Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm

Một số phương pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và aspartam Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích đã được triển khai và chuẩn hóa và chuẩn hóa tại phòn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt 3

1.1.1 Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam 3

1.1.2 Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và saccharin, aspartam 4

1.2 Một số phương pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và aspartam 7

1.2.1 Phương pháp trắc quang 7

1.2.2 Phương pháp chuẩn độ 9

1.2.3 Phương pháp điện di mao quản (CE) 9

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.1.2 Đối tượng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích 14

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu 14

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 14

2.2.2 Hóa chất, thuốc thử 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ 16

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích 17

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu : 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Nghiên cứu, xây dựng phương pháp phân tích 23

3.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích 23

3.1.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu 33

3.2 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp 38

3.2.1 Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống 38

3.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 38

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo 40

3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 58

3.2.5 Khoảng tuyến tính 41

3.2.6 Độ lặp lại của phương pháp phân tích 43

3.2.8 Đánh giá độ chính xác của phương pháp bằng phân tích đối chứng 58

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 66

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

R (%) Độ thu hồi (đơn vi ̣ %)

S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

UV-VIS Ultraviolet – Visible (Tử ngoại khả kiến)

tính bằng mg/kg thực phẩm dạng rắn và mg/l đối với thực phẩm dạng lỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam 3

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật 4

Bảng 3.1 : Ảnh hưởng bản chất cột đến thời gian lưu và diện tích pic Error! Bookmark not defined. Bảng 3.2: Tính chất của 1 số loa ̣i dung môi dùng làm pha đô ̣ng 26

Bảng 3.3: Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic 26

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH pha động đến thời gian lưu của chất phân tích 28

Bảng 3.5 Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 30

Bảng 3.6 Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3 31

Bảng 3.7 Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4 31

Bảng 3.8 Diện tích pic theo các chương trình gradient 32

Bảng 3.9 Chương trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ưu 33

Bảng 3.10 Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm 35

Bảng 3.11 Sự phụ thuộc diện tích pic vào thể tích MeOH thêm vào mẫu 36

Bảng 3.12: Kết quả tính toán sự phù hợp của hệ thống 38

Bảng 3.13 Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích 40

Bảng 3.14 : Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với các chất đang nghiên cứu 40

Bảng 3.15 LOD và LOQ của từng nền mẫu 58

Bảng 3.16: Phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 42

Bảng 3.17: Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn 44

Bảng 3.18: Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng saccharin trong mẫu thực (n=6) 44

Bảng 3.19: Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng aspartam trong mẫu thực (n=6) 46

Bảng 3.20: Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng acid benzoic trong mẫu thực (n=6) 47

Bảng 3.21: Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng acid sorbic trong mẫu thực (n=6) 49

Bảng 3.22: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu xúc xích 51

Bảng 3.23: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu bánh đậu xanh 52

Bảng 3.24: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu thạch bách vị 53

Bảng 3.25: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu dưa chuột muối 54

Bảng 3.26: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu ô mai 55

Bảng 3.27: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu kẹo 56

Bảng 3.28: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu nước ngọt 57

Bảng 3.29 Kết quả mẫu kiểm nghiệm đối chứng 60

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Sơ đồ 2.1 Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010 17

Sơ đồ 2.2: Qui trình phân tích mẫu dự kiến 34

Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam 23

Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic 24

Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic 24

Hình 3.4 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C8 (150mm× 4,6mm × 5μm) Error! Bookmark not defined. Hình 3.5 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (150mm×4,6mm× 5μm) Error! Bookmark not defined. Hình 3.6 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) 25

Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động K 2 HPO 4 : ACN = 80 : 20 (v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm 27

Hình 3.8 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 1 29

Hình 3.9 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2 30

Hình 3.10 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3 31

Hình 3.11 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4 32

Hình 3.12: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) 39

Hình 3.13: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin 40

Hình 3.14: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam 41

Hình 3.15: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid benzoic 41

Hình 3.16: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid sorbic 41

Hình 3.17: Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nồng độ 0,02 ÷ 80 ppm 42

Hình 3.18: Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nồng độ 0,5 ÷ 90 ppm 42

Hình3.19: Đường chuẩn của A benzoic trong khoảng nồng độ 0,08÷90 ppm 43

Hình 3.20: Đường chuẩn của A.sorbic trong khoảng nồng độ 0,01 ÷ 85 ppm 43

Hình 3.21 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp chuẩn 1 ppm của các chất phân tích 43

Hình 3.22 Sắc đồ của mẫu nước ngọt 50

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất lượng thực phẩm nói chung, chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm nói riêng là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người và nền kinh tế của xã hội

Gần đây, liên tiếp xảy ra các vụ ngộ độc tại nhiều địa phương trên toàn quốc, cũng như việc xuất hiện nhiều mặt hàng không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng những phụ gia ngoài danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lượng cho phép Tác hại do sử dụng phụ gia sai quy định có thể ảnh hưởng đối với sức khỏe con người Những tác động này thường không xảy ra cấp tính, rầm rộ và nguy kịch mà diễn biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ở Việt Nam hàng năm có khoảng hơn 3 triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD (khoảng 4000 tỷ VND)

Acid sorbic, acid benzoic và một số muối của chúng là những phụ gia được phép

sử dụng với nồng độ đủ để bảo quản sản phẩm thì chúng không gây độc cho cơ thể con người Tuy nhiên, một số nhà sản xuất đã dùng quá hàm lượng cho phép ảnh hưởng tới sức khoẻ, gây ngộ độc cấp và mãn tính Tổ chức Y tế thế giới, tổ chức Nông Lương thế giới đã thử nghiệm natri benzoat trên chuột sau nhiều ngày trọng lượng chuột giảm, hại gan và thận dẫn tới chết, thử nghiệm trên chó thì dẫn tới thần kinh, kết hợp với acid ascobic trong thực phẩm natri benzoat có thể gây ung thư do tạo ra benzen

Năm 2012, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hương trên địa bàn tỉnh Quảng Bình cho thấy: Tổng số mẫu xét nghiệm acid benzoic là 291 có 69 mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic chiếm là 23,7%, trong các thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vượt quá giới hạn cho phép là 46,4% Tổng số mẫu xét nghiệm acid sorbic là 286 có 50 mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic chiếm là 17,5%, trong các thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vượt quá giới hạn cho phép là 50% [3]

Đường hóa học (hay là chất ngọt tổng hợp) là chất không có trong tự nhiên,

có vị ngọt rất cao so với đường kính saccharose và không hề có một giá trị dinh dưỡng Thường dùng trong việc điều trị cho những người bệnh thừa cân hay đái tháo đường Các đường hóa học như: saccharin, manitol, acesulfam K, aspartam, isomalt, sorbitol, sucraloza được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối đa và có quy định của Bộ Y tế [12] Tuy vậy, các chất này có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe người dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lượng đưa vào cơ thể Điều nguy hiểm là loại đường này hòa tan trong nước, không màu, không mùi nên khó phát hiện Chỉ có thể chỉ tên "đích danh" qua phân tích hoá học Nếu nhà sản xuất chỉ cần cho 7 phần đường mía và 3 phần đường hóa học thì ngay cả các chuyên gia cũng không thể phát hiện ra

Cho đến nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định chất bảo quản

và chất tạo ngọt Tuy nhiên, để định lượng được đồng thời chất quản: acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt trong thực phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có nhiều ưu điểm vượt trội Phương pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao, thao tác đơn giản, có thể đồng thời xác định dược nhiều chất Xuất phát từ vấn

đề trên, đề tài: “Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoic, acid sorbic, muối

của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm” nhằm giải

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt

1.1.1 Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam

Tên hóa học, các tính chất, công thức cấu tạo của acid benzoic, acid sorbic,

saccharin và aspartam được cho trong bảng 1.1 [7], [8], [11]

Bảng 1.1 Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam

Acid benzoic Acid sorbic saccharine Aspartam

hexadienoic

3(2H)-on-1,1-dioxid;

1,2-Benzisothiazol-dihydrobenzo[d]isothiazol-1,1-dioxid

3-oxo-2,3-Aspartyl phenylamin metyl ester, 3-Amino-N-(α carbomethoxy-phenyletyl)-acid succinamic

- có mùi nhẹ đặc trưng

- ít tan trong nước, tan nhiều trong ethanol,

methanol

- Tinh thể hoặc bột tinh thể trắng,

- không mùi hoặc

có mùi thơm nhẹ

- Ít tan trong nước, ethanol, tan trong dung dịch kiềm

- Giữ được độ ngọt

ở nhiệt độ cao

- Tinh thể màu trắng, không mùi

có vị ngọt mạnh

- Ít tan trong nước và ethanol

1.1.2 Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và saccharin, aspartam

Tác dụng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật được thể hiện ở bảng 1.2 [1]

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật

Chất chống vi sinh vật Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc

1.1.2.1 Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid benzoic

Acid benzoic và các benzoat là chất sát trùng mạnh đối với nấm men và các nấm mốc, có tác dụng yếu đối với các vi khuẩn Tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi trường acid pH = 2,5 – 3,5 Đảm bảo hiệu quả tác dụng bảo quản, nồng độ natri benzoat có trong sản phẩm phải đạt tới 0,07 – 0,1% Các nồng độ này của acid

benzoic và natri benzoat không có hại đối với cơ thể con người [11]

Acid benzoic và các benzoat không gây độc khi dùng đúng liều quy định mà chỉ ảnh hưởng tới mùi và vị của sản phẩm khi cảm quan (natri benzoat cho dư vị ở nồng độ 0,04%) Nước quả và rau quả nghiền bảo quản bằng các benzoat thường có

màu thâm đen so với sản phẩm sunfit hoá Trong cơ thể acid benzoic và các benzoat

tác dụng với acid ascorbic hình thành benzen, một chất gây ung thư Natri benzoat

có thể phá huỷ và khử hoạt tính của ADN trong ti thể tế bào Ti thể tiêu thụ ôxi để tổng hợp ATP, cung cấp năng lượng cho cơ thể, khi ADN bị phá huỷ sẽ gây ra các

triệu chứng về thần kinh bao gồm hội chứng Parkinson và các hội chứng thoái hoá

thần kinh khác, làm tăng quá trình lão hóa của cơ thể [3]

Giới hạn cho phép (ML) của acid benzoic trong thịt và các sản phẩm từ thịt, trong nước chấm và các sản phẩm tương tự 1000mg/kg; trong các loại thủy sản, sản phẩm thủy sản ngâm dấm, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai 2000mg/kg [12]

1.1.2.2 Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid sorbic

Acid sorbic và các sorbate có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men và nấm mốc, các vi sinh vật này là nguyên nhân chủ yếu gây hư hỏng sản phẩm rau quả, tác dụng rất yếu đối với vi khuẩn Sử dụng Acid sorbic đem lại kết quả tốt trong công nghiệp chế biến rau quả, trong công nghiệp rượu nho, trong sản xuất đồ hộp sữa và các sản phẩm sữa, các sản phẩm cá, các sản phẩm thịt loại thịt dồi, xúc xích, các sản

phẩm bánh mỳ [11]

Khi sử dụng acid sorbic với hàm lượng vượt mức cho phép sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khoẻ người sử dụng Các chất này có thể gây dị ứng, gây hiện tượng đầy bụng, đầy hơi, khó tiêu Nếu tích tụ lâu ngày sẽ gây hại cho gan, thận, thậm chí có thể gây ung thư [3]

Giới hạn cho phép (ML) của acid sorbic trong các loại pho mát cao nhất là 3000mg/kg; trong các loại bánh nướng là 2000mg/kg; trong nước chấm và các sản

phẩm tương tự : 2000mg/kg; viên xúp và nước thịt: 1000mg/kg [12]

1.1.2.3 Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng saccharin

Là chất làm ngọt nhân tạo không có năng lượng, độ ngọt gấp khoảng 300 lần đường mía, nhưng có dư vị kim loại hơi đắng, đặc biệt là ở nồng độ cao Khi đi vào

cơ thể, saccharin không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà được thải hồi sau đó qua đường tiểu tiện Dùng để làm ngọt các sản phẩm như đồ uống, kem, chè,

Năm 1977, Canada và FDA Hoa Kỳ cấm sử dụng hóa chất này vì phát hiện gây ung thư bàng quang ở chuột Nhưng trước áp lực của dân chúng và nhà sản xuất, Quốc hội Hoa Kỳ cho phép dùng với điều kiện phải có hàng chữ “có nguy cơ độc hại cho sức khỏe” (potentially hazardous to health) Năm 2000, FDA Hoa Kỳ

lấy hàng chữ này ra vì có những nghiên cứu chứng minh sự an toàn của saccharin Tuy nhiên, hiện nay một số nghiên cứu hiện đại lại chỉ ra rằng, saccharin có thể tạo

ra dị ứng cho cơ thể như nhức đầu, tiêu chảy, da bị tróc v.v… Đối với các phụ nữ đang mang thai, saccharin có thể đi thẳng vào bào thai và nằm yên trong đó trong suốt thời kỳ mang thai, do đó thai nhi có thể bị ảnh hưởng và tạo nên những chứng rối loạn chức năng của cơ bắp Dùng nhiều lượng saccharin có thể sinh ra chứng béo phì Tuy nhiên tất cả những biến chứng do việc xử dụng saccharin vẫn còn là một tranh cãi và chưa có kết luận nào có tình cách thuyết phục [30]

Một khả năng gây nguy hiểm khác của saccharin là khả năng gây dị ứng Phản ứng dị ứng này là do nhóm hợp chất sufonamides gây ra đối với những người không đáp ứng được thuốc chứa sulfa Phản ứng này bao gồm đau đầu, khó thở, phát ban và tiêu chảy Một số sản phẩm dành cho trẻ em có chứa saccharin được cho là có thể gây kích ứng và rối loạn cơ bắp [30]

Giới hạn cho phép (ML) của saccharin trong kẹo cao su cao nhất là 2500 mg/kg, trong các loại gia vị là 1500 mg/kg, trong thực phẩm bổ xung là 1200 mg/kg, trong sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú, thủy sản và cá đã qua xử lý nhiệt, rau củ đông lạnh là 500 mg/kg, [12]

1.1.2.4 Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng aspartam

Hiện nay, aspartam là chất ngọt rất được ưa chuộng Nó được sử dụng rộng rãi trên thế giới với sự hiện diện trong hơn 6000 loại thực phẩm khác nhau như bánh kẹo, yogurt, trong các thức uống ít nhiệt năng như Coke diete, Pepsi và cả trong

với các loại đường khác (như acesulfame - K hay saccharin) [7]

Khi vào cơ thể , aspartam không hấp thụ vào máu mà tan ra trong ruột thành

ba chất: acid aspartic (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%)

+ Methanol là một chất có độc tính thấp Vào cơ thể, methanol được oxy hóa tạo nên formaldehyd, chất này lại tiếp tục bị oxy hóa tạo nên acid formic (hoặc formate, tùy theo pH) Acid formic có độc tính rất cao Chính acid formic là nguyên nhân gây nên tình trạng toan chuyển hóa (nhiễm acid) và mù lòa, những tổn thương đặc trưng của nhiễm độc methanol

+ Phenylalanine là một chất độc thần kinh Quá nhiều phenylalanine gây động kinh, chậm phát triển trí óc , mất ngủ… Chính phenylalanine ta ̣o ra bệnh

phenylketonuria (PKU), làm chậm phát triển trí tuê ̣ nghiêm tro ̣ng và làm tổn hại đến

hê ̣ thần kinh

+ Dư thừa acid aspartic có thể gây ra rối loạn nội tiết và các vấn đề về thị lực acid Aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn

giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh… [11]

Giới hạn cho phép (ML) của aspartam trong sản phẩm tạo màu trắng cho đồ uống là 6000 mg/kg, trong thực phẩm bổ sung là 5500 mg/kg, trong bánh mỳ và các sản phẩm bánh nướng thông thường và hỗn hợp là 4000 mg/kg, trong kẹo, kẹo mềm, kẹo cứng, kẹo ca su, dấm là 3000 mg/kg, viên xúp và nước thịt là 1200 mg/kg, [12]

1.2 Một số phương pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và aspartam

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích đã được triển khai và chuẩn hóa và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm, bao gồm các phương pháp xác định riêng chất bảo quản cũng như đường hóa học và các phương pháp xác định đồng thời cả chất bảo quản và đường hóa học: phương pháp chuẩn độ, quang phổ hấp thụ phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và điện di mao quản

1.2.1 Phương pháp trắc quang

* Xác định hàm lượng acid benzoic trong các mẫu thực phẩm:

Mẫu thử được đồng hóa, sau đó được pha loãng và acid hóa phần mẫu thử Acid benzoic được chiết bằng dietyl ete, rồi được chiết tiếp bằng kiềm

tinh chế bằng oxi hóa sử dụng kali dicromat trong môi trường acid Acid benzoic tinh sạch hòa tan trong dietyl ete được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 267,5 nm; 272 nm và 276,5 nm

Độ hấp thụ tính theo acid benzoic trong công thức này đối với phương pháp

so sánh ở bước sóng 272 nm là: A2 – (A1 + A3)/2

A1 là độ hấp thụ ở 267,5 nm

A2 là độ hấp thụ ở 272 nm

A3 là độ hấp thụ ở 276,5 nm

Chuẩn bị dãy chuẩn acid benzoic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo

độ hấp thụ, dựng đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng acid benzoic trong mẫu phân tích.[14]

* Xác định hàm lượng acid sorbic trong các mẫu thực phẩm:

Cất acid sorbic từ mẫu bằng hơi nước, oxy hóa bằng acid crom, dùng acid barbituric tạo phức màu hồng, đo cường độ màu của phức bằng máy đo quang phổ

ở bước sóng 532 nm

Để tính kết quả hàm lượng acid sorbic cần chuẩn bị dãy chuẩn acid sorbic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo độ hấp thụ, dựng đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng acid sorbic trong mẫu phân tích.[15]

Phương pháp này tuy có độ chính xác cao nhưng phức tạp và tốn nhiều dung môi hóa chất Đặc biệt là không phân tích được đồng thời 2 acid

- Để xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Saccharin, Aspartam, Acesulfame-K) và vitamin C trong đồ uống bằng phương pháp PLS - UV: cân chính xác 0,05 g mẫu, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 ml bằng dung dịch

H3PO4 0,1N Chất phân tích được đo ở bước sóng từ 190 – 300 nm Nếu mẫu có chứa màu thực phẩm, các chất phân tích được chiết bằng dung dịch n - butanol và được đo ở bước sóng từ 190 – 300 nm Phương pháp này được áp dụng cho đồ uống thương mại, đồ uống có màu (dạng bột và chất lỏng) [28]

Phương pháp này tương đối chính xác nhưng tốn dung môi, hóa chất độc hại, không xác định được đồng thời các chất cần phân tích

1.2.2 Phương pháp chuẩn độ

* Xác định acid benzoic và acid sorbic: Cân 50g mẫu chính xác đến 0,001g chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, dùng NaOH 10% trung hòa đến trung tính thử bằng giấy đo pH Thêm 10ml kali feroxyanua 15% lắc đều, để lắng sau đó lọc

Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCl 10%, thử bằng giấy đo pH sau đó thêm 5ml HCl 10% Thêm 30ml clorofooc vào phễu chiết lắc trong 5 phút để phân lớp, chiết phần dung dịch nước sang phễu chiết khác, cho thêm 15 ml clorofooc và chiết lại hai lần nữa Gộp toàn bộ cloroform, có thể cho vào bộ cất thu hồi bớt cloroform ở 650 đến còn lại ¼ thể tích Chuyển phần cặn còn lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp ở 500 để nguội, dùng 50ml etanol hòa tan cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphthalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05 M Phương pháp này tốn dung môi hóa chất, độc hại, đặc biệt là phương pháp này phân tích đối với mẫu có hàm lượng lớn.[8], [14], [21]

* Xác định saccharin: Cân khoảng 0,5g (chính xác đến mg) mẫu thử đã được làm khô, hòa tan trong 75 ml nước nóng Làm nguội nhanh và thêm dung dịch phenolphtalein (TS), chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M Mỗi ml natri hydroxyd 0,1N tương đương với 18,32 mg C7H5NO3S [7]

Phương pháp này cần hóa chất độc hại, chỉ phân tích được nếu hàm lượng

chất lớn

1.2.3 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối quan hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau

Ứng dụng phương pháp này, tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus đã xác định đồng thời aspartam, cyclamate, saccharin và acesulfam - K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với detector độ dẫn Phương pháp sử dụng hỗn hợp đệm tris (hydroxymetyl) aminometan (TRIS) 100 mmol/L và 1 histidin (HIS) 10 mmol/L với thời gian phân tích là 6 phút, hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng từ 94% đến 108%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong khoảng 1,5 6,5%.[22]

Tác giả Richard A Frazier và các cộng sự đã xác định đồng thời các chất ngọt nhân tạo acesulfam-K, aspartam, saccharin, chất bảo quản acid benzoic, acid sorbic và 7 phẩm màu quinolin yellow, sunset yellow FCF, carmoisin, ponceau 4R, brilliant lue FCF, green S và black PN trong mẫu nước giải khát bằng phương pháp điện di mao quản Phương pháp sử dụng chế độ sắc ký điện động học mixen, dung dịch đệm cacbonat 20 mM ở pH 9,5 với dun dịch natri dodecyl sulfat 62 mM trong vòng 15 phút Kết quả cho thấy giới hạn định lượng đối với tất cả các chất là 0,01 mg/ml [25]

Tác giả Trần Phúc Nghĩa đã xây dựng phương pháp định lượng Acesulfame - K, Saccharin, Aspartam trong đồ uống, nước giải khát với các điều kiện điện di: bước sóng phát hiện các chất là 215,5 nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM ở pH = 9,5, điện thế đặt vào hai đầu mao quản là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50 mbar trong thời gian 5s, dòng điện 100µA Xác định được giới hạn phát hiện LOD với Asp, Sac, Ace-K lần lượt là 3,79 ppm; 6,46 ppm; 4,43 ppm Giá trị LOQ tìm được là 4,8 ppm; 1,5 ppm và 3,0 ppm Sai số tương đối từ 0,75 – 1,85%, giá trị biến thiên CV < 3% Độ lặp lại tương đối tốt với độ lệch chuẩn (SD) từ 0,2 – 1,5%, hiệu suất thu hồi trên mẫu giả là 96,6 - 101,8% Đồng thời cũng đánh giá phương pháp trực tiếp trên mẫu thực với hiệu suất thu hồi là 95,2 – 107,0%.[6]

Phương pháp này có độ nhạy cao, xác định được đồng thời các chất cần phân tích nhưng thiết bị đắt tiền, quy trình phân tích phức tạp

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tác giả Ion Trandafir , Violeta Nour, Mira Elena Ionică đã phát triển phương pháp HPLC pha đảo để định l ượng đồng thời acesulfame - K, saccharin, aspartam, caffeine và acid benzoic trong nước giải khát cola không đường Việc tách sắc ký được thực hiện bởi sử dụng pha đô ̣ng là đệm kali dihydrogen orthophosphate (pH = 4,3) và acetonitrile (88:12, v/v) Cô ̣t DS hypersil C18 (250 mm x 4,6mm) và detector DAD với bước sóng λ = 227 nm cho acesulfame - K , λ = 265 nm cho saccharin và λ = 217 nm cho aspartam, caffeine và acid benzoic Thời gian các phân tích khoảng 40 phút, các đường chuẩn tuyến tính tốt trên phạm vi nồng độ 0-100 mg/L Việc xác nhâ ̣n giá tri ̣ sử du ̣ng của phương pháp phân tích đã thực hiê ̣n về đô ̣ nhạy, khoảng tuyến tính, độ tái lặp, đô ̣ lặp lại, đô ̣ thu hồi [27]

Mô ̣t phương pháp sắc ký ion mới được Qing - Chuan Chen, Jing Wang đề xuất để xác đi ̣nh đồng thời các chất làm ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartam, acesulfame - K ), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic ), caffeine, theobromine

và theophylline Mẫu được rung siêu âm, pha loãng, loại tạp bằng K4[Fe(CN)6 và ZnSO4 (mẫu sữa lên men) rồi cho qua cột chiết pha rắn C18 Việc tách được thực hiện trên một cột trao đổi anion của máy HPLC, phân tích được tiến hành ở 40°C trong vòng 45 phút và giải hấp theo chế đô ̣ isocratic với dung môi là dung dịch NaH2PO4 5mM (pH 8,20) và acetonitrile theo tỉ lê ̣ 4% (v/v), và detector UV Các giới hạn phát hiện (signal/noise = 3:1) cho tất cả các chất phân tích ở mức dưới µg/ml Phương pháp này đã được áp dụng cho các chế phẩm thực phẩm và dược phẩm, và sự thu hồi trung bình cho mẫu thật trong khoảng 85 -104% [23]

Tác giả N Dossi và các cộng sự đã sử dụng phương pháp RP – LC để xác định các chất phụ gia trong nước giải khát Các chất ngọt nhân tạo (acesulfam, aspartam, saccharin), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic) và phẩm màu (Ponceau 4R, sunset yellow, tatrazin) được tách trên cột LiChrosorb RP 18 Pha động là dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH = 4,0) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thời

gian phân tích trong khoảng 20 phút Pha động được chạy theo chế độ gradient như sau: trong 5 phút đầu tỷ lệ dung môi là dung dịch đệm : MeOH = 95% : 5% (v/v), sau đó MeOH tăng lên là 40% trong vòng 5 phút và được giữ ở tỷ lệ đó trong 10 phút rồi dung môi được đưa về tỷ lệ ban đầu trong 5 phút Bằng kỹ thuật chuyển đổi bước sóng, giới hạn phát hiện của các chất phân tích trong khoảng 0,1 - 0,3 mg/l Phương pháp này được áp dụng để xác định một số mẫu nước ngọt, mẫu được siêu

âm loại khí và lọc bằng 0,45 – 0,2 µm trước khi bơm mẫu vào cột [24]

Tại Việt Nam, chúng tôi đã khảo sát và nhận thấy có một số phương pháp xử

lý mẫu như sau:

Phương pháp 1: Mẫu phân tích được hòa tan vào trong nước hoặc được chiết bằng dung dịch đệm amoni acetat/acid acetic, và được khử tạp bằng hỗn hợp Carrez I (K4[Fe(CN)6].3H2O) và Carrez II (ZnSO4.7H2O) Sau đó lọc, thu dịch lọc đem phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) bằng cột sắc ký pha đảo RP-18, 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5µm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích bơm 10 µl với đầu dò UV-VIS, bước sóng phát hiện chất là 235 nm [17]

Phương pháp 2: Mẫu được pha loãng hoặc được chiết bằng siêu âm với nước Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao được tinh sạch trên cột chiết pha rắn hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần Mẫu được chuyển vào ống ly tâm và ly tâm ở tốc độ 1400 vòng/phút, trong 10 phút Lấy dịch nổi, định mức, lọc qua giấy lọc, màng lọc whatman 0,45µm rồi bơm vào máy HPLC Các chất phân tích được tách trên cột sắc kí pha đảo của HPLC với pha động là dung dịch đệm phosphat và acetonitril (80%:20%, v/v) và pha tĩnh là cột C18 chiều dài từ 100 mm đến 300 mm, đường kính trong từ 3 mm đến 4 mm Bước sóng để xác định chất tạo ngọt bằng phép đo phổ là 220 nm với detector UV hoặc DAD Nền mẫu của phương pháp này

là các sản phẩm lỏng trong (nước chanh, cola, các loại đồ uống), các sản phẩm đục (nước quả, đồ uống từ sữa có hương vị), mứt, mứt quả, mứt cam, sản phẩm rắn và nửa rắn [18]

Phương pháp 3: Mẫu được đồng nhất toàn bộ rồi tiến hành chiết acid benzoic

và sorbic khỏi nền mẫu bằng NaOH, sau đó loại tạp bằng K3Fe(CN)6,

(CH3COO)2Zn, lọc qua giấy lọc, màng lọc whatman 0,45µm và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD hoă ̣c UV -VIS [19]

Phương pháp 4: Mẫu được đồng nhất và được acid hóa bằng acid tartaric rồi tiến hành chưng cất lôi cuốn theo hơi nước nhằm tách lượng acid benzoic và acid sorbic có trong mẫu thử Sau đó lọc dịch cất thu được qua màng lọc whatman 0.45

µm và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao v ới detector DAD hoă ̣c UV-VIS [4], [16], [20]

Phương pháp 5: Mẫu sau khi đồng nhất được cân vào ống ly tâm 50 ml, thêm nước, lắc đều rồi thủy phân ở 500C trong 30 phút, để nguội, loại tạp bằng hỗn hợp carrez, ly tâm 6000 vòng/phút và định mức 100 ml, lọc qua giấy lọc rồi bơm vào HPLC với cột anion, detector PDA, bước sóng phát hiện chất đối với aspartam, saccharin là 210 nm, acid benzoic, acesulfam K là 225 nm và acid sorbic là 254 nm Pha động là dung dịch NaH2PO4 5 mM (pH = 8,2) và acetonitril, chương trình rửa giải theo gradient với tốc độ 1 ml/phút [13]

Trong quá trình nghiên cứu, tìm hiểu phương pháp phân tích hàm lượng saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic, chúng tôi nhận thấy: do aspartam không bền trong môi trường nhiệt độ và pH cao [29] nên không nên chiết chất này

ra khỏi nền mẫu bằng NaOH [19] hay chưng cất lôi cuốn hơi nước [4], [16], [20] Mặt khác, TCVN 8471:2010 tuy chỉ để xác định một số chất tạo ngọt nhưng lại cho thấy có khả năng ứng dụng để đồng thời xác định hàm lượng saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic trong đa dạng nền mẫu Do vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột sắc ký pha đảo C18 và detector DAD (có thể đo được ở nhiều bước sóng khác nhau)

để xác định đồng thời các chất bảo quản và chất tạo ngọt, tối ưu hóa các điều kiện cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có với quy trình phân tích mẫu

phù hợp sao cho vừa tiết kiệm được thời gian lại vừa giảm được giá thành phân tích

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Trong luận văn này, hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam có trong thực phẩm

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, từ đó áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam có trong thực phẩm đang lưu thông trên thị trường

2.1.2 Đối tượng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích

Mẫu thực phẩm là mẫu được lấy ngẫu nhiên tại một số cửa hàng bánh kẹo cạnh trường học, chợ, siêu thị trên địa bàn Hải Dương và mẫu được gửi tới labo kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương

Thời gian: 05/2014 đến 11/2014

Thực phẩm các loại bao gồm;

- Bánh đậu xach, ô mai, nước giải khát

- Rau củ đóng hộp: dưa chuột muối

Hình 2.1: Hệ thống HPLC 1200 hãng Agilent

- Cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm

- Van của máy sắc ký: G1311A

- Bơm gradient bốn kênh dung môi: G1311A (số: DE 62968696)

- Detector: PAD

Các thiết bị và dụng cụ khác

- Bộ lọc hút chân không thủy tinh, kích thước lỗ giấy loc 0,45 µm

- Bể rung siêu âm (wise clean): Daihan, WUC-A10H

- Máy ly tâm: Hermle, Z300

- Cân phân tích (độ chính xác 0,0001g): Shimadzu, AW220

- Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g): Citizen, CG 3102

- Máy đồng nhất mẫu: IKA, T25 BASIC ULTRA-TURRAX

- Máy đo pH: Elmetron, CP 501

- Bình định mức thủy tinh loại A: 1000 ml, 500 ml và 100 ml, 25ml, 20ml, 10ml

- Pipet thủy tinh loại A: 100 ml, 25 ml, 20 ml, 10 ml, 5 ml và 1 ml

- Chất chuẩn gốc riêng rẽ thuộc hãng Sigma: acid benzoic 99%, acid sorbic 99%, saccharin 100%, aspartam 99,85%

- Các hóa chất khác: K4[Fe(CN)6].3H2O (merk), ZnSO4.7H2O (merk), KH2PO4(merk), H3PO4 (merk), MeOH Trung Quốc, Acetonitril (merk)

 Cách pha hóa chất cần thiết

- Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm của mỗi chất: Cân chính xác 0,1g acid

benzoic chuẩn vào cốc có mỏ 50 ml hòa trong 1 - 2ml methanol cho tan hoàn toàn Chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng rửa cốc và định mức vừa đủ 100ml bằng nước cất

- Pha acid acid sorbic, saccharin, aspartam chuẩn gốc tương tự như trên vào các bình định mức 100ml Các dung dịch trên được bảo quản ở 2 - 40C trong 3 tháng Dung dịch chuẩn trước khi sử dụng phải lắc đều, rung siêu âm 10 phút

- Dung dịch chuẩn trung gian: Hút chính xác 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc (acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam) bằng pipet vào các bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nước cất để được hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian 100ppm mỗi loại đường

- Dung dịch Carrez 1: cân chính xác 15g K4[Fe(CN)6].3H2O bằng cân kĩ thuật vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nước cất

- Dung dịch Carrez 2: cân chính xác 30g ZnSO4.7H2O bằng cân kĩ thuật vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nước cất

- Dung dịch phosphoric 5%: hút 3ml acid phosphoric vào bình định mức 50ml

và định mức đến vạch bằng nước cất

- Dung dịch KH2PO4 0,02M (pH = 4,3): cân chính xác 2,72g KH2PO4 vào bình định mức 1 lít và định mức đến vạch bằng nước cất Dung dịch được đem lọc qua bộ lọc màng thích hợp và siêu âm trước khi sử dụng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ

- Lấy mẫu ở các cửa hàng cạnh trường học , ở chợ, đại lý, cửa hàng, siêu thị ta ̣i khu vực Tp Hải Dương

- Mỗi mẫu lấy khoảng 200 – 500 gam đối với mẫu rắn vào túi polyethylen khô, sạch, đóng kín, và khoảng 500 ml đối với mẫu lỏng cho vào chai nhựa điền đầy đủ thông tin chuyển về phòng thí nghiệm phân tích

- Đối với mẫu rắn, mẫu được nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ mịn, đồng đều Đồng nhất xong cho vào túi kín, tránh ẩm Đối với mẫu lỏng, mẫu được lắc kỹ trước khi đem phân tích

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích

Sơ đồ 2.1 Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010

2ml Dung dịch Carrez 1 Lắc vortex 2ml Dung dịch Carrez 2 Lắc vortex vortex

Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)

2.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện phân tích

Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời hàm lượng acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam được thực hiện theo các trình tự sau:

 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký trên máy HPLC

phương pháp Acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại rất tốt do trong cấu tạo phân tử của các chất phân tích

đều có thể được sử dụng cho việc định tính và định lượng các chất trên Nhưng detector DAD cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc ký Để thuận lợi cho công việc chung của phòng nên chúng tôi lựa chọn detector DAD để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

trang thiết bị của phòng thí nghiệm để lựa chọn detector phù hợp, dùng detector vừa lựa chọn để quét phổ và tìm bước sóng tối ưu cho mỗi chất cần phân tích

độ phân cực thấp

Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược Loại pha động này phù hợp với chất phân tích

là chất phân cực yếu

- Chương trình gradient: Sự thay đổi thành phần pha động diễn ra theo thời gian

- Ảnh hưởng của pH của pha động: Các chất phân tích đều là những acid hoặc muối của dạng acid nên pH của pha động sẽ quyết định chất phân tích trong cột tồn tại ở dạng acid hay dạng muối Khi thay đổi pH sẽ thay đổi thời gian lưu của chất phân tích trên cột

 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát thời gian rung siêu âm: Quá trình chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu thực hiện chủ yếu thông qua quá trình rung siêu âm Vì vậy quá trình chiết có

triệt để hay không phụ thuộc rất lớn vào thời gian rung siêu âm Chúng tôi khảo sát thời gian rung siêu âm từ 0 phút đến 60 phút

- Khảo sát lượng MeOH thêm vào: Tùy từng loại thực phẩm, nhà sản suất có thể thêm chất phụ gia ở dạng acid hay dạng muối Nếu chất phụ gia được thêm vào

ở dạng muối, chỉ cần sử dụng nước để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu Nếu chất phụ gia thêm vào ở dạng acid, khó tan trong nước Cho MeOH vào mẫu để chiết dạng acid trước rồi thêm nước để chiết nốt dạng muối của chất phân tích (nếu còn) Lượng MeOH cho vào xử lý mẫu được khảo sát từ 2 ml đến 10 ml

 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

nồng độ xác định, tiến hành phân tích trên HPLC lặp lại 6 lần Xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, diện tích pic

Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn

+ Hệ số chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách: α = '

'

RA

RB t t

Theo qui ước, B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy α luôn luôn lớn hơn 1

α còn được gọi là độ lưu giữ tỷ đối (relative retention)

Để tách riêng hai chất, cần có α > 1, thường chọn α trong khoảng 1,05 đến 2,0 α càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, với α quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài

+ Độ phân giải: Độ phân giải (RS) là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký RS =

) (

2 /

RA RB W W

t t





WA, WB là chiều rộng đáy pic của các chất 1 và 2

tRA, tRB là thời gian lưu thực của các chất 1 và 2

Rs = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4%

Rs =1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

- Khoảng tuyến tính

Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn với nồng độ của chất đó

Phương trình hồi quy tuyến tính y  a  x  b

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn

x là nồng độ chất khảo sát Sau khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn và xác định hệ

số hồi quy tương quan(R): hệ số tương quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm

cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)

Giới hạn định lượng LOQ là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10) Có thế tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD

- Độ chụm (độ lặp lại)

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính toán như sau:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại

x n

1 x

Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm

+ Độ lệch chuẩn :

1 n

) x x ( SD

2 n

1 i i

SDRSD  

So sánh RSD(%) tính được so với RSD(%) cho phép ở nồng đô ̣ chất tương ứng

theo AOAC RSD(%) tính được không được lớn hơn trị giá trong bảng ở hàm lượng

chất tương ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn Mối liên quan giữa nồng độ chất phân tích và RSD (%) được thể hiện trong phụ lục 1 [9]

- Độ đúng (độ thu hồi)

Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực (true value) hoặc được chấp nhận thực (accepted value)

- Độ thu hồi : Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn Lượng

chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu hồi (R%) được tính như sau:

100 C

C C

% R

c

m c

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu :

- Tính toán kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

- Tính toán thời gian lưu, diện tích peak, chiều cao peak và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng phần mềm của thiết bị

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu, xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích

3.1.1.1 Lựa chọn detector

Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của các chất đang nghiên cứu: sử dụng detector DAD để quét tìm, với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm Các chất đều được pha với nồng độ 10 ppm Xác định được bước sóng hấp thụ cực đại của sacchari và aspartam là 210 nm, acid benzoic là 198 nm và 226 nm, acid sorbic 254nm Hình ảnh quét phổ của saccharin và aspartam thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam

Hình ảnh quét phổ của acid benzoic thể hiện ở hình 3.2

Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic

Hình ảnh quét phổ của acid sorbic thể hiện ở hình 3.3

Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic

Dựa vào kết quả quét phổ chúng tôi lựa chọn bước sóng 210 nm để xác định đồng thời saccharin và aspartam, bước sóng 226 nm để xác định acid benzoic và bước sóng 254 nm để xác đinh acid sorbic

3.1.1.2 Lựa chọn cột tách

Cột tách là trái tim của hệ thống HPLC, nó quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không Căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích để lựa chọn cột tách phù hợp

Do cấu trúc phân tử saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic là chất phân cực yếu Vì vậy, để tách được các chất này nên chọn pha tĩnh là pha ngược Mặt khác, sử dụng chất nhồi pha ngược thì hệ dung môi là những chất phân cực nên kinh tế hơn, ổn định và không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ ẩm như chất nhồi củ a pha thường [6], [7]

Sắc đồ hỗn hợp các chất được phân tích bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) được thể hiện ở hình 3.4

Hình 3.4 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)

Cột C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) có hình ảnh pic tách tốt, ít doãng, nhọn và cân đối Thích hợp cho phân tích được nhiều chất, để thuận tiện cho công việc chung của phòng phân tích, chúng tôi chọn sử dụng cột Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) cho các khảo sát tiếp theo

3.1.1.3 Lựa chọn pha động

Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc

ký Thành phần pha động ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết,

có thể sử dụng khá nhiều dung môi Tuy nhiên, kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và nước được lựa cho ̣n nhiều Bên ca ̣nh đó , một số loại đệm (đệm phosphat, đệm acetat…) cũng là dung môi hay được sử du ̣ng, những dung môi này đem la ̣i hiê ̣u quả cao , chi phí rẻ [6], [7], [13], [15] Độ phân cực của một số dung môi dùng làm pha động được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Tính chất của 1 số loại dung môi dùng làm pha động

Để tách saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu và định lượng nó dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực Dựa trên độ phân cực của các dung môi ở bảng 3.2 có thể chọn dung môi

có độ phân cực phù hợp Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát pha động gồm đệm phosphat (KH2PO4), methanol (MeOH), Acetonitrile (ACN) với tỉ lệ thể tích khác nhau theo phương pháp đẳng dòng

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động đến diện tích pic và thời gian lưu được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic

là aspartam bị doãng pic Như vậy sẽ làm giảm độ nhạy của phương pháp phân tích Sắc đồ hỗn hợp các chất phân tích với thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 :

3.1.1.4 Khảo sát pH của pha động

Nếu pH của pha động cao, aspartam sẽ bị phân hủy pH của pha động chỉ nên trong khoảng 2-7, vì lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của các hạt silic trên pha tĩnh pH tốt nhất để tách các chất phân tích này là vùng acid vì ở vùng pH này, các chất phân tích tồn tại ở dạng acid nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn Sau khi tham khảo tài liệu [18], chúng tôi sử dụng pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,02M (pH = 4,3) và ACN Điều chỉnh để được dung dịch KH2PO4 pH = 3 và pH = 5 bởi dung dịch acid H3PO4 đặc và dụng dịch KOH trên máy đo pH Tiến hành khảo sát các điểm

pH khác nhau của dung dịch KH2PO4 (pH = 3, pH = 4,3, pH = 5), tỷ lệ dung môi pha động là KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v) Tốc dộ dòng là 1 ml/phút, thể tích bơm mẫu 20

µl, chất chuẩn hỗn hợp có nồng độ 5 ppm Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH pha động đến thời gian lưu của các chất phân tích được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH pha động đến thời gian lưu của chất phân tích

3.1.1.5 Khảo sát chương trình gradient pha động

Để giảm thiểu được chi phí phân tích các chất trên trong thực phẩm, thời gian lưu của 1 chất không được quá dài, nếu thời gian lưu dài, ngoài việc tăng chi phí, các pic sẽ kém nhọn và kém cân đối, làm giảm sự chính xác của phép đo Nhưng nếu pic ra sớm quá sẽ lẫn tạp chất có trong nền mẫu hoặc pic dung môi Nói chung, phù hợp nhất là thời gian lưu từ 6 – 10 phút

Vì chương trình chạy đẳng dòng không đáp ứng được yêu cầu trên nên chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient Cố định các điều kiện sắc ký:

- Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm)

- Pha động: Kênh A (ACN), kênh D (KH2PO4 0,02M,pH=4,3)

- Detector DAD với bước sóng 210 nm, 226 nm, 254 nm

- Mẫu phân tích là hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khoảng 10 ppm

- Tốc độ dòng vẫn giữ 1 ml/phút

Các kết quả như sau:

Chế độ gradient 1: Tỷ lệ dung môi là 95% dung dịch đệm pH= 4,3: 5% ACN (theo

thể tích) được duy trì từ lúc chạy nền đến khi bơm mẫu được 1 phút, sau đó tỷ lệ đó được thay đổi dần đến phút thứ 3 thì đạt 80% đệm : 20% ACN Duy trì tỷ lệ này đến khi kết thúc phân tích 1 mẫu Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 1 được biểu diễn ở hình 3.6

Hình 3.6 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 1

Bảng 3.3 cho thấy: với tỷ lệ 95% dung dịch đệm:5% ACN (theo thể tích) thì các chất phân tích ra rất muộn, trong khi đó, ở tỷ lệ 80% dung dịch đệm:20% ACN (theo thể tích) các chất lại ra rất sớm Kết hợp 2 tỷ lệ trên trong một chương trình gradient, thời gian lưu của các chất ra sớm đã được lùi lại, sau đó lại nhanh chóng kéo các chất còn lại ra nhanh hơn Mặc dù thời gian lưu của chất ra đầu tiên đã là hơn 6 phút nhưng thời gian lưu của chất ra cuối cùng vẫn dài hơn 10 phút Vì vậy chúng tôi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi lên từ sau phút thứ 6 Tốc độ dòng vẫn giữ 1 ml/phút trong chế độ gradient 2

Chế độ gradient 2

Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 được thể hiện ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2

Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2 được biểu diễn ở hình 3.7

Hình 3.7 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2

Mặc dù pic ra cuối cùng vào khoảng 8,70 phút nhưng các pic quá gần nhau,

có thể khó khăn khi tách chất ở nền mẫu thự tế Để cải thiện vấn đề trên, chúng tôi

đã giảm tốc độ dòng tại thời điểm tỷ lệ dung môi cao nhất so với dung dịch đệm

Chế độ gradient 3

Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3 được thể hiện ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3

Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3 được biểu diễn ở hình 3.8

Hình 3.8 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3

Các pic đã giãn ra đôi chút so với chương trình gradient 2 nhưng vẫn cần điều chỉnh giảm tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng để pic giãn phù hợp hơn, đồng thời giúp cho pic của aspartam cân đối

Gradient 4

Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4 được thể hiện ở bảng 3.7

Bảng 3.7 Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4

Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4 được biểu diễn ở hình 3.9

Hình 3.9 Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4

Chất phân tích trong sắc đồ thu được có thời gian lưu hợp lý hơn (bảng 3.8): saccharin: 6,519; aspartam: 8,231; acid benzoic: 9,393; acid sorbic: 9,866 (phút)

Diện tích pic và thời gian lưu của các chất trong 4 chương trình gradient vừa khảo sát được so sánh trong bảng 3.8

Bảng 3.8 Thời gian lưu và diện tích pic theo các chương trình gradient

Chế độ gradient 1

Chế độ gradient 2

Chế độ gradient 3

Chế độ gradient 4 Thời

Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic được chạy bằng chương trình gradient 4 là lớn nhất, pic cũng cân đối hơn Vì vậy chúng tôi chọn chương trình gradient 4 cho việc rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột và giữ cố định điều kiện này cho các bước tiếp theo

Như vậy, nghiên cứu có các thông số để cha ̣y HPLC như sau:

- Cột tách: RP18 - C18 (250mm × 4,6mm × 5μm) - Hãng Agilent

- Nhiệt độ cột: 30OC

- Thể tích bơm mẫu: 20l

- Detecter: DAD ở bước sóng 210 nm, 226 nm, 254 nm

Thành phần pha động: Kênh A: ACN; kênh D: KH2PO4 (pH = 4,3)

- Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng: tuân theo chương trình gradient ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Chương trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ưu

3.1.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu

Trong quá trình chế biến thực phẩm, khi các chất phụ gia thêm vào sẽ liên kết, hòa trộn trong thực phẩm Để xác định được các chất đó, chúng ta phải tách

được các chất phụ gia ra khỏi nền mẫu Chúng tôi chọn mẫu phân tích là mẫu thạch

bách vị để khảo sát xử lý mẫu phân tích hàm lượng saccharin, aspartam, acid

benzoic và acid sorbic vì trong mẫu này chứa cả 4 chất cần phân tích trên

Dự kiến quy trình phân tích tham khảo TCVN 8471:2010 như sơ đồ 3.1:

Sơ đồ 3.1: Qui trình phân tích mẫu dự kiến

Các chất bảo quản hoặc chất tạo ngọt, khi thêm vào mẫu hầu như ở dạng muối của chúng, vì vậy ta có thể chiết chúng ra khỏi nền mẫu bằng nước Tuy nhiên, cung có thực phẩm có mặt cả dạng acid và dạng muối của phụ gia đó Dạng acid ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong MeOH Vì vậy, khi xử lý chúng tôi thêm MeOH vào mẫu trước khi chiết với nước

Trong quy trình xử lý mẫu này, thời gian rung siêu âm và lượng MeOH thêm vào là yếu tố có khả năng ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hai yếu tố này

2ml Dung dịch Carrez 1 Lắc vortex Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)

2ml Dung dịch Carrez 2 Lắc vortex vortex

HPLC

30ml H2O

Định mức bằng nước Lọc qua giấy lọc

Đồng nhất mẫu

Rung siêu âm

Ly tâm MeOH Lắc vortex Rung siêu âm

3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm

Cân 4 mẫu thạch bách vị với khối lượng tương đồng nhau, thực hiện quy

trình xử lý mẫu tương tự nhau trừ thời gian siêu âm Mẫu 1: chỉ lắc với nước, mẫu

2: lắc đều rồi siêu âm 15 phút, mẫu 3: lắc đều rồi siêu âm 30 phút, mẫu 4: lắc đều

và rung siêu âm 60 phút Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.10

Bảng 3.10 Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm

Mẫu 1: không siêu âm

S Sac / Khối lượng mẫu 270,9 279,1 287,9 287,1

S Aap / Khối lượng mẫu 23,30 43,11 46,15 49,54