Khảo sát nguồn gen tập đoàn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- --- LÊ MAI PHƯƠNG KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠ

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-  -

LÊ MAI PHƯƠNG

KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2014

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-  -

LÊ MAI PHƯƠNG

KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI – 2014

Trang 3

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Lê Mai Phương

Trang 4

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn

bè cũng như những người thân trong gia ñình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình hướng dẫn, ñịnh hướng, giúp ñỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn

KS Phan Hữu Hiển, ThS Nguyễn Văn Hùng và toàn thể cán bộ, nhân viên

Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã rất nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực tập tại bộ môn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ðH Nông nghiệp Hà Nội ñã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết ñể có thể thực hiện và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình, anh em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014

Học viên thực hiện

Lê Mai Phương

Trang 5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii

2.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của cây

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 8

2.5 Cơ chế kháng của cây với nấm Phytophthora infestans 20

2.6.1 Một số nghiên cứu về sâu bệnh hại khoai tây 20 2.6.2 Các nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai 23 2.7 Ứng dụng chỉ thị DNA phân tử trong nghiên cứu các gen kháng

Trang 6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.4.1 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm ngoài ựồng ruộng 29 3.4.2 Phương pháp ựánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học của các

3.4.3 Phương pháp PCR phát hiện gen kháng R1, R3a 34

4.1 Khảo sát ựặc ựiểm nông sinh học một số mẫu khoai tây vụ ựông 2013 37

4.1.3 đặc ựiểm sự sinh trưởng phát triển của cây 50

4.2 Kết quả PCR phát hiện gen kháng sương mai 63

4.3 đánh giá mức ựộ nhiễm bệnh ngoài ựồng ruộng 65 4.3.1 So sánh kết quả PCR với mức ựộ nhiễm bệnh sương mai trên

Trang 7

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Danh sách các mẫu giống khoai tây theo dõi 27

Bảng 2: Một số chỉ tiêu theo dõi ñặc ñiểm nông sinh học 30

Bảng 3 Các chỉ thị phân tử DNA sử dụng ñể phát hiện gen R1, R3a

Bảng 4 Bảng thời gian qua các giai ñoạn sinh trưởng 38

Bảng 5 ðặc ñiểm thân của các mẫu giống khoai tây 41

Bảng 6 ðặc ñiểm lá của các mẫu giống khoai tây 47

Bảng 8: Bảng số liệu về năng suất của các mẫu giống khoai tây 57

Bảng 9 So sánh kết quả PCR với mức ñộ nhiễm bệnh sương mai trên

Bảng 10 Bảng theo dõi một số bệnh trên ñồng ruộng 69

Bảng 11 ðặc ñiểm nông sinh học của các giống khoai tây triển vọng 76

Trang 8

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 a) Bào tử phân sinh của nấm Phytophthora infestant , b) Bào tử

phân sinh nảy mầm trực tiếp tạo ra bào tử ñộng 15

Hình 3 Chu kì phát triển của nấm Phytophthora infestans 17

Hình 4 Các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng sương mai 26

Hình 5: Biểu ñồ về sự khác biệt về số hoa của các mẫu giống 56

Hình 6: Biểu ñồ về sự khác biệt về số củ trung bình giữa các mẫu giống 62

Hình 7: Biểu ñồ về sự khác biệt năng suất các mẫu giống khoai tây 63

Hình 8 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen R1 64

Hình 9 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen R3a 65

Trang 9

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1

PHẦN I MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ Solanaceae,

có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru, là cây trồng ngắn ngày, chiếm một vị trí quan trọng trong các cây lương thực, thực phẩm phục vụ cho con người Hiện nay, khoai tây là loài cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới, ñược trồng phổ biến thứ tư về mặt sản lượng lương thực sau lúa, lúa

mì và ngô Chúng có ñặc ñiểm rất dễ trồng, cho thu hoạch nhanh và thích ứng với các ñiều kiện môi trường khác nhau (International Year of the Potato 2008; Jeff Chapman và cộng sự, 2011)

Tuy nhiên, khoai tây có thể bị một số bệnh ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ Bệnh hại trên khoai tây rất ña dạng về thành phần và nguyên nhân gây bệnh như bệnh sương mai, bệnh héo vàng, bệnh ñốm lá, bệnh héo rũ

vi khuẩn, bệnh xoăn lá do virus….Trong ñó bệnh sương mai do nấm

Phytophthora infestans gây ra là bệnh hại nghiêm trọng bậc nhất, gây thiệt hại

16% năng suất trên toàn thế giới (Haverkort A và cộng sự, 2009) Bệnh có thể lây nhiễm toàn bộ cây, bao gồm thân, lá và củ (Fry W, 2008)

ðể ñối phó với dịch bệnh, tạo sự phát triển bền vững và giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật thì việc tạo ra giống khoai tây mới với mức kháng cao

với Phytophthora infestans ñược coi là chiến lược bền vững cho việc trồng

khoai tây trong tương lai

Nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, công nghệ chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử ra ñời rút ngắn thời gian chọn tạo giống, ñảm bảo

ñộ chính xác và quy tụ ñược nhiều gen mục tiêu vào một giống mà phương pháp chọn giống truyền thống rất khó hoặc không thể thực hiện ñược ðể tạo ñược giống khoai tây mới thì việc ñầu tiên là phải có nguồn gen kháng và chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng ñó, sau ñó ñánh giá và xác ñịnh khả

Trang 10

Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp 2

năng kháng bệnh sương mai của các giống để sử dụng trong cơng tác lai tạo giống sau này

Gen kháng bệnh sương mai đã được lai tạo từ các lồi dại S demissum,

S stoloniferum và S tuberosum andigena, S phureja là các lồi khoai tây

trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới (Bradshaw và cộng sự, 2006) Lồi S

demissum của Mexico mang gen kháng bệnh sương mai là nguồn cung cấp 11

gen trội R (R1-R11) đã được lai với S tuberosum trong những năm 1950 và

1960 để tạo giống kháng (Bradshaw và Ramsay, 2005) Gen R1, R3a là gen kháng chủng đặc hiệu với Phytophthora infestans đã được lai tạo vào giống

khoai tây truyền thống (Umaerus và Umaerous, 1994)

Bên cạnh đĩ, người ta đã xác định được một hệ thống các marker phân

tử DNA liên kết với các gen kháng đã được phát triển và hỗ trợ đắc lực cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai Các chỉ thị

phân tử DNA dựa trên PCR cho gen R1 là R1F/R(76-2sf2/76-2SR)), gen R3a

là R3-1380 đã được nhiều nhà chọn giống trên thế giới sử dụng để chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai

Hiện nay Trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng đã thu thập được một tập đồn các giống khoai tây ðây là một nguồn gen đa dạng cho việc lai tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai Vì vậy để cĩ định hướng sử dụng, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tơn, chúng tơi tiến hành đề tài:

“Khảo sát nguồn gen tập đồn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

Trang 11

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 3

thị phân tử DNA phục vụ lai tạo giống kháng

1.2.2 Yêu cầu

đánh giá ựược ựặc ựiểm nông sinh học và khả năng kháng sâu bệnh

đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu giống khoai tây trên ựồng

ruộng

Dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện ựược các gen kháng R1, R3a trong

các mẫu giống khoai tây

Trang 12

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

Khoai tây là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn nhưng lại cho năng suất cao trong ñiều kiện khí hậu ôn hòa với nhiệt ñộ thích hợp từ 18 –

23oC Bên cạnh giá trị lương thực, thực phẩm, khoai tây còn là nguyên liệu có giá trị cho nhiều ngành công nghiệp Cây khoai tây ñược truyền bá vào nước

Mỹ năm 1719, vào Ấn ðộ năm 1615, vào Trung Quốc năm 1700, vào Nhật Bản năm 1766 và vào Việt Nam năm 1890

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây khoai tây

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) có nguồn gốc từ Nam Mỹ ðầu

thế kỷ XVI những nhà hàng hải người Tây Ban Nha chinh phục Nam Mỹ ñã ñem về trồng ở nước họ Vào cuối thế kỷ XVI, khoai tây ñược trồng ở Ailen, Anh, ðức, Pháp…từ ñó khoai tây ñược trồng ở nhiều nước châu Âu khác Các nước châu Á và châu lục khác biết ñến khoai tây muộn hơn các nước châu Âu thông qua chính sách thuộc ñịa của người châu Âu

Ở nước ta, khoai tây ñược người Pháp mang sang trồng ở một số nơi từ năm 1890 và chủ yếu trồng ở vùng ñồng bằng sông Hồng Giống khoai tây ñược trồng phổ biến trước ñây là giống khoai tây ruột vàng Thường Tín, giống này có nguồn gốc từ giống Ackersegen, ñược nhập từ Pháp năm 1890

Cây khoai tây thuộc chi Solanum Setio Pentato thuộc họ cà (Solanaceace) là cây ở thể tứ bội (2n = 4x = 48), có khả năng sinh trưởng,

phát triển tốt và cho năng suất cao

2.1.2 ðặc tính thực vật học của cây khoai tây

Thân và lá cây khoai tây có nhiều lông, lá kép lông chim, không ñối xứng Thân cây khoai tây là hệ thống bao gồm thân, tia củ và củ, thân cây cao

từ 45 – 90cm tùy theo giống, ñộ phì của ñất và kỹ thuật canh tác

Trang 13

Tia củ phát triển từ mầm cành, với ñiều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành củ, ñiều kiện không thuận lợi sẽ chồi lên mặt ñất phát triển thành cành Cây khoai tây chủ yếu tự thụ phấn nhưng có trường hợp giao phấn Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, có 2 ô, hạt rất nhỏ có mầm uốn cong Mầm củ khoai tây là những mầm cây ñược tạo thành ở các nách lá không phát triển

2.1.3 ðặc ñiểm sinh học của cây khoai tây

ðời sống của cây khoai tây có thể chia làm 4 thời kỳ: thời kỳ ngủ, thời kỳ nảy mầm, thời kỳ hình thành củ và thời kỳ củ phát triển (ðường Hồng Dật, 2004)

Thời kỳ ngủ: củ khoai tây sau khi thu hoạch phải ñược cất giữ một thời gian dài sau ñó mới nảy mầm ñược, người ta gọi ñó là thời kỳ ngủ nghỉ của khoai tây Thời gian ngủ nghỉ của khoai tây phụ thuộc vào ñặc ñiểm của giống, ñiều kiện sinh thái của vùng cây trồng, kỹ thuật canh tác, ñiều kiện bảo quản

Thời kỳ nảy mầm: sau một thời gian ngủ nghỉ, những mắt củ trên cây khoai tây ñều có khả năng phát triển thành mầm cây Mầm cây phát triển thành thân lá và thành cây khoai tây thế hệ mới

Thời kỳ hình thành thân củ: cây khoai tây con sau khi phát triển vượt lên khỏi mặt ñất từ 7 – 10 ngày thì trên các ñốt thân nằm dưới mặt ñất xuất hiện những nhánh con, ñó chính là những nhánh thân ñịa sinh Nhánh ñịa sinh có màu trắng và mọc thẳng, ñầu cuối của nhánh thường phình to tạo thành những ñoạn thân ngầm, khi phát triển ñến mức ñộ nhất ñịnh thì ngừng phát triển về chiều dài, chất dinh dưỡng tập trung vận chuyển ñến các ñoạn thân ngầm này và chúng phình to lên tạo thành củ khoai tây ở ñầu mút thân ñịa sinh

Thời kỳ phát triển của củ: sau khi cây sinh trưởng ñược 20 – 25 ngày thì các chất dinh dưỡng tập trung vào các ñâu chóp của thân ñịa sinh, bộ phận này của thân ñịa sinh bắt ñầu phình to dần lên Ở những nơi có nhiều nắng, vào thời gian này cây hình thành hoa và bắt ñầu nở, ñây chính là lúc thân ñịa sinh phát triển mạnh nhất

Trang 14

2.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây

Nhiệt ñộ là yếu tố khí tượng ñặc biệt quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp ñến sinh trưởng phát triển của cây khoai tây Ở thời kỳ sinh trưởng sinh duỡng cây khoai tây có thể thích ứng với biên ñộ nhiệt từ 10 – 25oC, rộng hơn

so với giai ñoạn sinh trưởng sinh thực Theo Billd-Deau (1992), nhiệt ñộ thích hợp cho sự hình thành củ khoai tây là 18 – 20oC, từ 20oC trở lên quá trình hình thành củ khoai tây sẽ bị kìm hãm, khối lượng chất khô của củ cũng như chất lượng củ ñều bị giảm, nếu nhiệt ñộ quá thấp cũng ảnh hưởng ñến sinh trưởng của củ, khi nhiệt ñộ xuống thấp duới 15oC các ñặc tính như màng vỏ, hàm lượng tinh bột thay ñổi theo hướng không có lợi

Khoai tây là cây ưa sáng, cường ñộ ánh sáng thích hợp sẽ cho năng suất cao Cường ñộ ánh sáng mạnh có lợi cho quá trình quang hợp sẽ thuận lợi cho quá trình hình thành, tích lũy chất khô Cường ñộ quang hợp yếu, nhiều tia củ

sẽ không có khả năng hình thành củ

Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau của cây khoai tây có yêu cầu về thời gian chiếu sáng cũng khác nhau Từ khi khoai tây bắt ñầu mọc khỏi mặt ñất ñến thời kỳ xuất hiện nụ hoa yêu cầu ánh sáng ngày dài Thời kỳ phát triển tia

củ yêu cầu ánh sáng ngày ngắn

Trong các giai ñoạn sinh trưởng, cây khoai tây có yêu cầu về nước khác nhau Thời kỳ từ trồng ñến xuất hiện tia củ cần ñảm bảo ñộ ẩm ñất tối thiểu

60 – 80% sức chứa ẩm ñồng ruộng Thời kỳ phát triển củ cần thường xuyên giữ ñộ ẩm ñất là 80% Thiếu hoặc thừa nước ñều gây ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng của cây

2.1.5 Nhu cầu dinh dưỡng của cây khoai tây

Khoai tây yêu cầu một lượng dinh dưỡng lớn và ñầy ñủ các nguyên tố

ña lượng và vi lượng

Ảnh hưởng của ñạm ñến năng suất khoai tây ñã ñược nghiên cứu từ thập kỷ 70 Theo Benkeuma và Vander Zaag (1979), khi bón lượng ñạm quá

Trang 15

cao cho khoai tây sẽ làm giảm năng suất và chất lượng củ khoai tây Khoai tây ñược bón từ 45 – 400kg N/ha sẽ cho năng suất tối ưu

Khoai tây cũng cần nhiều phospho (P) cho sinh trưởng, tuy nhiên, hiệu lực của P phụ thuộc nhiều vào hàm lượng P và vôi có ở trong ñất Lượng P có

ở trong ñất ít còn lượng vôi tự do nhiều thì thường phải bón với liều lượng P nhiều hơn

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả của kali thể hiện không rõ ñến năng suất khoai tây, nhưng lại liên quan rõ ñến chất lượng củ, cụ thể là hàm lượng chất khô của củ, làm giảm bệnh ñốm ñen trên củ Kali làm tăng khả năng quang hợp, tăng sự vận chuyển các chất trong cây và tăng khả năng chống chịu sâu bệnh hại

Các nguyên tố vi lượng như Magie (Mg), Kẽm (Zn), Lưu huỳnh (S)…cần cung cấp ñầy ñủ và cân ñối cho cây Nếu thiếu cây sinh trưởng phát triển kém, năng suất thấp

Phân hữu cơ có vai trò rất quan trọng trong sản xuất khoai tây Muốn có năng suất, sản lượng khoai tây cao, chất lượng tốt thì phải sử dụng phân hữu cơ

vì phân hữu cơ cung cấp một cách cân ñối các nguyên tố ña lượng và bán ña lượng (N, P, K, Ca) cho khoai tây và ñặc biệt là bổ sung ñầy ñủ các nguyên tố

vi lượng quan trọng cần cho khoai tây Ngoài ra phân hữu cơ còn tạo ñộ xốp trong ñất, tăng khả năng giữ ẩm của ñất, kích thích bộ rễ phát triển và tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình hình thành và phát triển của củ khoai tây

2.1.6 Thời vụ trồng cây khoai tây ở Việt Nam

Ở vùng trung du và miền núi phía Bắc Việt Nam, khung thời vụ trồng khoai tây nằm gọn trong thời gian từ vụ lúa mùa sang vụ lúa xuân Thời vụ tốt nhất ñể trồng khoai tây là trung tuần tháng 10 ñến trung tuần tháng 11 Thời

vụ này có thể ñáp ứng ñầy ñủ nhất về nhiệt ñộ, ánh sáng ñể cây khoai tây sinh trưởng phát triển và cho năng suất cao Trồng sớm hơn khoai tây dễ bị rạc,

Trang 16

nếu trồng muộn hơn khoai tây sẽ gặp rét ngay lúc mới mọc, phát triển chậm nên cho năng suất thấp

Theo Vũ Thị Bắch Dẫn và cộng sự (1995), vụ ựông sớm ở ựồng bằng Bắc Bộ thường ựược bố trắ từ trung tuần tháng 9 ựến trung tuần tháng 10 Thời vụ này thường gặp ựiều kiện thời tiết khắ hậu bất thuận như lượng mưa lớn và nhiệt ựộ cao Mặt khác, khoai tây trồng ở Việt Nam có thời gian xuất hiện củ rất ngắn, chỉ khoảng 35 Ờ 40 ngày trồng, ựặc biệt với các giống ngắn ngày, mầm già sinh lý củ xuất hiện sớm và thời gian sinh trưởng ngắn nên năng suất không cao

Ở vùng nam khu IV cũ, khoai tây có thể trồng muộn hơn, tức là vào trung tuần tháng 11 vì ở vùng này mùa mưa kết thúc muộn hơn Còn vùng núi khắ hậu ôn hòa như Sapa, đà Lạt có thể trồng ựược quanh năm

Nghiên cứu của đào Mạnh Hùng (1996) cho thấy, khoai tây vụ xuân thường ựược trồng từ hạ tuần tháng 12 ựến thượng tuần tháng giêng, thu hoạch trung tuần tháng 4 Tháng 12 nhiệt ựộ trung bình là 18,1oC, tháng giêng lạnh nhất trong năm nhưng cũng ựạt 16,1oC nên ảnh hưởng không nhiều ựến sinh trưởng khoai tây giai ựoạn ựầu Lượng mưa ựầu vụ khoai xuân rất thấp, tăng dần vào tháng 2 và tháng 3, tăng nhanh vào cuối tháng 4, vì vậy cần ựảm bảo ựủ ấm thời kỳ ựầu cho khoai tây mọc mầm và phát triển nhanh, cuối vụ cần tiêu úng triệt ựể nhằm ựảm bảo chất lượng củ

Như vậy, thời vụ là một yếu tố ảnh hưởng mang tắnh chất quyết ựịnh ựến sự thành công trong sản xuất khoai tây Các nhà nghiên cứu khoai tây cho rằng thời vụ thắch hợp ựể trồng khoai tây bắt ựầu từ giữa tháng 10 ựến tháng

11, khi ựó nhiệt ựộ giao ựộng từ 17 Ờ 25oC là ựiều kiện thuận lợi nhất cho việc trồng khoai tây

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Khoai tây có vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp lương thực thực phẩm cho ựời sống của người dân nhiều nước trên thế giới Theo CIP (Trung

Trang 17

tâm nghiên cứu kinh tế thế giới), tính từ năm 1998 ñến nay có trên 130 nước trên thế giới trồng khoai tây, với tổng diện tích là 18.3 triệu ha, tổng sản lượng là 295.1 triệu tấn Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên hợp quốc, tính ñến năm 2010, tổng sản lượng khoai tây của thế giới ñạt khoảng 324.4 triệu tấn/năm, diện tích trồng 18.653.007 ha Sau khi Liên Xô tan rã thì Trung Quốc trở thành nước liên tục ñứng ñầu về sản lượng khoai tây trên thế giới, tiếp ñến là Ấn ðộ và thứ 3 là Nga Tính ñến năm 2010 diện tích trồng khoai tây của Trung Quốc ñạt khoảng 5.077 triệu ha

Hiện nay cây khoai tây ñược xếp vào hàng thứ tư trong số những cây lương thực quan trọng nhất của thế giới và ñược trồng ở 148 nước, với diện tích khoai tây trên thế giới năm 2012 là 18.380.000ha với tổng sản lượng 295 triệu tấn Trong ñó, diện tích trồng khoai tây của châu Âu chiếm 52,6% và sản lượng ñạt 52,3% của thế giới Nhằm nêu bật vị trí của khoai tây trong sản xuất nông nghiệp, trong phát triển kinh tế và trong mục tiêu xóa ñói giảm nghèo, ðại hội ñồng Liên hợp quốc quyết ñịnh năm 2008 là “năm quốc tế về khoai tây” vì có hơn 1 tỷ người trên thế giới có nhu cầu ăn khoai tây, trong ñó có khoảng nửa tỷ người ở các nước ñang phát triển

Do mức ñộ thâm canh và trình ñộ sản xuất ở các nước trên thế giới rất khác nhau nên năng suất khoai tây hiện tại chênh lệch rất lớn: tại Pháp, năng suất khoai tây dao ñộng từ 17 – 35 tấn/ha, tại ðức từ 21 – 33 tấn/ha, tại Hà Lan từ 29 – 42 tấn/ha, tại Anh từ 22 – 40 tấn/ha và ở Mỹ từ 22 – 36 tấn/ha Hiện nay, ở các nước phát triển, với trình ñộ khoa học kỹ thuật hiện ñại, ñầu tư cho nông nghiệp lớn, năng suất trung bình và sản lượng khoai tây không ngừng tăng do áp dụng các kỹ thuật sản xuất tiên tiến, cơ giới hoá, ñặc biệt là do sử dụng các củ giống sạch bệnh, chất lượng cao Trong khi ñó ở các nước ñang phát triển và kém phát triển (thuộc Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ

La Tinh), do các ñiều kiện kinh tế, văn hoá, xã hội còn hạn chế, cây khoai tây chưa ñược ñầu tư ñúng mức Tại các nước này, do sản xuất còn lạc hậu, sử

Trang 18

dụng củ giống kém chất lượng hoặc những củ giống từ vụ trước dẫn ñến nhanh chóng bị thoái hoá giống, năng suất và sản lượng khoai tây giảm ñáng

kể Bởi vậy, củ giống chất lượng cao kháng bệnh là vấn ñề hàng ñầu ảnh hưởng ñến năng suất

Khắc phục tình trạng thiếu củ giống chất lượng là vấn ñề cấp thiết cần ñược ñặt ra ñối với nền sản xuất nông nghiệp của các nước này (Nguyễn Thị Kim Thanh, 1998) Nghiên cứu, xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh, chất lượng cao ñang là biện pháp ñược ưu tiên, có tác ñộng trực tiếp ñến việc cải thiện tình hình sản xuất khoai tây

2.3 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Khoai tây ñược những người Pháp mang ñến Việt Nam từ năm 1890 Nếu như trước 1970, ở nước ta khoai tây chỉ ñược coi như một loại rau với diện tích trồng rất nhỏ thì ngày nay khoai tây ñã có vị trí nhất ñịnh trong nền nông nghiệp nước nhà, nó ñã thực sự trở thành cây lương thực quan trọng, một cây trồng lý tưởng trong các công thức luân canh vụ ñông Từ năm 1980, khoai tây ñược quan tâm và ñã có nhiều ñề tài nghiên cứu cấp nhà nước Trong khi lương thực lúa gạo và ngô dồi dào thì khoai tây ñược nghiên cứu theo hướng chất lượng và hiệu quả

Từ năm 1982 - 1996, Việt Nam ñã nhập khoảng 220 giống khoai tây của Liên Xô cũ, Ba Lan, Hungary, Cộng hòa Dân chủ ðức, Hà Lan ñể khảo nghiệm Kết quả ñã xác ñịnh và giới thiệu một số giống ra sản xuất như giống Việt-ðức 1 (Kardia của ðức), Việt-ðức 2 (Mariella của ðức), khoai Pháp (Ackersegen phục tráng bằng invitro), giống Diamant, Nicola (Hà Lan) Những giống tiến bộ này ñã ñưa vào sản xuất với diện tích 3.000-4.000 ha/năm; chúng có năng suất, chất lượng cao, mã củ ñẹp, có thể sử dụng ñể chế biến và xuất khẩu Tuy nhiên, những giống khoai tây này thoái hóa nhanh do

chúng mang gen Tuberosum (nguồn gốc ở Chi Lê), thích hợp ở vùng ôn ñới,

ngày có 14 giờ chiếu sáng ðể có giống phù hợp với ñiều kiện sinh thái Việt

Trang 19

Nam, Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp ñã hợp tác với Trung tâm Khoai tây Quốc tế (CIP) tiến hành chương trình chọn tạo giống sử dụng nguồn gen

khoai tây của CIP, phối hợp giữa Tuberosum (ôn ñới) với gen Andigena (nhiệt ñới); (gen Andigena có nguồn gốc ở Peru và các nước lân cận) Từ năm

1982 ñến 2001, Viện ñã tiếp nhận 190 tổ hợp lai, ñã tạo ra hàng chục vạn con lai ñể chọn lọc và ñã chọn ñược những giống khoai tây mới: VC38,6, KT2, KT3, giống khoai tây hạt lai Hồng Hà 2, Hồng Hà 7, ñưa vào sản xuất.Một

số giống khoai tây có nguồn gốc nhiệt ñới như giống DT02, LT7, B71.240.2, năng suất có thể ñạt 10-12 tấn/ha

Mức cung về khoai tây ở nước ta năm 2002 – 2003 là 521.036 tấn, trong ñó sản xuất trong nước chiếm 81% và 19% phải nhập khẩu Mặc dù cho ñến nay, sản lượng khoai tây cả nước ñã ñạt khoảng 25.000 – 40.000 tấn/năm,

ở nhiều vùng ñã ñạt năng suất trung bình 20 – 27 tấn/ha nhưng Việt Nam vẫn tiếp tục là nước nhập khẩu khoai tây vì: cầu về khoai tây không ngừng tăng, vượt so với cung và lượng khoai tây trong nước chỉ sẵn có trong vòng 6 tháng trong năm, trong khi ñó nhu cầu ñòi hỏi phải có khoai tây quanh năm

Hiện nay, nhu cầu thị trường ngày càng tăng và áp dụng tiến bộ kĩ thuật trong sản xuất nên khoai tây ñã thực sự ñược chú trọng phát triển Cả nước hiện còn khoảng 200.000 ha ñất có thể trồng ñược khoai ở các vùng như: ðồng bằng Sông Hồng, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ, Tây Nguyên với tiềm năng năng suất tối ña có thể ñạt 40 tấn/ha Với những thuận lợi trên, khoai tây giống trong nước ta sẽ hoàn toàn chiếm lĩnh thị trường trong nước

và chúng ta rất có khả năng xuất khẩu khoai tây

Theo số liệu phân tích giai ñoạn 2006 – 2011 của Cục trồng trọt – bộ Nông nghiệp cho thấy: diện tích khoai tây hàng năm dao ñộng trung bình khoảng 25.000 ha nhưng năng suất ñã ñược cải thiện, dao ñộng từ 13 – 14 tấn/ha với tổng sản lượng hàng năm ñạt gần 300.000 tấn Trong ñó vùng ñồng bằng sông Hồng có diện tích ñứng ñầu toàn miền (chiếm 64 – 89%), vùng

Trang 20

trung du miền núi phía Bắc có diện tích ñứng vị trí thứ hai (chiếm 10,8 – 27,2%), vùng Bắc trung bộ chiếm diện tích không ñáng kể (0,1 – 9,1%) ðể cải thiện năng suất, sản lượng và chất lượng khoai tây chúng ta ñã sử dụng những giống khoai tây mới có tiềm năng năng suất cao, giống sạch bệnh, kết hợp với biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến ñã là những yếu tố quan trọng ñể tạo ra bước ñột phá trong ngành trồng trọt khoai tây Tuy nhiên năng suất khoai tây luôn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: giống và chất lượng giống, thời vụ, ñất ñai, canh tác, bệnh hại trong ñó bệnh sương mai gây ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất cây khoai tây

2.4 Bệnh sương mai trên cây khoai tây

Bệnh sương mai khoai tây do nấm Phytophthora infestans là một trong

những bệnh ñược nghiên cứu nhiều nhất, lịch sử nghiên cứu lâu dài nhất, tuy vậy ñây vẫn là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trong lịch sử nhân loại

Bệnh sương mai khoai tây lần ñầu tiên ghi nhận tại Mexico, ñây cũng ñược coi là trung tâm ña dạng sinh học của nấm sương mai Triệu chứng bệnh ñược mô tả chi tiết năm 1845 trên cây khoai tây, trên cây cà chua bệnh ñược

mô tả vào năm 1847 Bệnh ñược xác ñịnh nguyên nhân là do nấm

Phytophthora infestans Sự phát tán của bệnh ñược chia làm hai giai ñoạn

giữa thế kỉ 19 và giai ñoạn thế kỉ 20 cho ñến nay Giai ñoạn giữa thế kỉ 19, lúc này khoai tây bắt ñầu xuất hiện và ñược phổ biến rộng rãi trên các nước Bắc

Mỹ và châu Âu Cùng với sự phổ biến của khoai tây, nấm sương mai cũng phát tán ra các vùng trồng, ñầu tiên là Mỹ theo nguồn bệnh trên khoai tây dại, sau ñó từ Mỹ lan sang châu Âu theo ñường củ giống Giai ñoạn thứ 2 vào thế

kỉ 20, lúc này do toàn cầu hóa về thương mại cũng như vận chuyển hàng hóa, bệnh sương mai theo củ khoai tây phát tán ra hầu như tất cả các vùng có xuất hiện cây khoai tây và cà chua Bệnh hại nặng có thể mất mùa và dẫn tới nạn ñói như ở Ireland năm 1845 - 1846 và ở ðức năm 1919 Bệnh sương mai có thể coi

là một trong những căn bệnh có sức tàn phá lớn nhất trong lịch sử con người

Trang 21

*Phạm vi phân bố

Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trên thế giới nơi có ñiều kiện lạnh ñủ

ñể trồng khoai tây Theo thống kê của CABI (1982) nấm Phytophthora

infestans ñã xuất hiện trên hầu hết các châu lục Tại châu Á bệnh xuất hiện tại

26 nước, trong ñó có những nước lân cận và láng giềng nước ta như Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Phillipin, Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn ðộ… và bao gồm

cả Việt Nam Do tính chất phức tạp của giai ñoạn phát tán thứ 2 của nấm

Phytophthora infestans không chỉ chủng quần cũ mang chủng nấm A1 phát

tán mà cả chủng quần mới A2 cũng phát tán ñi toàn thế giới, CABI năm 1996 cũng ñưa ra thống kê các nước ñã xuất hiện chủng quần mới này Theo kết quả trên chủng nấm A2 ñã xuất hiện ở 26 nước và vùng lãnh thổ trong ñó châu Á có 5 nước là Ấn ðộ, Indonesia, Hàn Quốc, Nhật, Israel Quần thể ở Hàn Quốc, Nhật, Ấn ðộ ñã xuất hiện cả hai loại chủng nấm Theo những công bố mới ñây có thể chủng nấm A2 ñã xuất hiện ở một số tỉnh phía nam Trung Quốc giáp với biên giới nước ta

Ở nước ta bệnh phân bố trên hầu hết các vùng trồng khoai tây và cà chua Bệnh gây hại mạnh và quanh năm ở các vùng có khí hậu mát mẻ như Lâm ðồng, Lào Cai, gây hại vào vụ ñông và ñông xuân ở các tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ nơi có mùa ñông lạnh

*Triệu chứng

Bệnh gây hại toàn cây ðối với cà chua bệnh hại trên thân, lá, quả; khoai tây bệnh hại trên thân, lá, củ Triệu chứng của bệnh rất ña dạng tùy thuộc vào ñiều kiện thời tiết

Triệu chứng bệnh trên lá: vết bệnh ban ñầu là những ñiểm nhỏ màu xanh thẫm sau ñó lan rộng ra có màu nâu thẫm, ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe không rõ ràng Bệnh thường xuất hiện ñầu tiên ở mép chóp lá, sau ñó lan rộng vào phiến lá (Stevenson, 1993) Phần giữa vết bệnh hóa nâu ñen do các ñám mô bị chết hóa nâu, xung quanh vết bệnh thường có ñám cành bào tử và

Trang 22

bào tử phân sinh màu trắng Khi thời tiết ẩm ướt hoặc buổi sáng sớm có sương, các ñám bào tử phân sinh này dày và xốp tạo ra một lớp trắng như sương muối ở mặt dưới lá bệnh (Drenth và cộng sự, 1996)

Hình 1: Triệu chứng sương mai: a) Triệu chứng trên lá,

b) Triệu chứng trên củ, c) Triệu chứng trên thân

Triệu chứng trên cuống lá, cành và thân cây cũng tương tự như những triệu chứng trên lá Những tổn thương trên thân và cuống lá ñiển hình là những vết ñốm lớn màu tối hoặc những vết ñốm màu nâu, dẫn ñến dễ gãy và cây bị chết( Stevenson, 1991) Khi ñiều kiện ẩm ñộ xuống thấp, vết bệnh chết tóp lại, khi ñộ ẩm cao, trên vết bệnh có lớp cành bào tử và bào từ phân sinh trắng như sương muối bao phủ Bệnh làm cho thân cành bị thối, mềm, có mùi mốc

Triệu chứng trên củ khoai tây: bắt ñầu từ những vết ñốm bóng nhờn, màu tối trên bề mặt củ Những vết ñốm này có thể tăng kích thước bao phủ toàn bộ củ Dưới ñiều kiện môi trường thuận lợi cho sự hình thành bào tử , hệ sợi trắng có thể nhìn thấy ñược trên củ (Stevenson, 1991) Tiếp theo sự xâm nhiễm trên củ khoai tây sương mai là bệnh thối nhũn dẫn ñến hỏng toàn bộ củ

Trang 23

(Watterson, 1986) Triệu chứng bệnh sương mai có thể nhầm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn vì có chung các ñặc ñiểm như có vết màu nâu lõm xuống Tuy vậy khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh có màu nâu xám lan rộng vào phía trong, ñôi khi còn ăn sâu vào trong lõi củ Các củ bị bệnh hoặc các lát củ này khi ñặt ở nhiệt ñộ dưới 200C và ẩm ñộ bão hòa có thể quan sát thấy một lớp nấm trắng và cành bào tử phân sinh cũng như bào tử phân sinh trên bề mặt của củ (Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, 2001)

Bệnh lan truyền trong cây có thể từ lá tới thân rồi quả, củ Nhưng cũng có thể lan truyền từ củ, hạt nhiễm bệnh lên hệ thân, lá Khi bệnh xuất hiện nếu gặp ñiều kiện thời tiết phù hợp như nhiệt ñộ dưới 200C, ẩm ñộ cao trên 80% cây sẽ nhanh chóng tàn lụi có thể gây thành dịch làm giảm năng suất nghiêm trọng

*Tác nhân gây bệnh và các ñặc ñiểm sinh học của chúng

Theo Anton de Bary và Montagne (1845), bệnh sương mai cà chua,

khoai tây do nấm Phytophthora infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes),

bộ nấm sương mai (Peronosporales) gây ra

Nấm có cấu tạo dạng sợi ñơn bào Sinh sản theo hai phương thức vô tính và hữu tính

Hình 2 a) Bào tử phân sinh của nấm Phytophthora infestant , b) Bào tử phân

sinh nảy mầm trực tiếp tạo ra bào tử ñộng

Trang 24

Phương thức sinh sản vô tính: nấm tạo ra cành bào tử phân sinh và

bào tử phân sinh lộ ra trên bề mặt vết bệnh, ñặc biệt là mặt dưới lá bệnh Bệnh sương mai qua ñông khi nấm tồn tại trên tàn dư thực vật, trên những ký chủ tự nhiên Dưới ñiều kiện môi trường thuận lợi cho sự sinh bào tử, hệ sợi sản sinh

ra các cành bào tử nhánh kéo dài 200µm trên bề mặt lá (Carlile, Watkinson, 1994) Cành bào tử không màu, chia nhiều nhánh cấp 1 so le với nhau, trên mỗi ñỉnh nhánh có nhiều chỗ phình lồi lõm, ñây là ñặc ñiểm riêng biệt của

cành bào tử nấm P.infestans so với các nấm Phytophthora khác

Tại ñầu cành bào tử, bào tử hình quả chanh yên, có núm ñược tạo ra Các bào tử này có kích thước khoảng 29x19µm ñến 36x22µm( Erwin, Ribeiro, 1996) Bào tử phát tán thông qua gió và giọt nước bắn Mỗi bọc bào

tử có thể chứa 3-8 bào tử ñộng ñược giải phóng khi phá vỡ thành bào tử (Agrios, 1997) Mỗi bào tử ñộng có 2 lông roi thuận lợi cho sự vận ñộng trong môi trường có nước (Lê Lương Tề, 2007)

Bào tử có 2 kiểu nảy mầm trực tiếp và gián tiếp Nếu nhiệt ñộ môi trường trong khoảng 20-240C bào tử phân sinh sẽ trực tiếp hình thành ống mầm sau ñó tạo thành sợi nấm xâm nhập vào tế bào mô cây kí chủ Nếu nhiệt

ñộ môi trường từ 12-180C trong ñiều kiện ẩm cao hoặc có giọt nước, bào tử phân sinh sẽ giải phóng các du ñộng bào tử (zoospore) có 2 roi

Các du ñộng bào tử này có khả năng chuyển ñộng nhờ có giọt nước sẽ tìm tới các lỗ khí khổng nảy mầm tạo ra các sợi nấm và xâm nhập vào cây kí chủ

Dù là phương thức nảy mầm trực tiếp hay gián tiếp nhưng khi xâm nhập sợi nấm ñều dùng phương pháp cơ học là hình thành các vòi hút hình trụ hoặc hình cầu

ñể xâm nhập vào mô lá

Nấm sương mai có chu kì phát triển hoàn toàn với giai ñoạn sinh sản vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính bằng bào tử phân sinh (Croiser, 1934), dưới hai hình thức nảy mầm trực tiếp và gián tiếp nảy mầm thông qua bào tử ñộng (hình thành trong ñiều kiện lạnh, có giọt nước) Nấm sương mai có 2 chủng

Trang 25

nấm A1, A2 và một dạng hữu tính Sinh sản hữu tính phần lớn xảy ra ở các vùng lạnh ẩm, phải có ñủ cả 2 chủng nấm A1, A2 hoặc có dạng hữu tính lúc này sẽ sinh ra bào tử trứng Bào tử trứng ñược hình thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao ñực (Antheridium) Sau khi phối giao nhân của bao ñực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng 31 x 50 µm (Erwin và Ribeico, 1996) Khi ở vùng khí hậu không thuận lợi cho sự hình thành bào tử trứng hoặc chỉ có 1 trong 2 chủng nấm thì nấm sương mai chỉ sinh sản theo kiểu vô tính Xem hình 3

Hình 3 Chu kì phát triển của nấm Phytophthora infestans

Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác do gió lan truyền bào tử phân sinh, có thể do nước rửa trôi bào tử Bào tử vô tính có khả năng tồn tại trong ñất ẩm từ vài ngày tới vài tuần tuy vậy trong ñất khô khả năng này khá hạn chế Trong ñiều kiện tồn tại trên bề mặt nước có ñất, bào tử cũng có thể tồn tại tới vài tuần nhưng trong ñiều kiện không có ñất bào tử chỉ tồn tại ñược vài ngày Khả năng qua ñông của bào tử trong ñất là hạn chế nhất là các tầng ñất

Trang 26

có phủ băng giá Khả năng chịu lạnh của bào tử vô tính khá tốt, khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo bào tử nấm có thể chịu ñược nhiệt ñộ tới -50C trong vòng 1 ngày Nếu bào tử nấm có khả năng nảy mầm và xâm nhập vào

củ khoai tây thì khả năng qua ñông của nấm lại rất cao, bào tử cũng có thể sống sót qua ñông nếu nằm trên ñất bám vào bề mặt củ trong quá trình bảo quản qua ñông và là mầm bệnh cho vụ sau

Phương thức sinh sản hữu tính có ý nghĩa ñặc biệt quan trọng trong sự tồn dư của bệnh Bào tử trứng hình thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao ñực (Antheridium) Sau khi phối giao nhân của bao ñực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng

31 x 50 µm (Erwin và Ribeiro, 1996) Bào tử trứng có khả năng tồn tại lâu trong ñất mà không mất ñi khả năng nảy mầm và ñộc tính ðặc biệt oospore

có khả năng tồn tại trong hạt cà chua là nguồn bệnh ñặc biệt cho vụ sau Tuy vậy chỉ khi ñủ cả 2 chủng nấm cùng với ñiều kiện lạnh ẩm mới xảy ra hiện tượng sinh sản hữu tính Hiện tượng này chưa tìm thấy xảy ra ở nước ta

Phytophthora infestans có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau

tùy thuộc vào vùng sinh thái cũng như chế ñộ phòng trừ của từng vùng Mỗi chủng khác nhau có ñộc tính khác nhau và khả năng xâm nhiễm trên mỗi giống cà chua, khoai tây là khác nhau, chính vì vậy việc xác ñịnh chủng nấm tại các vùng sinh thái sẽ ñưa ra cơ cấu giống cây trồng thích hợp ñể giảm tối

ña tác hại của bệnh

*Tác hại của bệnh sương mai ở nước ta

Bệnh sương mai khoai tây có thể coi là một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất ñối với ngành sản xuất khoai tây Bệnh khi xuất hiện trên ñồng ruộng sẽ ít nhiều ảnh hưởng tới năng suất Bệnh nhẹ hại trên bộ lá làm giảm diện tích quang hợp giảm năng suất của cây Bệnh hại nặng làm chết toàn bộ cây mất hoàn toàn năng suất Hơn nữa bệnh có khả năng tồn

Trang 27

tại trong củ giống, củ thương phẩm là nguồn bệnh cho vụ sau

Theo trung tâm khuyến nông khuyến ngư Việt Nam, vụ ñông xuân có nhiều ñợt lạnh, theo sau ñó là những ngày mưa phùn hoặc ẩm ñộ bão hoà khá thích hợp cho sự phát triển của nấm sương mai nên bệnh ñã xuất hiện

và gây hại ở một số ñịa phương như: Lào Cai, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Nội Ở các vùng trồng rau thuộc tỉnh Lâm ðồng bệnh xuất hiện quanh năm tỉ lệ hại cao phát triển nhanh Vào tháng 7 năm 2009 tại 2 huyện ðơn Dương và ðức Trọng diện tích nhiễm bệnh ñã lên tới 1620 ha trong ñó 50

ha nhiễm nặng, trong 1 tuần diện tích nhiễm bệnh ñã tăng thêm 100ha Tại các tỉnh Bắc Giang, Lạng Sơn, Lào Cai bệnh gây hại vào cuối tháng

12 và kéo dài tới tháng 3 năm sau Tại Lào Cai bệnh có thể xuất hiện vào tháng

8 - 9 nhưng chỉ hại rất nhẹ cho tới nhẹ Tỉnh Bắc Giang cũng có diện tích trồng khoai tây khá lớn tại huyện Hiệp Hoà, bệnh có xuất hiện trên khoai tây nhưng muộn hơn các tỉnh miền núi phía bắc, bệnh hại với mức ñộ nhẹ do bà con nông dân áp dụng biện pháp hoá học khá thường xuyên Tại Gia Lâm, Hà Nội bệnh hại xuất hiện với mức ñộ rất nhẹ trên cà chua Bệnh vẫn còn rải rác vào tháng 3 nhưng do nhiệt ñộ cao lên nhanh chóng các vết bệnh nhanh chóng

bị khô ñi, cùng với việc áp dụng biện pháp phun thuốc hoá học (Ridomil Gold-Syngenta) bệnh nhanh chóng ñược loại bỏ khỏi ñồng ruộng

*Biện pháp phòng chống

Vì nấm sương mai có tốc ñộ phát triển nhanh và ảnh hưởng lớn tới năng suất nên việc phòng chống bệnh là hết sức cần thiết Hiện nay phương pháp phòng bệnh thường ñược bà con nông dân sử dụng và phòng trừ bằng thuốc hóa học như Boocdo, manconeb có tác dụng ức chế sự phóng bào tử ra khỏi bọc bào tử làm giảm sự xâm nhiễm ban ñầu của nấm

Do sự bùng nổ của bệnh dịch sương mai nên thuốc hóa học ñược sử dụng với số lượng lớn, thời gian phun cách nhau ngắn làm gia tăng áp lực trong quần thể sương mai và làm cho tính kháng của nấm ñối với thuốc hóa

Trang 28

Ngoài biện pháp hóa học ñể phòng chống bệnh sương mai, giống kháng bệnh cũng ñã ñược nghiên cứu và tìm hiểu nhằm tạo ra các giống có gen kháng ñối với bệnh này

2.5 Cơ chế kháng của cây với nấm Phytophthora infestans

Khả năng kháng Phytophthora infestans của cây ñặc trưng bởi phản ứng tự vệ làm cho các tế bào bị xâm nhiễm tự chết nhanh chóng, gọi là phản ứng siêu nhạy (HR) Ở giai ñoạn ñầu xâm nhiễm, Phyotophthora infestans xâm nhập vào tế bào và tiết vào tế bào chủ các effectors Các effector hoạt ñộng như các yếu tố không ñộc - Avirulence (Avr) và kích hoạt gen kháng R tương ứng theo mô hình gen ñối gen Khi các protein R nhận biết ñược các effector, khả năng miễn dịch ñược kích hoạt dẫn ñến phản ứng siêu nhạy lập tức xảy ra bằng cách tích lũy H2O2 ở vị trí xâm nhiễm và cảm ứng nhanh chóng quá trình chết tế bào theo lập trình (Programmed cell death - PCD) tác ñộng ñến các tế bào xung quanh vị trí bị xâm nhiễm (Bolwell, 1999) làm hạn chế sự xâm nhiễm Quan hệ gen ñối gen ñược giả thiết dựa trên tương tác trực tiếp giữa protein R và Avr Sự tương tác này ñược gọi là mô hình elicitor – receptor, trong ñó các elicitor là các protein Avr ñóng vai trò chất kích hoạt còn receptor là các protein kháng ñóng vai trò là chất tiếp nhận Phản ứng kháng chỉ hình thành chỉ khi có sự tương tác trực tiếp giữa elicitor và receptor

2.6 Một số nghiên cứu về khoai tây

2.6.1 Một số nghiên cứu về sâu bệnh hại khoai tây

ðể hạn chế thiệt hại do sâu bệnh ở mức thấp nhất, việc cung ứng khoai

Trang 29

tây sạch bệnh phải ñược coi trọng hàng ñầu Ở châu Âu, Pháp, Hà Lan ñang áp dụng phương pháp chọn lọc dòng và xây dựng hệ thống sản xuất giống từ in-vitro Cuba áp dụng phương pháp chọn lọc quần thể, Hàn Quốc, áp dụng phương pháp in-vitro và công nghệ thuỷ canh (Lê Hưng Quốc, 2006) Ở Việt Nam Viện Công nghệ sinh học nông nghiệp, trường ðại học Nông Nghiệp I mới xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh từ sản xuất cây in-vitro ñến sản xuất giống xác nhận (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2006)

Một trong những ñiều kiện quan trọng ñể sản xuất ra củ giống sạch bệnh là phải tìm ra vùng cách ly với nguồn bệnh cũng như môi giới truyền bệnh Nhân các giống mới trong ñiều kiện không có vùng cách ly ñã làm lô giống bị nhiễm bệnh và thoái hóa nhanh chóng (Nguyễn Văn Viết, 1987, 1992) ðể tạo ra vùng cách ly, nhiều nước ñã thành lập các Trung tâm nhân giống tại các vùng cách xa khu vực trồng khoai hàng chục km ðối với hệ thống nhân giống ñơn giản một số tác giả cho rằng vùng cách ly ít nhất là 100m và tốt nhất là 2000m

Ở Việt Nam, giai ñoạn 1985 – 1989 sản xuất khoai tây giống sạch bệnh bằng phương pháp chọn lọc vệ sinh trên vùng cách ly ñịa hình ñã ñạt năng suất cao 21 tấn/ha với 50 ha thực nghiệm và 16 tấn/ha với 600 ha thực nghiệm (Vũ Triệu Mân, 1990) Tổ chức nhân và chọn lọc các giống mới ở khu tập trung cách ly kết hợp với chọn lọc vệ sinh quần thể ñể loại thải cây bệnh, hạn chế mức ñộ nhiễm bệnh (11,56% so với 28,57%) cho phép sản xuất khoai tây giống có chất lượng tốt với khối lượng lớn, năng suất khoai tây thương phẩm tăng 31,52% (Nguyễn Văn Viết, 1992)

Biện pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng (meristem) có thể tạo cây hoàn toàn sạch bệnh Nếu cây sạch bệnh ñược trồng liên tiếp ở môi trường không cách ly thì khoai tây bị nhiễm virus rất nhanh Khoai tây sạch bệnh nhập nội chỉ sau 1 vụ trồng, tùy từng giống mà tỷ lệ nhiễm virus biến ñộng từ 1 – 10% Ngoài ra tốc ñộ tái nhiễm cao, hệ số nhân giống thấp (Trương Công Tuyện, 1999)

Trang 30

Trồng khoai tây bằng hạt cũng là biện pháp hạn chế sự lan truyền bệnh virus Hầu hết các loại bệnh, ñặc biệt là bệnh nguy hiểm không truyền qua hạt khoai tây Các triệu chứng bệnh trên cây thực sinh chủ yếu là khảm lá và nhăn

lá nhọn, ñến ñời vô tính 1 mới xuất hiện triệu chứng như khảm nặng, cuốn lá

và xoắn lùn Mức ñộ nhiễm bệnh của khoai tây trồng bằng hạt thấp hơn nhiều

so với trồng bằng củ vô tính Ở ñời thực sinh tỷ lệ bệnh 6,06 – 8,38%, ñời vô tính 15,7 – 18,76% Tốt nhất chỉ nên dùng củ giống từ hạt lai ñể trồng một chu kỳ ngắn là 2 – 3 vụ (Nguyễn Văn Viết và cs, 1998)

Tuổi sinh lý của củ cũng tác ñộng rõ ñến hạn chế bệnh khoai tây, thu hoạch sớm (70 -80 ngày sau trồng) nguồn bệnh từ thân lá chưa kịp lan truyền xuống củ giống ñể gây thối củ trong kho Nếu sử dụng phân hữu cơ tươi còn tàng trữ nguồn bệnh và trong những ñiều kiện nhất ñịnh bệnh sẽ phát triển và truyền vào củ ngoài ñồng và gây thối củ trong kho (Nguyễn Văn Viết và cs, 1998)

Nguyễn Văn Viết và cs (1998) ñề xuất phương án phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại khoai tây hạt lai theo các bước sau: Chọn vùng trồng khoai tây thuần và tập trung có luân canh với 2 vụ lúa nước ñể sản xuất củ giống Go Không trồng khoai tây lẫn với các cây vụ ñông khác Nên trồng khoai tây ñúng thời vụ và ñồng loạt, tưới giữ ẩm thường xuyên, bón phân chăm sóc kịp thời Phát hiện sâu bệnh kịp thời, sâu xám có thể bắt bằng tay vào buổi sáng, khi xuất hiện nhện trắng phun thuốc Kenthan hoặc Danitol ðối với bọ trĩ sử dụng Bassa, Trebon phun từ 1 – 2 lần, mỗi lần cách nhau 5 ngày, phun ñồng loạt cả cây trồng khác

- Củ giống bị thoái hoá không sạch bệnh và già sinh lý: Thời gian bảo quản giống ở Việt nam rất dài (từ tháng 1 ñến tháng 9) Giống phải bảo quản lâu trong thời gian nhiệt ñộ cao nên củ giống bị già hóa nhanh Trồng củ trẻ sinh lý năng suất cao hơn 40% so với trồng củ già (Trương Văn Hộ và cs, 1990) Mặt khác hầu hết các giống khoai tây trồng trên ñồng ruộng ñều bị nhiễm virus với tốc ñộ tăng dần làm cho giống bị thoái hóa, năng suất và chất lượng giảm sút (Lê Hưng Quốc, 2006)

Trang 31

- ðiều kiện khí hậu ở Việt Nam ít thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng, phát triển: Nhiệt ñộ cao, ngày ngắn và nhiều ñiều kiện khí hậu không thích hợp khác nữa nên khoảng cách giữa năng suất thực tế với tiềm năng năng suất là rất lớn (chỉ bằng 10%) và thời vụ gieo trồng ngắn, chỉ trồng ñược 1 ñến 2 vụ/năm Thời vụ gieo trồng ngắn không chỉ trồng ñược ít vụ mà năng suất cây trồng cũng không cao

Những giống khoai tây nhập nội thường có thời gian sinh trưởng dài (150 – 190 ngày), khi trồng ở Việt Nam thời gian sinh trưởng bị rút ngắn, chỉ khoảng 85 – 115 ngày (Nguyễn Văn Thắng, Bùi Thị Mỳ, 1996) Thời gian sinh trưởng ngắn là yếu tố bất lợi, hạn chế nhiều ñến năng suất và phẩm chất khoai tây (Trương văn Hộ và cs, 1990)

2.6.2 Các nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai

Một số loài Solanum dại và trồng ñã ñược kiểm tra khả năng kháng

bệnh sương mai và do ñó ñược sử dụng ñể lập bản ñồ di truyền của gen R /

QTLs Một loạt các gen R có trong các loài hoang dại bao gồm R1- R11 từ S

demissum; RB/Rpi-blb1, Rpi - blb2, Rpi - blb3, Rpi - bt1 và Rpi - abpt từ S bulbocastanum; Rpi - bst1 từ S brachistotrichum; Rpi - edn1.1 từ S edinense; Rpi - hjt1.1, Rpi - hjt1.2 và Rpi - hjt1.3 từ S hjertingii ; Rpi - mcd1 từ S microdontum; Rpi - snk1.1 và Rpi - snk1.2 từ S schenckii; Rpi - veR1 từ S verrucosum; Rpi - pnt1 từ S pinnatisectum; Rpi - sto1 và Rpi - sto2 từ S stoloniferum; Rpi - pta1 từ S papita; Rpi - plt1 từ S polytrichon; Rpi - mcq1

từ S mochiquense; Rpi - phu1 từ S phureja; Rpi - vnt1.1, Rpi - vnt1.2 , Rpi -

vnt1.3 từ S venturii ; Rpi - dlc1 từ S dulcamara; Rpi - ber1 và Rpi - ber2 từ

S berthaultii; Rpi - avl1 từ S avilesi; Rpi - cap1 từ S capsicibaccatum và Rpi

- qum1 từ S circaeifolium spp quimense

Loài S demissum của Mexico mang gen kháng bệnh sương mai là nguồn cung cấp 11 gen trội R (R1-R11) ñã ñược lai với loài khoai tây trồng là

S tuberosum trong những năm 1950 và 1960 ñể tạo giống kháng (Bradshaw

Trang 32

và Ramsay 2005) đây là nguồn gen kháng tiềm năng với tác nhân gây bệnh phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng

Nghiên cứu của đào Mạnh Hùng và CTV (1995), trên các giống Ba Lan, giống Hồng Lan bị bệnh sương mai phá hại nặng, giống HP1, HP5 có khả năng chịu bệnh khá lớn Theo Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự (1982) các giống nhập nội từ châu Âu như: Hungari, Bungari, Liên Xô cũ thường bị nặng

và tốc ựộ phát triển bệnh cũng khá nhanh, một số giống khoai tây đức nhập nội như: Cardia, Mariella, giống khoai tây Pháp, giống Thường TắnẦ ựều là những giống nhiễm bệnh nặng

2.7 Ứng dụng chỉ thị DNA phân tử trong nghiên cứu các gen kháng bệnh sương mai

Trong số các biện pháp phòng trừ tác hại của bệnh sương mai thì việc

sử dụng các giống kháng ngày càng ựược quan tâm nhiều hơn Việc lựa chọn gen kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là mức ựộ

ựa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh, ựặc tắnh gây bệnh và tắnh ựộc của quần thể tác nhân gây bệnh, ựặc biệt là của các chủng, nòi chiếm ưu thế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà chọn giống bắt ựầu quan tâm hơn ựến vấn ựề Ộchọn giống nhờ chỉ thị phân tửỢ với ý ựồ sử dụng các chỉ thị phân tử phát hiện ra nguồn gen kháng sương mai Các nhà khoa học ựã tìm ựược

vị trắ các gen ựược ựịnh vị trên từng nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gen ựó, tạo ra các bản ựồ di truyền liên kết gen Dựa vào các chỉ thị này, chúng ta có thể phát hiện ựược sự có mặt của một gen bất kỳ, nếu biết ựược một hoặc nhiều chỉ thị liên kết chặt với gen ựó

Hiện nay có rất nhiều chỉ thị phân tử ựược sử dụng trong công tác chọn tạo giống như RAPD, AFLP, STS, SSR tùy theo mục ựắch và ựặc ựiểm, các nhà chọn giống sẽ lựa chọn chỉ thị phù hợp

Trong ựó RAPD (random amplified polymorphic DNA), AP-PCR (arbitrarily primed PCR) và DAF (DNA amplification fingerprinting) là 3 kỹ

Trang 33

thuật phổ biến thường ñược gọi chung là MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling) Sự khác nhau chủ yếu của các kỹ thuật MAAP là biến ñổi mô hình băng ñiện di bằng cách thay ñổi trình tự và ñộ dài mồi, số chu trình PCR, enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và cắt khuôn DNA hay sản phẩm PCR bằng RE; kỹ thuật tách và nhuộm sản phẩm PCR Các kỹ thuật này tạo các profile khác nhau ñáng kể, thay ñổi từ khá ñơn giản (RADP) tới rất phức tạp (DAF) Cả 3 kỹ thuật RAPD, AP-PCR và DAF sử dụng một mồi tùy ý ñể nhân DNA với sản phẩm nhìn chung có kích thước < 3000 bp

Một kỹ thuật khác dựa trên RAPD là SCARs (Sequence Characterised Amplified Regions) Chỉ thị này dựa trên việc tách dòng và ñọc trình tự các ñoạn RAPD ñược quan tâm (có thể vì chúng liên kết với gen ñược quan tâm), từ trình

tự ñã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thường dùng trong RAPD (24 nucleotide) ñể bổ sung chính xác với trình tự ñầu cuối của ñoạn RAPD ban ñầu Khi các mồi này ñược dùng trong PCR, một locus ñơn ñược xác ñịnh tương ứng với ñoạn DNA ban ñầu của locus này SCARs tiến bộ hơn RAPD là các kết quả

có khả năng lặp lại (dùng mồi dài hơn) và là các chỉ thị ñồng trội

Gen R1 là một gen kháng sương mai quan trọng, có tính kháng cao, kháng ñược các chủng ñặc hiệu (Stewart và cộng sự, 2003) Gen R1 ñược xác

ñịnh nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số V là gen kháng trội có nguồn

gốc từ loài khoai tây dại Solanum demissum (Leonards-Schippers và cs.1992;

Ballvora và cs 2002) Gen này ñược ñịnh vị giữa maker RAPD GP21 và GP179; nằm trong vùng “nóng” chứa nhiều gen kháng (Gebhardt và

Valkonen 2001) Maker R1F/R(76-2sf2/76-2SR) ñã ñược sử dụng ñể phát hiện gen R1 bởi Ballvora và cộng sự năm 2002

Gen R3a ñược xác ñịnh nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số XI là gen kháng trội có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum demissum (Huang và cộng sự, 2005) Gen R3a có tính kháng cao, kháng chủng ñặc hiệu của tác nhân

gây bệnh sương mai Sokolova và cộng sự (2011) ñã tìm ra maker R3-1380 ñể

phát hiện gen kháng R3a

Trang 34

Cả 2 gen R1 và R3a ñã ñược lai tạo vào giống khoai tây truyền thống

ñể tạo giống kháng hữu hiệu (Umaerus và Umaerous 1994)

Hình 4 Các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng sương mai

Trang 35

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu gồm 131 mẫu giống khoai tây Co nguồn gốc từ Mỹ ñược lưu giữ tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng – Khoa Công nghệ sinh học – trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Bảng 1 Danh sách các mẫu giống khoai tây theo dõi

STT Tên mẫu

giống STT

Tên mẫu giống STT

Tên mẫu giống

1 PI498108 34 PI320286 67 PI133709 100 498056

Trang 36

STT Tên mẫu

giống STT

Tên mẫu giống STT

Tên mẫu giống

3.2 địa ựiểm và thời gian nghiên cứu

Các nghiên cứu ngoài ựồng ruộng ựược thực hiện tại Trung tâm bảo tồn

và Phát triển nguồn gen cây trồng Ờ trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, Trâu Quỳ - Gia Lâm Ờ Hà Nội

Các thắ nghiệm về sinh học phân tử ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng - khoa Công nghệ Sinh học, Trường ựại học Nông Nghiệp Hà Nội, Trâu Quỳ - Gia Lâm Ờ Hà Nội

Thời gian thực hiện: tháng 6/2013 ựến tháng 1/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

Ớ đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học của các mẫu giống khoai tây trong vụ ựông 2013

Ớ Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng R1, R3a trong các

Trang 37

mẫu giống khoai tây

Ớ đánh giá khả năng kháng của các mẫu giống bằng phương pháp theo dõi trên ựồng ruộng trong vụ ựông 2013

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm ngoài ựồng ruộng

Ớ Thắ nghiệm khảo sát tập ựoàn giống ựược bố trắ tuần tự

Ớ 131 mẫu ựược bố trắ theo hàng, chiều dài mỗi hàng 5m, hàng cách hàng 30cm, các mẫu giống cách nhau 40cm

Ớ Mỗi mẫu giống gồm 6 khóm

Ớ Bón phân: đạm ure: 1ha là 250 - 300kg

Lân supe: 1ha là 350 - 400kg Kali sunphat: 1ha là 200 Ờ 250kg

Trang 38

Bảng 2: Một số chỉ tiêu theo dõi ñặc ñiểm nông sinh học

Một số chỉ tiêu theo dõi về ñặc ñiểm sinh trưởng STT Chỉ tiêu

theo dõi

Giai ñoạn ñánh giá

ðơn vị tính hoặc ñiểm

số

Mức ñộ biểu hiện

Phương pháp ñánh giá

mầm

khóm mọc khỏi mặt ñất

Quan sát toàn bộ số khóm/ô

2 Tỷ lệ nảy mầm 30 ngày sau

khi trồng

các chồi trên mặt ñất

ðếm số chồi mọc lên / số khóm

3 Thời gian sinh

trưởng

80 ngày sau khi trồng

và lá chuyển từ màu xanh sang màu vàng

hoa

C

K

Có Không

Quan sát hoa

5 Số hoa trên mỗi

nhánh chính

ðếm số hoa

6 Sinh trưởng của

cây

7

5

3

Tốt Trung bình Yếu

7 Khả năng thích

nghi

7

5

3

Tốt Trung bình Yếu

Quan sát các khóm

khi trồng

ðứng Nửa ñứng

Bò

Quan sát các khóm

10 Số nhánh trên

thân chính

sinh trưởng ñến mặt ñất

khi trồng

Xanh Xanh nhạt Xanh ñậm

Quan sát lá

khi trồng

ðơn Kép

Quan sát lá

Trang 39

Một số chỉ tiêu theo dõi về ñộ nhiễm bệnh STT Chỉ tiêu theo

dõi

Giai ñoạn ñánh giá

ðơn vị tính hoặc ñiểm số

Mức ñộ biểu hiện

Phương pháp ñánh giá

(20-bị bệnh)

Rất nặng (trên 75% diện tích thân lá bị bệnh)

Quan sát diện tích vết bệnh trên thân lá, ñánh giá và cho ñiểm

(20-bị bệnh)

(20-Quan sát diện tích vết bệnh trên thân lá, ñánh giá và cho

Trang 40

9

diện tích thân lá

bị bệnh)

(20-bị bệnh)

Quan sát lá

và thân cây

bị nhiễm bệnh, ñánh giá và cho ñiếm số

Định dạng
Số trang	94
Dung lượng	1,87 MB