Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh xenluloza từ phế phụ phẩm nông nghiệp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân, ñược xuất phát từ yêu cầu phát sin

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Trang 3

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân, ñược xuất phát

từ yêu cầu phát sinh trong công việc ñể hình thành hướng nghiên cứu Các số liệu

có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ ñúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong luận văn ñược thu thập ñược trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa từng ñược ai công

bố trước ñây

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Bình

Trang 4

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm Sinh Học đất Ờ Khoa Môi Trường - Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội để hoàn thành ựược luận văn này tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự ựộng viên, giúp ựỡ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến TS đinh Hồng Duyên ựã tận tình hướng dẫn cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo ựã truyền ựạt lại cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua

Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Ban quản lý đào tạo, trường đại học nông nghiệp Hà Nội ựã tạo ựiều kiện cho tôi trong quá trình học tập Sau cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ựến gia ựình ựã luôn tạo ựiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn

Do thời gian có hạn và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học chưa nhiều nên luận văn còn nhiều thiếu sót, rất mong nhận ựược ý kiến góp ý của Thầy/Cô trong

và ngoài trường

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Bình

Trang 5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.1 Khối lượng và thành phần phế phụ phẩm nông nghiệp 3

1.2.3 Biện pháp vùi trực tiếp vào ñất, trên ruộng 8

1.3 Cơ sở khoa học của quá trình phân giải chất thải rắn hữu cơ bằng con

1.3.1 Cấu trúc phân tử và khả năng bền vững của xenluloza 10

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và sinh enzym

1.4 Nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phế phụ phẩm nông

Trang 6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

2.4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật từ các mẫu

2.4.2 đánh giá ựặc tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật 24

2.4.4 đánh giá khả năng phân hủy rơm rạ của chế phẩm VSV qua kết quả thử

nghiệm ở chậu vại và quy mô nhỏ trên ựồng ruộng trong 35 ngày 24

2.5.4 đánh giá ựặc tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật 28

2.5.6 đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật 32

3.1 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật từ các mẫu nghiên cứu 34 3.1.1 Phân lập VSV có khả năng phân giải Xenluloza 34 3.1.2 đánh giá hoạt tắnh enzym ngoại bào của 57 chủng vi sinh vật 35 3.2 đánh giá ựặc tắnh sinh học của V5, T1, X10 và N21 39 3.2.1 Hình thái, kắch thước của V5, T1, X10 và N21 39

Trang 7

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

3.2.3 đánh giá khả năng thắch ứng pH của V5, T1, X10 và N21 45 3.2.4 đánh giá khả năng thắch ứng nhiệt ựộ của V5, T1, X10 và N21 46 3.2.5 đánh giá khả năng kháng kháng sinh của V5, T1, X10 và N21 48

3.3.1 đánh giá tắnh ựối kháng của V5, T1, X10 và N21 51 3.3.2 Sản xuất và ựánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh vật 52

Trang 8

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

enzym ngoại bào của các chủng V5, T1, X10, N21 43Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào của

Bảng 3.9 Kết quả phân tích các chậu vại sau 35 ngày 57

Bảng 3.11 Kết quả phân tích các ñống ủ sau 35 ngày 62Bảng 3.12 Khối lượng phân hữu cơ sau khi ủ ở các công thức thí nghiệm 63

Bảng 3.14 Lượng khí thải vào môi trường do ñốt rơm rạ ngoài ñồng ruộng 65

Trang 9

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lượng rơm rạ trung bình thải ra hàng năm của các nước thuộc khu vực

Hình 1.2 Ước tính lượng rơm rạ ngoài ñồng ruộng ở một số tỉnh vùng ñồng bằng

Hình 3.7 Khả năng gây bệnh lên thực vật của V5, T1, X10 và N21 50

Hình 3.10 Quy trình sản xuất chế phẩm dạng bột từ X10 và N21 54

Trang 10

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Emina : Effective Microorganisms of Institute of Agrobiology

IRRI : International Rice Research Institute

TD và MNPB : Trung du và miền núi phía Bắc

Trang 11

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ðẦU

Hiện nay phế thải là một vấn nạn ảnh hưởng trực tiếp ñến ñời sống con người, các hoạt ñộng xã hội, quá trình sản xuất, chế biến nông công nghiệp Phế thải không chỉ gây ô nhiễm môi trường, gây ñộc hại cho sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng mà còn làm mất ñi cảnh quan văn hóa ñô thị và nông nghiệp – nông thôn Phế thải có nhiều nguồn khác nhau: rác thải sinh hoạt, rác thải ñô thị, phế thải sau thu hoạch, phế thải từ các nhà máy công nghiệp

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng 74% dân số làm nghề nông,

do ñó lượng phế phụ phẩm sau thu hoạch rất lớn và ña dạng Hàng năm trên ñồng ruộng ñể lại hàng triệu tấn phế phụ phẩm, bao gồm: rơm rạ, lõi ngô, rễ cây, thân, lá thực vật… Những phế thải này phần lớn bị ñốt gây ô nhiễm môi trường không khí, một phần ñổ xuống các mương rãnh làm ô nhiễm nguồn nước, một phần ñể lại trên ñồng ruộng là ổ sâu bệnh hại cây trồng phát triển Trong khi ñó ñất ñai canh tác lâu năm bị thiếu chất dinh dưỡng trầm trọng, có nguy cơ bị thoái hóa rất cao…

Xu thế hiện nay là phát triển nền nông nghiệp bền vững - nền nông nghiệp hữu cơ Việc ñó vừa giúp làm sạch, bảo vệ môi trường mà còn tạo ra nguồn phân hữu cơ cung cấp tại chỗ cho cây trồng, giải quyết sự thiếu hụt về phân hữu cơ; ñồng thời giảm chi phí phân bón cho người dân Tuy nhiên, phế phụ phẩm nông nghiệp

có chứa hàm lượng xenluloza cao nên thời gian phân hủy tự nhiên lâu làm mất diện tích ñồng ruộng gây ảnh hưởng ñến môi trường sinh thái và cảnh quan

ðịnh hướng hiện nay là dùng các chế phẩm vi sinh vật trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp ðể có ñược chế phẩm vi sinh vật rút ngắn thời gian ủ phế phụ phẩm ñồng ruộng thì việc phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra enzym ngoại bào xenlulaza, proteaza, amylaza ñể chuyển hóa các chất xơ sợi thành mùn hữu cơ là việc làm rất quan trọng cần thiết hiện nay Xuất phát từ

những vấn ñề nêu trên, tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh xenluloza từ phế phụ phẩm nông nghiệp”

Trang 12

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

Yêu cầu của ựề tài

- Lấy mẫu phế phụ phẩm ựã hoai mục ựể phân lập

- Các thắ nghiệm phải lặp lại, ghi chép rõ ràng, cẩn thận số liệu và thường xuyên chụp ảnh ghi lại quá trình thực hiện ựề tài ựể làm minh họa

- đánh giá các ựặc tắnh sinh học ựể lựa chọn ựược các chủng VSV có khả năng phân giải mạnh xenluloza, protein, tinh bột ựể sản xuất chế phẩm

- Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm VSV sản xuất và so sánh với ựối chứng

và chế phẩm khác thông qua theo dõi các chỉ tiêu ựống ủ

Trang 13

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khối lượng và thành phần phế phụ phẩm nông nghiệp

1.1.1 Khái niệm phế phụ phẩm nông nghiệp

Phế phụ phẩm nông nghiệp là những sản phẩm phụ thu ñược từ cây trồng sau khi thu hoạch như: Rơm rạ, thân ngô, thân lạc, ngọn mía, bã mía, cỏ khô, bã sắn, các loại lá rau…

ðây là loại phế thải có khả năng phân hủy sinh học do nó chứa thành phần hữu cơ, vi sinh vật có thể phân hủy sử dụng làm dinh dưỡng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mình Các chất thải có khả năng phân hủy sinh học tốt như cỏ dại, lá cây…, các chất có khả năng phân hủy sinh học kém như: rơm, rạ, thân cây…

Nguồn gốc phát sinh phế phụ phẩm nông nghiệp từ quá trình chế biến các loại cây công nghiệp, cây lương thực, sản xuất hoa quả, thực phẩm… ðây là nguồn nguyên liệu khổng lồ luôn luôn tồn tại và ngày càng gia tăng

1.1.2 Khối lượng và thành phần phế phụ phẩm nông nghiệp

Hiện nay, phế phụ phẩm nông nghiệp chủ yếu ở nước ta bao gồm các loại như rơm rạ, vỏ trấu, lõi ngô, bã mía, vỏ dừa với tổng lượng lên ñến hàng chục triệu tấn mỗi năm

Việt Nam là nước nông nghiệp có nguồn gốc phế thải sau thu hoạch rất lớn

và ña dạng, ñó là: rơm rạ, thân cây ngô, cây ñậu… Trước ñây nguồn phế phụ phẩm ñược tận dụng triệt ñể như: ủ làm phân, ñun nấu, làm ñộn chuồng hoặc làm thức ăn gia súc Ngày nay ñời sống nông thôn ñược cải thiện sức ép ñun nấu không còn gay gắt, do ñó nguồn phế phụ phẩm sau thu hoạch chủ yếu bị ñốt ngoài ñồng ruộng ðây

là việc làm gây ô nhiễm môi trường trầm trọng và lãng phí bởi vì trong tro chỉ chứa chất khoáng

Nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp ở nước ta ñược ước tính dựa trên khảo sát khối lượng thực thực tế của từng loại phế phụ phẩm trên 1 ñơn vị diện tích, sau ñó dựa vào số liệu thống kê về diện tích gieo trồng hàng năm ñể tính ra tổng khối lượng cho toàn quốc Khối lượng này ñược quy ñổi ra chất khô ñể tiện cho việc so sánh, ñánh giá ở bảng sau:

Trang 14

Bảng 1.1 Ước tắnh khối lượng các nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp

chắnh ở Việt Nam

Tên phế phụ phẩm Diện tắch gieo trồng

(Triệu ha/ năm)

Khối lượng phế phụ phẩm (Triệu tấn chất khô/ năm)

Vì vậy việc sử dụng các chủng VSV có khả năng phân giải các chất xơ sợi ựể phân huỷ rơm rạ, phế thải rau, quả thành mùn và tái chế thành phân hữu cơ sẽ nâng cao hiệu quả sử dụng rơm rạ, không gây lãng phắ ựồng thời trả lại nguồn dinh dưỡng mất ựi hàng năm cho ựất trồng

a Rơm rạ

Theo số liệu thống kê ở Việt Nam, 70% dân số làm nông nghiệp và lúa là cây trồng chắnh, do vậy lượng rơm rạ sau thu hoạch là rất lớn, ước khoảng gần 26,9 triệu tấn/ năm ựứng thứ 2 sau Indonesia (so với các nước thuộc khu vực đông Nam Á)

Trang 15

Hình 1.1 Lượng rơm rạ trung bình thải ra hàng năm của các nước thuộc khu vực

đông Nam Á

Hình 1.2 Ước tắnh lượng rơm rạ ngoài ựồng ruộng ở một số tỉnh vùng ựồng bằng

Sông Hồng (đặng Kim Chi, 2011)

Trang 16

Theo Nguyễn Xuân Thành và cs (2003) thành phần chính của rơm rạ là xenluloza Nếu tính theo sản lượng khô thì trong rơm có: 3 – 4,5% chất ñạm; 1,2 – 2% chất béo; 30% các dẫn xuất không chứa ñạm; 35 – 36% xenluloza; 14 – 15% chất khoáng

Như vậy, rơm rạ là nhóm phế phụ phẩm giàu chất xơ và nghèo chất ñạm, do

ñó rất khó phân hủy tự nhiên và có giá trị dinh dưỡng thấp Vì vậy, việc sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các chất xơ sợi ñể phân hủy rơm rạ thành mùn và tái chế thành phân hữu cơ bón trả lại cho cây trồng sẽ nâng cao hiệu quả sử

dụng rơm rạ

b Thân, lá cây ngô

Quá trình chế biến nông sản ñã thải ra môi trường khoảng 1 triệu tấn lõi ngô mỗi năm Mặt khác theo một nghiên cứu gần ñây cho thấy cây ngô sau thu hoạch có thành phần chính gồm xenluloza (37,2%); hemi-xenluloza (24,1%) và lignin (17,8%) chứng tỏ khả năng khó phân giải của loại phế phụ phẩm này Hiện nay, lõi ngô mới ñược người dân sử dụng một phần làm chất ñốt, một phần rất nhỏ ñược dùng ñể trồng nấm, còn lại chủ yếu thải bỏ ra ngoài vệ ñường, dòng suối hoặc ñốt lấy tro nên tất yếu gây ô nhiễm môi trường

c Lá và ngọn mía

Lá mía và ngọn mía là phế thải chính của các vùng ñất trồng mía Lá mía và ngọn mía chiếm một khối lượng lớn từ 25-30% tổng sản lượng của cây mía, và ñây là một chất thải ñầu tiên thu ñược từ cây mía

Trong thời kỳ sinh trưởng phồn thịnh của mía, diện tích lá gấp 6 – 7 lần diện tích ñất trồng Thành phần lá mía: hàm lượng C: 46 – 47 %; hàm lượng H: 7 – 7,3 %;

Trang 17

năm cho 2 con bò hay trong 4 tháng thiếu cỏ của vụ ñông xuân/mùa khô cho 6 con bò Trong lá mía, ngọn mía thì xenluloza, hemixenluloza, lignin là 3 thành phần chính

1.2 Các biện pháp xử lí phế phụ phẩm nông nghiệp

1.2.1 ðốt

ðây là biện pháp khá phổ biến ở nước ta Quá trình ñốt diễn ra nhanh, dễ làm

và xử lí ñược cùng lúc một lượng lớn chất thải rắn hữu cơ nhưng bù lại nó làm mất gần như hoàn toàn lượng N Lượng P mất ñi khoảng 25%, K mất ñi khoảng 20% và

S mất từ 5 – 60% Lượng dinh dưỡng mất mát lại tuỳ thuộc vào cách thức ñốt Nguyễn Xuân Thành và cs., (2000); Lê Văn Nhương và Nguyễn Lan Hương, (2001) cho rằng biện pháp ñốt gây ra nhiều vấn ñề về môi trường như khói, bụi ðặc biệt việc ñốt phế phụ phẩm thường chỉ tập trung vào mùa thu hoạch nên việc ñốt tàn

dư thực vật ñại trà trên diện rộng còn gây ra rất nhiều khó khăn phiền toái cho giao thông nông thôn Mặt khác ñốt tàn dư trên ñồng ruộng ñã phá hủy khu hệ vi sinh vật ñất làm nhiệt ñộ mặt ñất tăng cao gấp nhiều lần bình thường

Torigue và cs., (2000); Chen, Kang-Shin và cs., (2008) cho rằng biện pháp ñốt rơm rạ là biện pháp ñơn giản, dễ làm, giảm giá thành, và giảm thiểu sâu bệnh hại nên nông dân vẫn thường xuyên áp dụng Nhưng ñây cũng là biện pháp gây mất mát một lượng lớn chất dinh dưỡng, và gây ô nhiễm môi trường không khí nghiêm trọng, ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người Vì vậy hiện nay một số nước ñã ban hành luật cấm ñốt phế thải nông nghiệp trên ñồng ruộng, ví dụ ở Mỹ, Ấn ðộ

1.2.2 Ủ làm phân

Roger (1993) nêu rõ “ủ phân (composting) là quá trình phân huỷ hợp chất hữu cơ tự nhiên (chủ yếu là ligno – xenluloza) bởi quần thể vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, ñộng vật nguyên sinh…) dưới tác ñộng của ñộ ẩm, nhiệt ñộ không khí tạo nên sản phẩm cuối cùng là hợp chất mùn và chất dinh dưỡng mà cây trồng

có thể hấp thụ ñược”

Từ rất xa xưa, con người ñã biết ủ lá cây, phân gia súc thành phân hữu cơ ñể bón cho cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế cao, ghi nhận tại Ai Cập từ 3.000 năm trước Công nguyên như là một quá trình xử lý chất thải nông nghiệp ñầu tiên trên

Trang 18

thế giới Người Trung Quốc ñã ủ chất thải từ cách ñây 4.000 năm, người Nhật ñã sử dụng compost làm phân bón từ nhiều thế kỷ Nhưng việc sản xuất và sử dụng phân

ủ chỉ theo những kinh nghiệm dân gian, chưa có những nghiên cứu ñầy ñủ về phương pháp này

Năm 1943, quá trình ủ compost ñược nghiên cứu một cách khoa học và báo cáo bởi giáo sư người Anh, Howard thực hiện tại Ấn ðộ Howard ñã ñưa ra

“phương pháp hữu cơ” tức là trộn xác hữu cơ với phân gia súc theo tỉ lệ 3:1 có ñảo trộn thường xuyên Ông ñã phát triển phương pháp ủ trên những loại nguyên liệu khác nhau theo từng lớp và có ñảo trộn ñể tạo ñiều kiện hiếu khí ðây là phương pháp Indore, phương pháp mang tên nơi mà Howarf ñang làm việc

Từ năm 1926 ñến năm 1941, Warksman và cộng tác viên nghiên cứu sự phân hủy hiếu khí bã thực vật, ñộng vật Ông ñã kết luận nhiệt ñộ và vi sinh vật có ảnh hưởng ñến sự phân hủy chất thải hữu cơ

Năm 1980, Haug ñã ñưa ra kết luận về việc làm phân ủ như sau: ủ chất thải

là quá trình phân giải sinh học các chất hữu cơ dẫn tới sự ổn ñịnh khối ủ trong tồn trữ và sử dụng như một dạng phân hữu cơ

Tuy nhiên, Nguyễn Xuân Thành và cs (2000) cho rằng sử dụng phương pháp này rất mất thời gian vì có thể khu hệ vi sinh vật có sẵn trong ñống ủ cần một thời gian nhất ñịnh ñể nhân nhanh sinh khối Do ñó, nếu phân lập các chủng vi sinh vật phù hợp, sau ñó tuyển chọn ñánh giá ñặc tính sinh học và nhân sinh khối rồi bổ sung vào ñống ủ, sẽ rút ngắn thời gian ủ và làm tăng dinh dưỡng của ñống ủ

Nhìn về tổng thể, quá trình ủ là quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ xảy ra do nhóm vi sinh vật dị dưỡng như: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và ñộng vật nguyên sinh, trong ñó vai trò của hệ sinh vật phân giải xenluloza và ligin là rất quan trọng

1.2.3 Biện pháp vùi trực tiếp vào ñất, trên ruộng

Danutawat và Nguyễn Thị Kim Oanh (2007) thì phế phụ phẩm sau thu hoạch ñược vùi trực tiếp vào ñất, sau ñó các vi sinh vật bản ñịa tiến hành nhân sinh khối, phân huỷ chúng ñể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng vụ sau, cải thiện các

Trang 19

ñặc tính lý hoá, sinh học của ñất, nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất ñể sản xuất ổn ñịnh lâu dài ðây là việc làm không những trả lại cho ñất hầu hết các nguyên tố dinh dưỡng cây trồng ñã lấy ñi từ ñất, mà còn kiểm soát ñược sâu bệnh và mầm mống của nó còn sót lại trên những phế thải này

ðề tài KN 01-10-08, “ Sử dụng hợp lý sản phẩm phụ nông nghiệp nhằm tăng năng suất cây trồng và ổn ñịnh ñộ phì nhiêu của ñất bạc màu” do ðỗ Thị Xô, Nguyễn Văn ðại thực hiện ñã chứng minh: vùi phế phụ phẩm nông nghiệp ñã làm tăng năng suất cây trồng từ 4-21% so với ñối chứng; các công thức vùi phế phụ phẩm cả 3 vụ cho năng suất cao hơn các công thức ñược vùi phế phụ phẩm 1 vụ; vùi phế phụ phẩm có thể tiết kiệm ñược phân khoáng

Việc vùi rơm rạ vào ñất mặc dù tác dụng lên năng suất lúa vụ kế tiếp là không lớn so với việc lấy rơm rạ ra khỏi ñồng ruộng, nhưng về lâu dài thì ảnh hưởng này là thấy rõ Nếu kết hợp song song việc bón phân hàng vụ cho lúa cùng với việc vùi rơm rạ vào ñất sẽ ñảm bảo ñược dinh dưỡng N, P, K và S cho lúa, và nhiều khi còn làm tăng ñược dự trữ dinh dưỡng cho ñồng ruộng Việc vùi rơm rạ vào ñất ướt , sẽ gây ra tình trạng cố ñịnh tạm thời của ñạm (N) và làm tăng lượng metan (CH4) phóng thích trong ñất, gây ra tình trạng tích lũy khí nhà kính

Bên cạnh những lợi ích thì việc vùi rơm rạ vào ñất có một số nhược ñiểm như: tốn thêm chi phí, có thể gây ra một số bệnh lúa, có thể làm chậm sự sinh trưởng và làm giảm năng suất lúa

1.2.4 Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Nguyễn Xuân Trạch (2004) khẳng ñịnh phương pháp sử dụng phế phụ phẩm làm thức ăn chăn nuôi ñược cho là phương pháp thay thế vững chắc hơn so với phương pháp ñốt và vùi phế thải hữu cơ vào ñất, ñặc biệt ở những nơi mà thức ăn gia súc khan hiếm, tuy vậy phạm vi áp dụng của phương pháp cũng chỉ bó hẹp ở các loại tàn dư thực vật Phương pháp chế biến rơm rạ, thân cây bắp, ngọn mía, lá mía… bằng cách xử lý urê – vôi và dùng làm thức ăn cho gia súc có sừng (trâu, bò,

dê, cừu) ñã giúp cho năng suất sữa của bò tăng thêm 10 – 15%, bò thịt tăng trọng lượng hàng tháng từ 12 – 15kg

Trang 20

Trước ñây chăn nuôi ở quy mô hộ gia ñình rất phổ biến thì phế thải trong trồng trọt phần lớn ñược sử dụng làm thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Ở miền núi, do phế phụ phẩm sau thu hoạch ngô thường rất phổ biến nên ở một số nơi người dẫn vẫn tận dụng thân, lá ñể cho trâu bò ăn thay vì rơm rạ như ở khu vực ñồng bằng ðây là biện pháp tận dụng triệt ñể sản phẩm phụ trong trồng trọt ñể tạo

ra năng suất thứ cấp, góp phần thu nhập cho nông dân Tuy nhiên, việc tận dụng triệt ñể này lại là một trong những nguyên nhân gây thiếu dinh dưỡng cho ñất trồng Hiện nay, do chăn nuôi phát triển theo hướng công nghiệp, thực vật không ñược sử dụng làm thức ăn mà ñược bỏ lại trên ñồng ruộng khá nhiều Nhược ñiểm lớn nhất có thể kể ñến của phương pháp là không áp dụng ñược cho phế thải ngành

1.3.1 Cấu trúc phân tử và khả năng bền vững của xenluloza

Theo Weinberg (1973), xenluloza là thành phần chính của tế bào thực vật chiếm khoảng 20% trong một số loài cỏ, 45% trên gỗ và trên 90% trên sợi bông Xenluloza kết hợp với hemixenluloza và lignin tạo nên ñộ cứng cho thành tế bào Xenluloza là polysacarit mạch thẳng gồm 1.400 ñến 12.000 gốc β – D glucopyranoza liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 glucozit thành dạng chuỗi, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n Xenluloza có cấu tạo sợi và các sợi liên kết với nhau bằng các liên kết hydro và các liên kết Vandervan tạo thành các bó nhỏ gọi là micro fibrin và tạo nên cấu trúc mixen của xenluloza Các sợi micro fibrin có chiều rộng từ 100 – 300Å và có chiều dài từ 40 – 100Å

Theo Coughlan và Folan (1979), trong tự nhiên xenluloza là một trong những hợp chất khá bền vững, chúng không tan trong nước mà chỉ bị trương lên do hấp thụ nước Xenluloza là một chất tương ñối phức tạp chỉ bị thủy phân khi ñun nóng với axit hoặc kiềm ở nồng ñộ cao, bị thủy phân ở nhiệt ñộ 40 – 500C bởi enzym

Trang 21

xenlulaza tuy vậy lại bị thủy phân ở ñiều kiện bình thường bởi phức hệ xenlulaza của vi sinh vật (VSV)

Nguyễn Thị Phương Chi và cs., 2001 cho rằng hàng năm thảm thực vật trên trái ñất tổng hợp ñược một khối lượng lớn hydrocacbon Trong ñó tinh bột là thức ăn cho con người và ñộng vật Phần còn lại chủ yếu là xenluloza (chiếm tới 50% trên tổng số hydratcacbon), ít hơn là các thành phần con người và ñộng vật không sử dụng ñược như lignin, hemixenluloza, vì thế chúng bị ứ ñọng và gây ô nhiễm môi trường

1.3.2 Cơ chế phân giải xenlulaza

Sinh tổng hợp xenluloza của vi sinh vật

Reese và cs., 1950 khẳng ñịnh phân giải xenluloza tự nhiên là một quá trình phức tạp ñòi hỏi sự tham gia phối hợp của phức hệ enzym xenlulaza Sự ñiều hòa sinh tổng hợp xenlulaza ñược thực hiện nhờ cơ chế cảm ứng, kìm hãm xenluloza tự nhiên và các dẫn xuất của chúng là những tác nhân cảm ứng ñặc hiệu với các thành phần trong phức hệ xenluloza Quá trình tổng hợp xenlulaza chịu sự ñiều khiển của

bộ máy di truyền và các quá trình sinh hóa Nhiều tác giả khẳng ñịnh xenlulaza là enzym cảm ứng và chất cảm ứng tốt nhất là xenluloza và lactoza Lê Văn Nhương

và Nguyễn Lan Hương (2001) cho rằng thực tế VSV tổng hợp xenlulaza mạnh nhất trên môi trường có hàm lượng xenluloza cao nhất hay có chất cảm ứng thích hợp

Vì vậy, có thể coi sự tổng hợp xenlulaza là có tính cảm ứng không chặt chẽ vì xenluloza là cơ chất không hòa tan, phân tử lớn, bản thân không thể thâm nhập vào

tế bào ñể gây ra các phản ứng sinh hóa Vì vậy ñể thu ñược nguồn enzym cao người

ta thường sử dụng cơ chất không thể thủy phân như: Bã mía, rơm rạ, giấy loại hoặc

có thể nuôi cấy kết hợp với VSV ñồng hóa tốt xenlobioza

Agrios, G.N (1997) nhận ñịnh rằng sự kìm hãm tổng hợp xenlulaza xảy ra rất mạnh mẽ trong môi trường có chứa hydratcacbon dễ tiêu, ñặc biệt là glucoza Khi

ñó, quá trình sinh tổng hợp xenlulaza chưa bắt ñầu Thậm chí khi tế bào ñang tổng hợp xenlulaza người ta bổ sung glucoza thì cường ñộ tổng hợp xenlulaza bị giảm ngay lập tức

Nhiều sản phẩm của chu trình Kerbs (axit nitric, succinic…) là chất ức chế quá trình sinh tổng hợp xenlulaza Nguồn nitơ hữu cơ tác ñộng rõ rệt tới quá trình

Trang 22

tổng hợp xenlulaza, khi nuôi Thermoactinomyces trên môi trường có avicel nếu bổ sung nước chiết nấm men hay pepton thì khả năng sinh C1, C2 sẽ tăng lên

Cơ chế phân giải xenluloza

Quá trình phân giải xenluloza của VSV ñược thực hiện bởi phức hệ enzym xenlulaza Phức hệ này gồm 3 enzym chủ yếu sau ñây:

- Endoglucanaza hay CMCaza có khả năng cắt ñứt các liên kết bên trong phân tử xenluloza làm giảm nhanh chiều dài chuỗi, làm tăng chậm các nhóm khử, thủy phân liên kết β – 1,4 glucozit một cách tùy tiện và giải phóng xenlodextrin, xenlobioza và glucoza Enzym này phân giải mạnh mẽ các xenluloza hòa tan nhất là dạng xenluloza vô ñịnh hình nhưng hoạt ñộng rất yếu ở vùng kết tinh

- Exoglucanaza có khả năng tấn công chuỗi xenluloza từ ñầu không khử và giải phóng xenlobioza và glucoza Enzym này không phân giải xenluloza kết tinh cũng như các xenluloza hòa tan, tác dụng yếu lên CMC nhưng hoạt ñộng mạnh lên xenluloza vô ñịnh hình

Theo Nguyễn Xuân Thành và cs (2000); Coughlan và Folan (1979); Lafferty

và Maier (1982) nhận ñịnh rằng:

- β – 1,4 glucozidaza hay xenlobiaza có khả năng thủy phân xenobioza hay xenlo – oligosacazit (xenlodextrin) hòa tan trong nước giải phóng glucoza Enzym này có hoạt tính cực ñại trên xenlobioza và hoạt ñộng giảm dần theo chiều dài của chuỗi xenlodextrin Chức năng của β – 1,4 glucozidaza chỉ là ñiều chỉnh sự tích lũy chất cảm ứng của enzym xenlulaza

Về ñộng học phản ứng của các enzym này, Reese và các cộng sự lần ñầu ñưa

ra cơ chế phân giải vào năm 1950

Reese Elwyn và cs., (1950) nói rằng enzym C1 tương ứng với endo – glucanaza là “tiền nhân tố thủy phân” hay enzym không ñặc biệt làm biến dạng xenluloza tự nhiên thành các chuỗi xenluloza hoạt ñộng có mạch ngắn hơn, sau ñó enzym Cx tương ứng với exo – glucanaza tiếp tục phân cắt, giải phóng các ñường hòa tan và cuối cùng tạo thành glucozo dưới tác dụng của xenlobioza

Trang 23

Năm 1988, Klyosov và các cộng sự lại cho rằng quá trình chuyển hóa xenluloza có thể xảy ra do nhiều phức hệ enzym xenlulaza, sơ ñồ sau thể hiện những bước chính của quá trình thủy phân xenluloza:

Hình 1.3 Quá trình phân hủy xenluloza (Klyosov, 1995)

Với E1 : Endoglucanaza E3 : Xenlobioza

E2 : Xenlobiohydrolaza E4 : Exoglucozidaza

Con ñường (4) E4 là enzym xúc tác, nhưng trong trường hợp còn có cả E1hay E2 có khi cả hai enzym này cùng xúc tác với E4.

Con ñường (5) ngoài E1 còn có cả E2 cùng xúc tác

Klyosov (1995) khẳng ñịnh các thành phần trên ñi theo con ñường nào phụ thuộc vào cấu trúc phân tử cơ chất và mức ñộ polime hóa, ñiều kiện thủy phân, thành phần phức hợp xenlulaza và một số yếu tố khác

Vi sinh vật phân giải xenluloza:

Trong tự nhiên, khu hệ VSV có khả năng phân giải xenluloza rất ña dạng và phong phú ngoài nấm mũ lớn (Mushrooms) còn bao gồm cả vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn ðể phân giải xenluloza tự nhiên ñòi hỏi sự tham gia phối hợp của phức hệ enzym xenlulaza rất phức tạp Các VSV thường không có khả năng tạo ra ñược một

tỉ lệ các enzym cân ñối Vì thế trong quá trình phân giải xenluloza cần có sự hiệp ñồng ñể tạo ra phức hệ enzym xenlulaza hoàn chỉnh

E(2) Xenlobioza

E3 (3) Glucoza

E4 (4) E

(5)

Trang 24

Trichoderma reesei, Trichoderma viride, tiếp ựến là Aspergillus niger, Fusarium solani, Penicillim pinophinum, Sporotrichum pulverulentum

Các loài nấm khác nhau có khả năng phân giải xenluloza khác nhau Mandels

và các cộng sự nhận thấy rõ ảnh hưởng của nguồn cacbon ựối với nấm Trichoderma

viride Nguồn cacbon thắch hợp cho tổng hợp xenlulaza ở Aspergillus fumigatus ưa

ấm và ưa nhiệt là giấy lọc hay rơm nghiền Ở Aspergillus tereus là giấy lọc còn ở

Trichoderma viride là hỗn hợp cám và củ cải ựường Bổ sung các chất dễ ựồng hóa

như gluco xenlobioza vào môi trường nuôi cấy chứa xenluloza có thể làm pH của môi trường giảm ựi cùng sự giảm hoạt tắnh xenlulaza của các chủng nấm

Trichoderma

Các loài nấm phân giải xenluloza thường gặp trong ựống ủ như: Alternaria,

Aspergillus, Chaetominum, Copprinus, Fomes, Fusarium, Myrotheccium, Penicillium,

Polypones, Rhizoctonia, Rhizopus, Trichoderma, Verticilli Ầ

+ Jacob (1908) ựã nhận ựịnh về Vi khuẩn (VK) như sau: đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về VK phân giải xenluloza Năm 1785 lần ựầu tiên L.Popov ựã phát hiện ra rằng các VK kỵ khắ tham gia vào quá trình lên men xenluloza Thế kỷ 19 các nhà khoa học ựã phân lập ựược một số VSV kỵ khắ có khả năng phân giải xenluloza

từ phân và dạ cỏ của ựộng vật nhai lại

Sin (1951) cho rằng vi khuẩn cũng có khả năng phân giải xenluloza nhưng cường ựộ không mạnh bằng nấm sợi Do vậy ựể phân giải xenluloza tự nhiên, các loài VK khác nhau phải phối hợp với nhau ựể cùng phân giải trong mối quan hệ hỗ sinh Các VK hiếu khắ có khả năng phân giải xenluloza khá mạnh như

Cellulomonas, Vibrio, Archomobacter Một số niêm vi khuẩn có khả năng này thì

ựáng chú ý là Cytophara, Sporocytophara, SoragiumẦ

+ Xạ khuẩn (XK): Bên cạnh nấm và VK, XK cũng có khả năng phân giải

xenluloza, ựáng chú ý là Streptomyces, Actinomyces, Nocardia, Mycromonospora

Sin (1951) nhận ựịnh XK phân giải xenluloza ựược phân lập từ các mẫu ựất, mùn rác, mẫu bùn, những nơi có chứa xenluloza Người ta thường sử dụng XK ựặc

biệt là Streptomyces trong việc phân hủy rác sinh hoạt Những XK này thường

Trang 25

thuộc nhóm ưa nhiệt, sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt ñộ 450 – 500C, rất thích hợp với quá trình ủ rác thải

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và sinh enzym của vi sinh vật

a) ðộ ẩm

Eliot (1997); Ken-Ichiro và cs., (1999) ñã cho rằng ñộ ẩm của ñống ủ là yếu

tố rất quan trọng ảnh hưởng ñến số lượng, thành phần và hoạt ñộng của vi sinh vật,

vì vậy ñộ ẩm ảnh hưởng ñến nhiệt ñộ và thời gian kết thúc quá trình ủ Trong quá trình ủ phân, vi sinh vật cần ñộ ẩm ñể phân huỷ chuyển hoá các chất dinh dưỡng thành các chất mới, mặt khác khi hoạt ñộng vi sinh vật cũng tạo ra nước

Eliot (1997); Waskman and Gerretsen (1931) khẳng ñịnh rằng ñộ ẩm cao quá 65% sẽ ngăn cản dòng khí thổi vào ñống ủ do nguyên liệu quá ướt, các khe hổng sẽ bị lấp ñầy nước làm giảm diện tích tiếp xúc của phế thải với không khí, các vi sinh vật hiếu khí không phát triển ñược, quá trình yếm khí xảy ra gây khó chịu, ñồng thời kéo dài thời gian ủ Nếu ñộ ẩm quá thấp ở dưới mức 40% sẽ không ñủ nước cho các hoạt ñộng trao ñổi chất của các vi sinh vật, do ñó quá trình ủ sẽ chậm lại Còn nếu ñộ ẩm ở dưới mức 20% thì chỉ còn rất ít vi sinh vật hoạt ñộng ðộ ẩm thích hợp nhất cho quá trình ủ là 40 – 60%

b) pH

Theo Roger (1993); Jan Beyea and cs., (1995), pH ban ñầu của nguyên liệu dùng làm phân ủ cần dao ñộng trong khoảng 5-7 Giai ñoạn ñầu của quá trình ủ thường pH bằng 6, sau 2-4 ngày pH giảm xuống 5 do axit hữu cơ ñược sinh ra, tại thời ñiểm này các loại nấm chịu axit ñóng vai trò cực kỳ quan trọng trong ñống ủ Tuy nhiên, trong quá trình ủ khi nhiệt ñộ tăng cao, các vi sinh vật nhanh chóng phân huỷ các axit hữu cơ này, do ñó pH dần dần tăng lên ñến mức trung tính thậm chí hơi kiềm (pH 7,5-8,5)

Theo Jan Beyea và cs (1995), việc khống chế pH trong ủ hiếu khí là không quan trọng lắm, nhưng nếu xảy ra quá trình yếm khí sẽ sinh ra nhiều axit hữu cơ do ñó làm giảm pH của ñống ủ Cho cacbonat, vôi và các chất có tính kiềm khác vào trong

Trang 26

ñống ủ có vai trò chất ñệm làm cho pH không xuống quá thấp, nhưng nếu bổ sung quá nhiều vào ñống ủ ñể pH chạm ñến 9 sẽ gây ra hiện tượng mất nitơ dưới dạng khí ammoniac bay lên do ñó làm mất nguồn nitơ cho vi sinh vật, vì vậy mà quá trình phân huỷ các chất sẽ bị chậm lại

c) ðộ thông khí

Roger (1993) nhận ñịnh không khí nhằm cung cấp oxy cho các vi sinh vật hiếu khí tiến hành quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ nhanh chóng, không gây mùi khó chịu là hai ñặc ñiểm nổi bật của quá trình ủ hiếu khí so với ủ yếm khí, ñồng thời làm giảm ñộ ẩm ban ñầu cao trong ñống ủ, có tác dụng tản nhiệt trong ñống ủ Oxy ñược cung cấp thông qua hai con ñường chính ñó là qua sự khuếch tán của không khí và thổi khí cưỡng bức Lượng oxy cung cấp bởi khuếch tán không ñáng kể chiếm 0,5-5% tổng lượng oxy ñòi hỏi do vậy thổi khí cưỡng bức là nguồn cung cấp khí chủ yếu của phương pháp ủ hiếu khí

d) Tỷ lệ C/N

Nakasaki and Yaguchi (1992); Nishan and Has (1995); Richard (1992) cho rằng ñể quá trình ủ thật sự hiệu quả thì vi sinh vật cần ñược cung cấp ñầy ñủ các chất dinh dưỡng thiết yếu ở dạng có thể dùng ñược, với lượng ñầy ñủ và tỷ lệ thích hợp Các chất dinh dưỡng ñược vi sinh vật ñòi hỏi với lượng lớn bao gồm: cacbon, nitơ, photpho và kali Vi sinh vật dùng cacbon như là một nguồn cung cấp năng lượng, ngoài ra chúng cũng dùng cacbon và nitơ ñể tổng hợp nên protein, xây dựng

tế bào, và sinh sôi nảy nở Photpho và kali cũng rất cần thiết cho quá trình trao ñổi chất và sinh sản của tế bào Trong quá trình ủ thì hoặc là cacbon hoặc là nitơ sẽ là nhân tố hạn chế quá trình phân huỷ diễn ra nhanh

Gray và cs (1971b); Hau (1980) khẳng ñịnh tỉ lệ C/N là tỉ lệ giữa tổng lượng cacbon và tổng lượng nitơ có trong thành phần phế thải Nếu tỷ lệ C/N nhỏ hơn 30 thì quá trình ủ phân diễn ra rất nhanh chóng Nếu tỷ lệ C/N >50 sẽ ức chế

sự sinh trưởng của vi sinh vật, do ñó làm chậm quá trình phân giải và chất lượng sản phẩm kém Nếu tỷ lệ C/N nhỏ hơn 30 (tức là nồng ñộ C thấp và nồng ñộ N cao) thì ở giai ñoạn ñầu của quá trình ủ sự sinh trưởng của vi sinh vật và sự phân

Trang 27

huỷ sẽ diễn ra rất nhanh Tuy nhiên, chính vì thế mà lượng oxy có thể dùng nhanh chóng hết và quá trình ủ chuyển sang giai ñoạn yếm khí, do ñó nếu ñống ủ không ñược thông khí thì mùi hôi sản phẩm của quá trình yếm khí sẽ xuất hiện Khi lượng nitơ quá nhiều thì nitơ sẽ bị mất dưới dạng khí N2 hoặc NH3 và hiện tượng này cũng gây ñộc cho quần thể vi sinh vật do ñó sẽ ảnh hưởng ñến quá trình ủ Theo Jan Beyea và cs (1995); Nishan and Has (1995) nếu tỷ lệ C/N quá thấp thì khi sản phẩm ñược bón vào ñất có thể gây hại cho cây trồng gây hiện tượng “ñói nitơ” của cây

Gotass nghiên cứu về qui trình ủ có mặt của vi sinh vật ñã cho rằng có ba trường hợp xảy ra : (1) Khi lượng cacbon trong phế thải có ít thì một lượng lớn các khí NxOy và NH3 sẽ thoát ra ngoài không khí; (2) Tỷ lệ C/N thích hợp cho VSV sử dụng thì nitơ mất ñi không ñáng kể; (3) Khi lượng nitơ có ít hơn lượng cacbon thì một số vi sinh vật sẽ chết và nitơ chứa trong tế bào của chúng sẽ ñược tái sử dụng

e) Nhiệt ñộ

Nakasaki cho rằng nhiệt ñộ là nhân tố then chốt quyết ñịnh tốc ñộ phân huỷ các chất xơ sợi trong ñống ủ Nhiệt ñộ của ñống ủ phụ thuộc rất nhiều vào việc nhiệt ñộ do vi sinh vật tạo ra ñã bù lại lượng nhiệt bị mất do quá trình thông khí kiểm soát, sự làm mát bề mặt, và việc ñộ ẩm giảm Theo McKinley and Vestal (1985); Strom (1985); Finstein và cs (1986), nhiệt ñộ từ 35-550C là dải nhiệt ñộ tối thích cho quá trình ủ bởi vì có rất nhiều vi sinh vật khác nhau cùng tham gia vào việc phân huỷ các hợp chất hữu cơ Nếu nhiệt ñộ ở dưới 200C, các

vi sinh vật không thể hoạt ñộng và quá trình phân huỷ sẽ diễn ra rất chậm Nếu nhiệt ñộ cao hơn 650C, một số chủng vi sinh vật bị giết hoặc bị hạn chế sinh trưởng phát triển, và sự ña dạng của vi sinh vật giảm xuống do ñó dẫn ñến tốc ñộ của quá trình phân huỷ sẽ chậm ñi

Finstein và cs (1980) khẳng ñịnh nấm và vi khuẩn sinh axit xuất hiện ở giai ñoạn nhiệt ñộ khoảng 25- 300C ðây là những chủng ưa ấm và vai trò quan trọng của chúng là làm tăng nhiệt ñộ của ñống ủ tạo ñiều kiện cho vi sinh vật ưa nhiệt phát triển Ngoài ra, vi khuẩn ưa ấm phát triển mạnh trong thời gian ngắn

Trang 28

ñã sinh ra enzyme thuỷ phân phần lớn protein và hydratcacbon dễ phân huỷ Khi nhiệt ñộ tăng hơn 400C các chủng ưa ấm ñược thay thế bởi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt, vi khuẩn có bào tử phát triển ở nhiệt ñộ khoảng 60-700C Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt có vai trò quan trọng trong việc phân huỷ các hợp chất hữu cơ: vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân huỷ mạnh protein, lipit, hemixenluloza, xạ khuẩn phân huỷ tích cực tinh bột và làm giảm ñáng kể hàm lượng nước trong ñống ủ, còn nấm ưa nhiệt có khả năng phân huỷ mạnh xenluloza và hemixenluloza ðạt ñược nhiệt ñộ cao trong quá trình ủ phân có thể giết chết ñược vi sinh vật có hại trong ñó, giảm lượng nước có nhiều trong nguyên liệu phế thải tươi, thúc ñẩy quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ nhanh Và cuối cùng khi nhiệt ñộ ñống ủ hạ xuống dưới 400C thì nấm và vi khuẩn ưa ấm lại xuất hiện trở lại tiếp tục phân huỷ các chất hữu cơ ñể hoàn tất quá trình ủ

1.4 Nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới

Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học ñã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kỵ khí có khả năng phân giải xenluloza Những năm ñầu của thế kỷ XX người ta phân lập ñược các loài vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza thì niêm vi khuẩn là quan trọng nhất

Năm 1946, Hungate ñã phân lập ñược loài xạ khuẩn có tên là Micromonospora

propionici có khả năng thủy phân xenluloza cao Sau ñó vào năm 1966, Hungate

Presvot ñã tiếp tục phân lập ñược 9 chủng vi khuẩn yếm khí có hoạt tính xenlulaza

thuộc chi: Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium, Ruminococcus và Cillobacterium

Nối tiếp các nghiên cứu của Hungate và Shuval (1981); năm 2007, Hesham khi ñi nghiên cứu về khả năng xử lý rơm rạ của 3 chủng xạ khuẩn thuộc

chi: Micromonospora, Streptomyces và Nocardiodes ñã kết luận rằng: việc bổ

sung vào xạ khuẩn ñã giúp ñẩy nhanh quá trình phân hủy rơm rạ và làm giảm thể tích của ñống ủ; sau 3 tháng ở ñống ủ có bổ sung xạ khuẩn thể tích ñống ủ giảm xuống 38,6 – 64% so với ban ñầu trong khi ñó ñống ủ ñối chứng thể tích ñống ủ

Trang 29

chỉ giảm 13,6% so với trước khi ủ; việc bổ sung xạ khuẩn vào ñống ủ còn làm tăng chất hữu cơ (organic matter) lên 34,9% và hàm lượng nitơ lên 0,59mg/g, trong khi ñó ở ñống ủ ñối chứng không bổ sung xạ khuẩn chất hữu cơ là 20% và hàm lượng nitơ chỉ ñạt 0,2 mg/g

Stutzenberger ñã nuôi cấy Thermonospara curyata trên môi trường chứa

xenluloza và cao nấm men có bổ sung 0,1% bông nghiền nhỏ thì thấy chúng có khả năng tích lũy enzym phân hủy xenluloza

Jeris và Regan (1973) thấy trong ñống ủ có các loài vi khuẩn phân giải

xenluloza sau: Achromobacter, Clostridium, Cellulomonas, Cytophaga, Cellvibrio,

Bacillus, Pseudomonas, Sorangium, Sporocytophara, Và các loại nấm phân giải

xenluloza như: Alternaria, Aspergillus, Chactomium, Fomes, Fusarium,

Myrothecium, Polyponus, Rhizoctonia, Rhozopus,

Tại New Delhi - Ấn ðộ, từ năm 1985 ñến 1987 , Gaur và Bhardwaj ñã phân lập và tuyển chọn ñược rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenluloza

và lignin Sau ñó Gaur ñã sử dụng các chủng nấm Trichurus spiralis, Trichoderma

viride, Paecilomyces fusisporus, Aspergillsus sp ñể ñưa các ñống ủ (rơm, lá khô) và

kết quả cho thấy: hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong vòng một tháng ñầu tiên của quá trình ủ; và chỉ trong 8 ñến 10 tuần rơm rạ ñã phân hủy hoàn toàn thành một loại phân hữu cơ có chất lượng tốt Trong phân này chứa khoảng 1,7% N, và tỷ lệ C/N là 12:3

Ở Trung Quốc cũng có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập vi sinh vật và ứng dụng trong xử lý phế thải hữu cơ Năm 2005 Wen-Jing Lu và ñtg ñã phân lập ñược 5 chủng vi khuẩn ưa ẩm xenluloza cao từ phế thải rau quả v vi sinh và thân lá

hoa thuộc giống Bacillus, Halobacillus, Aeromicrobium, Brevibacterium Khi ứng

dụng các chủng vi sinh vật này ñể ủ phế phụ phẩm rau quả và thân lá hoa cho thấy:

bổ sung 1% các chủng vi sinh vật vào ñống ủ ñã làm tăng quá trình phân hủy sinh học các nguyên liệu lên 23,64% so với ñống ủ không bổ sung thêm vi sinh vật, do

ñó rút ngắn thời gian ủ và tăng chất lượng của phân ủ

Nhìn chung, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật thì các nước trên thế giới ñã phân lập tuyển chọn ñược rất nhiều giống vi sinh vật có khả năng

Trang 30

phân hủy phế thải hữu cơ Các kết quả nghiên cứu ựều cho thấy rằng, việc bổ sung

vi sinh vật vào ựống ủ phế thải hữu cơ ựã rút ngắn thời gian ủ, làm giảm thể tắch và tăng hàm lượng dinh dưỡng của ựống ủ, do ựó góp phần bảo vệ môi trường

1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng 74% dân số làm nghề nông

do vậy phế thải nông nghiệp rất lớn và thắch hợp cho việc làm phân ủ Có nhiều phương pháp làm phân ủ có thể áp dụng, từ phương pháp ủ ựống tĩnh ựơn giản nhất ựến hệ thống lên men trong các thiết bị phức tạp Việt Nam có khắ hậu nóng ẩm nên các quá trình phân hủy phế thải xảy ra rất mạnh mẽ vì thế việc xử lý phế thải làm phân ủ là biện pháp rất thắch hợp Tuy nhiên việc xử lý phế thải ở Việt Nam gặp một số khó khăn: vốn ựầu tư cho xử lý phế thải còn thiếu thốn; ựòi hỏi phải có các biện pháp kỹ thuật ựợn giản, dễ vận hành, dễ bảo quản và sửa chữa; ý thức người dân chưa cao

Hiện nay có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công vi sinh vật trong việc

xử lý rác thải, phế thải hữu cơ Trong ựó, các ựề tài cấp Nhà nước KHCN-02-04, cấp Bộ B99Ờ32-46, B2001-32Ờ09 và các nghiên cứu khác về xử lý phế thải hữu cơ thành phân bón hữu cơ sinh học ựã khẳng ựịnh vi sinh vật bổ sung vào vào các ựống

ủ phế thải hữu cơ góp phần rút ngắn thời gian ủ và nâng cao chất lượng phân ủ Nguyễn Lân Dũng và ựtg ựã phân lập ựược hàng trăm chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, hemixenluloza, lignin Xây dựng ựược quy trình sản xuất chế phẩm VSV phân giải chất hữu cơ ựạt huy chương vàng hội chợ triễn lãm kinh tế kỹ thuật toàn quốc năm 1987 Kết quả thử nghiệm cho thấy chế phẩm ựã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45 Ờ 60 ngày thay vì 6 tháng ựến tận 1 năm ủ trong ựiều kiện tự nhiên

Lê Văn Nhương (1998) ựã phân lập tuyển chọn ựược 11 chủng nấm sợi, 7 chủng vi khuẩn, 6 chủng xạ khuẩn có hoạt tắnh xenlulaza cao đã xác ựịnh khi các loại vi sinh vật này ựược phối trộn với nhau theo một tỷ lệ thắch hợp sẽ cho hiệu suất phân giải cao nhất, ựã tạo ra ựược 3 bộ phối trộn các chủng vi sinh vật thắch ứng với sự phân giải lá mắa, rác nông thôn và vỏ cà phê Khi xử lý rác nông thôn bằng EMUNI, ựảm bảo ựộ ẩm 50-60%, 7 ngày ựảo trộn một lần thì sẽ cho hiệu quả

xử lý nhanh nhất

Trang 31

Năm 2001, Nguyễn Xuân Thành cùng ựtg ựã nghiên cứu xử lý rác thải hữu

cơ và phế thải nông công nghiệp bằng vi sinh vật bón cho cây trồng Kết quả cho thấy: xử lý phế thải bằng chế phẩm VSV hạn chế mùi hôi; rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45-60 ngày; phân hữu cơ VSV chế biến từ rác thải và phế thải hữu cơ ựạt tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 134B Ờ 1996; phân bón sản xuất ra ựược thử nghiệm trên cây ựậu tương ựạt kết quả tăng năng suất từ 9 Ờ 15%; ựề tài có nhiều ý nghĩa kinh tế, văn hóa xã hội và môi trường

Việc dùng rơm rạ ựể sản xuất phân hữu cơ không những tận dụng ựược tối ựa

và hiệu quả nguồn phế phẩm nông nghiệp, mà ựiều này còn ựồng nghĩa với việc ựem lại hiệu quả về kinh tế Theo tắnh toán của các hộ làm phân hữu cơ từ rơm rạ,

ựể sản xuất 1 tấn phân hữu cơ từ rơm rạ thì chỉ mất khoảng 600.000 ựến 650.000 ựồng, trong khi các loại phân hữu cơ vi sinh hiện bán trên thị trường có giá từ 2 ựến 3,5 triệu ựồng/tấn

Nguyễn Xuân Thành và ựtg nghiên cứu thành công ựề tài khoa học cấp Bộ B2004 Ờ 32 Ờ 66: Ộ Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý tàn sư thực vật trên ựồng ruộng thành phân hữu cơ tại chỗ bón cho cây trồngỢ đề tài ựã phân lập ựược 8 chủng VSV ựể làm giống sản suất chế phẩm VSV đã xây dựng ựược quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật, chế phẩm vi sinh ựạt tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 134B Ờ 1996) đã xây dựng ựược quy trình xử lý tàn dư thực vật bằng chế phẩm VSV tại nông hộ với thời gian từ 30 Ờ 60 ngày ủ phụ thuộc vào từng nhóm cây trồng khác nhau, phế thải sau ủ có hàm lượng mùn, hàm lượng dinh dưỡng tăng có thể làm phân bón hữu cơ tại chỗ cho các loại cây trồng Tắnh trung bình trong một vụ, lượng tàn dư thực vật ựể lại trên ựồng ruộng là 28,17 tấn/ha, nếu ựem toàn bộ ựi xử lý bằng chế phẩm vi sinh vật, thì sẽ cho ra ựược 8,1 tấn phân hữu cơ Lãi suất mang lại cho nông hộ là 718.000 ựồng/ha

Phan Bá Học (2007) trong nghiên cứu về Ộ Ứng dụng chế phẩm vi sinh vật

xử lý tàn dư thực vật trên ựồng ruộng thành phân hữu cơ tại chỗ bón cho cây trồng trên ựất phù sa sông HồngỢ ựã có kết luận: cứ 1 tấn rơm rạ ủ thì cho ra 0,2 Ờ 0,25 tấn phân hữu cơ; 1 tấn thân và lá ngô sau khi ủ cho ra 0,3 Ờ 0,33 tấn phân hữu cơ; 1

Trang 32

tấn thân và lá khoai tây sau khi ủ cho ra 0,2 tấn phân hữu cơ Phân hữu cơ chế biến

từ tàn dư thực vật khi bón cho cây rau cho các kết quả sau: ðối với cây cải bắp: Năng suất khi bón phân khoáng kết hợp 18 tấn phân chuồng/ha tăng thêm 3,9 tấn/ha, khi bón phân khoáng kết hợp với 18 tấn phân hữu cơ tái chế/ha tăng thêm 6,6 tấn/ha so với ñối chứng chỉ bón phân khoáng Hiệu quả kinh tế khi bón phân hữu cơ tái chế tăng thêm 3,12 triệu ñồng/ha, khi bón phân chuồng tăng thêm 0,96 triệu ñồng/ha so với ñối chứng ðối với súp lơ, năng suất và hiệu quả kinh tế khi bón phân hữu cơ tái chế kết hợp với phân khoáng so với ñối chứng tăng thêm 4,9 tấn/ha, 5,55 triệu ñồng/ha

Lý Kim Bảng và ñtg ở viện Khoa học Công Nghệ Việt Nam ñã nghiên cứu thành công chế phẩm VIXURA và công nghệ xử lý rơm rạ ñem lại hiệu quả kinh tế,

xã hội rất cao Chế phẩm VIXURA chứa 12 – 15 chủng vi sinh vật ñược phân lập tại Việt Nam, có khả năng sinh ra các enzym khác nhau ñể phân hủy chất hữu cơ trong rác thải và rơm rạ, ñồng thời tăng khả năng chống chịu sâu bệnh của cây trồng Tàn dư cây lúa sau thu hoạch ñược gom thành từng ñống; rơm rạ ñược xếp thành từng lớp có rắc xen kẽ phân chuồng, phân NPK và chế phẩm VIXURA Chiều cao mỗi ñống rạ từ 1,5 – 2m, phủ kín bằng nilon, có một lỗ nhỏ ñể tưới nước; ñống rạ ủ ñượ tưới ẩm thường xuyên Sau 5 – 7 ngày, nhiệt ñộ ñống ủ tăng lên 70 –

800, ñống ủ xẹp xuống, rạ mềm ñi Sau 25 – 30 ngày, nhiệt ñộ ñống ủ giảm dần, rơm rạ trong ñống ủ mềm hết, chuyển sang màu ñen và trở thành một loại phân bón hữu cơ rất tốt cho ñồng ruộng

Năm 2011, ðinh Hồng Duyên ñã thực hiện ñề tài “Nghiên cứu quá trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong sản xuất phân bón hữu cơ tại ñồng ruộng” ñã phân lập và tuyển chọn ñược 3 chủng VSV: VP-14, XX-7 và NT-18 có sức sống cao, khả năng cạnh tranh lớn và khả năng thích ứng pH rộng ñể làm giống sản xuất chế phẩm VSV phân hủy phế thải sau thu hoạch Cụ thể: Chế phẩm VSV ñã rút ngắn thời gian ủ phụ phẩm rơm rạ từ 3 - 4 tháng xuống còn 40 ngày, thời gian ủ phụ phẩm hành tỏi từ 5 - 6 tháng xuống còn 50 ngày, thời gian ủ phụ phẩm rau quả từ 2

- 3 tháng xuống còn 30 ngày Hàm lượng photpho, kali trong các ñống ủ thí nghiệm

Trang 33

có bổ sung chế phẩm vi sinh vật ñều cao hơn trong ñống ủ ñối chứng và cao hơn trước khi ủ

Tóm lại nhờ có những sự thay ñổi trong nhận thức về môi trường và những kết quả khá quan trong nghiên cứu mà việc xây dựng các cơ sở xử lý, tái chế phế thải ngày càng tăng lên Các nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phế thải và tải chế phân hữu cơ ñã bước ñầu góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm ñồng thời

mở ra hướng ñi mới trong việc khắc phục hậu quả của thời ñại công nghiệp, dần thay ñổi phương thức sản xuất nông nghiệp hiện nay ñể hướng tới nền nông nghiệp bền vững – nền nông nghiệp hữu cơ Tuy nhiên chế phẩm vi sinh vật hiện nay vẫn chưa rút ngắn ñược thời gian ủ xuống như mong muốn của con người Vì vậy công tác phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý các chất hữu cơ vẫn

là hướng ñi mới

Trang 34

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 đối tượng nghiên cứu

Vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh xenluloza

2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nguồn phụ phẩm nông nghiệp ựể phân lập vi sinh vật: huyện Gia Lâm Ờ Hà Nội

Sử dụng chế phẩm vi sinh vật ựể xử lý rơm rạ

2.3 địa ựiểm nghiên cứu

Phòng Sinh học ựất Ờ Khoa Môi Trường Ờ Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật từ các mẫu nghiên cứu

- Phân lập vi sinh vật có khả năng phân giải Xenluloza trên môi trường chuyên tắnh

- đánh giá hoạt tắnh enzym ngoại bào của các chủng VSV

2.4.2 đánh giá ựặc tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật

- Quan sát ựặc ựiểm hình thái, kắch thước khuẩn lạc, hình thái vi sinh vật và

sơ bộ ựịnh tên

- Lựa chọn môi trường nuôi cấy thắch hợp

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh enzym ngoại bào của các chủng VSV ở các mức pH, nhiệt ựộ khác nhau

- đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng VSV

- đánh giá khả năng gây bệnh lên thực vật của các chủng vi sinh vật ựã chọn

2.4.3 Sản xuất và ựánh giá chất lượng chế phẩm

- Nghiên cứu tắnh ựối kháng

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Vật liệu nghiên cứu

Trang 35

Hóa chất: KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, FeCl3, MnSO4, CaCl2, NaCl, NaNO3, CaCO3, FeSO4, KI, I2, Na2HPO4, KNO3, KHPO4, H2SO4, tinh bột tan, CMC, malt, pepton, cao nấm men, rose bengal, gelatin, glucoza, cao thịt, nước cất, thạch, cồn

Các công thức môi trường:

+ Môi trường Sabouraud (g/l): Pepton – 10; Glucoza – 40; Nước cất 1 lít + Môi trường Czapek Dox (g/l): Saccaroza – 30g; NaNO3 – 30; K2HPO4 – 1; MgSO4 – 0,5; KCL – 0,5; FeSO4 – 0,01; Thạch – 20; Nước cất – 1 lít

+ Môi trường cho vi sinh vật phân giải xenluloza ưa nhiệt (g/l): K2HPO4 – 0,5; NH4H2PO4 – 1,5; MgSO4 – 0,4; K2HPO4 – 0,5; MnSO4 – vết; NaCl – 0,1; CaCO3 – 1; FeSO4 – vết; Pepton – 5; Nước cất – 1 lít

+ Môi trường thạch – glucoza (g/l): Pepton – 10; NaCl – 5; Cao thịt – 5; Glucoza – 1; Thạch – 15; nước cất – 1 lít

+ Môi trường MPA (g/l): Cao thịt – 3; Pepton – 10; NaCl – 0,5; Thạch – 20; Nước cất – 1 lít

+ Môi trường LB (Lauria Betani) (g/l): Pepton – 10; Glucoza – 10; Cao nấm men – 5; NaCl – 10; Nước cất 1 lít

+ Môi trường Gost (g/l): Na2HPO4 – 0,7; KH2PO4 – 0,3; KNO3 – 3; MgSO4 – 0,4; Nước cất – 1 lít

+ Môi trường A – 4 (g/l): Glucoza – 10; Bột ñậu tương – 10; NaCl – 5; CaCO3 – 1; Nước – 1 lít

+ Môi trường A – 4H (g/l): Glucoza – 15; Bột ñậu tương – 15; NaCl – 5; CaCO3 – 1; Nước – 1 lít

+ Môi trường A – 12 (g/l): Tinh bột tan – 10; Rỉ ñường – 10; Bột ñậu tương – 10; KH2PO4 – 2; NaCl – 5; CaCO3 – 1; Nước – 1 lít

Trang 36

+ Môi trường Gauze I (g/l): Tinh bột tan – 20; KH2PO4 – 0,5: MgSO4.7H2O – 0,5; (NH4)2SO4 – 2; KNO3 – 0,5; FeSO4 – 0,01; Thạch - 18g; Nước cất – 1 lít + Môi trường Gauze II (g/l): Nước chiết thịt – 30ml; Pepton – 5; NaCl – 5; Glucoza – 10; Thạch – 18; Nước cất – 1 lít

+ Môi trường Rose bengal (g/l): Glucozo – 10; Pepton – 5; K2HPO4 – 1; Rose bengal (5% w/v) – 0,5x10-3 lít; Dichloran (0,2% w/v trong ethanol) – 10-3 lít; Chloramphenicol* - 0,1 (* Chloramphenicol ñể nguội ñến 500C mới bổ sung vào); Agar – 15; Nước cất – 1 lít

Môi trường ñánh giá hoạt tính enzym:

+ Môi trường xác ñịnh hoạt tính amilaza: Tinh bột tan – 0,2g; Thạch – 1,5g; Nước – 100ml

+ Môi trường thử hoạt tính enzym xenlulaza: CMC – 0,3g; Thạch – 1,5g; Nước – 100ml

+ Môi trường xác ñịnh hoạt tính xenlulaza (g/l): NH4NO3 – 1; K2HPO4 – 0,5;

KH2PO4 - 0,5; MgSO4 7H2O – 0,5; NaCl – 1; CaCl2 – 0,1; FeCl2 – 0,02; Cao men – 0,05; Bột giấy – 2

+ Môi trường thử hoạt tính enzym proteaza: Gelatin – 0,2g; Thạch – 1,5g; Nước – 100ml

+ Thuốc thử lugol (g/l): I2 – 1g; KI – 2g; Nước cất – 300ml

Môi trường sản xuất chế phẩm vi sinh

+ Môi trường nấm tổng số (Martin) (g/l): Glucoza – 10; Peptone – 5;

Trang 37

+ Dung dịch muối tiêu chuẩn (g/l): K2HPO4 Ờ 5; MgSO4 Ờ 2,5; NaCl Ờ 2,5;

Fe2(SO4)3 Ờ 0,05; MnSO4 Ờ 0,05; Nước Ờ 1 lắt

+ Môi trường dịch thể (g/l): Rỉ ựường Ờ 14; Peptone Ờ 1; Dung dịch muối tiêu chuẩn Ờ 10

+ Môi trường chất mang chế phẩm (tỷ lệ): 21 Cám gạo : 3 Cám ngô : 3 Bột ựậu tương : 1 Rỉ ựường

2.5.2 Phương pháp lấy mẫu

65 mẫu phế thải dùng ựể phân lập VSV ựược lấy ựều ở các ựịa ựiểm khác nhau, cụ thể trong bảng sau:

Bảng 2.1 địa ựiểm lấy mẫu phân lập vi sinh vật xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp

An đào đào

Nguyên

Cửu Việt Tổng

50C, mang về phòng thắ nghiệm tiến hành quá trình phân lập

2.5.3 Phân lập vi sinh vật từ các mẫu phế thải

Pha loãng mẫu ựến nồng ựộ 10-4 theo TCVN 6168:2002

Tại mỗi nồng ựộ, dùng pipet hút 0,05ml dịch pha loãng cấy lên các loại môi trường thạch bằng ựã chuẩn bị sẵn, ựem nuôi ở nhiệt ựộ thắch hợp từ 2 ựến 7 ngày Khi các chủng vi sinh vật mọc rõ, hình thành khuẩn lạc thì ựem cấy truyền

và làm thuần khiết theo phương pháp ria 3 pha Sau khi ựược làm thuần khiết, các chủng vi sinh vật ựược cấy vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng ựể giữ

giống (James và Natalie, 2002)

Trang 38

2.5.4 đánh giá ựặc tắnh sinh học của các chủng vi sinh vật

2.5.4.1 Xác ựịnh hoạt tắnh enzym bằng phương pháp khuếch tán trên ựĩa thạch

Xác ựịnh hoạt tắnh phân giải xenluloza, CMC, tinh bột, protein của các chủng

vi sinh vật theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên ựĩa thạch (Wiliam, 1983)

* Tiến hành:

Môi trường ựược hấp khử trùng trong nồi hấp sau ựó ựổ ra ựĩa peptri Mỗi ựĩa thạch ựổ dày khoảng 0,2cm, ựợi nguội Dùng khoan khoan lỗ thạch ựường kắnh 1cm trên hộp lồng

Nhỏ 0,1ml dịch cấy vào các lỗ ựục, chờ dịch khô ựể trong tủ lạnh 6 Ờ 8 giờ Cho vào tủ nuôi trong 24 giờ ở 370C ựể enzym có khả năng phản ứng với cơ chất Nhỏ 5ml lugol vào hộp lồng, tráng ựều lên bề mặt thạch, sau 10 Ờ 15 giây xuất hiện vòng phân giải màu vàng chanh đo ựường kắnh vòng phân giải

Hoạt tắnh của enzym ựược xác ựịnh qua kắch thước vòng phân giải theo công thức: (D Ờ d) (mm)

Trong ựó: D là ựường kắnh vòng phân giải

d là ựường kắnh lỗ khoan

2.5.4.2 Xác ựịnh thời gian nuôi cấy của các chủng giống vi sinh vật

Các chủng VSV ựược nuôi cấy trên môi trường thạch bằng chuyên tắnh trong

tủ ựịnh ôn ở 28 Ờ 350C Theo dõi thời gian mọc của các chủng vi sinh vật tại các mốc thời gian khác nhau: 16, 24, 36, 48, 60, 72, >72h

2.5.4.3 Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc, hình thái vi sinh vật và sơ bộ ựịnh tên

* Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc:

Nuôi cấy các chủng giống vi sinh vật trên môi trường thạch bằng chuyên tắnh

ở 28 Ờ 350C, trong 5 ngày Xác ựịnh hình thái và kắch thước khuẩn lạc theo phương pháp quan sát và ựo trực tiếp bằng thước ựo (cm)

* Quan sát hình thái vi sinh vật và ựịnh tên:

- đối với vi khuẩn: Tiến hành phương pháp nhuộm Gram ựể xác ựịnh vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hay Gram dương, quan sát bằng kắnh hiển vi

ựể biết hình thái của vi khuẩn

Trang 39

- ðối với xạ khuẩn và nấm: Xạ khuẩn ñược nuôi cấy trên môi trường Gauze

1, nấm ñược nuôi cấy trên môi trường thạch, khoai tây (PDA) có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường Sau 7 – 9 ngày nuôi ở nhiệt ñộ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học

Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Ratinaculiapert) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira)

So sánh với khóa phẩn loại Klich (2004) ñể sơ bộ ñịnh tên chủng nấm và khóa phân loại Bergey (1989) ñể sơ bộ ñịnh tên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn

2.5.4.4 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Các chủng vi sinh vật ñược nuôi cấy lắc 220vòng/phút ở nhiệt ñộ 28 - 300C với các loại môi trường khác nhau Sau 5 ngày ñem xác ñịnh sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào của các chủng vi sinh vật So sánh kết quả thu ñược ñể lựa chọn ra môi trường nuôi cấy thích hợp nhất

P1: Khối lượng khô của giấy lọc

P2: Tổng khối lượng khô của giấy lọc và sinh khối

2.5.4.6 Ảnh hưởng của pH

Các chủng vi sinh vật ñược nuôi cấy lắc (220 vòng/phút) trên môi trường dịch thể ở các mức pH khác nhau (pH = 4, pH = 5, pH = 6, pH = 7, pH = 8) Sau 5 ngày xác ñịnh các thông số: Số lượng khuẩn lạc, sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào So sánh kết quả ñể lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp

2.5.4.7 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Nuôi cấy các chủng vi sinh vật trong ñiều kiện môi trường và pH thích hợp ở các nhiệt ñộ khác nhau: 200C, 300C, 400C, 500C Sau 5 ngày xác ñịnh số lượng

Trang 40

khuẩn lạc, sinh khối và hoạt tắnh enzym ngoại bào So sánh kết quả ựể lựa chọn nhiệt ựộ nuôi cấy thắch hợp nhất

2.5.4.7 đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật ựược nuôi lắc (220 vòng/phút) trên môi trường dịch

thể ở các mức Streptomycin với các nồng ựộ khác nhau: 300, 500, 800, 1000mg/l

(Obtin, 1971) Sau 5 ngày xác ựịnh số lượng khuẩn lạc, sinh khối, hoạt tắnh enzym ngoại bào

2.5.4.8 Khả năng gây bệnh lên thực vật của các chủng vi sinh vật

Dùng que cấy chấm các chủng XK lên vết thương của căn hành ựã khử trùng Sau 4 ngày kiểm tra, nếu vết thương không lở loét, chứng tỏ chủng ựó an toàn ựối với thực vật

2.5.5 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật

2.5.5.1 Nghiên cứu tắnh ựối kháng giữa các chủng vi sinh vật

Nghiên cứu tắnh ựối kháng giữa các chủng vi sinh vật dùng ựể sản xuất chế

phẩm bằng phương pháp cấy vạch Các chủng vi sinh vật ựược nuôi trên cùng một

ựĩa thạch, nuôi cấy trong khoảng từ 24h ựến 48h Tại những chỗ giao nhau nếu chúng phát triển bình thường thì có nghĩa là chúng không ựối kháng nhau Còn nếu chúng không phát triển có nghĩa là chúng ức chế nhau

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	2,5 MB