Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trong mật ong góp phần đánh giá ô nhiễm môi trường

Ứng dụng quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong để xác định chất trong các mẫu thực tế.... Nếu như trước năm 1985 khối lượng thuốc bảo vệ thực vật d

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Thị Thu Thủy

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM CLO HỮU CƠ TRONG MẬT ONG GÓP

PHẦN ĐÁNH GIÁ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Thị Thu Thủy

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM CLO HỮU CƠ TRONG MẬT ONG GÓP

PHẦN ĐÁNH GIÁ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành: Khoa học môi trường

Mã số: 60440301

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Đỗ Quang Huy

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS

Đỗ Quang Huy, giảng viên Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ

em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em cũng tỏ lòng biết ơn đến tập thể các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ môi trường, Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt hướng dẫn cách tổng hợp các kiến thức quý báu trong suốt những năm học vừa qua và nhiệt tình giúp đỡ em về mọi mặt, cũng như luôn tạo điều kiện thuận lợi để

em có thể hoàn thành tốt đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các cán bộ, viên chức Ban

10-80, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn các cử nhân Nguyễn Thị Lan Anh đã cộng tác với tôi triển khai nghiên cứu trong lĩnh vực chuyên môn môi trường

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên

Vũ Thị Thu Thủy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU U 1

4 5 7 8 9 10 11 14 15 16 18 18 18 20

Chương 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ

1.2.1 Hợp chất nhóm DDT

1.2.2 Hợp chất nhóm BHC

1.2.3 Hợp chất nhóm Chlordane

1.3 Giới thiệu chung về ong mật và sản phẩm mật ong

1.3.1 Tổ chức xã hội đàn ong

1.3.2 Mật ong

1.3.3 Vai trò của cây nguồn mật phấn đối với ong

1.3.4 Cách thức nuôi ong ở Việt Nam

1.4 Nguồn gốc xuất hiện các hóa chất BVTV trong mật ong

1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV trong mật ong

1.5.1 Phương pháp chiết lỏng-lỏng kết hợp với sắc ký khí khối phổ

1.5.2 Phương pháp chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí khối phổ

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU U 20 20 20 20 21 21 34 34 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập và tổng hợp tài liệu

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu

2.2.3 Phương pháp thực nghiệm

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

34 34 35 39 39 41 42 43

44 44 44 44

46 52 52 53 54 57

3.1 Đường ngoại chuẩn của các thuốc BVTV cơ clo nghiên cứu

3.1.1 Nhận diện chất phân tích trên sắc ký đồ của chất chuẩn

3.1.2 Xây dựng đường ngoại chuẩn định lượng các chất nghiên cứu

3.2 Xây dựng quy trình phân tích

3.2.1 Kết quả khảo sát thể tích dung môi rửa giải

3.2.2 Khảo sát khả năng loại bỏ tạp chất trong dịch chiết của cột sắc ký

3.3 Độ thu hồi của các thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ

3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

3.5 Quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong

3.5.1 Chiết mẫu

3.5.2 Làm sạch dịch chiết

3.5.3 Làm giàu mẫu

3.6 Ứng dụng quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong để xác định chất trong các mẫu thực tế

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

1 Kết luận

2 Khuyến nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

6 7

9 13 30 34 35

38 42 43 47 48

49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của DDT và các chất chuyển hóa của nó

Bảng 1.2 Tính chất của BHC và các đồng phân của BHC

Bảng 1.3 Một số tính chất vật lý của các nhóm thuốc BVTVtiêu biểu thuộc họ clo hữu cơ

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của mật ong

Bảng 2.1 Nồng độ các dung dịch hỗn hợp chất chuẩn

Bảng 3.1 Thời gian lưu của một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ chuẩn

Bảng 3.2 Mối quan hệ giữa nồng độ chất chuẩn và số đếm diện tích píc

Bảng 3.3 Phương trình đường ngoại chuẩn và hệ số tương quancủa 19 loại thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ

Bảng 3.4 Độ thu hồi của các chất khi thực hiện bướcchuẩn bị và phân tích mẫu

Bảng 3.5 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp phân tích thuốc BVTV nhóm cơ clo trong mật ong

Bảng 3.6: Kết quả phân tích một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong các mẫu mật ongtại xã Hồng Nam - tỉnh Hưng Yên (từ mẫu HY1 đễn mẫu HY11)

Bảng 3.7: Kết quả dư lượng một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong các mẫu mật ong tại xã Hồng Nam - tỉnh Hưng Yên (từ mẫu HY12 đến mẫu HY22)

Bảng 3.8: Kết quả phân tích dư lượng một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong các mẫu mật ong tại xã Giáp Sơn - tỉnh Bắc Giang; xã Bằng Khánh - tỉnh Lạng Sơn

5 25 34 39 40 40 41 41

45 57 57 58 58 59 59 60 60 61 61 62 62 63 63 64 64 65 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự chuyển hóa của DDT thành DDE và DDD

Hình 2.1 Sơ đồ khối của máy sắc ký khí

Hình 3.1 Sắc đồ của các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Hình 3.2 Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 ứng với dịch rửa giải là 5 mL etyl axetat

Hình 3.3.Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 ứng với dịch rửa giải là 15 mL etyl axetat Hình 3.4.Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 ứng với dịch rửa giải là 10 mL etyl axetat Hình 3.5 Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 rửa giải bằng 10 mL etyl axetat

cho qua cột Al2O3

Hình 3.6 Quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong

Hình 1P Đường ngoại chuẩn của α-BHC

Hình 2P Đường ngoại chuẩn của Hexachlorbenzen

Hình 3P Đường ngoại chuẩn của β-BHC

Hình 4P Đường ngoại chuẩn của γ-BHC

Hình 5P Đường ngoại chuẩn của δ-BHC

Hình 6P Đường ngoại chuẩn của Heptachlor

Hình 7P Đường ngoại chuẩn của α-Chlordene

Hình 8P Đường ngoại chuẩn của β-Chlordene

Hình 9P Đường ngoại chuẩn của Oxychlordane

Hình 10P Đường ngoại chuẩn của trans-Chlordane

Hình 11P Đường ngoại chuẩn của o,p’-DDE

Hình 12P Đường ngoại chuẩn của cis-Chlordane

Hình 13P Đường ngoại chuẩn của trans-Nonachlor

Hình 14P Đường ngoại chuẩn của p,p’-DDE

Hình 15P Đường ngoại chuẩn của o,p’-DDD

Hình 16P Đường ngoại chuẩn của cis-Nonachlor

Hình 17P Đường ngoại chuẩn của o,p’-DDT và p,p’-DDD

Hình 18P Đường ngoại chuẩn của p,p’-DDT

66 66 67 67 68 68

Hình 19P Sắc đồ phân tích mẫu HY6 bằng GC/ECD

Hình 20P Sắc đồ phân tích mẫu HY8 bằng GC/ECD

Hình 21P Sắc đồ phân tích mẫu LS1 bằng GC/ECD

Hình 22P Sắc đồ phân tích mẫu LS3 bằng GC/ECD

Hình 23P Sắc đồ phân tích mẫu BG1 bằng GC/ECD

Hình 24P Sắc đồ phân tích mẫu BG2 bằng GC/ECD

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng bảy mươi phần trăm dân số sống bằng nghề nông, vì vậy việc nâng cao năng suất, sản lượng cây trồng luôn được quan tâm hàng đầu Trên con đường tìm kiếm các biện pháp để tăng năng suất cây trồng, đảm bảo đời sống của người sản xuất, việc đưa hoá chất bảo vệ thực vật vào sản xuất nông nghiệp ở nước ta được coi là một thành tựu khoa học to lớn, từ

đó mà năng suất nông sản thu hoạch tăng lên rõ rệt, cuộc sống vật chất của người nông dân no đủ hơn Tuy nhiên cũng chính từ những lợi ích đó mà người nông dân

đã lạm dụng hoá chất trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là hóa chất bảo vệ thực vật một cách quá mức, không chỉ cho các loại cây lương thực mà còn được dùng cho tất cả các loại cây trồng khác trong đó có cây ăn quả, và hoa màu Theo số liệu của Cục Bảo vệ Thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ở Việt Nam, số lượng và chủng loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng ngày càng tăng lên Nếu như trước năm 1985 khối lượng thuốc bảo vệ thực vật dùng hàng năm khoảng 6.500 đến 9.000 tấn thành phẩm quy đổi và lượng thuốc sử dụng bình quân khoảng 0,3 kg hoạt chất/ha thì hiện nay theo Cục BVTV (Bộ NN&PTNT), trung bình mỗi năm cả nước nhập khẩu khoảng trên 70.000 tấn thuốc bảo vệ thực vật thành phẩm các loại, trong

đó 90% được nhập khẩu từ Trung Quốc Như trong năm 2012 số lượng và giá trị nhập khẩu đã tăng lên 103.500 tấn với khoảng 700 triệu USD

Sự phân hủy chậm của thuốc bảo vệ thực vật đặc biệt là nhóm thuốc bảo vệ thực vật gốc clo hữu cơ và việc sử dụng không đúng cách thuốc bảo vệ thực vật đã làm xuất hiện chúng ở trong môi trường và trong các sản phẩm nông nghiệp, dẫn

ngành y tế, trong năm 2012 cả nước đã xảy ra 168 vụ ngộ độc thực phẩm với 5541 nạn nhân và làm chết 34 người, trong khi đó trong năm 2013 cả nước xảy ra 163 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 5000 nạn nhân, trong đó 28 người tử vong

Việc phun trực tiếp hóa chất bảo vệ thực vật lên hoa và sự có mặt của hóa chất bảo vệ thực vật trong không khí là nguyên nhân chính dẫn đến mật hoa có thể chứa các loại hóa chất bảo vệ thực vật Vì vậy, trong quá trình lấy mật hoa, ong mật

(Apis mellifera) đã mang theo cả mật hoa và các hóa chất bảo vệ thực vật về tổ Đó

Ở Việt Nam, mật ong được sản xuất với số lượng lớn và phủ rộng khắp các vùng miền Mật ong được sử dụng làm thức ăn, sản xuất hóa mỹ phẩm, dược phẩm

và được xuất khẩu tới nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ Việc giám sát dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong mật ong giúp đánh giá rủi ro tiềm tàng của sản phẩm này đến sức khỏe người tiêu dùng, đồng thời cung cấp thông tin về loại thuốc bảo vệ thực vật đã được sử dụng cho các loại cây trồng xung quanh khu vực nuôi ong Vì

vậy, đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật

nhóm clo hữu cơ trong mật ong góp phần đánh giá ô nhiễm môi trường”, được lựa

chọn với mục tiêu:

- Xây dựng được quy trình xác định hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật

nhóm clo hữu cơ trong mật ong;

- Xác định mức dư lượng các loại hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trong mật ong và bước đầu đánh giá có hay không sự ô nhiễm môi trường do thuốc bảo vệ thực vật tại khu vực lấy mẫu nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật

1.1.1 Định nghĩa

Hóa chất bảo vệ thực vật hay còn gọi là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV): là những chế phẩm có nguồn gốc hoá chất, thực vật, động vật, vi sinh vật và các chế phẩm khác dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật Bao gồm: các chế phẩm dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật; các chế phẩm điều hoà sinh trưởng thực vật, chất làm rụng hay khô lá; các chế phẩm có tác dụng xua đuổi hoặc thu hút các loài sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệt

- Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất hữu

cơ của acid photphoric Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn hơn so với nhóm Clo hữu cơ và được sử dụng rộng rãi hơn Nhóm này tác động vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ, gây choáng váng và chết Nhóm này bao gồm một số hợp chất như parathion, malathion, diclovos, clopyrifos…

- Nhóm carbamat là các dẫn xuất hữu cơ của acid cacbamic, gồm những hoá chất ít bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với người và động vật Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Cholinestraza

của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc giống như nhóm lân hữu cơ Đại diện cho nhóm này như: carbofuran, carbaryl, carbosulfan, isoprocarb, methomyl…

- Nhóm pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúc nào đó Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, fenvalarate, deltamethrin,…

Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân…)

1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ

Thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ chủ yếu là dẫn xuất clo của hydrocacbon đa nhân, xicloparafin, tecpen… Đặc tính của thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ rất bền trong môi trường được sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp để chống kiến, mối tha hạt Đặc điểm bền trong môi trường của chúng lúc đầu được coi là ưu điểm

vì độc tính có thể giữ được lâu, phun một lần có thể đảm bảo phòng trừ sâu bệnh trong khoảng thời gian dài Tuy nhiên, cho đến nay thuốc BVTV có chu kỳ bán phân huỷ dài hơn 1 tuần được coi là phải kiểm soát sử dụng một cách nghiêm ngặt

Thị trường thuốc BVTV của Việt Nam rất phức tạp do nạn buôn lậu qua biên giới, chủ yếu là từ Trung Quốc, không kiểm soát được Theo những công bố mới nhất, Trung Quốc vẫn tiếp tục sản xuất BHC, DDT để dùng nội địa và thậm chí suất

mới đáp ứng được yêu cầu của nông dân nghèo ít tiền mà vẫn cần phải có năng suất Ngoài mục đích sử dụng trong nông nghiệp, các loại nông hoá còn được sử dụng nhiều trong y tế Trong đó, thuốc BVTV được dùng để chống muỗi, chống gián, tẩy

uế những nơi công cộng như bệnh viện, nhà ga.v.v

Tuy nhiên, do độ bền hóa học của thuốc BVTV nhóm cơ clo cao nên thuốc tồn lưu lâu dài trong đất, cây trồng, nông sản, thực phẩm và làm cho môi trường bị

ô nhiễm trong một thời gian lâu dài Khi thuốc BVTV thâm nhập vào cơ thể qua tiếp xúc hoặc qua chuỗi thức ăn có thể gây ngộ độc hoặc gây ra các bệnh hiểm

nghèo như ung thư, quái thai… Do những nhược điểm trên, ngày nay nhiều thuốc BVTV thuộc nhóm cơ clo đã bị cấm hoặc hạn chế sử dụng ở nhiều nước

Một số thuốc BVTV nhóm cơ clo được nghiên cứu trong luận văn bao gồm: hợp chất nhóm DDT, hợp chất nhóm BHC, hợp chất nhóm Chlordane

1.2.1 Hợp chất nhóm DDT

DDT được điều chế từ phản ứng trùng ngưng giữa chlorobenzene với trichloroacetaldehyde và sản phẩm DDT công nghiệp thường có 30% đồng phân o,p- cũng có tính diệt côn trùng nhưng sản phẩm chính là p,p’-DDT Do vậy, khi đề cập đến DDT người ta thường quan tâm đến p,p’-DDT Các thành phần khác trong

DDT bị khử clo trong điều kiện yếm khí tạo thành DDD (hình 1.1), đây cũng

là một chất diệt côn trùng DDT bị khử clo và hydro trong điều kiện hiếu khí lại chuyển thành DDE (hình 1.1) (tính độc DDT > DDE > DDD) Độ bền DDE > DDD

> DDT, vì vậy DDE thường có nồng độ cao hơn DDD và DDT trong môi trường

Cả ba loại hợp chất này có nhiều đồng phân nhưng quan trọng hơn cả là các đồng phân p,p’- [1]

Hình 1.1 Sự chuyển hóa của DDT thành DDE và DDD

Tính chất hóa lý của nhóm thuốc DDT, DDD và DDE được nêu trong bảng 1.1: [8], [21]

Bảng 1.1 Tính chất của DDT và các chất chuyển hóa của nó

1

1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-

chlorophenyl)ethane Hoặc 4,4’-DDT

CTPT: C14H9Cl5

M= 354.49 đvC

Tnc= 1090C

Ts= 2600C (phân hủy)

Tỷ trọng: 0.98 – 0.99 g/cm3

2

chlorophenyl)-2-(p-chlorophenyl)ethane Hoặc 2,4’-DDT

1,1,1-trichloro-2-(o-CTPT: C14H9Cl5

M= 354.49 đvC

Tnc= 74.20C

Tỷ trọng: 0.98 – 0.99 g/cm3

3

1,1-dichloro-2,2-bis (p-

chlorophenyl)ethylene Hoặc 4,4’-DDE

1,1-dichloro-2-(o-CTPT: C14H8Cl4

M= 318.03 đvC

5

1,1-dichloro-2,2-bis (p-

chlorophenyl)ethane Hoặc 4,4’-DDD

6

chlorophenyl)ethane Hoặc 2,4’-DDD

sự sắp xếp không gian của các nguyên tử chlor trong phân tử BHC đối xứng qua vòng cyclohexane Thuốc BVTV Lindan được sản xuất có chứa trên 98% γ-BHC,

của nhiều đồng phân gồm 60 – 70% α-BHC, 5 – 12% β-BHC, 10 – 15% γ-BHC và

δ-BHC > α-δ-BHC > δ-BHC Trong số các đồng phân của δ-BHC chỉ có đồng phân BHC là có tính diệt côn trùng và nó được biết đến ở Việt Nam từ những năm 60 của thế kỷ trước như một thần dược với tên gọi 666 dùng để chống muỗi, kiểm soát bệnh sốt rét cùng với DDT

γ-Tính chất hóa lý của các đồng phân phổ biến nhóm BHC được nêu trong bảng 1.2: [15], [21]

Bảng 1.2 Tính chất của BHC và các đồng phân của BHC

STT Công thức cấu tạo Tên gọi Thông số cơ bản

1

α-BHC hoặc α-benzenhexachloride

2

β-BHC hoặc β-benzenhexachloride

3

γ-BHC hoặc γ- benzenhexachloride

CTPT: C6H6Cl6

M= 209.83 đvC

Tnc= 112.50C

Ts= 323.40C (ở 760mmHg)

Tỷ trọng: 1.89 ở 190C g/cm3

4

δ-BHC hoặc δ- benzenhexachloride

CTPT: C6H6Cl6

M= 209.83 đvC Tnc= 141 – 1420C

1.2.3 Hợp chất nhóm Chlordane

octachloro-4,7-methanotetrahydroindane (cis và đồng phân trans) và 40% hợp chất khác

Chlordane là hỗn hợp của những đồng phân của chlordane, những hydrocarbon được clo hóa và nhiều thành phần khác Ví dụ, hỗn hợp gồm 94,8% chlordane (cis [hoặc alpha]-Chlordane, 71,7%; trans [hoặc gamma]-Chlordane, 23,1%) với heptachlor, 0,3%; trans-Nonachlor, 1,1%; cis-Nonachlor, 0,6%; các đồng phân của chlordane, 0,25%; 3% hợp chất khác, và hexachlorocyclopentadiene, 0,25%

chlordane kỹ thuật và phần trăm tổng cộng của 12 hợp chất phổ biến nhất là: Chlordane, 15%; trans-Chlordane, 15%; trans-Nonachlor, 9,7%; octachlordane,

cis-3,9%; heptachlor, 3,8%; cis-Nonachlor, 2,7%; hợp chất K, 2,6%; dihydrochlordene, 2,2%; nonachlor III, 2%; và 3 stereoisomeric dihydroheptachlors với thành phần 10,2% 12 hợp chất gồm 67% của hỗn hợp này, và 33% còn lại gồm hỗn hợp của

135 hợp chất khác

Infante và cộng sự (1978) đã báo cáo một mẫu khác của chlordane kỹ thuật

có thành phần gồm 38 - 48% cis- và trans-Chlordane, 3 - 7 hoăc 7 - 13% heptachlor,

5 - 11% nonachlor, 17 - 25% đồng phân chlordane khác và một lượng nhỏ những hợp chất khác

Tóm lại, nhóm Chlordane có 5 đồng phân chính đó là cis-Chlordane, Chlordane, cis-Nonachlor, trans-Nonachlor và heptachlor

trans-Một số tính chất vật lý và mục đích sử dụng của các chất tiêu biểu trong nhóm thuốc BVTV cơ clo được thể hiện trong bảng 1.3

Độ hoà tan trong nước

ở điều kiện thường, mg/l

Áp suất hơi bão hoà, mPa

chống dán, mối

Dạng lỏng, sánh

(20oC)

1.3 Giới thiệu chung về ong mật và sản phẩm mật ong

Ong mật là một loại động vật được yêu chuộng nhất trên thế giới Trên thế giới có hơn 80.000 loại côn trùng, chỉ riêng có ong mật mới là loại có thể cung cấp

thức ăn cho con người, nên con người luôn luôn đi tìm tòi và nghiên cứu về loại động vật nhỏ bé này Chân của ong mật có một bộ bàn chải rất thích hợp cho việc lấy phấn hoa, chân nó như một bàn chải, như một cái lược, cái bừa, cái làn để đựng phấn Số hạt phấn hoa có thể mang trên mình ong tới 5 triệu hạt, vượt xa các loại côn trùng khác Ong mật có thị giác và khứu giác đặc biệt, đôi mắt có nhìn rất xa,

có thể phân biệt các màu sắc: trắng, vàng, lam, tím nhạt và nhìn thấy cả tia tử ngoại

mà mắt người không thể nhìn thấy được Cơ quan khứu giác của ong là một cặp góc tương xứng di động, không ngừng xoay bốn phía, có thể ngửi thấy mùi hoa với độ thơm cực ít, nên nó có thể tìm ngay tới mục tiêu, tiết kiệm thời gian đi tìm Mặt khác với đôi cánh khỏe, tốc độ bay mỗi giây đạt 400 lần đập cánh, đạt 60km/giờ, một con ong mỗi lần bay đi có thể thu hút hoa phấn tới mấy trăm bông nên hiệu quả rất cao Ngoài ra trong cơ thể ong còn có các túi mật hoa, có thể chứa một trọng lượng bằng 1/2 trọng lượng cơ thể ong, tại tổ ong có kho chứa phấn hoa và mật hoa

1.3.1 Tổ chức xã hội đàn ong [2]

Ong mật có đặc tính sống thành xã hội, đàn ong là một đơn vị sinh học hoàn chỉnh gồm 3 loại: Ong chúa, ong đực, ong thợ Mỗi loại có một chức năng sinh học nhất định trong đàn, có mối quan hệ chặt chẽ với nhau

- Ong chúa: Trong mỗi đàn ong thường chỉ có một ong chúa, kích thước và khối lượng của nó lớn nhất đàn Ong chúa lớn nhất đàn, dáng cân đối, bụng thon dài

lộ sau đỉnh cánh, chúa mới đẻ có lớp lông tơ nhiều, mịn, bò nhanh nhẹn Ong chúa

là ong cái duy nhất có cơ quan sinh dục phát triển hoàn chỉnh để giao phối với ong đực Nhiệm vụ chủ yếu của ong chúa là đẻ trứng và tiết chất chúa (Feromon) để điều tiết hoạt động của đàn ong Tuổi thọ trung bình của ong chúa là 3 năm nhưng sức đẻ trứng của ong chúa chỉ cao nhất trong năm đầu tiên Khi già, khả năng đẻ trứng của ong chúa giảm dần, lượng Feromon sản sinh ít và đẻ nhiều trứng không thụ tinh Khi đó, đàn ong có thể sẽ tạo chúa để thay thế chúa già hoặc thay thế đàn

- Ong đực: Đến mùa sắp sinh ong chúa mới, trong đàn ong xuất hiện vài trăm con ong đực, chúng có màu đen, to hơn ong thợ, ngắn hơn ong chúa, đôi cánh dài hơn mình nó Ong đực chậm chạm, ăn cũng nhờ ong thợ bón Ong đực được sinh ra

từ trứng không thụ tinh có nhiệm vụ giao phối với ong chúa, chỉ có một con ong đực khỏe mạnh nhất đàn mới thụ tinh cho ong chúa Ong đực sau khi thụ tinh cho ong chúa thì chết hoặc khi thiếu ăn chúng sẽ bị ong thợ đuổi ra ngoài và bị chết đói Tuy nhiên, ong đực là một bộ phận không thể thiếu được của đàn ong, chỉ sau khi giao phối với ong đực, ong chúa mới có khả năng đẻ ra các trứng đã thụ tinh Từ những trứng này sẽ nở ra ong thợ và ong chúa thế hệ sau Tuổi thọ trung bình của ong đực là 50 – 60 ngày Tuy ong đực không đóng góp gì vào các hoạt động xã hội của đàn ong như nuôi ấu trùng, sản xuất mật mà chúng còn tiêu thụ một số thức ăn

và sự có mặt của chúng làm nâng cao nhiệt độ trong tổ Song bằng Feromon của chúng hoặc bằng cách nào đó, sự có mặt của chúng cũng có tác dụng làm cho đàn ong ổn định

- Ong thợ: cũng là ong cái nhưng không phát dục hoàn chỉnh mà phát triển các cơ quan phù hợp với chức năng của ong thợ Các nhiệm vụ chính của ong thợ là

vệ sinh tổ, vít lắp lỗ tổ; nuôi ấu trùng, chăm sóc, nuôi dưỡng ong chúa; tiết sáp, xây cầu và kiếm mật Tuy nhiên, nhiệm vụ chủ yếu của ong thợ là hút mật hoa và chế biến mật hoa thành mật ong Các nhà nghiên cứu cho rằng, sau khi ong thợ hút mật hoa về, tuyến hạ hầu của chúng tiết ra enzym Invectaza và Gluco-oxydaza để chuyển hóa đường saccaroza thành đường glucoza, chế biến thành mật ong, dự trữ lại trong các tổ và dự trữ tới mức dư thừa nhu cầu trong tương lai của đàn ong

1.3.2 Mật ong [2]

1.3.2.1 Quy trình tạo thành mật ong

Mật ong là sản phẩm do ong mật làm ra từ mật hoa, mật của dịch lá Bước đầu tiên trong quá trình làm mật được bắt đầu khi những con ong bay từ cây hoa này sang cây hoa khác để “thu thập” mật hoa Chúng sử dụng những chiếc vòi của mình để hút mật từ hoa và cất giữ trong một cái túi dạ dày đặc biệt của mình Loài ong có hai cái dạ dày – một chiếc dạ dày dùng để đựng mật hoa gọi là dạ dày mật ong và một chiếc dạ dày thông thường dùng để tiêu hoá thức ăn Dạ dày mật ong có thể chứa tới gần 70mg mật hoa và khi đầy, nó sẽ nặng gần bằng trọng lượng của một chú ong

Những con ong phải cần đến khoảng từ 100 đến 1500 bông hoa mới làm đầy được chiếc dạ dày của mình Sau đó, chúng sẽ trở về tổ và sẽ chuyển lượng mật hoa

dự trữ ấy cho những con ong thợ khác ở nhà Những con ong thợ này sẽ hút mật hoa

từ những con ong nói trên vào miệng của mình, sau đó sẽ “nhai” mật hoa trong vòng khoảng nửa tiếng, trong thời gian đó, enzim trong miệng sẽ chuyển hóa các loại đường phức tạp trong mật hoa thành những loại đường đơn giản vì thế nó sẽ vừa dễ tiêu hoá hơn vừa giảm khả năng xâm nhập của các loại vi khuẩn trong quá trình cất giữ Những con ong sau đó sẽ phân phối mật hoa vào những cái ngăn ở bên trong tổ mà tại đó nước trong mật hoa sẽ bị cô cạn và mật hoa sẽ biến thành một chất xi-rô đậm đặc hơn Những con ong dùng những chiếc cánh của mình để làm khô mật hoa Ngay khi mật đủ đặc, ong sẽ đóng nắp những cái ngăn đó lại bằng một cái nút sáp ong

Mật ong là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng làm thức ăn bổ sung cho con người trong nhiều loại thực phẩm và là vị thuốc tự nhiên chữa được nhiều bệnh như viêm họng, bệnh đường ruột, viêm gan

1.3.2.2 Phân loại mật ong

Mật ong được chia thành nhiều loại khác nhau, nhưng chủ yếu được phân làm 3 loại là: mật ong hoa, mật ong dịch lá, mật ong hỗn hợp

- Mật ong hoa: Tùy theo lượng mật hoa do ong khai thác chủ yếu từ một hay nhiều hoa mà mật ong được chia làm 2 loại là mật ong đơn hoa và mật ong đa hoa Mật ong đơn hoa như: mật ong hoa nhãn, mật ong hoa vải, mật ong hoa bạch đàn,…Mật ong đa hoa gồm một số loại như mật ong vải nhãn, mật ong hoa rừng,…

- Mật ong dịch lá: là mật ong do ong khai thác từ mật của dịch lá, búp non của cây, ví dụ mật ong đay, mật ong cao su,…

- Mật ong hỗn hợp: mật ong do ong khai thác từ mật hoa và mật của dịch lá,

ví dụ mật ong cao su - vải, mật ong cà phê – bạch đàn - táo – đay

Sự đa dạng và phong phú của các cây nguồn mật tạo nên các loại mật ong khác nhau như mật ong hoa vải, mật ong hoa nhãn, mật ong hoa bạch đàn, mật ong rừng… Các loại mật ong khác nhau có màu sắc, hương vị đặc trưng riêng như mật

ong hoa nhãn có màu hổ phách, mật ong hoa bạc hà có màu hơi xanh xanh, mật ong vùng Mộc Châu có màu vàng trong,…

1.3.2.3 Tính chất và thành phần hóa học của mật ong

Mật ong có màu sắc và mùi vị đặc trưng cho từng loại hoa mà ong lấy mật Dựa vào tính chất này, người ta có thể nhận biết được nguồn gốc địa lý của mật ong thông qua phương pháp phân tích phấn hoa

Mật ong rất nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng trực tiếp, do vậy nên đựng mật ong trong những lọ, chai thủy tinh mờ và bảo quản ở những nơi thoáng mát (nhiệt độ không quá 36oC)

Mật ong có tính chất lên men, khi tỷ lệ nước trong mật ong cao, vượt quá

Đặc biệt, nếu sử dụng các đồ đựng mật bằng kim loại, mật có thể bị biến chất, gây ngộ độc cho người sử dụng vì trong mật ong có chứa axit hữu cơ và đường, dưới tác dụng của men, sẽ sinh ra axit etylenic ăn mòn lớp kim loại và làm tăng thêm hàm lượng kim loại trong mật ong

b Thành phần hóa học của mật ong

Thành phần hóa học của mật ong khá phức tạp vì chứa đến 80 các loại chất khác nhau có liên quan đến dinh dưỡng Thành phần chính và tỷ lệ các chất hóa học

quan trọng của mật ong thể hiện ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của mật ong [11]

STT Thành phần hóa học Tỷ lệ trung bình (%) Biên độ giao động (%)

số emzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và điều hòa các hoạt động của cơ thể

1.3.3 Vai trò của cây nguồn mật phấn đối với ong [2]

Cây nguồn mật có vai trò quan trọng đối với ong bởi thức ăn chủ yếu của ong là mật hoa, phấn hoa Mật hoa và phấn hoa có thể cung cấp tất cả các năng lượng cần thiết cho ong Trong mật hoa có nhiều loại đường, chủ yếu là saccaroza, glucoza, fructoza,… là nguồn năng lượng cơ bản cho sự sinh tồn và sản xuất của đàn ong, trong đó, một phần mật hoa mà ong lấy được để sinh trưởng và phát triển đàn, phần mật hoa dư thừa ong luyện thành mật ong dự trữ trong các lỗ tổ Lợi dụng đặc điểm này, con người đã trồng các loại cây nguồn mật cho ong và khai thác mật ong, đem lại hiệu quả kinh tế cho nghề nuôi ong

Cơ sở để phân loại cây nguồn mật là dựa vào lượng mật có trong hoa, các vùng địa lý, phân loại thực vật, cơ quan tiết mật của cây,… Cây nguồn mật được chia làm 2 loại, đó là cây nguồn mật chính (cây nguồn mật chủ yếu) và cây nguồn

mật hỗ trợ Cây nguồn mật chính là cây tiết nhiều mật, số cây nhiều và tập trung Cây nguồn mật hỗ trợ là những cây có mật, phấn cho ong ăn nhưng không đủ khai thác

Ở nước ta, cây nguồn mật khá phong phú và phân bố rộng khắp Thời gian

nở hoa của cây nguồn mật đã tạo nên các vụ mật chính trong năm

Các loại cây nguồn mật chủ yếu ở nước ta bao gồm:

- Cây vải: Phân bố chủ yếu ở tỉnh Bắc Giang, Hải Dương và Hưng Yên, vùng đồng bằng và trung du Bắc Bộ Thời gian nở hoa từ 20/2 – 3/4 hàng năm Một ha cây vải có thể khai thác được 120 – 140 kg mật ong

- Cây nhãn: Phân bố ở hầu khắp các vùng ven sông ở đồng bằng và trung du Bắc Bộ, có nhiều ở Hải Dương và Hưng Yên, đồng bằng sông Cửu Long (Tiền Giang, Bến Tre) Thời gian nở hoa từ 10/3 – 15/4 Trung bình một ha có thể khai thác được 100 – 125kg mật ong

- Cây cao su: Phân bố chủ yếu ở miền đông Nam Bộ (Đắc Lắc, Gia Lai, Kom Tum), Khu IV cũ (Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh) Ong khai thác dịch ngọt tiết ra từ lá cây Thời gian tiết mật từ 15/2 – 30/4 Một ha cao su có thể khai thác được 70 – 75 kg mật ong Đây là nguồn mật xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam do diện tích cây cao su khá lớn

- Cây đay: Phân bố chủ yếu ở vùng đồng bằng Bắc Bộ Trước đây được trồng nhiều ở vùng Thái Bình, Hưng Yên, Hà Nam, nhưng nay diện tích bị thu hẹp nhiều Ong khai thác mật từ lá cây, thời gian tiết mật từ 15/4 – 3/6 Một ha có thể khai thác được 50kg mật

- Cây bạch đàn: được trồng nhiều ở các tỉnh Trung du Bắc Bộ như Vĩnh Phúc, Bắc Giang Một ha bạch đàn có thể khai thác được 100 – 150 kg mật ong

- Ngoài ra, một số cây nguồn mật như táo, keo lá chàm, bạc hà dại,… cũng cho năng suất và chất lượng mật khá tốt Đặc biệt là mật ong khai thác từ hoa táo và hoa bạc hà dại có hương vị rất đặc trưng

1.3.4 Cách thức nuôi ong ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nhân dân ta đã biết nuôi ong từ lâu, việc nuôi ong Apis cerana

ở các tỉnh phía bắc sớm phát triển, phương pháp nuôi không ngừng được cải tiến từ

đõ nằm sang đõ đứng có cầu di động Trong khai thác sản phẩm đã biết chỉ cắt một phần mật, còn phần trứng và ấu trùng thì buộc lại xà cầu cho ong tiếp tục sinh sản

và làm mật Ở các tỉnh trung du miền núi, nhân dân có kinh nghiệm bắt ong rừng về nuôi nhưng việc nuôi ong của nước ta trước năm 1960, chủ yếu là nuôi theo kiểu dã sinh, đàn ong tự sinh, tự diệt, lấy mật theo kiểu cắt bánh tổ vắt lấy mật nên năng suất thấp, chỉ khoảng 2-3 kg/đàn/năm Sau vụ mật, đàn ong bốc bay có nơi tới 90%

Từ sau những năm 60 đến nay, kỹ thuật nuôi ong ở nước ta có nhiều tiến bộ Đàn ong được nuôi trong kiểu thùng cải tiến của Trung Quốc, sử dụng thùng quay li tâm để quay mật, sản xuất ra chân tầng nhân tạo nên năng suất mật cao, bình quân gấp 5 - 7 lần so với trước [2]

Vào mùa hoa nở (tháng 2 đến tháng 4 của năm) là lúc nguồn mật cho ong rất phong phú, chủ nuôi ong sẽ mang các thùng ong đến đặt ở những nơi có đủ nguồn mật cho ong như tại các vườn hoa nhãn, hoa vải, hoa mận, hoa rừng… và thực hiện quay mật ngay tại nơi đặt thùng ong Mật ong thu được có mùi thơm đặc trưng của từng loại cây nguồn mật Vào những thời điểm nguồn mật tự nhiên giành cho ong khan hiếm (mùa đông), để duy trì sự sống cho đàn ong, người ta thường cho ong ăn mật, ăn đường… Lúc này, lượng mật ong thu được ít và có chất lượng thấp

1.4 Nguồn gốc xuất hiện các hóa chất BVTV trong mật ong

Từ lâu nước Việt Nam ta đã hình thành những loài cây ăn quả nổi tiếng, ở miền Bắc có nhãn lồng Hưng Yên, vải Thanh Hà Ngày nay, trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng, những loài cây ăn quả đó đã vượt qua vùng sản xuất truyền thống đến những vùng trồng mới như vải thiều Lục Ngạn, nhãn Sông Mã, Văn Chấn,… Sự phát triển về cây nguồn mật tạo điều kiện cho kinh tế phát triển, cuộc sống người dân được cải thiện Song bên cạnh đó đã hình thành một hệ sâu bệnh gây hại Để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng, con người đã sử dụng một lượng thuốc hóa học khổng lồ 210.000 tấn/năm (FAO 1981)

Theo Cục BVTV (2012) cho biết: qua thanh kiểm tra, các cơ quan ước tính không dưới 25% số hộ nông dân thường xuyên vi phạm trong việc sử dụng thuốc BVTV, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất, cộng đồng và môi trường Thiếu hiểu biết về tác hại của thuốc và vì lợi nhuận trước mắt, họ sử dụng bừa bãi thuốc không rõ nguồn gốc, không đúng đối tượng sâu bệnh nên gây ra hiện tượng kháng thuốc và không phát huy tác dụng của thuốc BVTV, ô nhiễm môi trường sống, …

Việc phun thuốc thường thực hiện trước khi hoa nở, nhưng nhiều trường hợp

do điều kiện mùa hoa nở vào cuối tháng 3 đầu tháng 4, thời tiết mưa phùn tạo điều kiện cho nấm bệnh hại hoa phát triển nên ngay cả khi hoa nở vẫn còn phun thuốc

Việc phun thuốc BVTV trên các cây nguồn mật như nhãn, vải, xoài, cam, chanh, mận, gioi, lúa,… khi hoa nở, hay có những loài phun thuốc khi không có hoa

nở nhưng thuốc rơi xuống cỏ hoa cũng sẽ gây ngộ độc cho ong mật Khi phun thuốc theo chiều gió thuốc có thể bay vào cửa tổ ong Có thể thuốc BVTV nhiễm vào nước, dính vào dụng cụ nuôi ong, vào chân tay, quần áo người nuôi gây tác hại cho ong Thuốc xâm nhập vào cơ thể ong qua đường hô hấp Bị ngộ độc thuốc BVTV nặng ong sẽ chết Ong thu được mật và phấn nhiễm thuốc BVTV sẽ mang về tổ khi

đó mật ong sẽ có thuốc BVTV Mật này làm thức ăn nuôi ấu trùng làm ấu trùng chết hoặc ra đời yếu ớt, bay khó khăn, tuổi thọ giảm, đàn ong sa sút

Mỗi ngày, 10.000-25.000 con ong làm việc trung bình 10 chuyến đi để khám phá khoảng 7 km2 trong khu vực gần tổ của chúng, thu thập mật hoa, nước, và phấn

từ hoa Trong quá trình này, các vi sinh vật khác nhau, các loại hóa chất, và các hạt

lơ lửng trong không khí, được chặn bởi các con ong này và giữ lại trên lớp lông bề mặt cơ thể của chúng, hoặc hít vào và giữ lại trên khí quản của chúng [14] Vì vậy, bằng cách dễ dàng đó, hầu hết các sinh vật ở khắp mọi nơi, với yêu cầu thực phẩm khiêm tốn, rất nhạy cảm với các yếu tố sinh học, hóa học, và vật lý, chẳng hạn như

ký sinh trùng, chất gây ô nhiễm công nghiệp, thuốc trừ sâu và có thể được sử dụng như một chỉ thị sinh học để theo dõi tình trạng môi trường [10], [16] Hơn thế nữa,

sự liên hệ của ong mật với hầu hết các yếu tố môi trường (đất, thảm thực vật, nước,

không khí) nên ong giúp cung cấp nhiều thông tin chỉ thị môi trường (thông qua tìm kiếm thức ăn) cho mỗi mùa Cuối cùng, nhiều loại vật chất được đưa vào tổ ong

Do đó sản phẩm mật do ong tạo ra bị nhiễm thuốc BVTV

1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV trong mật ong

1.5.1 Phương pháp chiết lỏng-lỏng kết hợp với sắc ký khí khối phổ

Dư lượng 48 loại thuốc trừ sâu họ halogen hữu cơ, photpho hữu cơ, pyrethroid và nito hữu cơ trong các mẫu mật ong được sản xuất tại Brazil được xác

tan trong nước, lắc đều Tiếp theo mẫu được chiết bằng 50 mL dung môi etyl axetat

để chiết bằng cách khuấy trong 20 phút Pha hữu cơ được tách ra khỏi mẫu bằng cách ly tâm hỗn hợp chiết đã nêu trên Thu lấy dung mỗi hữu cơ ở lớp phía trên, chiết mẫu thêm một lần nữa bằng etyl axetat Gộp hai phần lại và làm cô cạn trong

axetat và lọc mẫu còn lại qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,5 µm Dịch chiết được làm sạch bằng cách cho qua cột Florisil đã được hoạt hóa bằng 5 mL axeton, dung môi rửa giải chất phân tích ra khỏi cột Florisil là 10 mL hỗn hợp hexan:etyl axetat tỉ lệ 50:50 Sau khi hoàn thành bước rửa giải, dung dịch thu được được cô cạn nhờ dòng

GC/MS

Trong số 48 loại thuốc trừ sâu nghiên cứu, có 45 loại có giới hạn phát hiện (LOD) thấp hơn 0,005mg/L, trong đó 28 loại có LOD bằng hoặc thấp hơn 0,001 mg/L Giới hạn định lượng (LOQ) của các chất nghiên cứu biến thiên trong khoảng

từ 0,0010 mg/L đến 0,0200 mg/L

1.5.2 Phương pháp chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí khối phổ

cơ, photpho hữu cơ và thuốc diệt ve trong các mẫu mật ong được xác định đồng

mật ong được hòa tan trong hỗn hợp nước:metanol (70:30), sau đó chuyển vào cột C18 (1 g) đã được hoạt hóa bởi axetonitril và nước Các chất phân tích được rửa giải bằng hỗn hợp hexan:etyl axetat Dung dịch sau rửa giải được thổi khô và đem xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Khối phổ làm việc theo chế độ chọn lọc ion

Giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích đối với từng loại thuốc trừ sâu

có giá trị trong khoảng 0,1-6,1μg/kg Khoảng tuyến tính thu được từ 25-200 µg/Kg với hệ số xác định > 0,996

tích đồng thời 42 loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm clo hữu cơ, carbamate, và phốt pho hữu cơ trong các mẫu mật ong Trong đó nhóm photpho hữu cơ và cacbamat được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề ion ở áp suất khí quyển

Với phương pháp này, giới hạn định lượng của phương pháp LC/APCI/MS đối với từng loại thuốc trừ sâu nhóm phốt pho hữu cơ và cacbamat từ 0,005-0,1 mg/kg LOQ của phương pháp GC/MS đối với từng loại thuốc trừ sâu nhóm clo hữu

cơ trong khoảng 0,003-0,2 mg/kg Độ thu hồi của phương pháp LC/APCI/MS là 95%, độ thu hồi của phương pháp GC/MS là 79-98%

73-Detectơ quang hóa ngọn lửa (FPD) sử dụng trong sắc ký khí và detectơ huỳnh quang (FL) sử dụng trong sắc ký lỏng cũng được sử dụng để thực hiện xác định đồng thời dư lượng 15 loại thuốc trừ sâu nhóm phốt pho hữu cơ (OP), 17 loại nhóm clo hữu cơ (OC), 8 loại nhóm Pyrethoid (PYR), 12 loại nhóm N-metyl-

nghiên cứu Hầu hết các thuốc trừ sâu có độ thu hồi trong khoảng 70-103% Các giá trị LOQ cho tất cả các loại thuốc trừ sâu nghiên cứu dao động từ 0,0005-0,025 mg/kg, giá trị LOD từ 0,0002-0,008 mg/kg

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là sản phẩm mật ong nuôi tại các tỉnh Hưng Yên, Bắc Giang, Lạng Sơn Mật ong được lấy trực tiếp vào các tháng 2, 3 và 4 năm 2014 từ

cơ sở nuôi ong tại xã Hồng Nam - huyện Tiên Lữ - tỉnh Hưng Yên; xã Giáp Sơn - huyện Lục Ngạn - tỉnh Bắc Giang; xã Bằng Khánh - huyện Lộc Bình - tỉnh Lạng Sơn Ở những nơi lấy mẫu, các thùng ong được đặt trong những vườn cây ăn quả như nhãn, vải, mận… Vào thời điểm tháng 2 đến tháng 4 là mùa hoa nở, hàng ngày chủ nuôi ong sẽ thả đàn ong ra để chúng đi hút mật tại các vườn cây ăn quả này

Các chất lựa chọn nghiên cứu xác định trong mật ong là nhóm chất clo hữu

cơ, bao gồm: α-BHC; Hexachlorbenzen (HCB); β-BHC; γ-BHC; δ-BHC; Heptachlor; α-Chlordene; β-Chlordene; Oxychlordane; trans-Chlordane; o,p’-DDE; cis-Chlordane; trans-Nonachlor; p,p’-DDE; o,p’-DDD; cis-Nonachlor; o,p’-DDT; p,p’-DDD; p,p’-DDT Trong đó, các hợp chất của BHC, DDT, Chlordane, Hexachlorbenzen và Heptachlor đều nằm trong danh mục thuốc BVTV cấm sử dụng ở Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập và tổng hợp tài liệu

Luận văn có sử dụng các tài liệu thuộc nhiều nguồn khác nhau, trong đó có các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học trong nước và quốc tế; các sách chuyên đề về nông nghiệp, hóa chất bảo vệ thực vật trong và ngoài nước; các báo cáo tại các hội nghị khoa học;… Mục đích của phương pháp là thu thập, tiếp thu có chọn lọc các công trình nghiên cứu, các thông tin, tài liệu có liên quan

Từ các tài liệu thu thập và tổng hợp được, chúng tôi nhận thấy quy trình phân tích dư lượng thuốc BVTV thường có các bước sau: lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, tách chiết, làm sạch, phân tích trên máy, xử lý kết quả Kết quả phân tích có độ chính xác cao là cơ sở cho các quyết định và hành động sau đó Để đạt được điều đó,

phòng thí nghiệm phải chuẩn hóa thiết bị, dụng cụ, lưu mẫu và chất chuẩn tại điều kiện tiêu chuẩn

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu

2.2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản

Mẫu mật ong được lấy trực tiếp ở những vùng chuyên sản xuất mật ong Mẫu được đựng trong các lọ thủy tinh màu nâu và sạch, vận chuyển về phòng thí nghiệm

nhãn mác, ghi đầy đủ các thông tin cần thiết tránh nhầm lẫn

2.2.2.2 Phương pháp tạo mẫu phân tích

Chọn một số mẫu ở cùng cơ sở sản xuất, trộn đều, sau đó lấy 1 phần làm mẫu phân tích (mẫu đại diện trong phân tích) Phần còn lại được bảo quản để dùng cho những mục đích khác

2.2.2.3 Phương pháp tạo mẫu so sánh

Từ mẫu thực đã trộn đồng nhất lấy ra hai mẫu: một mẫu cho thêm chất chuẩn (mẫu tự tạo), mẫu còn lại giữ nguyên (mẫu trắng) Tiến hành phân tích hai mẫu này

Ưu điểm của phương pháp SPE là khả năng làm giàu mẫu cao, giúp loại bỏ ảnh hưởng của các chất gây nhiễu, quy trình thực hiện dễ tự động hoá, phù hợp với phân tích sắc ký và giảm lượng dung môi sử dụng so với phương pháp chiết lỏng - lỏng thông thường

b Cấu tạo cột SPE

Cột SPE có nhiều dạng nhưng loại thường sử dụng là những cột nhỏ có dạng thân ống tiêm, bên trong nhồi các pha tĩnh Pha tĩnh nhồi vào cột chiếm bề dày cột khoảng 0,5 - 2cm, lượng sử dụng từ 100mg đến 1g, trong một số trường hợp có thể lên đến vài gram Trong cột có 2 đĩa thuỷ tinh xốp giúp giữ pha tĩnh để không cho chúng đi ra khỏi cột theo dung môi và giữ cho cột ổn định

Cột SPE có 3 loại:

- Loại chứa các pha tĩnh như C18, C8, C4, C2, cyclophenyl được gắn trên

chức năng tách các chất không phân cực hay ít phân cực

- Loại chứa các chất tách như silica, florisil, amino alumina, có gắn các nhóm chức như -OH, -NH2, -CN dùng chủ yếu để tách các chất tương đối phân cực Phần lớn được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột ghép –CN có thể sử dụng trong pha đảo)

- Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột SCX tách cation)

c Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Bước 1: Hoạt hoá pha tĩnh

Cho dung môi thích hợp chảy qua pha tĩnh để thấm ướt vật liệu nhồi và để solvat hoá các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời loại bỏ không khí và các chất bẩn trong cột

Để hoạt hoá cột có thể sử dụng hai dung môi có khả năng chiết tách mạnh:

- Dung môi 1: có khả năng chiết tách mạnh hơn hoặc bằng khả năng chiết tách của dung môi sẽ được sử dụng cuối cùng để rửa giải hết các chất phân tích ra khỏi cột

- Dung môi 2: có khả năng tách chiết yếu hơn, hoà tan dễ dàng trong dung môi 1 Dung môi 2 này có khả năng chiết tách chất gần bằng dung môi 3 (dung môi

để hoà tan hỗn hợp chất cần phân tích)

Trong quá trình hoạt hoá cột không được để cột bị khô dung môi

Bước 2: Cho mẫu chảy qua cột

Hoà tan mẫu phân tích vào dung môi 3 (dung môi 3 phải có khả năng chiết tách yếu đối với chất phân tích được giữ lại trên cột SPE) rồi dội mẫu qua cột Trong quá trình này chất phân tích được giữ lại trên cột Dung môi và phần lớn tạp chất được rút từ từ ra khỏi cột dưới tác dụng của áp suất thấp tạo bởi bơm chân không

Bước 3: Rửa các tạp chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

Quá trình này sẽ loại bỏ tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại chất phân tích Nếu mẫu hoà tan trong nước thì nên sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ Nếu mẫu hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa các tạp chất

ra khỏi cột cần sử dụng chính dung môi hữu cơ này

Bước 4: Giải hấp chất phân tích khỏi cột

Tách từ từ cấu tử các chất phân tích ra khỏi cột bằng dung môi 1 hoặc những dung môi thích hợp có khả năng chiết tách chất theo hướng tăng dần Trường hợp dung môi dùng để giải hấp không tan trong dung môi đã sử dụng để rửa tạp thì phải rút chân không nhẹ để làm khô cột trước khi cho dung môi giải hấp vào

Về nguyên tắc không nên sử dụng dung môi có khả năng chiết tách quá mạnh vì có thể lôi kéo theo cả những tạp chất không mong muốn trong quá trình giải hấp Ngược lại nếu khả năng chiết tách của dung môi quá yếu thì sẽ phải sử dụng một lượng dung môi lớn thì mới có thể giải hấp hết các chất phân tích trên cột

Do thuốc bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ là những chất không phân cực hoặc ít phân cực nên trong đề tài này sẽ sử dụng cột chiết pha rắn là cột C18

2.2.3.2 Phương pháp sắc ký cột

Để phân tích thuốc BVTV bằng phương pháp sắc ký khí trong các đối tượng mẫu mật ong khác nhau (có thành phần cấu tử trong mẫu phân tích rất phức tạp) thì cần phải được tiến hành bước làm sạch nhằm loại bỏ các cấu tử gây cản trở phân tích (phần lớn lượng tạp chất đi kèm theo thuốc BVTV cần phân tích) Tạp chất trong mẫu có thể gồm các amin, phenol, axit hữu cơ, đường, dầu thực vật, chất màu, diệp lục… các chất này gây ảnh hưởng đến khả năng phát hiện của detectơ ECD Vì vậy quá trình làm sạch các cấu tử gây cản trở có trong dịch chiết mẫu là giai đoạn

bắt buộc khi phân tích hóa chất BVTV bằng phương pháp GC sử dụng detectơ ECD Quá trình làm sạch dịch chiết được thực hiện trên sắc ký cột

Để loại bỏ tiếp tục các tạp chất trong dịch chiết mẫu đã tách trên cột chiết pha rắn cần sử dụng cột sắc ký hấp phụ Những cột này chứa chất hấp phụ ổn định

về tính chất, kích thước hạt đồng nhất, hoạt độ phù hợp với tách chất

Các chất hấp phụ dùng cho giai đoạn làm sạch thường là nhôm oxit, magie silicat biến tính (florisil), silicagel không biến tính (silicagel thường), các polime,… Các vật liệu hấp phụ này có khả năng loại trừ các chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích, đó là hợp chất béo, các hydrocacbon thơm, các hợp chất hữu cơ chứa Nitơ Các chất hấp phụ được nhồi vào cột sắc ký có khóa điều chỉnh tốc độ dòng dung môi rửa giải Các chất sau khi hấp phụ trên cột sắc ký sẽ được rửa giải bằng dung môi thích hợp

Trong nghiên cứu này sử dụng cả 2 phương pháp để làm sạch trên để làm sạch mẫu: phương pháp chiết pha rắn và phương pháp sắc ký cột

b Sơ đồ khối thiết bị sắc ký khí (hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ khối của máy sắc ký khí [7]

Khối I: khối này gồm các thiết bị dùng để tách các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích ra khỏi nhau, gồm hệ sắc ký và các bộ phận vận hành sắc ký

biết kết quả Trong đó:

D: Detectơ (bộ phận nhận biết chất), là một máy phân tích hoàn chỉnh, cho biết từng chất hoặc nhóm chất ra khỏi cột với tín hiệu tỉ lệ với hàm lượng tương ứng

6- Bộ phận phân tích sắc đồ 7- Bộ phận ghi sắc đồ

c Nguyên tắc vận hành của sắc ký khí

Bộ phận quan trọng nhất của máy phân tích sắc ký là hệ thống cột tách và detectơ Nhờ có khí mang chứa trong bom mà mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký diễn ra tại đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại

đó chúng chuyển thành tín hiệu điện, các tín hiệu điện được khuếch đại tại bộ phận

khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi hoặc chuyển sang phân tích kế có máy tính, tín hiệu được xử lý ở đó và chuyển sang bộ phận ghi kết quả Trên sắc đồ nhận được từ bộ phận ghi, ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử cần tách ra gọi là píc [7]

Thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho các cấu tử cần tách, được dùng để định tính, còn diện tích píc là thước đo định lượng cho từng cấu tử trong hỗn hợp nghiên cứu Trong sắc ký khí, người ta cần dạng píc không bị biến dạng nhiều nhằm xác định chính xác đỉnh píc, đối với phân tích định lượng, yêu cầu đặt ra cao hơn:

độ lặp lại, độ so sánh tốt, độ chính xác cao [7]

Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký khí được sử dụng rộng rãi bởi vì khả năng tách cao và tính sẵn có của detectơ chọn lọc như detectơ cộng kết điện tử (ECD), detectơ dẫn nhiệt (TCD), detectơ ion hóa ngọn lửa (FID), detectơ nitơ phốt

clo, phương pháp phân tích phù hợp nhất và được lựa chọn trong nghiên cứu này là phương pháp sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử

Detectơ cộng kết điện tử (ECD) hoạt động dựa trên đặc tính các chất có khả năng cộng kết điện tử trong pha khí ECD là một dạng của detectơ ion hoá, các ion

một dòng điện nền Khi các chất có khả năng bắt điện tử đi qua, chúng sẽ bắt giữ điện tử làm giảm đường nền và gây ra các tín hiệu tương ứng ECD rất chọn lọc với các nguyên tố có độ âm điện cao như halogen, sulfua và những chất có cấu trúc chưa no [17]

d Định tính và định lượng

- Định tính: trên sắc đồ nhận được sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được

tách gọi là píc Người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu của các cấu tử để nhận diện chúng, bằng cách so sánh thời gian lưu của cấu tử cần xác định với thời gian lưu của chất chuẩn Việc nhận diện một cấu tử chính xác hay không phụ thuộc vào sự giống nhau của mẫu phân tích so với mẫu chuẩn và chỉ được khẳng định khi thời gian lưu của chất cần phân tích trùng với giá trị thời gian lưu của chất chuẩn

Trong nghiên cứu này, thời gian lưu của từng cấu tử trong chất chuẩn được xác định dựa vào tín hiệu ghi nhận bởi detectơ ECD

- Định lượng: diện tích píc là thước đo định lượng các chất trong hỗn hợp

nghiên cứu Dựa vào mối tương quan giữa số đếm diện tích píc và nồng độ chất chuẩn sẽ dựng được đường ngoại chuẩn thể hiện mối tương quan này Từ số đếm diện tích píc thu được của các mẫu phân tích và đường ngoại chuẩn sẽ xác định được nồng độ chất cần nghiên cứu trong mẫu

mesh của hãng Merck (Đức), diện tích bề mặt 155 m2/g, Al2O3 được sấy khô và hoạt hoá ở nhiệt độ 130oC trong 5 giờ

- Các chất chuẩn và nồng độ của từng chất chuẩn: α-BHC (1,05 ppm); BHC (1,03 ppm); γ-BHC (1,033 ppm); δ-BHC (0,97 ppm); Hexachlorbenzen (1,053 ppm); Heptachlor (0,505 ppm); α-Chlordene (1,005 ppm); β-Chlordene (1,005 ppm); Oxychlordane (1,055 ppm); trans-Chlordane (1,025 ppm); cis-Chlordane (1,005 ppm); trans-Nonachlor (1,000 ppm); cis-Nonachlor (1,015 ppm); o,p’-DDE (1,038 ppm); p,p’-DDE (1,02 ppm); o,p’-DDD (1,033 ppm), p,p’-DDD (1,053 ppm); o,p’-DDT (1,04 ppm); p,p’-DDT (1,063 ppm) Các chất chuẩn được cung cấp

β-từ Nhật Bản

- Lọ thủy tinh dung tích 30 mL có nút silicon

- Cột sắc ký bằng thủy tinh có kích thước dài 30 cm, đường kính trong 0,6 cm

có gắn van điều chỉnh tốc độ dòng

Tất cả các dụng cụ thủy tinh sử dụng trong các thí nghiệm đều được làm sạch bằng cách ngâm trong dung dịch rửa (H2SO4 đặc + Cr2O3) khoảng 24h Sau đó tráng lại bằng nước cất hai lần và axeton, n-Hexan Dụng cụ đã rửa được sấy ở nhiệt độ

• Thiết bị:

- Tủ sấy 300oC

- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,001 mg

- Máy cô cất quay chân không

- Máy hút chân không

- Thiết bị chiết pha rắn

- Syranh bơm mẫu Hamilton các loại: 10 µL; 100 µL; 500 µL

- Máy sắc ký khí HP 5890 của Mỹ với detectơ cộng kết điện tử (ECD), cột sắc ký mao quản HP5_MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy 0,25 µm

Điều kiện làm việc của máy sắc ký khí:

Trên cơ sở tham khảo tài liệu, quá trình thực nghiệm và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn chế độ phân tích dư lượng thuốc BVTV nhóm

clo hữu cơ trên máy GC/ECD như sau:

- Chương trình nhiệt độ cột tách:

+ Nhiệt độ ban đầu là 900C giữ trong 1 phút; tăng đến 2500C với tốc

độ gia nhiệt là 150C/phút, giữ trong 10 phút; tăng đến 2700C với tốc độ gia nhiệt 80C/phút, giữ trong 2 phút

+ Tổng thời gian chạy máy là 33,8 phút

- Nhiệt độ injectơ: 2700C

- Nhiệt độ detectơ: 2600C

- Khí mang Nitơ: 99,999%

- Áp suất đầu cột: 20 psi

- Bơm: Splitless, đóng van 0,3 phút

- Bơm mẫu 1 µL

- Cột sắc ký mao quản HP5 MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy 0,25 µm

c Xây dựng đường ngoại chuẩn

Đường ngoại chuẩn được sử dụng để xác định nồng độ thuốc BVTV trong các mẫu mật ong Trong phương pháp này dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cần xác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo số đếm diện tích píc trên sắc ký đồ và nồng độ chất chuẩn phân tích Dựa vào đường ngoại chuẩn và số đếm diện tích píc của chất cần phân tích có thể xác định được nồng độ chất cần phân tích

• Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chất chuẩn:

- Dùng syranh Hamilton lấy chính xác 100µL hỗn hợp chất chuẩn gồm 19 chất

đã biết nồng độ của từng chất (gọi là C0): α-BHC; β-BHC; γ-BHC; δ-BHC;

Oxychlordane; trans-Chlordane; Chlordane; trans-Nonachlor; Nonachlor; o,p’-DDE; p,p’-DDE; o,p’-DDD, p,p’-DDD; o,p’-DDT; p,p’-DDT pha loãng thành 1 mL bằng n-Hexan nhận được dung dịch C1

cis Lấy chính xác 500 µL dung dịch C1 pha loãng thành 1 mL bằng ncis Hexan được dung dịch C2