Nghiên cứu chuyển hóa saccharose thành FOS và tinh sạch FOS bằng phương pháp lọc nano

Để góp phần giải quyết vấn đề trên, luận án tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng, động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme Fructosyltransferase FTS và

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ HỒNG ÁNH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SACCHAROSE

THÀNH FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS)

VÀ TINH SẠCH FOS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC NANO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ HỒNG ÁNH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA SACCHAROSE

THÀNH FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS)

VÀ TINH SẠCH FOS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC NANO

Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm và đồ uống

Mã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm

Phản biện độc lập 2: PGS TS Lý Nguyễn Bình

Phản biện 1: GS TSKH Lưu Duẩn

Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng

Phản biện 3: PGS TS Mai Thanh Phong

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Đống Thị Anh Đào

2 TS Nguyễn Hữu Phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất cứ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu

đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

Lê Thị Hồng Ánh

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Sản xuất prebiotic và bổ sung prebiotic vào thực phẩm là xu hướng nổi bật của các nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm hiện nay trên toàn thế giới Một trong những prebiotic đã và đang được quan tâm nhiều là Fructooligosaccharides (FOS) Chính vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất FOS có độ tinh khiết cao, phù hợp với tiêu chuẩn chế biến thực phẩm từ nguồn nguyên liệu trong nước thật sự là vấn đề cần quan tâm và phát triển

Để góp phần giải quyết vấn đề trên, luận án tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng, động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme Fructosyltransferase (FTS) và nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng phương pháp lọc nano Luận án đã đạt được một số kết quả chính như sau:

1) Kết quả nghiên cứu lý thuyết

 Xây dựng được mô hình động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS

 Xác định được quy luật ảnh hưởng của một số thông số công nghệ đến khả năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nano và

đề xuất phương án lọc tuần hoàn kết hợp pha loãng để nâng cao độ tinh khiết của FOS

2) Kết quả nghiên cứu thực nghiệm

 Đã xác định các thông số động học của enzyme FTS bằng phương pháp giải thuật di truyền, giúp giảm thiểu số thí nghiệm, thời gian và chi phí khi nghiên cứu động học phản ứng enzyme, đặc biệt trong trường hợp phản ứng

có nhiều cơ chất

 Xây dựng được phương trình hồi quy thực nghiệm mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose ban đầu và tỷ lệ enzyme đến hiệu suất chuyển hóa saccharose thành FOS, từ đó xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp FOS

 Đã tối ưu hóa các thông số công nghệ của quá trình lọc nano bằng phương pháp vùng cấm và lựa chọn chế độ lọc tuần hoàn thích hợp để nâng cao độ tinh khiết của FOS đến 86,7%

Những kết quả trên bước đầu đã tạo tiền đề cho việc triển khai công nghệ, ứng dụng vào thực tế, đồng thời là nguồn tham khảo tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo trong cùng lĩnh vực

ABSTRACT OF THESIS

Nowadays, producing prebiotic and supplement prebiotic in food products is considered a worldwide prominent trend in food technology One of the most important prebiotics that has gotten interest is Fructooligosaccharides (FOS) Hence, the study of producing high purity for FOS that can meet the food processing standards from domestic materials must obviously be put into consideration

In order to solve the above issue, this dissertation aims to study the influencing factors, the kinetics of FOS synthesis from sucrose using Fructosyltransferase enzyme (FTS), and the improvement of purity for FOS by nanofiltration The major results are found as follows:

2) Experimental results

 The kinetic parameters of FTS enzyme by genetic algorithm method were determinated The result helped reduce the quantity of experiments, time and cost related to study of kinetics of FTS enzyme, especially in case of multiple substrates

 The regression equation which stimulates the effects of temperature, pH, initial sucrose concentration and rate of enzyme on the performance of transforming saccharose into FOS was established, from which the optimum conditions of FOS synthesis was proposed

 Main parameters of nanofiltration process were optimized by restricted area method Moreover, the optimum diafiltration mechanism was also set to increase the purity of FOS to 86.7%

These results have established beginning steps for the application of new technology into practice In addition, results found in this dissertation would be useful reference for coming research in the same field

LỜI CẢM ƠN

Luận án được hoàn thành là kết quả sự nỗ lực của bản thân cùng những giúp đỡ, động viên tinh thần của các thầy, cô, gia đình, đồng nghiệp, bạn bè

Với tất cả sự chân thành, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đống Thị Anh Đào

đã tận tình hướng dẫn, nâng bước tinh thần cho tôi trong suốt thời gian vừa qua; xin cảm ơn TS Nguyễn Hữu Phúc đã giúp đỡ, góp ý cho luận án

Tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bé nhỏ đã tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu, yên tâm làm việc, cảm ơn các con Vĩnh Liêm, Viên Phương và Thục Khuê

đã mang lại niềm vui và nhiệt tình cho mẹ

Đặc biệt, cảm ơn người bạn Như Nguyện đã sát cánh nghiên cứu cùng tôi, từng ngày từng ngày, dù đã ở thật xa, vẫn luôn hỗ trợ và động viên tôi hoàn thành luận án này

Tôi cũng xin cảm ơn Khoa Kỹ thuật Hóa học – Trường Đại học Bách khoa, tập thể đồng nghiệp khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM đã giúp đỡ và chia sẻ với tôi trong thời gian vừa qua

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT LUẬN ÁN ii

ABSTRACT OF THESIS iv

LỜI CẢM ƠN vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH 4

1.1 FOS và prebiotic 4

1.2 Các phương pháp tổng hợp FOS từ saccharose 8

1.3 Động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS 14

1.4 Các phương pháp nâng cao độ tinh khiết của FOS 19

1.5 Ứng dụng phương pháp giải thuật di truyền (GA - Genetic Algorithm) vào bài toán tìm kiếm và tối ưu 30

1.6 Những vấn đề tồn tại trong công nghệ sản xuất FOS 32

1.7 Hướng nghiên cứu và nội dung nghiên cứu của luận án 33

2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Nguyên liệu 36

2.2 Hóa chất 36

2.3 Màng lọc nano 37

2.4 Thiết bị 39

2.5 Phương pháp nghiên cứu 40

2.6 Phương pháp phân tích 41

3 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG VÀ ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG CHUYỂN HÓA SACCHAROSE THÀNH FOS BẰNG ENZYME FTS THU

NHẬN TỪ ASPERGILLUS FLAVIPES 43

3.1 Tổng hợp FOS từ saccharose bằng enzyme FTS 43

3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp FOS từ saccharose bằng enzyme FTS 44

3.3 Nghiên cứu động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS thu nhận từ Aspergillus flavipes 51

3.4 Đánh giá mức độ tương thích của mô hình toán học đã xây dựng với thực nghiệm 69

3.5 Kết luận 71

4 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO ĐỘ TINH KHIẾT CỦA FOS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC NANO 72

4.1 Nghiên cứu lựa chọn màng lọc nano để tinh sạch FOS 72

4.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng loại bỏ glucose, fructose và saccharose ra khỏi dung dịch FOS sau tổng hợp bằng phương pháp lọc nano 74

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức pha loãng trong quá trình lọc nano đến độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi FOS 99

4.4 Kiểm tra chất lượng, xác định tổng hiệu suất thu hồi sản phẩm FOS 85% 111

4.5 Kết luận 113

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114

5.1 Kết luận 114

5.2 Kiến nghị 115

6 CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 116

7 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Tỷ lệ tiêu thụ các loại prebiotic trên thế giới năm 2008 4

Hình 1.2 Cấu trúc của một số phân tử FOS 5

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống sản xuất FOS phổ thông (Neosugar G) và FOS cao độ (Neosugar P) sử dụng phương pháp lọc gel 13

Hình 1.4 So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình toán học và thực nghiệm 18

Hình 1.5 So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình của Lee và thực nghiệm với nồng độ saccharose ban đầu là 400g/L 19

Hình 1.6 So sánh kết quả dự đoán theo mô hình của Rocha và thực nghiệm 19

Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống phức hợp sản xuất FOS cao độ theo nghiên cứu của

Sheu và cộng sự 24

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống thí nghiệm với bình phản ứng có tích hợp bộ phận

lọc màng trong nghiên cứu của Nishizawa và cộng sự 26

Hình 2.1 Hệ thống thiết bị lọc nano sử dụng màng dạng cuộn xoắn 39

Hình 3.1 Quy trình tổng hợp FOS từ saccharose bằng enzyme FTS 43

Hình 3.2 Lưu đồ thuật toán xây dựng quần thể bằng phương pháp ngẫu nhiên 59

Hình 3.3 Lưu đồ thuật toán tìm nghiệm tối ưu bằng phương pháp giải thuật

di truyền 66

Hình 3.4 So sánh giữa mô hình động học phản ứng tổng hợp FOS bằng enzyme

FTS với thực nghiệm 70

Hình 4.1 Sơ đồ hệ thống thiết bị lọc nano 73

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ phân riêng và tốc độ dòng qua màng 77

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ tới độ phân riêng và tốc độ dòng qua màng 82

Hình 4.4 Cơ chế quá trình lọc nano 83

Hình 4.5 Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới độ phân riêng,tốc độ dòng qua màng 87

Hình 4.6 Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng và tốc độ dòng qua màng 90

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ nhập liệu tới tốc độ dòng (DS-5-DL) 99

Hình 4.8 Sự thay đổi của nồng độ các đường, độ tinh khiết của FOS, hiệu suất

thu hồi FOS theo số bước lặp đối với các phương thức pha loãng khác nhau

(màng DS-5-DL) 104

Hình 4.9 Sự thay đổi của nồng độ các đường, độ tinh khiết của FOS, hiệu suất

thu hồi FOS theo số bước lặp đối với các phương thức pha loãng khác nhau

(màng G5) 108

Hình 4.10 Sắc ký đồ FOS phổ thông và sản phẩm FOS cao độ 112

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tổng kết thị trường prebiotic trên thế giới giai đoạn 2004-2009 và

dự đoán giai đoạn 2009-2014 4

Bảng 1.2 Tỷ lệ bổ sung FOS vào một số thực phẩm 7

Bảng 1.3 Thông số động học của một số enzyme FTS 17

Bảng 1.4 So sánh các phương pháp tinh sạch FOS 28

Bảng 2.1 Chỉ tiêu chất lượng của đường saccharose 36

Bảng 2.2 Đặc tính của enzyme FTS 36

Bảng 2.3 Thông số kỹ thuật của màng M-N2514A5 37

Bảng 2.4 Thông số kỹ thuật của màng DS-5-DK 38

Bảng 2.5 Thông số kỹ thuật của màng DS-5-DL 38

Bảng 2.6 Thông số kỹ thuật của màng G5 38

Bảng 2.7 Thông số kỹ thuật của màng GM 39

Bảng 3.1 Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố trong quá trình chuyển hóa saccharose thành FOS sử dụng enzyme FTS 45

Bảng 3.2 Kết quả thực nghiệm theo ma trận TYT 24 45

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình tổng hợp FOS bằng enzyme FTS 50

Bảng 3.4 Quần thể được xây dựng bằng phương pháp ngẫu nhiên trong giai

đoạn 1 60

Bảng 3.5 Thông số động học của enzyme FTS thu nhận từ Aspergillus flavipes

xác định bằng phương pháp giải thuật di truyền 67

Bảng 4.1 Khả năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS của các màng 73

Bảng 4.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc nano (Màng DS-5-DL) 74

Bảng 4.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc nano (Màng G5) 75

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lọc nano 76

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nhập liệu đến quá trình lọc nano 81 Bảng 4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng nhập liệu đến quá trình

lọc nano 85

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất đến quá trình lọc nano 88

Bảng 4.8 Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố (màng DS-5-DL) 93

Bảng 4.9 Ma trận thực nghiệm toàn phần, k=2 và kết quả (màng DS-5-DL) 93

Bảng 4.10 Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố (màng G5) 94

Bảng 4.11 Ma trận thực nghiệm toàn phần, k=2 và kết quả (màng G5) 95

Bảng 4.12 Bố trí thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng 100

Bảng 4.13 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức CVD (Màng DS-5-DL) 101

Bảng 4.14 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức

VVD 0,95:1 (Màng DS-5-DL) 102

Bảng 4.15 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức

VVD 0,90:1 (Màng DS-5-DL) 103

Bảng 4.16 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức

CVD (Màng G5) 105

Bảng 4.17 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức

VVD 0,95:1 (Màng G5) 106

Bảng 4.18 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức

VVD 0,9:1 (Màng G5) 106

Bảng 4.19 Kết quả thí nghiệm lọc tuần hoàn có pha loãng theo phương thức

VVD 0,85:1 (Màng G5) 107

Bảng 4.20 Số bước lặp trong các phương thức pha loãng 110

Bảng 4.21 Hiệu suất thu hồi FOS trong các phương thức pha loãng 110

Bảng 4.22 Các phương thức pha loãng có thể áp dụng để tinh sạch FOS 111

Bảng 4.23 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm FOS 85% 111

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng Việt

RO Quá trình lọc thẩm thấu ngược

SCFA Acid béo mạch ngắn

MỞ ĐẦU

Fructooligosaccharides (FOS) ngày càng được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào thực phẩm như sữa, bánh kẹo…vì những đặc tính sinh học có lợi cho cơ thể con người Các nhà khoa học đã chứng minh FOS có khả năng cải thiện hệ vi sinh vật hữu ích

trong đường ruột (Bifidobacteria, Lactobacilli), ít gây sâu răng, giảm lượng

triglycerides trong máu, tăng khả năng hấp thu canxi cho cơ thể… nên có tác dụng tốt đối với trẻ em, người già, các bệnh nhân tiểu đường, béo phì, mỡ máu…[1], [2], [3], [4]

Tại Việt Nam, người tiêu dùng đã quen với một số thực phẩm được bổ sung FOS như sữa bột Ensure, Nestle, Dielac, một số loại bánh (Kinh Đô, Bibica), kẹo… Mặc dù nhu cầu tiêu thụ FOS tại Việt Nam rất cao nhưng hiện nay thị trường sản xuất FOS trong nước chưa phát triển, các nhà máy vẫn sử dụng 100% sản phẩm FOS ngoại nhập từ các hãng Orafti (Bỉ), Meiji Seika Kaisha (Nhật)… Cũng chính vì vậy, nghiên cứu công nghệ sản xuất FOS từ saccharose và sản xuất ở quy mô pilot đã được chính phủ quan tâm và đưa vào nội dung chính trong chương trình nghiên cứu trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020 (quyết định số 61/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng chính phủ ký ngày 7/5/2007) Do đó, việc nghiên cứu quá trình chuyển hóa saccharose thành FOS và tinh sạch để thu được FOS có độ tinh khiết cao (>75%), từ nguyên liệu sẵn có trong nước, thay thế FOS nhập ngoại, là vấn đề thực sự cần thiết,

có ý nghĩa khoa học, có giá trị thực tiễn và tính xã hội cao

Mục tiêu của luận án:

(1) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học phản ứng chuyển hóa

saccharose thành FOS bằng enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nhận từ Aspergillus

flavipes nhằm lựa chọn các thông số công nghệ thích hợp và thông qua mô hình hóa về

động học phản ứng, có thể dự đoán được nồng độ saccharose, glucose, fructose, FOS theo thời gian phản ứng, tăng khả năng chủ động điều khiển quá trình tổng hợp FOS

(2) Nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng phương pháp lọc nano,

khẳng định tính ưu việt của phương pháp này so với các phương pháp truyền thống như lên men, enzyme

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

(1) Đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ sản xuất FOS, bao gồm cả

chuyển hóa tạo FOS và tinh sạch đến độ tinh khiết 86%, phù hợp với tiêu chuẩn sử dụng cho thực phẩm Đặc biệt, đã chứng minh được cơ chế phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS thông qua mô hình động học và dữ liệu thực nghiệm Các kết quả thu được có ý nghĩa như những bước khai phá ban đầu để các nhà khoa học công nghệ khác tham khảo khi nghiên cứu về lĩnh vực này

(2) Đã xác định được các thông số công nghệ tối ưu và xây dựng mô hình toán

học mô tả động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS dưới dạng hệ phương trình vi phân Đây là cơ sở khoa học quan trọng cho việc tiến tới chủ động điều khiển quá trình tổng hợp FOS, hướng tới quy mô công nghiệp

(3) Lần đầu tiên đã ứng dụng thành công phương pháp giải thuật di truyền (GA –

Genetic Algorithm) để xác định các thông số động học của enzyme FTS và tối ưu hóa thông số công nghệ của quá trình lọc nano bằng phương pháp vùng cấm Thành công bước đầu này đã chứng minh một cách thuyết phục rằng ứng dụng lý thuyết toán học vào giải quyết các vấn đề của khoa học công nghệ sẽ mang lại hiệu quả tốt, chính xác, rút ngắn khoảng cách giữa toán học với các ngành khoa học công nghệ

(4) Đã xác định được quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ, lưu lượng, áp

suất đến khả năng phân riêng monosaccharides, saccharose, FOS bằng màng lọc nano

và xác lập được chế độ lọc nano thích hợp nhằm nâng cao độ tinh khiết của FOS

(5) Việc ứng dụng thành công màng lọc nano để tách các cấu tử có kích thước

phân tử như glucose, fructose, saccharose… ra khỏi hỗn hợp nhiều cấu tử là gợi ý có sức thuyết phục các nhà khoa học Việt Nam trong việc nghiên cứu vật liệu nano ứng dụng vào thực tế sản xuất các quá trình của công nghệ cao như tinh sạch enzyme, kháng sinh, các hoạt chất sinh học…

Luận án được trình bày trong 115 trang, chia làm 5 chương bao gồm:

 Mở đầu (03 trang)

 Chương 1: Tổng quan, hướng nghiên cứu và nội dung chính (32 trang)

 Chương 2: Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

(07 trang)

 Chương 3: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme fructosyltransferase (FTS) thu nhận

từ Aspergillus flavipes (29 trang)

 Chương 4: Nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng phương pháp lọc nano (42 trang)

 Chương 5: Kết luận và kiến nghị (02 trang)

1 TỔNG QUAN, HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ NỘI DUNG CHÍNH

1.1 FOS và prebiotic

Prebiotic là nguồn thức ăn cho các vi sinh vật sống hữu ích trong đường ruột vật chủ Nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do

đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ

Trên thế giới có trên 400 sản phẩm prebiotic từ hơn 20 công ty sản xuất Ở châu

Âu, tổng doanh thu của thực phẩm chức năng vào năm 2005 là khoảng 8 tỷ euro, trong

đó phân đoạn prebiotic khoảng 87 triệu euro Khả năng sản xuất prebiotic ở châu Âu ước tính khoảng 30.000 tấn/năm, bao gồm Inulin, Oligofructose, Fructo-oligosaccharides (FOS), Galacto-oligosaccharides (GOS) và Lactulose, trong đó FOS chiếm 19,7% Thị trường oligosaccharides tăng trưởng khoảng 15% mỗi năm [5], [6]

Bảng 1.1 Tổng kết thị trường prebiotic trên thế giới giai đoạn 2004-2009 và dự

đoán giai đoạn 2009-2014 [7]

Năm Tổng doanh thu (triệu USD) Năm Tổng doanh thu (triệu USD)

Hình 1.1 Tỷ lệ tiêu thụ các loại prebiotic trên thế giới năm 2008 [6]

Các prebiotic được bổ sung nhiều vào thực phẩm là fructo-oligosaccharides (FOS), galacto-oligosaccharides (GOS), isomalto-oligosaccharides (IMO), inulin và oligosaccharides đậu nành [8] Trong số đó, FOS được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm bởi chúng có nhiều hoạt tính sinh học tốt cho cơ thể của người, dễ thu nhận

và phạm vi ứng dụng rộng rãi

Meiji Seika Co là công ty đầu tiên sản xuất FOS thương mại từ saccharose với

tác nhân là Aspergillus niger vào năm 1984 Sản phẩm được đưa ra thị trường Nhật

Bản với tên gọi Meioligo (Neosugar) Công ty này sau đó thiết lập một liên doanh với Beghin-Say của Pháp và sản xuất FOS với tên thương mại Actilight Ngoài ra, công ty Cheil Foods & Chemical của Hàn Quốc cũng đã sản xuất FOS ở quy mô công nghiệp

với tác nhân là các tế bào Aureobasidum pullulans cố định [5], [9], [10]

1.1.1 Định nghĩa, cấu tạo, nguồn gốc của FOS

FOS là các oligomer fructose với các nhóm fructosyl được gắn với saccharose ở

vị trí β-2.1, thường được mô tả bằng công thức GFn, trong đó G chỉ nhóm glucosyl và

F chỉ nhóm fructosyl, n là số nhóm fructosyl [11] Các dạng phổ biến nhất của FOS là 1-kestose (GF2), nystose (GF3) và 1F-fructofuranosyl nystose (GF4) [12]

FOS có nhiều trong các loại thực vật như hành, măng tây, lúa mì, lúa mạch, artichoke Jerusalem [13], chuối, mận, hành, hẹ tây, củ chicory [14] Quá trình trích ly FOS từ những nguồn này ở quy mô công nghiệp không có tính kinh tế do nồng độ FOS trong nguyên liệu rất thấp Vì lý do đó, FOS thương mại được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp từ sacharose hoặc thủy phân từ inulin [15]

Hình 1.2 Cấu trúc của một số phân tử FOS [16]

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của FOS

Một số tác giả khi nghiên cứu về tính chất hóa lý của FOS đều đưa ra kết luận chung là FOS có nhiều tính chất hóa lý tương tự saccharose như độ hòa tan, độ đông đặc, nhiệt độ sôi và các thông số về quá trình kết tinh [9], [17] Tuy vậy, khác với saccharose, FOS mang nhiều đặc tính sinh học ưu việt hơn Đây chính là đặc điểm khiến các nhà thực phẩm chú ý và tập trung khai thác loại đường này

FOS có khả năng gây sâu răng thấp hơn so với saccharose, do vi khuẩn

Streptococcus mutans trong khoang miệng gây sâu răng không sử dụng được FOS

[18] Ngoài ra Ikeda T (1990) [2] còn nghiên cứu cho thấy FOS không chỉ có khả năng phòng mà còn có khả năng chữa bệnh sâu răng Vì thế ngày nay nhiều nơi trên thế giới dùng FOS thay thế cho đường saccharose trong thành phần thức ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng

FOS không bị tiêu hóa ở ruột non nên đến được ruột già một cách nguyên vẹn Tại đây FOS bị lên men bởi hệ vi sinh vật trong ruột tạo thành những acid béo mạch ngắn (SCFA) như acid acetic, acid propionic, acid butyric làm cho FOS có tác dụng giống chất xơ: giảm táo bón, cải thiện tính chất của phân, cải thiện mỡ máu và ngăn chặn sự tổng hợp các chất thối rữa trong ruột Mặt khác, việc sử dụng FOS còn thúc đẩy quá trình hấp thu Ca, Mg, không làm tăng lượng đường trong máu do FOS không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột Vì vậy FOS thích hợp cho người già, phụ nữ và người bị bệnh tiểu đường [3], [4]

Tính an toàn của FOS đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác nhau (Hidaka và cộng sự, 1986; Clevenger và cộng sự, 1988; Tokunaga và cộng sự, 1989; Kolbye, 1992; Coussement, 1999) với kết quả là FOS không có nguy cơ gây ung thư Nhiều nghiên cứu tiến hành trên động vật và người cho thấy có rất ít tác dụng phụ liên quan tới việc sử dụng FOS [19] Các kết quả nghiên cứu độc tính đã chứng tỏ FOS không gây đột biến hoặc sinh quái thai và không tạo ra tác dụng phụ nghiêm trọng hoặc khả năng gây ung thư ở động vật sau khi hấp thu với liều lượng lên tới 15% trong chế độ ăn [20]

Bảng 1.2 Tỷ lệ bổ sung FOS vào một số thực phẩm [20]

FOS được bổ sung vào các loại thực phẩm như nước giải khát, các sản phẩm sữa, bánh kẹo, mứt, thức ăn gia súc [16] Trong mứt, FOS có thể được dùng làm chất tạo ngọt, sản phẩm có mức năng lượng thấp hơn khi so sánh với dùng saccharose Mặc dù các đặc điểm cảm quan tương tự nhau, sản phẩm bổ sung FOS có độ ngọt thấp hơn và cấu trúc mềm hơn Trong kem, FOS có thể được dùng với inulin để thay thế đường, tạo cảm giác ngon miệng [21]

Ở Nhật Bản, FOS được dùng phổ biến như chất tạo ngọt, chất điều vị, chất độn

và chất giữ ẩm, bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm như bánh quy, bánh ngọt, bánh

mì, kẹo, các sản phẩm sữa và một số loại nước giải khát thay thế saccharose Ngoài ra, FOS còn đuợc bổ sung vào một số loại thực phẩm chức năng để tăng cường sự phát triển của vi khuẩn có ích trong tuyến tiêu hóa [17]

1.2 Các phương pháp tổng hợp FOS từ saccharose

FOS được tổng hợp từ saccharose bằng phương pháp lên men với tác nhân là vi sinh vật hoặc enzyme theo phương thức liên tục hoặc không liên tục Trong phương pháp lên men không liên tục, người ta thường sử dụng tế bào vi sinh vật và enzyme tự

do, còn công nghệ cố định enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng đối với phương pháp liên tục [22], [23], [24]

Giải pháp cố định enzyme và cố định tế bào trong sản xuất FOS cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất được liên tục, tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ v.v… nhưng tính

ổn định kém và cần máy móc, thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn Mặc dù vậy, đây lại là phương pháp có khả năng công nghiệp hóa cao và được tập trung nghiên cứu nhiều ở các nước có nền công nghiệp phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc Phương pháp không liên tục có kỹ thuật sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền hơn phương pháp liên tục Vì vậy, phương pháp này được sử dụng nhiều ở các qui mô nhỏ, đầu tư thấp [25]

1.2.1 Sử dụng tác nhân là tế bào vi sinh vật

Vi sinh vật thường được sử dụng để chuyển hóa saccharose thành FOS là các

chủng có hoạt tính fructosyltransferase như: Aspergillus [26], [27], [28],

Aureobasidum [24], Fusarium [29] và Penicillium [30], trong đó Aspergillus được sử

dụng phổ biến nhất

1.2.1.1 Sử dụng tế bào vi sinh vật tự do

Sangeetha và cộng sự [28] dùng tế bào Aspergillus oryzae CFR 202 để tổng hợp

FOS với cơ chất là dung dịch saccharose 60% trong điều kiện nhiệt độ 550C và pH 5,15 Hiệu suất thu nhận FOS đạt 53% (g FOS/g saccharose)

Trong một nghiên cứu khác, Aspergillus sp N74 có hoạt tính fructosyltransferase

đã được Oscar và các cộng sự [27] dùng để tổng hợp FOS trong thiết bị phản ứng có

khuấy trộn cơ học với hai nồng độ sinh khối của Aspergillus sp N74 là 6 và 9,5g/L

Các điều kiện phản ứng là nhiệt độ 600C, pH 5,5, nồng độ saccharose ban đầu là 70% (w/v) và thời gian phản ứng 26 giờ Kết quả thu nhận được cho thấy hiệu suất tổng hợp FOS cũng như thành phần của sản phẩm FOS phụ thuộc vào nồng độ sinh khối và thời

gian phản ứng Thời gian phản ứng tối ưu cho quá trình tổng hợp FOS ứng với nồng độ sinh khối 6 và 9,5g/L lần lượt là 24 giờ và 4 giờ (nồng độ FOS tương ứng là 378 và 427g/L) Nồng độ sinh khối 9,5g/L tổng hợp được 1-β-fructofuranosylnystose, trong khi đó sản phẩm FOS tổng hợp với nồng độ cơ chất 6g/L không có thành phần này Các tác giả cũng khẳng định rằng thiết bị phản ứng thiết kế trong đề tài và enzym

fructosyltransferase được sản xuất từ Aspergillus sp N74 nguyên bản có thể là phương

án sản xuất FOS ở quy mô công nghiệp

Ngoài Aspergillus, một số loại tế bào vi sinh vật tự do khác cũng được sử dụng

để tổng hợp FOS Prata và cộng sự (2010) [30] đã nghiên cứu tổng hợp FOS từ

Penicillium expansum ở nhiệt độ 22 – 25°C, sau 12 giờ thu được 0,58g FOS/g

saccharose Kết quả này đã khẳng định tiềm năng của chủng Penicillium expansum

trong sản xuất FOS

1.2.1.2 Sử dụng tế bào vi sinh vật cố định

Đối với công nghệ cố định tế bào, một số chất mang có hiệu quả cao đã được nghiên cứu là calcium-alginate [31], [32], gluten [33], lõi bắp [34]

Nhiều nhà khoa học đã cố định tế bào vi sinh vật trên gel calcium alginate để

tổng hợp liên tục FOS như Feng, Bo với Aspergillus niger AS0023 [31] và Sanchez với Aspergillus sp N74 [32] Bằng khảo sát thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số

nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose ban đầu, kết quả cho thấy có thể đạt hiệu suất tổng

hợp FOS lên đến 53% w/w (Aspergillus niger AS0023) và 50% w/w (Aspergillus sp

N74)

Việc tổng hợp FOS từ saccharose sử dụng công nghệ cố định tế bào Aspergillus

japonicus (có hoạt tính β-D-fructofuranosidase) đã được nghiên cứu với chất mang là

gluten (Chien, 2001) và lõi bắp (Mussatto, 2009) Chien và cộng sự chứng minh rằng tốc độ phản ứng tăng theo nồng độ tế bào trong mạng gluten và giá trị tối ưu đạt được khi nồng độ tế bào là 20% (w/w), nồng độ ban đầu của dung dịch saccharose là 400g/L, thời gian phản ứng 5 giờ, hiệu suất tổng hợp FOS đạt 61% [21], [35] Kết quả

thực nghiệm khi cố định Aspergillus japonicus ATCC 20236 trên lõi bắp cho thấy với

nồng độ saccharose ban đầu là 200g/L, hiệu suất tổng hợp FOS cao hơn so với khi dùng tế bào tự do, đạt 0,66g/g dựa trên tổng cơ chất, 0,73g/g dựa trên cơ chất tiêu thụ [34]

1.2.2 Sử dụng xúc tác là enzyme

Ngoài tác nhân tế bào vi sinh vật tự do hoặc cố định, để chuyển hóa saccharose thành FOS, có thể dùng xúc tác enzyme β-fructofuranosidase, còn gọi là invertase (EC 3.2.1.26) hoặc fructosyltransferase (E.2.4.1.9) có ở thực vật và vi sinh vật [36] Việc

sử dụng enzyme của thực vật không hiệu quả khi sản xuất ở quy mô lớn, do đó hiện nay chủ yếu dùng enzyme của vi sinh vật

Enzyme fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) được thu nhận từ nhiều loại vi sinh vật

như Aspergillus foetidus [37], Bacillus subtilis [38], Bacillus macerans [39], [40],

Streptococcus salivarius [41], Aureobasidium pullulans [42], [43], Aspergillus niger

[1], [44], Aspergillus japonicus [45], Aureobasidium sp [46], Aureobasidium

pullulans [47], Fusarium oxysporum [29] và các chủng Penicillium [8], [48]

Những thông số quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa saccharose thành FOS là nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose ban đầu, tỷ lệ enzyme xúc tác và thời gian lên men

Việc lựa chọn nhiệt độ và pH thích hợp cho phản ứng phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme Các điều kiện tối ưu được khuyến cáo cho quá trình tổng hợp FOS là nhiệt độ

55°C, pH 5,5 với enzyme từ Aureobasodium pullulans; nhiệt độ 60°C, pH 5 với enzyme từ Aspergillus niger; nhiệt độ 55 – 65°C, pH 5,0 – 6,0 với enzyme từ

Aspergillus japonicus [49]; nhiệt độ 40 – 50°C, pH 4 – 6 với enzyme từ Aspergillus flavipes [25] Hiệu suất lý thuyết của quá trình tổng hợp là 75% nếu chỉ tạo thành FOS

Tuy nhiên, do enzyme xúc tác bị ức chế bởi glucose được giải phóng ra nên hiệu suất

thực tế thấp hơn nhiều [50], chỉ đạt khoảng 60% khi dùng enzyme từ Aspergillus niger ATCC 20611 [1], [44] từ 53 đến 59% với enzyme từ Aureobasidium sp [46] và 54,3% với enzyme từ Aspergillus flavipes [25]

Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứu cho rằng nên chọn nồng độ saccharose ban đầu cao để giảm hoạt độ nước, vì vậy làm giảm nguy cơ nhiễm vi sinh trong quá trình tổng hợp và làm giảm chi phí cô đặc sản phẩm sau này [9], [49]

Quá trình tổng hợp FOS từ saccharose có thể được thực hiện theo phương thức liên tục bằng enzyme cố định hoặc phương thức không liên tục bằng enzyme tự do (enzyme hòa tan) Việc sử dụng enzyme tự do có một số nhược điểm như bị tổn thất hoạt tính enzyme trong quá trình vận hành, phải bất hoạt enzyme sau khi chuyển hóa,

hoạt tính thủy phân cao dẫn đến tạo nhiều fructose, giảm độ tinh khiết của FOS Điều này làm tăng chi phí sản xuất FOS [10], [21] Tuy nhiên, hiện nay sử dụng enzyme tự

do để tổng hợp FOS vẫn là phương pháp phổ biến nhất

1.2.2.1 Sử dụng enzyme tự do

Enzyme tự do β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) của Aspergillus sp 27H phân

lập từ đất đã được Fernandez và cộng sự (2004) [51] sử dụng để tổng hợp FOS Điều kiện tối ưu cho hoạt tính chuyển fructose là pH 5,5 – 6,0 và 60°C, trong khi hoạt tính thủy phân cao nhất tại pH 4,0 và 55°C Ở nồng độ saccharose thấp (10g/L), có sự chuyển hóa nhanh saccharose thành glucose và fructose, nồng độ FOS thu được rất thấp Ở điều kiện nồng độ saccharose 615g/L, tỷ lệ enzyme 20 U/g saccharose, nhiệt độ 40°C, pH 5,5, nồng độ FOS đạt giá trị tối đa 376g/L (234g/L 1-kestose và 142g/L nystose)

Enzyme -D-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) dưới dạng chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L của hãng Novozymes mang hoạt tính fructosyltransferase đã được nghiên cứu để tổng hợp FOS từ saccharose [52] và từ dịch mía [53] Từ saccharose (nồng độ 450g/L), sau 14 giờ phản ứng ở 65°C trong đệm natri acetate 0,05mol/L (pH 5,6), Hang Y.D [52] đã thu được FOS có nồng độ 272g/L (224g/L kestose và 48g/L nystose) với hiệu suất chuyển hóa hơn 70% dựa trên lượng saccharose tiêu thụ Trong đó, FOS, saccharose, glucose và frucrose chiếm 56,5%, 19,4%, 23,4% và 0,7% tổng lượng đường có trong sản phẩm Còn với cơ chất

là saccharose từ dịch mía, hoạt lực chuyển hóa của chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L là 58,1U/ml, nhiệt độ 40C, pH 5,6 và tỷ lệ enzyme/dịch đường mía là 2:100 (v/v), dung dịch FOS sau tổng hợp có thành phần gồm: FOS 50,4%; saccharose 10,4%; fructose 3,9% và glucose 35,3% [53]

Năm 2007, Yoshikawa và cộng sự [50] sử dụng chế phẩm enzyme thô

β-fructofuranosidase thu nhận từ Aureobasidium pullulans DSM 2404 trong các nghiên

cứu chuyển hóa saccharose thành FOS và đã đạt hiệu suất tổng hợp FOS 62% Giá trị

này cao hơn so với khi dùng các chủng Aureobasidium sp khác (53 – 59%)

Ngoài ra, xúc tác là inulinase từ Kluyveromyces marxianus cũng đã được Risso

(2009) [54] và Santos (2007) [55] nghiên cứu thông qua việc xác định các điều kiện tối

ưu của quá trình tổng hợp FOS từ saccharose (nhiệt độ, pH, nồng độ saccharose, hoạt tính inulinase, tỷ lệ dung môi hữu cơ) bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Hiệu suất chuyển hóa FOS tối đa đạt 16,7±1,1% (w/w) đối với hệ nước – dung môi hữu cơ (ở nhiệt độ 40°C; pH 6,0; nồng độ saccharose 55%; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml;

tỷ lệ dung môi hữu cơ/tổng hệ thống là 25/100), đạt 12,8±1,0% (w/w) đối với hệ nước (ở nhiệt độ 40°C; pH 5,0; nồng độ saccharose 55%; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml) [54] Trong thiết bị phản ứng có cánh khuấy của Santos và cộng sự (2007), ở điều kiện tối ưu (nhiệt độ 50°C; pH 6,0; nồng độ saccharose 450g/L; hoạt lực enzyme inulinase 4U/ml) thu được sản phẩm cuối cùng bao gồm fructose (155g/L), glucose (155g/L), saccharose (132g/L) và FOS (50g/L) [55]

Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, enzyme fructosyltranferase đã được Trịnh Thị

Kim Vân và cộng sự [25] nghiên cứu sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus flavipes

VVTP84 và ứng dụng trong sản xuất FOS Tác giả đã tối ưu hóa các thông số công nghệ theo mô hình bậc 1 với các biến là nồng độ saccharose, tỷ lệ enzyme, thời gian phản ứng (cố định nhiệt độ 50C, pH5) và hàm mục tiêu là nồng độ FOS tạo thành Kết quả thu được sản phẩm FOS phổ thông có độ tinh khiết cao nhất 54,3% khi dùng

cơ chất là saccharose 54%, tỷ lệ enzyme 8U/g saccharose, thời gian phản ứng 12 giờ Dựa trên phương pháp khảo sát từng yếu tố, Nguyễn Hoàng Anh (2008) [56] cũng đã xác định điều kiện tối thích cho quá trình sản xuất FOS từ dịch mía bằng enzyme FTS của Viện Công nghiệp thực phẩm là thời gian 15 giờ, tỷ lệ enzyme 0,02, nhiệt độ 500C, pH 5,0 Sản phẩm FOS thu được gồm: FOS (61,48%), saccharose (10,10%), glucose (26,29%), fructose (2,13%)

Ở quy mô công nghiệp, FOS được tổng hợp từ saccharose dưới tác dụng xúc tác của enzyme fructosyltransferase (EC 2.4.1.9) hoặc β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26)

thu nhận từ các loại vi sinh vật như Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, …

(Hình 1.3) Enzyme được thêm vào dung dịch saccharose 50 – 60% (w/v) ở pH 5,5 –

6 Sau phản ứng từ 4 – 20 giờ ở nhiệt độ 50 – 600C, hỗn hợp đường chứa FOS, glucose

và saccharose dư được gia nhiệt tới 900C trong 30 phút để bất hoạt enzyme; làm nguội xuống dưới 500C; lọc; khử màu, mùi bằng than hoạt tính; khử muối bằng cột nhựa trao đổi ion và cô đặc chân không tới 75% chất khô FOS phổ thông thu được là Neosugar

G có độ tinh khiết 60% (w/w) [3]

Sơ đồ hình 1.3 là quy trình sản xuất FOS phổ thông (sản phẩm Neosugar G có độ tinh khiết của FOS đạt 60% w/w) và FOS cao độ (sản phẩm Neosugar P có độ tinh khiết của FOS đạt 95% w/w)

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống sản xuất FOS phổ thông (Neosugar G) và FOS cao độ

(Neosugar P) sử dụng phương pháp lọc gel [3]

1.2.2.2 Sử dụng enzyme cố định

Các nghiên cứu về cố định enzyme và ứng dụng trong tổng hợp FOS đã được thực hiện với nhiều loại enzyme từ nguồn vi sinh vật khác nhau như Pectinex Ultra

SP-L (từ Aspergillus aculeatus) [36], enzyme fructosyltransferase (từ Aureobasidium

pullulans) [57], enzyme β-fructofuranosidase (từ Aspergillus oryzae) [58] Kết quả cho

thấy các điều kiện tối ưu như pH, nhiệt độ không bị ảnh hưởng do việc cố định enzyme

và sản phẩm FOS thu được khi dùng enzyme cố định giống như khi dùng enzyme hòa tan Mặt khác, enzyme cố định ổn định hơn ở pH, nhiệt độ cao [57], [59]

Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh enzyme -D-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) dưới dạng chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L của hãng Novozymes có thể được cố định hiệu quả trên các chất mang như Sepabeads EC-EP3, Sepabeads EC-EP5 [36] và Eupergit C [59] mà không cần thêm muối hoặc dung dịch đệm Khi cố định trên polymer polymethacrylate (Sepabeads-EC) hoạt hóa với nhóm epoxy như Sepabeads EC-EP3, Sepabeads EC-EP5, với cơ chất là dung dịch

saccharose nồng độ 630g/L, nồng độ FOS đạt giá trị tối đa 387g/L sau 36 giờ (240g/L 1-kestose, 144g/L nystose và 3g/L 1F- fructofuranosyl nystose) [36] Nghiên cứu về chất mang Eupergit C của Tanriseven và Aslan (2005) [59] cho thấy sau khi cố định, hoạt tính tương đối của enzyme đạt 96%, các điều kiện tối ưu như pH 5,5 – 6,5, nhiệt độ 650C không bị ảnh hưởng do việc cố định enzyme Enzyme cố định không giảm hoạt tính sau 20 lần phản ứng gián đoạn Nồng độ FOS tổng hợp được trong nghiên cứu này đạt khoảng 57% (w/w) với nồng độ dung dịch saccharose ban đầu là 60% (w/v), tương đương với việc sử dụng enzyme Pectinex Ultra SP-L ở dạng tự do

Yun và cộng sự (1996) [57] đã tổng hợp FOS liên tục từ saccharose với xúc tác là

enzyme FTS từ Aureobasidium pullulans cố định trên nhựa có tính xốp cao, Diaion

HPA 25 Ở các điều kiện tối ưu tương tự như khi sử dụng enzyme tự do (nhiệt độ 55°C, pH 5,5, nồng độ saccharose ban đầu là 600g/L), sản phẩm thu được khi dùng enzyme cố định giống như khi dùng enzyme tự do Khoảng 8% hoạt tính của enzyme

cố định bị tổn thất sau 30 ngày vận hành liên tục, năng suất đạt được là 1174g/L.h Trong một nghiên cứu khác của Kurakake và cộng sự (2010) [58], enzyme β-

fructofuranosidase (sinh tổng hợp từ Aspergillus oryzae) được cố định trên nhựa trao

đổi anion (WA-30; polystyrene với amine bậc ba) Từ dung dịch saccharose 60%, nhiệt độ phản ứng 550C, thu được FOS có độ tinh khiết 51,9% Hoạt tính enzyme cố định duy trì được trong 984 giờ

1.3 Động học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS 1.3.1 Cơ chế phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS

Phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS rất phức tạp Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về cơ chế của phản ứng chuyển hóa này nhưng cho đến nay vẫn chưa có kết quả thống nhất

Hầu như các cơ chế phản ứng đã công bố đều dựa trên 3 phản ứng chuyển hóa (1.1), (1.2), (1.3) do Jung và cộng sự [60] công bố vào năm 1989 thông qua quá trình nghiên cứu phản ứng tổng hợp FOS bằng enzyme FTS với nhiều cơ chất khác nhau

Chú thích: G là glucose, GF là saccharose, GF2 là 1-kestose, GF3 là nystose, GF4

là fructofuranosyl nystose

Jung đã nhận thấy khi dùng glucose, fructose làm cơ chất thì không có phản ứng enzyme xảy ra Khi saccharose (GF) được dùng làm cơ chất cho phản ứng enzyme (phản ứng 1.1), chỉ có glucose (G) và 1-kestose (GF2) được tạo thành Tỷ lệ glucose/1-kestose là 1/1 chứng tỏ cơ chế phản ứng không đối xứng, nghĩa là saccharose đóng cả vai trò chất cho và chất nhận nhóm fructosyl Do đó 1 mol glucose và 1 mol 1-kestose được tạo thành đồng thời từ 2 mol saccharose Tương tự với cơ chất khác như 1-kestose và nystose (phản ứng 1.2, 1.3), saccharose (GF) và nystose (GF3) được tổng hợp từ 1-kestose (GF2), trong khi 1-kestose (GF2) và fructofuranosyl nystose (GF4) được tạo thành từ nystose (GF3) Phản ứng enzyme với fructofuranosyl nystose là cơ chất không xảy ra, có lẽ là do giá trị vận tốc cực đại Vmax nhỏ và giá trị hằng số Michaelis – Menten Km lớn [60] Vì vậy, có thể trình bày tổng quát các phản ứng chuyển fructosyl như sau:

GFn + GFn → GFn+1 + GFn-1 , trong đó n=1-3 [60], [61] (1.4) Tuy nhiên, cơ chế của Jung đề xuất không giải thích được sự tạo thành một lượng nhỏ fructose trong quá trình tổng hợp FOS trên thực tế Vì vậy, ngoài 3 phản ứng chuyển hóa nêu trên, một số nhà khoa học đã bổ sung các phản ứng thủy phân vào cơ chế phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS bằng enzyme FTS, tiêu biểu là 4 phản ứng với cơ chế của Rocha [62] và 1 phản ứng thủy phân với cơ chế của Duan [63] Khi nghiên cứu về lập mô hình động học quá trình lên men tổng hợp FOS, Rocha [62] mô tả 7 phản ứng chính, trong đó có 4 phản ứng thủy phân (1.5, 1.6, 1.7, 1.8)

1-kestose rất nhỏ, có thể bỏ qua (do nồng độ của những cơ chất này đều > 5% trong hầu hết thời gian phản ứng), nhưng không bỏ qua hoạt tính thủy phân của nystose được, Duan và cộng sự [63] đã đề xuất cơ chế phản ứng tổng hợp FOS gồm 3 phản ứng chuyển hóa (từ 1.1 đến 1.3) và 1 phản ứng thủy phân nystose GF3 (phản ứng 1.7)

Ngoài các cơ chế phản ứng do Jung, Duan, Rocha đề xuất, Nishizawa [64] đã đưa

ra cơ chế gồm 6 phản ứng chuyển fructosyl (phản ứng 1.2, 1.2, 1.3, 1.9, 1.10, 1.11) Tuy nhiên, giống như cơ chế do Jung mô tả, cơ chế của Nishizawa cũng không giải thích được sự có mặt của fructose trong sản phẩm sau tổng hợp

Thông số động học của một số enzyme thường sử dụng trong nghiên cứu xây dựng mô hình toán học phản ứng chuyển hóa saccharose thành FOS được tổng hợp trong bảng 1.3 Các kết quả thực nghiệm này cũng cho thấy, việc tăng số đơn vị fructose trong cơ chất dẫn đến giảm Vmax và tăng Km

Bảng 1.3 Thông số động học của một số enzyme FTS

Jung cùng cộng sự (1989) [60] đưa ra mô hình toán học mô tả quá trình tạo thành

FOS từ saccharose dưới xúc tác enzyme fructosyltransferase từ Aureobasidium

pullulans là hệ 5 phương trình vi phân mô tả tốc độ phản ứng của mỗi thành phần

(saccharose, glucose, 1-kestose, nystose, fructofuranosyl nystose) trong phản ứng enzyme, sử dụng phương trình Michaelis – Menten được hiệu chỉnh để bao gồm sự ức chế cạnh tranh của glucose với cơ chất saccharose

Dựa trên kết quả này, Duan cùng cộng sự (1994) [63] đã phát triển cơ chế phản

ứng chuyển saccharose thành FOS bằng enzyme β-fructofuranosidase từ Aspergillus

japonicus bằng cách thêm phản ứng thủy phân nystose kết hợp các phản ứng chuyển

hóa Thông qua việc hiệu chỉnh phương trình Michaelis – Menten để bao gồm sự ức chế của cơ chất và sự ức chế cạnh tranh của glucose với các cơ chất khác nhau (saccharose, glucose, 1-kestose, nystose), Duan đã xây dựng mô hình toán học gồm 6 phương trình vi phân nhằm dự đoán sự biến đổi của nồng độ saccharose, glucose, fructose, 1-kestose, nystose, fructofuranosyl nystose Kiểm chứng thực nghiệm cho thấy có sự phù hợp tương đối giữa mô hình (đường liền nét) và thực nghiệm (điểm)

(a) (b)

Hình 1.4 So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình toán học và thực nghiệm (a) Nghiên cứu của Jung [60] (b) Nghiên cứu của Duan [63]

Với cơ chế và mô hình toán học tương tự như Duan, Alvarado-Huallanco [65] đã

nghiên cứu động học phản ứng tổng hợp FOS bằng enzyme FTS từ Rhodoturola sp tự

do và cố định Các kết quả cho thấy mô hình toán học đã đưa ra phù hợp thực nghiệm với hệ số tương quan R là 0,92

Năm 1999, Lee và cộng sự [61] đã nghiên cứu mô hình hóa đơn giản quá trình

tổng hợp FOS bằng enzyme fructosyltransferase từ Aspergillus japonicus cố định Dựa

trên cơ chế của Jung, kết quả dự đoán nồng độ cân bằng của tổng FOS, glucose, saccharose theo mô hình được so sánh với thực nghiệm và thể hiện trong hình 1.5

Hình 1.5 So sánh kết quả giữa dự đoán theo mô hình của Lee và thực nghiệm với

nồng độ saccharose ban đầu là 400g/L [61]

Trên cơ chế gồm 3 phản ứng chuyển hóa và 4 phản ứng thủy phân, Rocha và cộng sự [62] đã thiết lập mô hình động học tổng quát của quá trình tổng hợp FOS từ

saccharose với chủng nấm Aspergillus sp Nhóm tác giả đã xác định được 27 thông số

của mô hình từ số liệu thực nghiệm, đồng thời tiến hành nhiều thí nghiệm để so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả dự đoán theo mô hình (hình 1.6) Kết quả cho thấy

mô hình động học đã đưa ra có thể sử dụng để dự đoán quá trình sản xuất FOS

Hình 1.6 So sánh kết quả dự đoán theo mô hình của Rocha và thực nghiệm [62] 1.4 Các phương pháp nâng cao độ tinh khiết của FOS

FOS phổ thông thu được trong quá trình tổng hợp từ saccharose dưới tác dụng của vi sinh vật hoặc enzyme thường chỉ đạt độ tinh khiết 50 – 60%, còn lại hơn 40 – 45% là saccharose, fructose và glucose, trong đó glucose chiếm khoảng 25 – 30%

Nguyên nhân là glucose, sản phẩm phụ của phản ứng, có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme FTS dẫn đến giảm độ tinh khiết của FOS Vì thế muốn thu được FOS có độ tinh khiết cao (FOS cao độ) hoặc FOS tinh khiết, cần phải tách bỏ hoặc chuyển hóa lượng glucose, fructose và saccharose trong dung dịch sau tổng hợp [25] Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về việc nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng các phương pháp khác nhau, trong đó có thể chia thành 2 nhóm chính: phương pháp sinh hóa học (phương pháp lên men, phương pháp enzyme) và phương pháp vật lý (phương pháp sắc ký lọc gel, phương pháp lọc nano)

1.4.1 Các phương pháp sinh hóa học

1.4.1.1 Phương pháp lên men

Phương pháp này được thực hiện thông qua việc sử dụng vi sinh vật, thường là nấm men, để lên men saccharose, glucose, fructose có trong dung dịch FOS sau tổng hợp Quá trình lên men bằng vi sinh vật để loại bỏ saccharose, glucose, fructose có thể thực hiện đồng thời hoặc tiếp sau quá trình tổng hợp FOS [66]

Một số chủng vi sinh vật đã được sử dụng để nâng cao độ tinh khiết của FOS là

Pichia pastoris [67], Issatchenkia hanoiensis [68], Zymomonas mobilis [69]

Từ đặc điểm của Pichia pastoris có thể lên men monosaccharides nhưng không

lên men disaccharides và oligosaccharides, Yang Y và cộng sự (2008) [67] đã nghiên cứu thiết lập “phương pháp hai bước” để cải thiện độ tinh khiết FOS: tổng hợp FOS

với xúc tác là β-fructofuranosidase ngoại bào của Aspergillus japonicus và sau đó cấy

Pichia pastoris vào hỗn hợp Nấm men Pichia pastoris được cấy vào sẽ sử dụng gần

hết các đường đơn sau 12 giờ ở 30ºC làm tăng độ tinh khiết của FOS, phục hồi hoạt tính β-fructofuranosidase do không còn glucose có tác dụng ức chế Độ tinh khiết của FOS tăng từ 56,55 tới 84,45% (26,4% 1-kestose và 57,98% nystose) và khoảng 10% glycerol được tạo ra trong quá trình nuôi cấy Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này có khả năng áp dụng ở quy mô công nghiệp

Chủng nấm men HB1.3.13 (Issatchenkia hanoiensis) đã được Trịnh Thị Kim

Vân [68] sử dụng để loại bỏ đường glucose trong dịch đường FOS phổ thông Từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm, nhóm nghiên cứu đã tuyển chọn được

chủng nấm men HB1.3.13 (Issatchenkia hanoiensis) đặc hiệu có khả năng đồng hóa

glucose trong dịch đường FOS phổ thông Thông qua việc xác định điều kiện nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm men và dùng chúng để tinh sạch dịch FOS phổ thông, kết quả

là đã tăng độ tinh khiết của FOS từ 50% lên xấp xỉ 70%

Vi khuẩn Zymomonas mobilis lên men chủ yếu saccharose, glucose và fructose

Nó không có enzyme carbohydrase nên không thể thủy phân hầu hết oligosaccharides

Zymomonas mobilis lên men nhanh glucose và fructose thành ethanol và carbon

dioxide với rất ít sản phẩm phụ Các tế bào Zymomonas mobilis cố định đã được

Crittenden và cộng sự (2002) [69] nghiên cứu sử dụng để loại được 91% glucose ra khỏi hỗn hợp oligosaccharides sau 12 giờ Sản phẩm phụ của quá trình lên men là ethanol (14%), CO2 và một lượng nhỏ sorbitol Ethanol được tạo ra trong quá trình lên men có thể được loại bỏ khá dễ dàng trong quá trình sấy các sản phẩm oligosaccharides FOS không bị ảnh hưởng trong quá trình lên men

Phương pháp lên men bằng vi sinh vật có ưu điểm là thiết bị và vận hành đơn giản, hiệu quả kinh tế cao Tuy nhiên hệ thống hoạt động gián đoạn, thời gian lên men

để tinh sạch dài (>12 giờ) nên năng suất không cao và sản phẩm có lẫn tạp chất (glycerol, ethanol), có mùi vị lạ [66], [67], [69]

1.4.1.2 Phương pháp enzyme

Một trong các phương pháp nâng cao độ tinh khiết của FOS được nghiên cứu nhiều là dùng enzyme chuyển mono- và disaccharides thành một dạng khác để có thể tách dễ dàng ra khỏi hỗn hợp FOS Có hai loại enzyme được sử dụng để phân giải glucose là glucose isomerase (GI) và glucose oxidase [70]

Sử dụng enzyme GI

Trong phương pháp này enzyme GI xúc tác chuyển hóa glucose thành fructose

Về lí thuyết, fructose mới sinh ra lại gắn kết với saccharose để tạo thành FOS Nhưng thực tế cho thấy fructose mới tạo ra không có khả năng gắn kết với saccharose, 1-kestose hoặc nystose Do đó việc sử dụng enzyme GI chỉ có thể làm giảm glucose trong trong dung dịch FOS sau tổng hợp chứ không nâng cao độ tinh khiết của FOS được [25], [71]

Yoshikawa [50] đã nghiên cứu sử dụng enzyme GI để nâng cao độ tinh khiết của

FOS Chế phẩm enzyme thô β-fructofuranosidase thu nhận từ Aureobasidium

pullulans chuyển hóa được saccharose thành FOS phổ thông với hiệu suất tổng hợp

FOS đạt 62% Khi tiến hành phản ứng có bổ sung glucose isomerase (GI) với tỷ lệ fructofuranosidase/GI là 1/2, hiệu suất tổng hợp FOS đạt 69%

β-Sử dụng enzyme GOD

Đây là loại enzyme có hiệu quả nhất trong việc chuyển hóa glucose trong sản xuất FOS Dưới tác dụng của enzyme glucose oxidase, glucose chuyển hóa thành acid gluconic và được tách ra bằng phương pháp trao đổi ion (Yung và cộng sự, 1993), hoặc kết tủa bằng calcium carbonate (Sheu và cộng sự, 2002) Độ tinh khiết FOS có thể đạt 90% [72], [73]

Tuy nhiên sản phẩm phụ H2O2 của quá trình chuyển hóa glucose bằng xúc tác GOD lại ức chế hoạt động của enzyme GOD Vì vậy, có thể kết hợp hệ enzyme glucose oxidase – catalase (GOD – CAT) để nâng cao độ tinh khiết của FOS với vai trò của GOD là chuyển hóa glucose và CAT là loại bỏ H2O2 Trong một nhánh của đề tài cấp Nhà nước mã số KC 04-07, Trịnh Thị Kim Vân và cộng sự [25] đã nghiên cứu

sử dụng hệ enzyme GOD/CAT để nâng cao độ tinh khiết của FOS Với nồng độ saccharose ban đầu 32%, nồng độ enzyme GOD là 17U, tỷ lệ GOD/CAT là 0,085, nhiệt độ 300C, pH 5, thời gian 13 giờ, độ tinh khiết của FOS được nâng từ 54,3% lên 78%

Tương tự như trường hợp lên men bằng vi sinh vật, có thể tiến hành chuyển hóa glucose bằng enzyme GOD đồng thời hoặc sau khi tổng hợp FOS phổ thông bằng enzyme FTS Việc sử dụng đồng thời enzyme FTS và GOD cho hiệu quả tốt do tác nhân ức chế hoạt động của enzyme FTS là glucose sẽ được chuyển hóa ngay bằng enzyme GOD, nhờ đó enzyme FTS lại tiếp tục hoạt động hiệu quả để chuyển hóa saccharose thành FOS

Theo nghiên cứu của Yun và cộng sự (1993) [74], có thể đạt được độ tinh khiết của FOS là 90% khi sử dụng hệ enzyme hỗn hợp fructosyltransferase và glucose oxidase trong thiết bị có sục khí và đảo trộn với nồng độ saccharose 40% (w/v), tỷ lệ enzyme là 10U fructosyltransferase và 10U glucose oxidase/g saccharose, thời gian 25 giờ, nhiệt độ 40ºC và pH 5,5

Sirisansaneeyakul và cộng sự (2000) [75] nghiên cứu tăng hiệu quả tổng hợp FOS từ saccharose với xúc tác là hệ hỗn hợp enzyme -fructofuranosidase (từ

Aspergillus niger ATCC 20611) và glucose oxidase trong thiết bị phản ứng có thể tích

2L với các điều kiện nồng độ saccharose ban đầu 400g/L, tỷ lệ enzyme là 10U fructofuranosidase và 15U glucose oxidase/g saccharose, nhiệt độ 40ºC, pH 5,5; tỷ lệ sục khí 1vvm và đảo trộn 550 vòng/phút trong 32 giờ Kết quả hiệu suất tổng hợp kestose (YGF2/S), nystose (YGF3/S) và năng suất (QGF2/S và QGF3/S) là 0,44; 0,49g/g và 4,97; 5,44 g/L.h

-Sheu và cộng sự (2001) [76] cũng nghiên cứu sử dụng một hệ hỗn hợp enzyme gồm -fructofuranosidase (thu nhận từ Aspergillus japonicus) và glucose oxidase

(Gluzyme, Novo Nordisk) để tổng hợp FOS cao độ từ saccharose Phản ứng được tiến hành trong thiết bị phản ứng có cánh khuấy và sục khí, điều chỉnh pH 5,5 bằng CaCO3 Glucose, chất ức chế enzyme -fructofuranosidase, được chuyển hóa thành acid gluconic dưới tác dụng của enzyme glucose oxidase, sau đó được kết tủa thành calcium gluconate Sản phẩm thu được gồm FOS với độ tinh khiết 90% (w/w), còn lại

là glucose, saccharose và một ít calcium gluconate

Giống như tổng hợp FOS phổ thông, công nghệ tinh sạch FOS bằng phương pháp enzyme có thể thực hiện bằng hai phương pháp là cố định và không cố định enzyme Hầu hết các nghiên cứu đã chọn hệ enzyme FTS, GO và catalase (CAT), cố định trên chất mang như calcium alginate và hạt trao đổi ion Với công nghệ này Yun đã sản xuất được FOS có độ tinh khiết cao hơn 90 % [24], còn Bo Jiang đã kết hợp cố định tế

bào nấm mốc Aspergillus niger AS0023 với GO và GI để tạo thành FOS có độ tinh

khiết 72% [71] Ngoài ra, bằng phương pháp không liên tục với hệ enzyme GO – CAT, Lamia cũng đã xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của hệ enzyme trên và nâng cao được độ tinh khiết của FOS phổ thông từ 50% lên 82% [77] Trong một

nghiên cứu khác, Lin và cộng sự (2008) [78] sử dụng tế bào Aspergillus japonicus

(mang hoạt tính -fructofuranosidase) và Aspergillus niger (có hoạt tính glucose

oxidase) cố định trong calcium alginate để sản xuất FOS cao độ từ saccharose Kết quả độ tinh khiết của FOS đạt 90% (w/w), cao hơn nhiều so với độ tinh khiết của FOS phổ

thông là 55% nếu chỉ dùng Aspergillus japonicus

Sheu và cộng sự (2002) [73] còn nghiên cứu sản xuất FOS cao độ từ dung dịch saccharose 30% (w/v) và pH 5,5 trong hệ thống thiết bị phản ứng có bộ vi lọc (MF)

hoạt động liên tục (hệ complex cell) Hệ thống dùng tế bào Aspergillus japonicus CCRC 93007 hoặc Aureobasidium pullulans ATCC 9348 với hoạt tính β-

fructofuranosidase và gluconobacter oxydans ATCC 23771 với hoạt tính glucose dehydrogenase Ở điều kiện nhiệt độ 30ºC, mức độ thông khí 5vvm, độ tinh khiết của FOS đạt hơn 80%, còn lại là glucose 5 – 7%, saccharose dư 8 – 10% (tính trên chất khô) và một lượng nhỏ calcium gluconate Hệ thống có thể hoạt động liên tục với năng suất tổng hợp FOS hơn 160g/L.h

Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống phức hợp sản xuất FOS cao độ theo nghiên cứu của

Sheu và cộng sự [73]

Khi so sánh với hệ hai enzyme gián đoạn (không có lọc màng) có thể đạt được độ tinh khiết của FOS 90%, hệ thống phức hợp chỉ tổng hợp được FOS có độ tinh khiết 87%, nhưng ưu điểm nổi bật của hệ thống này là có thể hoạt động liên tục và tiết kiệm enzyme, sức lao động, có tính kinh tế hơn hệ hai enzyme do hoạt tính enzyme được duy trì trong 6 ngày [73]

Phương pháp enzyme có thể nâng cao độ tinh khiết của FOS nhưng có nhược điểm là chi phí cao do glucose oxidase đắt tiền, dễ bị mất hoạt tính bởi nhiệt [73] và sản phẩm bị lẫn tạp chất (ngoài FOS còn lại là glucose, sacharose và một lượng nhỏ calcium gluconate) [76] Mặt khác, khi glucose oxidase xúc tác quá trình chuyển hóa glucose thành acid gluconic, pH của phản ứng giảm nhanh, do đó phải điều chỉnh pH

tự động trong quá trình phản ứng (phương pháp potentionmetric) [25]

1.4.2 Các phương pháp vật lý

1.4.2.1 Phương pháp sắc ký lọc gel

Phương pháp này đã được đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp tại Nhật Bản (hình 1.3) Sau sắc ký lọc gel, độ tinh khiết của FOS tăng từ 60% w/w (sản phẩm Neosugar G) lên 95% w/w (sản phẩm Neosugar P) Dung dịch FOS sau chuyển hóa, lọc, khử màu, khử muối được bơm qua cột (chứa các hạt gel) với lưu lượng không đổi Glucose, fructose, saccharose do có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ gel nên có thể đi vào trong các lỗ trên hạt gel và bị giữ lại ở đó FOS có kích thước lớn hơn nhiều nên không thể đi vào các lỗ gel, do đó sẽ đi ra khỏi cột trước trong quá trình rửa giải Các phần tử khác sẽ được rửa giải ra sau Kết thúc quá trình thu được FOS có độ tinh khiết cao hơn FOS sau khi tinh sạch bằng lọc gel được đưa khử màu, mùi bằng than hoạt tính, khử muối trong cột trao đổi ion, cô đặc chân không và sấy phun để thu được sản phẩm FOS cao độ 95% w/w [3]

Phương pháp này có ưu điểm nổi bật là độ tinh khiết của FOS cao, có thể áp dụng với nồng độ nhập liệu khá cao, có khả năng tự động hóa và dễ triển khai ở quy

mô công nghiệp nhưng chi phí đầu tư, vận hành cao và đòi hỏi điều kiện vệ sinh, bảo trì nghiêm ngặt Những bất lợi của phương pháp lọc gel là tốn thời gian, dung môi rửa giải, tốn nhiều năng lượng, chi phí tinh sạch FOS cao [74], [79], [80]

1.4.2.2 Phương pháp lọc nano

Lọc nano là một phương pháp có nhiều tiềm năng trong tinh sạch và cô đặc FOS

ở quy mô công nghiệp Theo Goulas [81], ngoài phương pháp sắc ký được dùng chủ yếu thì các màng lọc kích thước nano cũng đã được ứng dụng trong sản xuất FOS mạch ngắn ở Nhật Màng kích thước nano có giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) trong khoảng 200 – 1000Da Đường kính lỗ của hầu hết các màng kích thước nano trong khoảng 0,6 – 2,0nm, trung bình 0,8 – 0,9nm [73] Đường kính của monosaccharides là 0,6 – 0,8nm [82] Vì vậy, màng kích thước nano có thể phân riêng monosaccharides ra khỏi disaccharides và oligosaccharides

Với mục đích nâng cao độ tinh khiết của FOS bằng cách tách glucose liên tục khỏi hỗn hợp phản ứng, Nishizawa và cộng sự (2001) [64] dùng hệ thống bình phản ứng có tích hợp bộ phận lọc màng gồm màng NTR-7410 (sulfonic polyether sulfone),

NTR-7450 (sulfonic polyether sulfone), NTR-7250 (polyvinyl alcohol), NTR-729HF (polyvinyl alcohol) của Nitto Denko Co và NF-45 (polyamide) của Sanko Shokai Glucose đi qua được màng, còn saccharose và FOS thì không qua màng Độ tinh khiết của FOS trong sản phẩm đạt trên 90%, cao hơn nhiều so với khi phản ứng gián đoạn (55 – 60%) và tương đương độ tinh khiết trong sản phẩm được xử lý bằng phương pháp sắc ký

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống thí nghiệm với bình phản ứng có tích hợp bộ phận lọc

màng trong nghiên cứu của Nishizawa và cộng sự [64]

Các thông số vận hành của bình phản ứng có tích hợp bộ phận lọc màng là nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme, diện tích hoạt động của màng, thể tích bình phản ứng, áp suất xuyên màng và lưu lượng nhập liệu Tỷ lệ chuyển fructose và tính thấm của glucose là những yếu tố quan trọng nhất của bình phản ứng do phản ứng chuyển fructose bị ức chế cạnh tranh bởi glucose Sau 12 giờ, độ tinh khiết của FOS đạt 93%, saccharose còn lại là 5% [64]

Hệ thống kết hợp vi lọc (UF) với lọc nano (NF) cũng có khả năng đạt hiệu quả cao trong tinh sạch và cô đặc fructooligosacharides từ củ chicory Trong nghiên cứu của Kamada và cộng sự (2002) [83], các tác giả sử dụng màng UF là GR61PP (Danish Separation Systems As, Nakskov, Đan Mạch) và khảo sát bốn loại màng NF gồm G5, G10, G20, G50 (Osmonics) Quá trình UF gián đoạn, hồi lưu toàn bộ dòng không qua màng, được sử dụng để lọc sơ bộ, tách các phân tử lớn như protein, tinh bột, chất xơ

và các chất không hòa tan… Dòng qua màng thu nhận từ quá trình UF được tiến hành lọc NF để cô đặc FOS đồng thời tách mono-, disaccharides và muối ở điều kiện nhiệt độ 25ºC, áp suất 40bar, lưu lượng 6,4L/phút