang ựều trên

bề mặt thạch (trang nhẹ tay) và ựể ở nhiệt ựộ phòng Sau ựó ựưa ra quan sát sau 2h, 4h, 8h, 24h Xem sự phát triển của ống phấn và tiến hành ựánh giá vào giai ựoạn 24h:

Nếu tỷ lệ nảy mầm ựạt 85% thì tổ hợp ựó hữu dục hạt phấn và chứng tỏ dòng

bố của các tổ hợp lai có khả năng phục hồi hạt phấn

Nếu tỷ lệ không nảy mầm ựạt trên 85% thì tổ hợp ựó bất dục hạt phấn và chứng

tỏ dòng bố của các tổ hợp lai có khả năng duy trì bất dục hạt phấn

Môi trường nảy mầm hạt phấn PMG

Hoá chất Nồng ựộ Khối lượng (V=200ml)

Quy trình tách chiết DNA tổng số theo (Saghai, 1984):

Bước 1: Thu ngắt mẩu lá mẫu khoẻ dài khoảng 2cm bỏ vào ống nghiệm có

dung tắch 1,5ml ựánh dấu tên giống rồi bỏ vào ựá lạnh

Bước 2: Trong phòng thắ nghiệm các cối sứ ựã ựược hấp khử trùng ựặt trong ựá lạnh Các mẩu lá ựược cắt nhỏ 0,5cm rồi bỏ vào cối sứ

Bước 3: Nhỏ 400ộl dung dịch chiết xuất ADN vào cối rồi lấy chày nghiền nhỏ mẩu lá

Bước 4: Nghiền nhỏ mẫu lá ñến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh ñen, chứng tỏ tế bào lá ñã vỡ và diệp lục ñược giải phóng ra

Bước 5: ðổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất ADN vào và trộn lẫn và chuyển 400µl vào ống nghiệm ñã ñược ñánh dấu, sau ñó ủ ở 650C trong 30 phút

Bước 6: ðổ vào ống nghiệm 800µl hỗn hợp Phenol : Chloroform : isoaminalchohol (25 : 24 :1) Sau ñó quay ly tâm 13,000 vòng/phút trong 5 phút 40C rồi chuyển phần dung dịch phía trên sang ống nghiệm mới ñã ñánh số theo cùng tên giống

Bước 7: Cho 400µl hỗn hợp chloroform: isoaminalchohol (24:1) vào ống nghiệm, sau ñó ly tâm 13,000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C

Bước 8: Cho 600µl ethanol (98%), trộn ñều sau ñó ly tâm 5 phút với tốc ñộ 13000 vòng/phút, ðổ phần dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa dưới ñáy ống nghiệm

Bước 9: Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt ñộ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm

Bước 10: Hoà tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt ñộ - 200C

Các cặp mồi sử dụng ñể phát hiện gen CMS, gen duy trì và phục hồi hữu dục